Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

llfcrencía de las bacterias, que por lo general constan de un solo compartimiento rodea· ¡>ur una membrana plasmática, la célula eucariota está subdividida en compartimientos

.l..ados por membrana, que son funcionalmente distintos. Cada compartimiento u .... nuJo contiene su propia dotación de enzimas, otras moléculas especializadas y un ~tllplcjo sistema de distribución que transporta de forma específica los compuestos de tomparrimiento a otro. Para entender la célula eucariota es necesario conocer cómo ge­ft y mantiene estos compartimientos, qué ocurre en cada uno de ellos y cómo se despla· <lli•IS moléculas entre ellos.

las proteínas confieren a cada compartimiento sus propiedades estructurales y funcio· Catalizan las reacciones que tienen lugar en cada orgánuJo y transportan selectiva­

'" pequeilas moléculas hacia dentro y hacia fuera del interior del orgánulo o turnen. h!én actúan como marcadores específicos de superficie de los orgánuJos que dirí~en el

tino de proteínas y lípidos al orgánulo apropiado. tina célula animal contiene alrededor de 1 O mil millones ( 1010) de moléculas de proteí­

•l•• unos 10.000 tipos distintos. La síntesis <.le la mayoría de todas estas proteína~ empieza col dtosol. el espacio común que engloba ¡¡los orgánulos. Una vez sintetizada, cada pro­"' t~s transportada específicamente al compartimiento ceJula r que la necesita. El trans­w intracelular es el tema central de este capítulo y del siguiente. El conocimiento del "k o de proteínas desde un compartimiento a otro permite empezar a comprender el des­>u•rtarte laberinto de las membranas intracelulares.

A COMPARTIMENTACIÓN DE LAS CÉLULAS • l.J sección introductoria se proporcionará una visión general de los distintos comparti­

•os de la célula y de las relaciones que existen entre ellos mediante la organización con­•:11 de los orgánulos en lUl pequeño número de familias, revisando cómo las proteínas se u o orgánuJos especítlcosy explicando cómo atraviesan las membranas de los orgánuJos

odas las células eucariotas tienen la misma dotación básica t orgánulos rodeados de membrana

• hos procesos bioquímicos vitales ocurren en o sobre superficies de membrana. Por nplo, el metabolismo lípfdico está catalizado sobre todo por enzimas unidas a membra­\ tnnto la fosforilación oxidativa como la fotosíntesis requieren una membrana semi­

tt115Lble para acoplar el transporte de H• con la síntesis de ATP. Además de proporcionar 1111 romento del área de membrana a las reacciones bioquínúcas, los sistemas intracelu-

lic membranas forman comparthnientos cerrados separados del citosol. generando 1111 de la célula espacios acuosos que tienen una función especí¡¡lizada. Dado que la bi· 1 hpfdica de los orgánulos de membrana es impermeable a la mayoría de las muléculas u11licas.la membrana de cada orgánulo debe d isponer de proteínas transportadoras que nll.tn o exportan determinados metabolitos. La membrana de cada orgánulo también

tc11cr tm mecanismo de importación y de incorporación ¡d orgánulo de las protefna<> •!erísticas de dicho orgánulo. l.ula Figura 12-1. se ilustran los compartimientos más importantes comunes a todas tlulas eucariotas. El núcleo contiene el genoma principal (además de las mitocondrias y

En este capítulo

LA COMPARTIMENTACIÓN 695 DE LAS CtLULAS

TRANSPORTE 704 DE MOLÉCULAS ENTRE EL NÚCLEO YELCITOSOL

TRANSPORTE DE 713 PROTEINAS AL INTERIOR DE MITOCONDRIAS Y CLOROPLASTOS

PEROXISOMAS 720

RETICULO 723 ENDOPLASMÁTICO

695

696 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

endosoma

peroxisoma

polirrlbosomas libres

¡..... _ __ 15 Jlm ----1

cltosol

lisosoma

complejo de Golgi

mltocondria

retfculo endoplasmático con pollrribosomas unidos a su membrana

núcleo

membrana plasmiitica

los cloroplasws) y es el lugar m~s importante de síntesis de DNA y de HNA. El citoplasma que lo circunda consiste en el citosol y los orgá11ulos citoplasmático~ suspendidos en él. El citosol con~tituye un poco más de la mitad del volumen total de la célula y e~ el lugar donde tiene lugar la sfnte'lis de proteínas y su degradación. Además es donde se desarrollan lama­yoría de las reacciones del metabolismo intermediario celular, es decir, el elevado número de reacciones mediante las cuales ai&'Unas moléculas pcquct\as son degradadas y otra<; son sin­tetizadas proporcionando los elementos para la construcción de las macromoléculas (se describe en el Capíllllo 2).

Aproximadamente la mitad del :irca total de membrana de una célula eucariota englo­ba los espacios laberfnticos del retículo endoplasmático (FR: e11doplrumic reticulum). El F.R rugoso presenta muchos ribosomas unidos a su superficie citoplasmáiica, que sintetizan proteínas solubles e integrales de membrana, la mayoría destinadas a ser segregadas o a ser transportadas a otros orgánulos. Veremos que aunque las proteínas son transportadas a otros orgánulos después de ser sintetizadas, son transportadas al ERa medida que se sinte­tizan. Esto explica por qué el ER presema ribosomas de fom1a característica. Ciertas regiones que no tienen ribosomas se denominan ER liso. El FR también produce la mayorfa de lo~ lí­pidos del resto de la célula y también actúa como almacén de iones ea2•. rl EH envía muchas de sus protefnas y lfpidos al complejo de Golgi, que está formado por una serie de comparti­mientos organizados en forma de sacos discoidales llamados cistemru del Golgi. El comple­jo de Golgi recibe lípidos y proteínas del ER y las distribuye hacia diferentes destinos intracelulares, por lo general modificándolas covalentemente durante e/r1iaje.

Las mitocondrias y (en plantas) los cloropltrstos generan la mayor parte del AfP que uti­lizan las células para impulsar las reacciones biosintéticas que requieren un aporte de ener­gía libre; los cloroplastos son una versión especializada de los plastidios. que pueden tener otras funciones en las células vegetales, romo el almacenamiento de reservas o de pigmen­tos. Los lisosomas contienen enzimas digestivas que degradan tanto orgánulos muertos co­mo macromoléculas y panículas captadas del exterior de la célula por endocitosis. En su camino hacia los lisosomas, las macromoléculas y las panículas endocitadas primero deben pasar por una serie de compartimientos llamados endosoma.s. Por último, los peroxisomru son pequei\os compartimientos vesiculares que contienen enzimas que participan en di­versas reacciones oxidativas.

En general, cada orgánulo rodeado por membrana reali:r.a el mismo tipo de funciones básicas en todos los tipos celulares. Pero. para poder cwnplir las funciones especia1i7.adas de las células, estos orgánulos varlan en abundancia y pueden tener propiedades adicionales que difieran de un tipo celular a otro.

En conjunto, estos orgánulos ocupan casi la mitad del volumen celular (Tabla 12-l ) y para fabricarlos se requiere una gran cantidad de membranas intracelulares. Por ejemplo, en las células hepáticas y en las células pancreáticac¡, el retículo endoplasmático tiene una super­ficie de membrana total que es 25 y 12 veces mayor respectivamente que la membrana plas­mática (Tabla 12- 2). Asf, en términos de área y de masa en la mayoría de las células

Figura 12-1 Esquema de los principale' compartimientos intracelulares de una célula animal. -ATCC El cltosol (en gm el reticulo endoplasmático, el complejo de Golgi, el núcleo, las mitocondrias, lo•. endosomas, los llsosomas y los peroxiSP•• son diferentes compartimientos que se 1 aislados del resto de la célula mediante • menos, una membrana dotada de permeabilidad select1va.

:OMPARTIMENTACIÓN DE LAS a LULAS

12- 1 Volúmenes relativos ocupados por los principales compartimientos celulares en una cé lula hepática típica (hepatocito)

'AR riMIENTO INTRACEWLAR

•s del ER rugoso

las del ER liso y cisternas del Golgl

as

PORCENTAJE DEL VOLUMEN CEWLAR TOTAL

54

22

9

6

6

tas la membrana plasmática sólo es una membrana minoritaria y los orgánulos se ntran densamente empaquetados en el citosol (Figura 12- 2).

4 menudo los orgánulos rodeados de membrana ocupan posiciones características 1sol. Por ejemplo, en la mayorfa de células el complejo de Golgi se encuentra cerca

dt:o mientras que la red de sáculos del ER se extiende a partir del núcleo por todo el l. Estas distribuciones caracterfs ticas dependen de las interacciones de los orgá­con el citoesqueleto. Por ejemplo. la localización del ER y del complejo de Golgi de de la exisLCncia de una red intacta de microtúbulos. Si se despolimerizan experi­lmcnte los microtúbulos con un fármaco, el complejo de Golgi se fragmenta y se

1 por toda la célula y la red del ER se colapsa hacia el centro celular (se describe en Ctulo 16).

orígenes evolutivos explican las relaciones topológicas los orgánulos

(ender la relación que existe entre los compartimientos de la célula, resulta útil con­c6mo pueden haber evolucionado. Se cree que los precursores de las primeras célu­riotas fueron organismos pa recidos a bacterias, los cuales generalmente tienen

una plasmática pero no membranas in temas. En estas células, por lo tanto, la mem-

'12- 2 Cantidades relativas de t ipos d e membrana en dos tipos de cé lulas tas

PORCENTAJE DE LA MEMBRANA CELULAR TOTAL

HEPATOCITO* --

2 S

35 60

16 <1

7 10

7 4 32 17

0,2 0,7 1

no determinado 3

0,4 no determinado

0,4 ll

no determinado

0,4 no determinado

células son de tamaño m'CI)I diferente; los hepatocitos henen un volumen medio de 5000 ~m ción con los 1000 ~m·. de la~ células exocrmas pancreátícas. 1 as áreas totales de membrana estiman en 110.000 ~m7 y 13.000 ~m1 respectivamente.

697

698 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

retfculo endoplasmático rugoso

núcleo

peroxisomas

lisosomas

mttocondrh1s

brana plasmática realiza todas las funciones dependientes de membrana. como el bombeo de protones, la síntes.is de ATP y la síntesis de lfpidos. No obstante, las células eucariotas ac­tuales tienen una dimensión lineal entre 10 y 30 veces mayor y un volumen entre 1000 y 10.000 veces mayor que una bacteria típica como R. coli. Se podría proponer que la profusión de membranas internas responde en parte a una adaptación a este incremento en tamaño: las células eucariotas tienen una relación entre superficie y volumen mucho menor, de for­ma que probablemente su membrana plasmática es demasiado pequeña para desempeñar la gran cantidad de funciones vitales ligadas a membrana. El extenso sistema de membranas intracelulares de una célula eucariota compensa ese problema.

Como es evidente, la evolución de las membranas internas ha ido en paralelo con la es­peciali7..ación de sus funciones. Consideremos, por ejemplo. la formación de las tll!sfculas ti­/acoidales en los cloroplastos. Estas vesículas se forman durante el desarrollo de los cloroplastos a partir de proplastidios en las hojas verdes de las plantas. Están rodeadas de una doble membrana y se desarrollan de acuerdo con las necesidades de las células diferen­ciadas: por ejemplo, en las células de la hoja se transforman en cloroplastos, pero en otros ti­pos celulares forman orgánulos que almacenan almidón, lfpidos o pigmentos (Figura 12-3A). Cuando se transforman en cloroplastos, se forman regiones de membrana especia­lizadas que se separan de la membrana interna del proplastidio. Estas vesículas forman un nuevo compartimiento especiali7..ado, eltilacoide, que contiene toda la maquinaria fotosin­tética del cloroplasto (Figura 12-3 B).

Otros compartimientos de la célula eucariota se pueden haber formado de una manera conceptualmente similar (Figura 12-4). Las invaginaciones y separación de estructuras in­tracelulares membranosas de la membrana plasmática generan orgánulos con un interior que es equivalente desde un punto de vista topológico al exterior de la célula. Veremos que estas relaciones topológicas existen para todos los orgánulos implicados en las vfas secreto-

Figura 12- 2 Electromicrografía de un.t parte de una cé lula hepática vista en sección transversal. Se señalan ejemr de la mayorla de los principales compartimientos intracelulares. (Por cortesla de Daniel S. Friend.)

MPARTlMENTACIÓN DE LAS C~LULAS

dudlicas. incluyendo el ER, e l complejo de Golgi,los endosomas y los lisosomas. Por :o podemos pensar que todos estos orgánulos son miembros de la misma familia. e describirá en detalle en el próximo capftulo, sus in teriores se comunican emre sí y

exterior de la célula a través de tlf!SícuillS de transporte que emergen por gemación de nulo y se fusionan con otro (Figura 12-5). mo describimos en el Capítulo l4,las rnitocondrias y los cloroplastos difieren de los

org;hulos rodeados de membrana porque poseen su propio genoma. La naturaleza de ·t10ma<; y la estrecha similitud existente entre las proteínas de estos orgánulos y las

rila' bacterias actuales sugiere claramente que las mitocondrias y los cloroplastos 011aron a partir de bacterias que fueron "engullidas" por otra~ células con las que ini­

-...:. ...... llc vivieron en simbiosis (se explica en los Capítulos 1 y 14). De acuerdo con el es-hipotético de la Figura 12-48, la membrana interna de las mitocondrias y de los

'---··'·1ilstos corresponde a la membrana plasmática original de las bacterias, miemras que n de estos orgánulos evolucionó a partir del citoplasma bacteriano. Como podrfa-

"fll::' 1r debido a su origen endocftico, estos dos orgánulos están formados por una membrana y permanecen aislados del extenso tráfico de vesículas que conecta el r d1 la mayoría de los orgánuJos delimitados por mt'mbrana ent.re ~r y con el exterior ·lula.

1 esquema evolutivo descrito anteriormente agrupa los prindpaJes compartimientos ·htlares de la células eucariotac,, en cuatro gmpos: ( 1) el micleo y el citosol, que se ca­

entre sf a través de los complejos de poros nucleares por lo que son topológicamen­tlnuos (a pe~ar de tener funciones diferentes); (2) todos los orgúnulo~ que acllían en

de secreción y de endocitosis, incluyendo el ER. t•l complejo de (,olgi. los endoso­los lisosomas, las numerosa~ clases de vesículas de tr.msportc q ue se desplazan entre

V posiblemente lo'> perox.isomas; (3) las mitocondrias, y (4) los p laslidios (sólo en

proteínas pueden desplazarse entre compartimientos diferentes maneras

·c~ls de todas las proteínas empieza en e l cllosol, excepto las que son simetizadas en [}SOmas de las mitocondrias y de los plastidios. Su de.,tino 'iiguiente depende de su cla de aminoácidos, que puede presentar '>eñales de clac;ificación que dirigen su re-

hrida posiciones fuera del citosol. Muchas proteínas no presentan sei\aJes de clasi­y, en consecuencia, permanecen en el citosol como residentes permanentes. Sin muchas otras tienen seriales de clasificación especfficas que las dirigen desde el

,J hacia e l núcleo, e l EH, las milocondrias. los plastldios o los peroxisomas; las sena­clasificactón también pueden drrigir eltramporte desde el ER hacia otros de<;tinos res. ru entender los principios generales por lo!> que actuan las sen aJes de clasificación, es

ti\ 1te distinguir tres s istemas fundamentales diferentes mediante los cuales las pro­SI desplazan desde un compartimiento a otro. E'>tos tres mecan ismos se describen

(A) (B)

~ proplastidio

699

Figura 12- 3 Desarrollo de los plastidios. (A) En las plantas, los proplastidios son heredados con el citoplasma de las células del huevo. Cuando una célula vegetal inmadura se d1ferencla, los proplastldios se desarrollan de acuerdo con las necesidades de la célula especializada: pueden convertirse en doroplastos (p. ej. en las células de las hojas), en plastldios de almacenamiento que acumulan almodón (p. ej. en los tubérculos de patatal o aceite y gotas de lipidos (p. ej. en las semillas grasas), o cromoplastos que acumulan pigmentos (p. ej. en los pétalos de las flores). (8) Desarrollo del tilacolde. A medida que el doroplasto se desarrolla, unas reg1ones de la membrana especializada se van separando por invaginación de la membrana interna del proplastidio, formando vesículas tilaco1dales que maduraréin convirtiéndose en el tilacoide maduro. La membrana del tilacoide forma un comparto miento separado, el espacio tolaco1dal, que es estructural y funcoonalmen· te diferente del resto del cloroplasto. Los tilacoodes pueden crecer y dividirse de forma autónoma a med1da que el doroplasto prolifera.

membrana externa~

membrana·~ interna

l

proplastídio

familia de plastidios

1 1\ ®~~

rego6n especializada~ de la membrana interna del proplastidio

vesfculas tolacoidales

-r.-·~rdio d m'~-·~

(almacena grasa, aceite o almidón)

crom--1."~~11! '""

(almacena pigmentos)

r- oplasto (realiza la

fotosfntesís) espacio tilacoidal

membrana tolacoidal

l

~ cloropla)to

700 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

(A) complejo de poro nuclear

membrana nuclear interna

DNA

ribosomas unidos a membrana

célula procarlota ancestral

- -núcleo

retículo r endoplasmátíco ...

~J. citosol

célula eucariota primitiva

(B) célula preeucariota anaeróbiCa célula eucariota

aeróbica ancestral

-

p- membrana celular

célula procariota aeróbica

membranas Internas

-

membrana procedente de la célula eucariota

-

mltocondria con doble membrana

más adelante, mostrándose el lugar donde ocurren en la Figura 12-6. En este capítulo des­cribimos con detalle los dos primeros mecanismos y el tercero (flechas uerdes en la Figura 12-6) en el Capítulo 13.

l . En el transporte regulado, las proteínas se desplazan entre el citosol y el núcleo (que son equivalentes en cuanto a su topología) a través de los complejos de poro de la en­voltura del núcleo. El complejo de poro nuclear acrúa como una puerta selectiva que puede transportar de forma activa macro moléculas específicas y complejos macro-

2.

moleculares. aunque también permiten la difusión libre de moléculas pequeñas.

En el transporte transmembrana, unos translocadores proteicos transmembrana dJ­rigen el transporte específico de proteínas a través de la membrana desde el citosol ha­cia un espacio que es topológicamente distinto. Por lo general, la molécula de protefna transportada t:iene que desplegarse para poder deslizarse a través del translocador; de este modo por ejemplo tiene lugar el transporte inicial de determinadas proteínas des­de el citosol hacia el lumen del ERo hacia el interior de las mitocondrias.

ER rugoso

lmembrana

envoltura Interna nuclear membrana

externa

membrana plasmática lisosoma

vesfcula de secreción

complejo de Golgl endosoma

Figura 12-4 Esquema hipotético de lo orlgenes evolutivos de algunos orgán los orígenes de la mitocondria, de lo~. doroplastos, del ER y del núcleo celul.u podrían explicar las relaciones topol6<¡ de estos compartimientos en las célul.o eucariotas.

(A) Una posible vía para la evolución núcleo celular y del ER. En algunas bd< 1

la molécula de DNA única, que contlet• cromosoma bacteriano, está unida a u• Invaginación de la membrana plasmdl Esta invaginación en una célula procaro primitiva podrla haber evolucionado formando una envoltura del DNA, qu• permitirla todavla el acceso del DNA al

citosol celular (como se requiere para 1

slntesis de protefnas). Se supone que,.,, envoltura podrfa haberse separado d membrana plasmática, formándose uP compartimiento nuclear rodeado de una doble membrana.

Como se Ilustra, unos canales de comunicación denominados complejc poro nuclear (NPQ atraviesan la envoh nuclear. Dado que está rodeado por dr membranas que están en contacto y atravesadas por los NPC, el compartiiTI• nuclear es topológicamente equivalenr citosol; de hecho. durante la mitosis el contenido nuclear se mezcla con el Ctt<

Ellumen del ERes continuo con el esp.• entre las membranas nucleares intem,, extema y es topológicamente equival•·• al espacio extracelular (véase Agura 1.'

(B) Parece que las mitocondrias (y lo~ plastidios) se originaron cuando una bacteria fue Incorporada por una célul.• preeucariota de un tamaño mayor. Estt hecho podrla explicar por qué contienr·n sus propios genomas y por qué el lumf'• estos orgánulos se mantiene aislado dc tráfico de membranas que lnterconect.• lumen de muchos otros compartimient Intracelulares.

Figura 12- S Relaciones topológicas entrt los compartimientos de las vfas secretora y endocltica de una célula eucariota. Los espacios topológicamente equivaler se representan en rojo. Los ciclos de gemación y fusión permiten, en princip .. que cualquier lumen se comunique con cualquier otro y con el exterior celular mediante vesículas de transporte. las n.-. azules indican la extensa red del tráfico r1

salida y de entrada de vesículas (se expl" en el Capitulo 13). Algunos orgánulos, especialmente las mitocondrias, y los plastldios en células vegetales, no partlc•t en esta comunicación sino que están aislados del tráfico entre orgánulos tal e que se muestra en la figura.

:OMPARTIMENTACIÓN DE LAS aLULAS

Figura 12-6 •Mapa de carreteras" simplificado del tñfico proteico. Las protelnas pueden desplazarse de un compartimiento a otro por medio de un transporte regulado (en rojo), un transporte transmembrana (en azun o un transporte vesicular (en verde). La información para la organización de las seflales que dirigen el camino de una determinada protelna a través del sistema, determinando su localización en la célula, está contenida en la secuencia de aminoácidos de cada protelna. El viaje comienza con la slntesls de una protelna sobre un ribosoma en el citosol y termina cuando la protelna alcanza su destino final. En cada una de las estaciones Intermedias (recuadros) se toma una decisión respecto a si la protelna será retenida en ese compartimiento o será transportada más allá. En principio, tanto para retener la protelna en el compartimiento como para no retenerla se requiere una seflal de clasificación.

En este capitulo y en el siguiente, se ut ilizará a menudo esta figura como referencia, destacando el color de la vla particular que se analiza en cada momento.

En el transporte vesicular, intermediarios de transporte rodeados de membrana, que pueden ser vesículas de transpone pequeñas y esféricas o fragmentos de orgánulo grandes y de formas irreguJares, conducen proteínas desde un compartimiento a otro. l.ns vesículas de transporte y los fragmentos de orgánulo están cargados de moléculas que se encuentran en ellumen del orgánulo, hasta que geman y se separan de su membrana; entonces descargan su carga en un segundo compartimiento al fusionar-

con la membrana que rodea este compartimiento (Figura 12-7). Por ejemplo, la transferencia de proteínas solubles desde el ER al complejo de Golgi tiene lugar por

te mecan1smo. Dado que las proteínas transportadas no atraviesan la membrana, el transporte vesicular sólo puede transportar proteínas entre compartimientos que son topológicamente equivalentes (véase Figura 12-5).

1\Jr lo general, cada sistema de transporte de proteínas está controlado mediante seña­clasificación presentes en la proteína transportada, que son reconocidas por recepto­'UlSificación complementarios. Por ejemplo, si una proteína grande tiene que ser da hacia el núcleo, debe tener una señal de clasificación que sea reconocida por los

ores de clasificación que la guiarán a través del complejo de poro nuclear. Si una pro­ne que ser transferida de forma directa a través de una membrana, debe tener una

de clasificación en la membrana que sea reconocida por el translocador Del mismo 1 una proteína tiene que ser incorporada a cierto ópo de vesfculas o retenida en cier­nulos, sus señales de clasificación deben ser reconocidas por un receptor comple­o de la membrana apropiada.

cuencias señal dirigen a las proteínas a su destino rcorrecto

.'Orla de sei'lales de clasi.ficación de las proteínas residen en una región continua de la ia de aminoácidos de 15-60 residuos de longitud característicos. A menudo estas ·las señal se encuemran en el extremo N-terminal; una vez se ha completado el pro­cla ,ificación, unas peptJdasas señal especializadas eliminan la secuencia sei'lal de la

En algunos casos, las señales de clasificación están compuestas por varias secuen­rnas de aminoácidos que adoptan una disposición tridimensional característica de

mos de la superficie de la proteína, denominadas una reglón sei\al. :dn secuencia señal especifica un destino particular en la célula. En general, las pro­que están destinadas a ser transferidas al ER tienen, en su extremo N-terminal, se­

señal que en su parte central presentan entre 5 y 10 restos de aminoácidos hidro­Muchas de estas prote(nas pasarán después desde el ER al complejo de Golgi; no

Figura 12-7 Gemación de veslculas y fusión durante el transporte vesicular. Las veslculas aparecen por gemación de un compartimiento (dador) y se fusionan con otro compartimiento (aceptor o diana). En el proceso, determinados componentes solubles (puntos rojos) son transferidos de un lumen a otro. Nótese que la membrana también es transferida y que la orientación original, tanto para las protefnas como para los lfpidos en el compartimiento original, se mantiene en la membrana del compartimiento aceptor. Asl pues, las protefnas de membrana conservan su orientación asimétrica, con los mismos dominios siempre orientados hacia el citosol.

701

CITOSOL

- _~-' NÚCLEO

MITOCONDRIA PLASTOS _j

RETICULO ENDOPLASMÁTICO -=:J .__ __

GOLGI

ENDOSOMA ] TARDIO

LIS OSO MA

TI l VESICULAS 0EJ

SECRECIÓN - ,

ENDOSOMA TEMPRANO

¡- EXTERIOR DE LA CtlULA ~

CLAVE: - • transporte regulado = transporte transmembrana

= transporte vesicular

bicapa lipldica

1 protelna de membrana

FUSIÓN l

COMPARTIMIENTO DADOR

veslcula que se produce por gemación, cuyo contenido va a ser transportado

veslcula de transporte en el citoplasma

702 Capítulo 12: Compart imientos intracelulares y clasificación de proteínas

obstante, las proteínas que presentan en su extremo C-rerminal una secuencia señal deter­minada de cuatro aminoácidos son reconocidas como residentes en el ER y devueltas al mis­mo. Las proteínas destinadas a las mitocondrias tienen secuencias señal de otro tipo, en las que se alternan restos de aminoácidos cargados positivamente con restos de aminoácidos hidrofóbicos. Finalmente, las proteínas destinadas a los peroxisomas tienen una secuencia señal de tres aminoácidos característicos en su extremo C-terminal.

En la Tabla 12-3 se muestran algunas secuencias señal específicas. La importancia que tiene cada una de estas secuencias sei\al en el destino de las proteínas se ha demostrado me­diante experimentos en los que el péptido ha sido transferido desde una proteína a o tra mediante técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, colocando la secuencia señal N-terminal especffica para el ER. al principio de una proteína citosólica, o,e consigue que ahora la proteína se dirija al ER. Por tanto, las secuencias señal son tan necesarias como suficientes para el direccionamiento de las proteínas. Aunque sus secuencias de ami­noácidos difieran en gran medida, las secuencias señal de todas las proteínas que tienen el mismo destino son funcionalmente imercambiables; parece que en el proceso de reco­nocimiento de la señal son más importantes las propiedades frsicas que la propia secuencia de aminoácidos.

Las secuencias o,cñal son reconocidas por receptores de clasificación que guían a las proteínas hacia el destino correcto, donde los receptores se separan de su carga. l.o<, re­ceptare~ actúan de forma catalítica: después dt' completar un ciclo de transpone vuelven a su punto de origen y son reutili7.ados. La mayoría de los receptores de clasificación recono­cen clases de protefnas más que una sola especie proteica. Por lo tanto pueden ser con~i­derados como ~istema~ públicos de transporte dedicados a la entrega de diferentes compo­nentes a su destino correcto de la c(!lula.

En el Pnnel 12-1 se describen los principales métodos utilizados para estudiar cómo se dirigen las proteínas de~dc el citosol a un compartimiento espt•cilico y los mecanismos de su translocación a trav~s de las membranas.

La mayoría de los orgánulos no se pueden construir de novo: necesitan información del propio orgánulo

Cuando una célula se reproduce y se divide, tiene que duplicar sus orgánulos. Nonnalmente las células reali:t.an esta duplicación incorporando nuevas moléculas y, por tanto, agrandán­dolos; entonces. los orgánulos agrandados se dividen y se distribuyen entre las dos cl'lulas hijas. Asf, cada célula hija hereda de su madre un juego completo de membranas celulares especializadas. Esta herencia es esencial ya que una célula no puede fabricar de la nada es­tas membrana-;. Por ejemplo. si se elimina completamente el LR de la célula, ¿de qué rorma puede la célula reconstnlirlo? Como veremos más adelan te, las protefnas de membrana que definen el FR y realiza.n muchas de su"> funciones clave son productos del propio ER. No '>e puede fabricar un nuevo FR sin la exi~tencia previa de un ERo al menos de una membrana que contenga los translocadores necesarios para importar pro ternas esp!.'cfficas hacia el FR

Tabla 12-3 Algunas secuencias señal típicas . ..---

FUNCION DELA SECUENCIA SdAL E.IEMPID DE SECUENCIA sdAL

~Ala ·

Importación al núcleo

Exportación desde el núcleo

Importación a la mitocondria + H1N Met-leu· Ser·leu·Arg-Gin· Ser-lle-Arg-Phe·Phe-L ys-Pro· Ala-Thr·Arq-Thr·leu·Cys·Ser· Ser·Arg-Tyr-leu·leu·

Importación a plastid1os

Importación a los peroxisomas

Importación al ER

Retomo al ER

1 H3N~Met-Vai·Aia·Met·Aia-Met·Aia·Ser-leu-Gin·Ser-Ser-Met·Sf:'r-Ser·leu ·Srr·leu-Ser-Sc'"­

Asn·Ser·Phe-leu·Giy·Gin·Pro·leu·Ser·Pro·lle·Thr-leu·Ser·Pro·Phe·leu·Gin·Giy

-'i~r-Lyo,· ,.CQO •

•H3N-Met-Met·Ser·Phe-Vai·Ser· Gln·Leu·Thr·ly~rCys-· ,: ,,..vai·Phe·Gin-

Asp-Giu- .coo-

.Thr·Giu-Aia ·Giu-

Ln color ~e destacdn algunas de las características de 1~ d1ferentes tipos de ~ecuerxtas señdl Cuando se sabe que tienen Importancia para L1 función de la secul•rlCia señal, los re~iduos de amino.1cidos ca1yddo~ posinvamcnte ~e mueman en rojo y los cargados negativamenre en verde. De man<'r" wníldr, los aminoácidos hidrofóbicos !m pon antes se muestran en blanco y los aminoácidos hidroxilildo~ más Importantes se mueman en a tul. •1 t3N indiCi! el extremo N terminal de Ll proteina y(()() el C.teHn1nal

APROXIMACIÓN POR TRANSFECCIÓN 'ARA DEFINIR SECUENCIAS SEÑAL

manera de demostrar que una secuencia señal es esaria y suficiente para dirigir una proteína hacia compartimiento intracelular determinado, consiste generar una protelna de fusión en la que la ucncia señal se halle unida, mediante técnicas de emeria genética, a una protelna que normalmente de en el citosol. Después de transfectar células con

cnNA que codifica esta protelna, se determina la l •li:aCión de la protelna de fusión mediante

rr .momarcaje o fraccionamiento celular.

""~uencia sei'lal a o b gen que codifica una /'" .,& , proteína citOSÓIICa

A. plásmido utilizado para transfectar células

/ "

" secuencia sei'lal a ( • ) ~lrige la pro teína de 'fusión al organulo A

la secuencia sei'lal b ( • ) d irige la proteína de fusión al orgánulo B

ter ando la secuencia senal mediante mutagénesis rlgida, puede determmarse cuáles de sus racterísticas son importantes para su función.

APROXIMACIÓN GENÉTICA AL MECANISMO OE TRANSLOCACIÓN DE PROTEINAS

aparato de translocación

h1stidinol histidina

~ ­~ ,,_ '--'

enzima en el citosol: - la célula vive sin

necesitar histidina como nutriente

la enz1ma se ha dlngido al ER:

-la célula muere al colocarla en un medio sin histidína

no toda la enzima _se halla en el ER.

la célula vive aunque se coloque en ausencia de h1st1dina

aparato de translocaclón mutante

APROXIMACIÓN BIOQUIMICA PARA ESTUDIAR EL MECANISMO DE TRANSLOCACIÓN DE LA PROTEINA

En este caso, una proteína marcada que contiene una secuencia señal especifica es transportada in vitro al interior de orgánulos aislados. Generalmente la protelna marcada es producida por traducción de un mRNA que codifica la protelna en un sistema libre de células; se utilizan aminoácidos radiactivos para marcar la protelna acabada de sintetizar de forma que pueda distinguirse de las muchas otras proteínas que se hallan presentes en el sistema de traducción in vitro Por lo general, se utilizan tres métodos para determinar si la proteína marcada se ha translocado al orgánulo:

1. La protelna marcada cofracciona con el organulo en una centrifugación.

secuencia ser'lal

_,~ proterna marcada con radiactividad

·@J protelna transportada al orgánulo aislado

3, La protelna esta protegida de la digestión cuando se a naden proteasas al medio de incubacíón, pero es susceptible a ellas si primero se a naden detergentes que rompan la membrana del organulo.

2. La secuencia senal es eliminada mediante una proteasa especifica que se halla en el interior del orgánulo.

incubac1ón sin el orgánulo 1 incubación con el orgánulo

+ . · ~ o. --- 1 1 O"J

& protemas radiactivas sobre gel SOS

e - • .. proteasa • .. .. ••.. .. ' ~ e· , .. ·® ·· ,,.., ., \_. 04J . .. 9.~ 1 J .. . ... , ...... • • " proteína' --~ ... . .. ..

,¡n deiergenÍP

Para estudiar la translocación de protelnas, se utilizan habitualmente células de levadura con mutaciones en genes que codifican componentes de la maqumaria de translocación. Debido a que las células mutantes que no pueden translocar proteínas a través de sus membranas monrán, el truco consiste en diseñar una estrateg1a que perm1ta a1slar las mutaciones que sólo causan un defecto parcial en la translocación de proteínas.

Una estrateg1a consiste en uti lizar la ingenierla genética para disenar células especiales de levadura. Por ejemplo, la enzima histidinol deshidrogenasa reside normalmente en el citosol, donde es necesaria para producir el aminoácido esencial histidina a partir de su precursor histidinol. Se construye una cepa de levadura en la que el gen de la histidinol reductasa está sustituido por un gen modificado de forma artificia l para que codifique una proteína de fus1ón con una secuencia señal extra que dirige la protelna al interior del ret~eulo endoplasmátiCO (ER) Cuando estas células se hacen crecer en ausencia de histidina, mueren debido a que toda la histidinol deshidrogenasa está secuestrada en el ER, donde no es funcional. Sin embargo, las células con mutaciones que inactivan parcialmente el mecanismo de translocación de las proteinas desde el citosol al ER sobrevivirán debido a que habrá suficiente cantidad de deshidrogenasa retenida en el citosol para producir la histidina necesaria.

A menudo se obtienen células en las que la protelna mutante de la maquinaria de translocaci6n todavla actúa de forma parcial a temperatura normal pero que es completamente inactiva a temperaturas elevadas. Una célula que transporte una de estas mutaciones sensibles a la temperatura muere a temperat uras elevadas, tenga o no histidina, ya que no puede transportar ninguna protelna al ER. Este hecho permite identificar el gen normal que fue modificado por la mutación, mediante la t ransfección de la célula mutante con un vector plasmldico de levadura en el que se han clonado fragmentos al azar de DNA gen6m1eo: el fragmento especifico de DNA que recupera la célula mutante cuando se hace crecer a una temperatura elevada será el que codifica la versión salvaje del gen mutante.

704 Capitulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proternas

desde el citosol (incluyendo a los propios translocadores específicos del ER). Lo mismo es válido para mitocondrias, plastidios y peroxisomas (véase la Figura 12-6).

Así, parece que la información necesaria para construir un orgánulo no reside exclusi­vamente en el DNA que especifica las proteínas del orgánulo. También se requiere la infor­mación en forma de al menos una proteína característica de cada una de las proteínas de membrana del orgánulo; esta información es transmitida desde la célula progenitora a las céluJas de la progenie en forma del propio orgánulo. Probablemente esta información es esencial para la propagación de la organización celular en compartimientos, al igual que la información del DNA es esencial para la propagación de las secuencias celulares de nucleó­tidos y de aminoácidos.

Sin embargo, como se expone con mayor detalle en el Capítulo 13, el ER produce de for­ma constante una corriente de vesfculas de membrana que sólo incorporan un subconjun­to de proteínas del ER. por tanto con una composición diferente a la del propio ER. De manera similar, la membrana plasmática constantemente produce varios tipos de vesículas endodticas especializadas. De este modo, se pueden formar algunos orgánulos a partir de otros orgánulos y no es necesario que se hereden en el proceso de división celular.

Resumen

Las células eucariotas concienen membranas intracelulares que encierran casi la mitad de su volu­men total en compartimientos intracelulares individualizados llamados orgánulos. En todas las cé­lulas eucarioras, los principales tipas de orgdnulos son el retfculo endoplasmdtico, el complejo de Golgi, el mícleo, las mitocondrias, los lisosomas, los endosomas y los peroxisomas; las células vege­tales además contienen plastídios, como por ejemplo los cloroplastos. Cada orgdnulo contiene pro­reinas caracteristicas que desarrollan sus funciones caracteristicas.

Cada nueva protefna de un orgdnulo debe encontrar su camino desde el ribosoma donde ha si­do sintetizada hasta el orgánu/o donde actuard. Lo consigue siguiendo una vla especfjica, guiada por sena les de clasificación que se encuentran en su secuencia de aminoácidos y que actúan como secuencias señal o como regiones señal. Las secuencias serlal son reconocidas por receptores de clasi­ftcaciótl complememarios que entregan la protefna en/os orgdnulos de destino. Las protefnas que actúan en el citosol no presentan secuencias o regiones señal y, por lo tanro, pennanecen en el cito­sol después de ser sintetizadas.

Durante la división celular. los orgdnulos como el ER y la mitocondria se distribuyen intactos entre las células hijas. Estos orgánulos contienen infonnación necesaria para su construcción, lo que impide que puedan reconstruirse de novo.

TRANSPORTE DE MOLÉCULAS ENTRE EL NÚCLEO Y ELCITOSOL La envoltura nuclear encierra el DNA y defme el compartimiento nuclear. Esta envoltura es­tá formada por dos membranas concéntricas que están perforadas por complejos de poro nuclear (Figura 12-8). A pesar de que la membrana nuclear interna y la externa son, de hecho, un continuo, presentan una composición proteica diferente. La membrana nuclear Interna contiene proteínas que actúan como lugares de anclaje específicos de la cromatina y de la lámina nuclear; una red proteica que aporta soporte estructural a la envoltura nu­clear. La membrana nuclear interna está rodeada por la membrana nuclear extem.a, que es continua con la membrana del ER. Como en el caso de la membrana del ER (trataremos de ella posteriormente), la membrana nuclear externa está tapizada por ribosomas que realizan la síntesis de proteínas. Las proteínas producidas por estos ribosomas son transportadas al espacio que queda entre las membranas nuclear interna y externa (el espacio perinuclear), el cual, a su vez, es continuo con el lumen del ER.

Existe un tráfico bidireccional continuo entre el citosol y el núcleo. La gran cantidad de protefnas que actúan en el núcleo -que incluye las histonas, las DNA y RNA polimerasas, las protefnas reguladoras de genes y las proteínas de procesamiento del RNA- son importa­das de forma selectiva desde el citosol, donde son fabricadas, hasta el compartimiento nu­clear. Al mismo tiempo, los tRNA y los mRNA son sintetizados en el compartimiento nuclear y luego son exportados al citosol. Al igual que el proceso de importación, el proceso de expor­tación también es selectivo; por ejemplo, los mRNA sólo son exportados si han sido modifi-

CITOSOL

"l ¡·/ ¡1 _J NÚCLEO . f PEROXISOMAS

MITOCONDRIA 1 .J_;,

[ PLASTOS

0

"""} c=n= L. RET[CULO ENOOPLASMÁTI~

J GOLGI

~ '<.. Z

ENOOSOMA 'vES[CULAS DE TARD[O SECRECIÓN

~J f¡ i~ l l UsOSO~ u >

[ENDOSOMA TEMPRANO

~ t L EXTERIOR DE LA a LuLA

tRANSPORTE DE MOL~CULAS ENTRE EL NÚCLEO Y EL CITO SOL

u~ de forma correcta en el núcleo por reacciones de procesamiento de RNA. En algunos 1-;, el proceso de transporte es complejo. Por ejemplo, las proteínas ribosomales son fa­adas en el citosol e importadas al núcleo, donde se ensamblan con RNA ribosomales re­

n fabricados formando partlculas. Estas partfculas son exportadas de nuevo al citosol mle se ensamblan formando los ribosomas. Cada uno de esms pasos implica w1 trans­·rtc selectivo a través de la envoltura nuclear.

los complejos de poro nuclear atraviesan la envoltura nuclear

tudas las células eucariotas, la envoltura nuclear está perforada por elaboradas estrucru­conocidas como complejos de poro nuclear (NPC: nuclear pore complexes). En las célu­nnímales cada NPC tiene un peso molecular estimado de 125 millones de dalton y está

ado por unas 30 proteínas diferentes o mteleoporinas, ordenadas según una sorpren­ntc ~imetrfa octogonal (Figuras 12-9).

La envoltura nuclear de una célula Lfpica de mamífero contiene entre 3000 y 4000 NPC ·!tráfico que pasa a través de cada NPC es enom1e: cada NPC puede transportar más de

macromoléculas por c;egundo y en ambos sentidos simultáneamente. No sabemos có­puede coordinar el llujo de macromoléculas en ambos sentidos para evitar atascos y co­'11!! frontales. Qtda NPC contiene uno o más pasos acuosos a través de los cuales pueden difundir pa­mente pequeñas moléculas solubles en agua. Los investigadores han determinado que

tanuño efectivo de estos pasos inyectando en el citosol moléculas marcadas solubles en n dr· diferentes tamaños y midiendo luego la velocidad de difusión hacia el núcleo. Las ~éo1las pequeñas (5000 dalton o menos) d ifunden con tanta rapidez que podemos con­mr que la envoltura nuclear es Libremente permeable a ellas. Sin embargo, las proteínas

mayor tamaño atraviesan los NPC con mucha más lentitud; cuanto mayor es una protef­mds lentamente atraviesa los NPC. Las proteín as mayores de 60.000 dalton apenas pue­entrar en el núcleo por difusión pasiva. Parece que este tamaño Urnite para la difusión nde de la estructura de los NPC (Figura 12-1 O). Muchas proteínas NPC que recubren el

•ro central sólo contienen regiones desestructuradas que parecen forma.r un laberinto de­itdcnado (semejantes a un banco de algas en el ma.r), bloqueando el paso de macromolé­

grandes pero dejando pequeños orificios que permiten la difu'>ión de las moléculas ,ucñas, Dado que muchas proteínas celulares son demasiado grandes para difundir de forma tila través de los NPC, el compartimiento nuclear y el citosol pueden mantener diferen­onjuntos de protefnas. Por ejemplo, los ribosomas citoplasmáticos maduros tienen un

metro de unos 30 nm, por lo que no pueden difundir a través de los NPC de fom1a que la tl."'ls proteica quedará confinada en el citosol. Pero ¿cómo importa el núcleo las grandes .J~ulas que necesita, como las DNA y las RNA polimerasas cuyas subunidades tienen pe-moleculares de entre 100.000 y 200.000 dallon? Como explicaremos más adelante, éstas ud1as otras moléculas de proteína y de RNA se unen de forma especffica a proteínas re­toms que los transportan activamente través de los NPC.

s proteínas nucleares son dirigidas hacia el núcleo mediante 1'1ales de localización nuclear

,ndo las protefnas son experimentalmente extraídas del núcleo y reintroducidas de nue­·n ('! citosol, incluso las más grandes se vuelven a acumular en el núcleo de una forma eli­te. Ciertas señales de clasificación denominadas señales de localización nuclear son las

ns 1bles de este proceso de importación activo al núcleo. Estas señales se han definido p1 ·'Cisión utilizando la tecnología del DNA recombinante en numerosas proteínas y en

td 1.1s que sólo entran en el núcleo de forma transitoria (Figura 12-11). En muchas pro­las señales consisten en una o dos secuencias cortas, ricas en los aminoácidos carga­

p<:·~itivamente lisina y arginina (véase Tabla 12-3, p. 702), con una secuencia precisa rente de la de otras proteínas nucleares. Otras prote(nas nucleares tienen señales dife­

illgunas de las cuales todavía no se han caracterizado . . ~señales de localización nuclear se localizan en casi en cualquier lugar de la secuen-1minoácidos y parece que forman asas o parches en la superficie de las protefnas. ~de ellas actúan incluso cuando se unen como péptidos cortos a las cadenas latera-

705

nuclear envoltura externa nuclear membrana l

membrana

nuclear ntema membrana del ER

espacio perlnuclear

' poros nucleares

Figura 12-8 La envoltura nuclear. La doble membrana de la envoltura está atravesada por poros en los que se encuentran los NPC y es continua con el retlculo endoplasmátlco. No se muestran los ribosomas que normalmente se hallan unidos a la cara cltosólica de la membrana del ER y en la

membrana externa del núcleo. La lámina nuclear es una red fibrosa que recubre la membrana nuclear Interna.

706 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de protelnas

(A)

citosol

núcleo

(0

fibrilla cítosólica

1 . IJ lamina

nuclear

~nasta nuclear ,¡

fibrilla nuclear

membrana nuclear eiCterna

CITOSOL

membrana nuclear interna

7'! 1 1

J envoltura nuclear

comple¡os de poro nuclear

(D) 0, 111m

Flgura 12-9 Disposición de los complejos de los NPC en la envoltura nuclear. (A) Esquema que muestra una pequena región de la envoltura nuclear. En uN sección transversal. el NPC parece estar formado por cuatro elementos: las subunidades en forma de columna, que forman el grueso de la pared del poro; l.t subunidades anulares, ubicadas en el centro; las subunldades luminales, que contienen protelnas transmembrana que anclan el complejo de poro a la membrana nuclear, y las subunidades del anillo, que forman las caras citosólica y nuclear del complejo. Además, existen fibrillas que sobresalen tanto desde la cara citosólica como desde la cara nuclear del NPC En la parte nuclear, las fibrillas convergen formando estructuras en forma de cesta. Estudios de mmunolocalización en microscopia electrónica muestran que las proteínas que forman el núcleo del NPC se orientan simétricamente a través de la envolturl nuclear de forma que las caras nuclear y otosóllca parecen idénticas. Por el contrario, las protelnas que forman las fibras son diferentes en el lado citosólico y el nuclear de los NPC. La slmetrla de ocho unidades centrada en un punto y de dos unidades centrada en un plano del núcleo de los NPC explica cómo puede formarse una enorme estructura con sólo unas 30 protelnas d1ferentes, ya que muchas de estas protelnas estan presentes 16 coplas (o múltiplos de 16). Los dominios desordenados del núcleo de las protelnas se extienden hacia el centro de los NPC (no mostrado), bloqueando la difusión pasiva de las grandes macromoléculas. (B) Una electromicrografla de barrido de la cara nuclear de la envoltura nuclear de un oocito (v~ase tamb1én la Flgura 9 SS). (C) Electromicroscopla de una sección ultrafina, en la que se muestra una vista lateral de dos NPC (corchetes), obsérvese que el interior y el exterior de las membranas nucleares son continuos en los bordes de los poros. (O) Esta electromlcrografia muestra una Imagen frontal de NPC tenidos negativamente. Se ha eliminado la membrana mediante extracción con detergentes. Obsérvese que algunos de los NPC contienen matenal en el centro; se cree que son macromoléculas en tránsito por estos NPC. (B, de M.W. Goldberg yT.D. Allen, J. Ce// Biol .. 119:1429-1440, 1992. Con la autorización de The Rockefeller Universlty Press; C, cortesla de Werner Franke y Ulrich Scheer; O, cortesía de Ron M1lligan.)

le~ de lisina de la superficie de proteínas citosólicas,lo que sugiere que la localización preci­sa de la señal dentro de la secuencia de aminoácidos no es importame. Además, mientras una de las subunidades de un complejo fonnado por muchos componentes presente una ser'lal de localización nuclear, todo el complejo será importado al núcleo.

L_ ___J

50 nm

•

tama"o de las moléculas que entran en el núcleo por d1fusión libre

tama"o de las macromoléculas que entran en el núcleo mediante transporte activo

Figura 12- 1 O Un modelo para la difusión regulada por barrera del NPC. El dibujo muestra una vista lateral de un NPC. Las reglones desestructuradas de las proteínas que revisten el poro central forman una marana, que bloquea la difusión pasiva de las grandes macromolkulas. Sin embargo, durante el transporte activo pueden pasar por el NPC incluso partlculas de hasta 39 nm de diámetro.

NSPORTE DE MOLI~CULAS ENTRE EL NÚCLEO Y EL CITOSOL

l.IZAOÓN DEL ANTIGENO T QUE PRESENTA ~Al DE IMPORTACIÓN NUCLEAR NORMAL

(B) LOCALIZACIÓN DEL ANTIGENO T QUE PRESENTA SU SEÑAL DE IMPORTACIÓN NUCLEAR MUTADA

Pro Pro Pro Val-

Podemos visuali7.ar el transporte activo de proteínas nucleares a través de los NPC re­>riendo partículas de oro coloidal con una señal de localización nuclear, inyectando estas tfculas en el citosol y siguiendo su destino mediante la técnica de microscopfa electróni­l:tgura 12- 12). Eltran~porte empieza cuando las panfculas se unen a unas fibrillas se­ntes a tentáculos que sobresalen hacia el citoplasma desde el borde del NPC y de~pués

11roduce por el centro del NPC. Probablemente las regiones de~estructuradas de las pro­del NPC, que forman una barrera a la difusión de las grandes moléculas (que ya he­

mencionado), se separan y permiten que la partfcula de oro pase a su través m transporte de macromoléculas a través de los NPC se diferencia del transporte de

tdnas a través de las membranas de otros orgánulos en que ocurre a través de un gran 'nruoso en lugar de a través de un transportador proteico que atraviesa una o más bica-llpfdicas. Por e~ta razón, a través de los NPC se pueden transportar las protefnas nu­rcs plegadas por completo y las subunidades de los ribosomas son transportadas hacia

tlt·l míe leo en forma de partfculas ensambladas. Por el contrario, para poder ser trans­tlas a otros orgánulos,las proteínas tienen que estar desplegadas en su totalidad, como

mos más adelante. Sin embargo, imágenes de microscopfa electrónica de partlculas grandes atravesando los NPC parecen indicar que estas partfculas o;e comprimen a me­

JJ que pasan por el poro, lo cual indica que se reestructuran durante el transporte. Como '!escribe en el Capftulo 6, la exportación de algunos mRNA muy grandes se ha observado detalle (véase la Figura 6-39).

10S receptores de importación nuclear se unen tanto a señales localización nuclear como a proteínas NPC

que se inicie el tmnsportc hacia el núcleo, mucha-. secuencias de localización nuclear 11 de ser reconocidas por receptores de importación nuclear, codificados por una familia

ncs relacionados entre sr. Cada uno de los miembros de esta familia codifica una pro­receptora que está e&peciali7.ada en el transporte de un subconjunto de proteínas de

h s que contienen señales de locali.zación nuclear a las que se puede unir dicho re­'tor (Hgurn 12-13A). Los receptores de importación son proteínas cito&ólicas soluble~ que se unen tanto a

11encias de localit.ación nuclear de la proteína que va a ser transportada como a pro-.s NPC, alguna!> de las cuales fom1ru1 las fibriUas que se imroduccn en el citosol. Estas fi-

las y muchas otras proteínas NPC, que recubren el centro del NPC y contribuyen a r la barrera de difusión, incluyen un gran número de cortas secuencias repetidas de

noác1dos ricos en fenilalanina y glicina, por lo que se denominan repeticiones FG (a par­Jcl código de una letra de los aminoácidos, que se describe en el Capftulo 3). Las repeti­ucs FC. actúan como lugares de unión de los receptores de importación. Se cree que rcan el camino que siguen a través del NPC los receptores de importación y las proteínas · trnnsportan. Estos complejos receptor-carga se desplazan a través de la vía de transpor­

mcdíante ciclos repetidos de unión, disociación y nueva unión, a secuencias FG repetidas centes. De esta forma, los complejos saltan de una protefna NPC a otra para atravesar el r nllco interior del NPC. Una vez en el interior del núcleo, los receptores de importación p.tran de su carga y vuelven al citosol. 1 o~ receptores de importación no siempre se unen directamente a las proteínas nu­rr.l En ocasiones participan proteínas adaptadoras adicionales que forman un puente

707

Figura 12-1 1 Función de una señal de localización nuclear. Micrograflas obtenidas por lnmunofluorescencia que muestran la localización en la célula del antlgeno T del SV40 conteniendo o no una corta secuencia que actua como señal de localización nuclear. (A) La forma normal de la protelna del antlgeno T contiene la secuencia rica en lislna que se Indica y que es Importada a su lugar de acción en el núcleo, como se demuestra mediante una tlnción inmunofluorescente con anticuerpos contra el antlgeno T. (8) SI el antlgeno T presenta una señal de localización nuclear alterada (una treonlna que reemplaza a una lislna) permanece en el cltosol. (De D. Kalderon, B. Roberts, W. Richard son y A. Smlth, Ce// 39:499-509, 1 984. Con la autorización de Elsevier.)

envoltura nuclear 4

(~) nucleo citosol

Figura 12 12 Observación de la importación activa a través del NPC.

100 nm

Esta serie de electromlcrograflas muestra esferas de oro coloidal (puntas de flecha) recubiertas con péptidos que contienen señales de localización nuclear entrando en el nudeo a través de los NPC. Las partlculas de oro coloidal se inyectaron en el Interior de células v1vas, que fueron fijadas y preparadas para ser estudiadas con el m1croscoplo electrónico a varios tiempos después de la Inyección. (Al Las partículas de oro se ven primero en la proximidad de las fibras citosólicas del NPC. (B, C) Después migran hacia el centro de los NPC, donde primero sólo se ven en la cara citosólica. (0) Posteriormente aparecen en la cara nuclear. Estas partículas de oro coloidal tienen un diámetro mucho mayor que el canal de difusión del NPC y deben ser transportadas mediante transporte activo. (De N. Pantéy U. Aebl, Science 273:1729-t732, 1996. Con la autorización de AAAS.)

708 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

protefna 1 proteina 2 protefna 3 a transportar a transportar a transportar

receptor de (A) Importación nuclear

señales de localización nuclear

receptor de imnnrt;~riñr

protefna adaptadora (B) de Importación nuclear

entre el receptor de importación y la proteína que va a ser transportada (Figura 12-136). Algunas protefnas adaptadoras están relacionadas estructuralmente con los receptores de importación, lo que sugiere un origen evolutivo común. Utilizando varios receptores de im­portación y proteínas adaptadoras diferentes, las células reconocen el amplio repertorio de secuencias de localización nuclear que presentan las pro temas nucleares.

la exportación del núcleo funciona como la importación, pero en el sentido opuesto

La exportación nuclear de grandes moléculas, tales como las subunidades ribosomales y las molécuJas de RNA, se realiza a través de los NPC, y también depende de un sistema selecti­vo de transporte. El sistema de transporte se basa en la presencia de señales de exportación nuclear en las moléculas a exportar, as( como en la existencia de receptores de exporta­ción nuclear complementarios. Estos receptores se unen a las señales de exportación y a las proteínas del NPC, gujando su carga a través del NPC hasta el citosol.

Muchos receptores nucleares de exportación están relacionados estructuralmente con los receptOres de importación al núcleo y están codificados por la misma familia génica de receptores de c:ransporte nuclear, o carioferinas. En la levadura hay 14 genes que codifican miembros de esta familia; en las células arumales, el número es significativamente superior. A partir de su secuencia de ammoácidos no es posible deducir s i un miembro de esta fami­lia génica actúa corno receptor de importación o de exportación nuclear. Como era de espe­rar, por Jo tanto, los s istemas de transporte en la importación y en la exportación actúan de manera similar pero en sentido opuesto: los receptores de importación se unen a su carga en el citosolliberándola en el núcleo y son exportados hacia el citosol para su reutilización, mientras que los receptores de exportación funcionan de manera opuesta.

la GTPasa Ran impone una direccionalidad en el transporte a través de los NPC

La importación de las proteínas nucleares a través de los NPC concentra determinadas pro­teínas en el núcleo y aumenta asf el orden en la célula. La céluJa obtiene la energía necesaria para este proceso a través de hldrólisis de GTP por la GTPasa monomérica Ran. Ran se en­cuentra tanto en el citosol como en el núcleo, y es necesaria para la importación y para la ex­ponación nuclear.

Como otras GfJ>-asas, la proteína Ran es un interruptor molecular que existe en dos es­tados conformacionales, dependiendo de sj está u.njda a GDP o a GTP (se describe en el CapftuJo 3). Dos prorefnas reguladoras específicas de Ran disparan la transformación entre estos dos estados: una protelna citosólica activad ora de GTPasa (GAP: GTPase activating protein), que induce la hidróUsis de GTP convirtiendo Ran-GTP en Ran-GDP. y un factor nuclear intercambiador de guanina (GEF: guanine exchange factor) que activa el intercam­bio de GDP por GTP convirtiendo Ran-GDP en Ran-GTP. Dado que Ran-GAP se localiza en el citosol y Ran-GEF en el núcleo, el citosol contiene sobre todo Ran-GDP y el núcleo Ran-GTP (Figura 12-14).

Este gradiente de las dos formas conformacionales de Ran dirige el transporte nuclear en la dirección apropiada (Figura 12-15). Por ejemplo, la unión de los receptores de impor­tación a las repeticiones FG en la cara citosólica del NPC, se produce tanto cuando el recep­tor está unido a su carga como cuando está libre. Los receptores de importación saltan tle una repetición FG a otra. Si alcanzan la cara nuclear del complejo de poro, Ran-GTP se une

Figura 12-13 Receptores de Importación al núcleo. (A) Muchos receptores de Importación nuclear se unen tanto a los Nf como a las secuencias de localización nud sobre las protelnas que son transportadas 1 este ejemplo, las protefnas transportadas 1

y 3 contienen diferentes señales de localización nuclear y, por lo tanto, se unen a diferentes receptores nucleares de importación. (B) la proteína transportada ·1

precisa de una protelna adaptadora para unirse a su receptor de Importación nuciP.II Los adaptadores están relacionados desdP ' punto de vista estructural con los recepto" de importación nuclear y reconocen señ .. l• de localización nuclear en protelnas a transportar. También contienen señales do localización nuclear que les permiten unir' a un receptor de Importación.

N S PORTE DE MOL~CULAS ENTRE EL NÚCLEO Y EL CITOSOL

Ran·GDP 1

Ran-GAP

CITOSOL

Ran-GEF _JIIJ_

Ran-GTP l "=j"' ~· si llegan cargados con alguna molécula, la unión de Ran-GTP hace que los recepto­hnponaci6n liberen su carga (Figura 12-16). Dado que en el citosol Ran-GDP no se

a lo~ receptores cargados, la descarga únicamente se produce en la cara nuclear de los 1 le t'sta forma, la localización nuclear de Ran-GTP da lugar a la direccionalidad.

Una ve~. que se libera la carga en el núcleo, el receptor de importación vacfo unido a 1 rP es devuelto al cirosol a través del comple¡o de poro. Allí, Ran-GAP acriva a Ran-GTP hídrolice el Gn) al que está unido, transfom1ándose en Ran-GDP: emonces. el recep­lmportación está de nuevo l.isto para otro ciclo de imponación nuclear.

1~1 t'xportación nuclear se realiza mediante un mecanismo similar, excepto que GTI' en el núcleo favorece la unión de la carga a los receptores de exportación en lugar ,ociarlos de ella. Cuando el receptor de exponación se desplaza a tra\'és del poro hacia ,ol, su Ran-GTP encuentra una Ran-GAP e hidroliza su GTP. Como resultado de ello, el

tor de exportación libera su carga y la Ran-GDP en el cito~ol. Los receptores de expor­\~lcíos son devueltos entonces al núcleo y completan el ciclo (véase la Figura 12-15).

transporte a través de los NPC se regula controlando cceso a la maquinaria transportadora

;tS protefnas, como las que se unen a los mRNA recién sintetizados en el mkleo, pre­n mnto seilales de localización nuclear como seriales de exportación del núcleo. Estas

protelna con serial de localización nuclear (carga)

SEPARACIÓN DE Ran-GDP~ carga liberada en el cltosol DE LOS RECEPTORES ...

recept-or de receptor .de S ~ 1mponación exportación nuclear nuclear /

r{an·GDP ~ ~7 _ftf "': • •n-GDP

\ ..-r p

-~ .!. ) ( ~e::

carga liberada en el núcleo

IMPORTACIÓN NUCLEAR

~ -'""G'~"

... protefna con serial de

exportación nuclear (carga)

EXPORTACIÓN NUCLEAR

709

Figura 12-14 La compartimentación de Ran-GDP y Ran-GTP. La localización de Ran-GDP en el citosol y de Ran-GTP en el núcleo es consecuencia de la localización de dos proteínas reguladoras de Ran: la proteína activadora de la actividad GTPaXI de Ran (Ran-GAP) que se localiza en el citosol, y el factor intercambiador de guanina de Ran (Ran-GEFJ, que se encuentra unido a la cromat1na y que, por lo tanto, se encuentra en el núcleo.

Figura 12- 15 Modelo que explica cómo la hidrólisis de GTP por Ran en el citosol dirige el transpone nuclear. El desplazamiento, a través del NPC, de receptores de transporte nuclear cargados se produce a lo largo de las repeticiones FG que presentan ciertas protelnas NPC. La localización diferencial de Ran-GTP en el nucleo y de Ran-GDP en el citosol aporta direccionalldad (flechas rojas) tanto a la importación nuclear (izquierda) como a la exportación nuclear (derecha). Ran-GAP estimula la hidrólisis de GTP para producir Ran-GDP en el lado citosólico del NPC (véase la Figura 12- 14).

Ran-GDP es Importado al núcleo por su propio receptor de importación, especifico para la conformación de Ran unida a GDP. El receptor Ran-GDP no está relacionado estructuralmente con las principales familias de receptores de transporte nuclear. Sin embargo, también se une a repeticiones de FG en protelnas de NPC y salta al otro lado del NPC.

71 O Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de protefnas

protelna carga

\

, Ran·GTP

Ran·GTP -J DESCARGA

lugar de unión protefna

carga liberada -\ de las protefnas -carga

(A)

receptor de importación

(B)

proteú1as se desplazan de forma constante entre el núcleo y el citosol. La distribución en un momento dado de estas protefnas lmiUUiem dependerá de la relación entre sus velocidades de exportación y de importación al núcleo. Si la velocidad de importación es superior a la de exportación, se encontrarán sobre todo en el núcleo. Por el contrario, si la velocidad de ex­portación supera a la de importación, se encontrarán fundamentalmente en el citosol. Asf pues, cambios en las velocidades de importación, de exportación o de ambas cambian la lo· calización de la proteína.

Al&runas protemas lanzadera se desplazan de forma constante hacia dentro y fuera del núcleo. En otros casos, sin embargo, su transporte está estrictamente comrolado. Como se describe en el Capftulo 7, las células controlan la actividad de algunas proteínas de regula· ción génica manteniéndolas fuera del núcleo hasta que son necesarias en dicho comparti· miento (Figura 12-17). En muchos casos, las células controlan el transpone regulando las señales de localización y de exportación nucleares; éstas pueden ser activadas o inactivadas, mediante fosforilación de aminoácidos cercanos a las secuencias seiial (Figura 12- 18 ).

Otras protemas de regulación génica se unen a protefnas citosólicas inhibidoras que las retienen en el citosol (probablemente mediante interacciones con el citoesqueleto o con or­gánulos especfficos) o enmascaran sus seiiales de localización nuclear impidiendo que inte­ractúen con los receptores de importación nuclear. Un esúmulo apropiado libera la pro tema de regulación génica de su anclaje citosólico o de la protefna que lo enmascaraba, por lo que ahora será transportada al núcleo. Un ejemplo importante al respecto es la proteína regula­dora latente que controla la expresión de los genes implicados en el metabolismo del coles­terol. La protefna es producida y almacenada en una forma inactiva como una proteína transmembmna en el ER. Cuando se produce una carencla de colesterol, la protema sale del ER hasta el complejo de Golgi, donde cncuentm tmas proteasas específicas que la cortan y li­beran su dominio cltosólico en el citosol. Este dominio es importado al núcleo donde activa la transcripción de genes necesarios tanto para la adquisición de colesterol como para su síntesis.

Como se explica con detalle en el Capfrulo 6, las células controlan la exportación del mRNA desde el núcleo de una manera similar. Las proteínas que guían el mRNA hasta el ex­terior del núcleo se cargan sobre el RNA de forma que tiene lugar su síntesis y su madura­ción. Una vez alcanzan el citosol, las proteínas se separan del RNA y vuelven rápidamente al núcleo. Otros RNA, como los snRNAy los tRNA, son exportados por diferentes receptores de exportación nuclear.

Agura 12- 17 Control del transporte nuclear en el embrión de la mosca. La protefna reguladora génica dorsal se expresa uniformemente en todo este embrión temprano de Drosophila, que se muestra en una sección transversal. La protefna ha sido teñida con una enzima acoplada a un anticuerpo que da lugar a un producto marrón. Sólo es activo en las células del lado ventral (abajo) del embrión, donde se encuentra en el núcleo. (Cortesla de Siegfried Roth.)

CARGA

r-

sel'lal de localízación nuclear

Ran-GDP liberado

Figura 12- 16 La unión de Ran-GTP pued• provocar la liberación de la carga por el receptor de Importación. (A) Estructura de los receptores de transporte nuclear que unen Ran-GTP Los receptores están formados por mot1vos hellcoidales a repetidos que se agrupan uno encima d1 otro, formando estructuras flexibles en forma de arco, que pueden adoptar varia· conformaciones en respuesta a las prote1n de carga o a Ran-GTP. Obsérvese que las protefnas de carga y Ran-GTP se unen a v regiones diferentes del arco. Ran-GTP est.• recubierto parcialmente por un bucle conservado (rOJO) del receptor, que se en· que es Importante para la unión de la carq cuando el receptor no está unido a Ran. (B) Ciclo de carga en el citosol y de desear•¡ en el núcleo de un receptor de importacio• nuclear. (A, adaptado de V.M. Chook y G. Blobel, Nature 399: 230.237, 1999. Con 1 ••

autorización de Macmíllan Publishers Ltd

1SOJ.1m

NSPORTE DE MOLÉCULAS ENTRE EL NÚCLEO Y EL CITOSOL

calclneurína (protelna ..... fosfatasa) ~ p • P P

~ célula T acttvada ~ NF-AT

(

crTosoL E) = E ~ NÚCLEO señal de

exportación ~ , nuclear expuesta :"'~¡ / .

baja (Ca2'1 en la \

F? ATP + proteína l

señal de importación nuclear

quinasa activa ACTIVACIÓN DE LA

TRANSCRIPCIÓN G~NICA

nvoltura nuclear se desorganiza durante la mitosis

~111lna nuclear, localizada sobre la cara nuclear de la membrana nuclear interna, es una

dr sub unidades proteicas interconectadas. denominadas laminas nucleares. Las lami­lif•ll un tipo especial de filamentos intermedios (descrito en el Capftulo 16) que poli­

'.llll formando una red b idimensional (Figura 12-19). La lámina nuclear da forma

hilidad a la e nvoltura nuclear, a la cual se halla anclada por la unión de los NPC y pro­integrales de membrana de la membrana nuclear interna. La lámina también inte-

iona directamente con la cromatina, que a s u vez lo hace con proteínas integrales de la bmna nuclear in tema. Junto con la lámina, estas protefnas inlernas de membrana ac­

l'orno unión estructural entre el DNA y la envoltura nuclear. Cuando el núcleo se desorganiza durante la mitosis, la lámina nuclear se despolin1eriza.

''"amblaje es debido, a l menos parcialmente, a la fosforilación directa de las laminas

ar,•s por acción de la quinasa dependiente de ciclina Cdk que es activada al inicio de la ls ¡descrito en el Capflu lo 16). Al mis mo riempo, diferentes protefnas de la membrana

.r interna son fosfor iladas y los NPC se desensamblan y se dispersan por el citosol.

nt·~ e~te proceso algunas protefnas NPC se unen a los receptores de importación nu­, que desempeñan un papel importante en el reensamblaje de los NPC al final de la mi­

. l.ns protefnas de membrana de la envoltura nuclear -que ya no están unidas a los 'piejos de poro, cromatina o lámina nuclear- se dispersan a través de la m embrana del l.n pro terna motor dinefna, que se desplaza a lo largo de los microtúbulos (se describe en

pftulo 17), participa de forma activa en separar la envoltura nuclear de la c romatina. En mto. estos procesos rompe n las barreras que normalmente separan el núcleo y el c ito­

ie forma que las proteínas nucleares. que ya no están unidas ni a las me mbranas ni a los 10somas, se diluyen en el citosol de la célu la en división (Figura 12- 20).

Al final de la mitosis, la envoltura nuclear se reorgani1..a sobre la superficie de los ero­m cs. Además d e su papel cnrcial e n e l transporte nuclear, Ran-GTPasa también actúa

rnJrcador posicional para la cromatina durante la división celular, cuando los compo­. del núcleo y del citosol están mezclados. Dado que Ran-GEF permanece unida a la

tí na después de que la envoltura nuclear se haya roto, las moléculas de Ran cercanas roma tina están fundamentalmente unidas a GTP e n su conformación. Por el contrario,

olí culas de Ran alejadas tienen una gran facilidad de encomrarse con Ran-GAP. que distribuida por el citosol, por lo que estas moléculas de Ran están sobre todo unidas a

n ;u conformación. l'or lo tanto, la cromatina de las células rnitóticas está rodeada por una capa de

fJIP Esta capa desplaza localmente los receptores de importación nuclear de las prote­NI'C, que empiezan el proceso de ensamblaje de los NPC unidos a la superficie de los

sumas. Al mismo tiempo, las proteínas de la membrarta nuclear interna y las laminas

711

Figura 12- 18Control de la importación nuclear durante la activación de la célula T.

AGll El factor nuclear de las células T activadas (NF-AT: nuclear factor of acrivated T cells) es una protefna reguladora de genes que, en la célula en reposo, se encuentra en el citosol en un estado fosforilado. Cuando las células T están activadas por antfgenos extraños (se explica en el Capitulo 25), aumenta la concentración de Cal+ intracelular. A elevadas concentraciones de Ca2+,1a protefna fosfatasa calcineurina se une a NF-ATy se desfosforila. la desfosforilación deja expuestas señales de importación nuclear y oculta una señal de exportación del núcleo. El complejo formado por NF-AT y caldneurina es tmportado al núcleo, donde NF-AT activa la transcripción de varios genes que codifican protefnas de membrana necesarias para la activación de las células T.

la respuesta cesa cuando disminuyen los niveles de Ca2+, liberando NF-AT a partir de cakineurina. la refosforilación de NF-AT inactiva las señales de Importación nuclear, vuelve a exponer la señal nuclear de exportación y provoca que el NF-AT pase al cltosol. Algunos de los medicamentos inmunosupresores más potentes, Incluyendo la cidosponna A y FKS06, inhiben la capacidad de la calcineurlna para desfosforilar NF-AT y de esta manera bloquean ia acumulación nuclear de NF-AT y la activación de la célula T.

111m

Figura 12-19 la lámina nuclear. Electromicrograffa de una porción de la lámina nuclear en un oocito de Xenopus preparado por sublimación y sombreado metálico. la lámina está formada por una red regular de filamentos intermedios especializados. (Cortesía de Uell Aebi.)

712 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

l;¡minas DNA

lt 1 [membrana nuclear interna envo ura nuc earlmembrana nuclear externa

proteínCJs

FUSIÓN O~ lOS CROMOSOMAS RECUBIERTOS

rO'.FORILACIÓN

~·· ~

del complejo de poro nucleat

NUCLEO INTERFÁSICO

ICJminas ¡ fosforila~d" '/ r~

¡{ ... L') íí --\ .

cromáttda

TELOFASE TAROIA

FUSIÓN DE LO) , AG Ml N •S DE LA ENVOLTURA ~UCLEA!

cromosoma

¿ ÓN PROFASE

fragmento de la envoltura nuclea•

ll_ LAS LAMINAS

TELOFASE TEMPRANA

dcsfosforilada<> se unen de nuevo a la cromatina. Las membranas del ER rodean grupos de cromosomas y con ti mían fusionándose hasta que se forma de nuevo una envoltura nuclear completa. Durante este proceso. los NPC ir1ician la reimportación activa de proteínas que presentan secuencias de locali7.ación nuclear. Dado que inicialmente la nueva envoltura nu­clear está situada muy cerca de la superficie de los cromosomas. al formarse el núcleo de nuevo excluye todas las proteínas de la célula excepto aquellas que están unidas a los cro­mosomas mitóticos y las que son imponadru. de forma selectiva a través de los NPC. De es­ta forma, todas las demás proteínas grandes se mantienen fuera del nuevo núcleo.

Las señales de localización nuclear no son eliminadas después del transpone hacia el núcleo, probablemente porque las proteínas nucleares tienen que ser importadas al núcleo varias veces después de cada división celular. Por el contrario, cuando una molécula de pro­teú1a ha sido importada a cualquier otro orgánulo rodeado de membrana, se transmite de generación a generación en el interior del compartimiento y no necesita ser lranslocada de nuevo. En este caso, por lo general la secuencia senal de estas moléculas es eliminada des­pués de la translocación proteica.

Como se expone en el Capítulo 17, la capa de Ran-GTP que envuelve la cromatina tam­bién es importante en el ensamblaje del huso mitótico en una célula en división.

Resumen

/..a envolwra nuclec1r está Jormn<ltl por u11a membrana 1111clear illtema y otra externa. La membra­na nuclear externa es continua con la membrana deli:."R: el espacio entre ésta y La membrana nu­dear interna es colllinuo con ell11men del ER. lLLS moléculas de RNA, que son fabrictulas en el mícleo, y las subunidades ribosomales que son ensambúulas también en elmíc/eo, son exportadas al citosol: por el comrario, todas las protefnas que sonjimcionales en elmícleo flan sido sintetizadas en el cicosol e importarkLS. El imenso tráfico de materiales entre el nticleo y el cirosoltiene lugar a craués de los complejos de poro nuclear (NPCJ que proporcionan una ufa de paso a trat'és de la envoltura 1wclear. Las moléwlas peque1ias difunden pasiuameflle a través de los NPC, pero las grandes ma­cromoldcu/as deben ser tmmportadas deforma activa.

Figura 12- 20 Rotura y nueva formación de la envoltura nuclear durante la mitO\f' La fosforiiCJción de las laminas Induce el desensambla¡e de la lámina nuclear, que contribuye a la rotura de la envoltura nur 1, Se cree que la desfosforiladón de las lamín facilita la reversión de este proceso. Algun nucleoporinas y protefnas del interior de~. membrCJna nuclear siguen un ciclo anáiOQ•. de fosforilac16n y desfosforilación; alguna• estas desfosforilaciones también particip.¡• • en el proceso de reensamblaje mostrado

Como ya hemos indicado, inicialmente 1.1 envoltura nuclear se repliega alrededor dt· cromátidas descondensadas. Por último, cuando progresa la descondenSCJcion, est.• estructuras se funden formando un solo núcleo completo.

ANSPORTE DE PROTEINAS AL INTERIOR DE MITOCONDRIAS Y CLOROPLASTOS

f¿¡s proteínas que presentan sella/es de imporwci611nuc/ear son rrallSportadas defonna acti­

la el núcleo a través de los NPC mientras que las tnoléculas de RNAy las subunidades riiJOso­rt'cién Jabricadru; contienen sella/es de exporración nuclear que dirigen su transporte actiiJO

~~juera, a trcwés de los NPC.Algunas proteflws, incluyendo los receptores de im¡JOrtación y los de ·wci6n.uiajan contitwamenteenrree/ ciroso/yelnúcleo. La Ran-GTPasa aporw ta/lto la ener-

11/m como la direccionalidad al transporte nuclear. Las células regulan el trans¡JOrte de las pro­nucleares y de las moléculas de RNA a traués de los NPC controlando el acceso de estas

·utas a la maquinaria de transporte. Dado que las secuencias de localización nuclear no son ·mulas, las proteínas nucleares pueden ser importadas !'arias veces. tal como se requiere cada

IW el nlicleo se reorganiza después de la mitosis.

ANSPORTE DE PROTEfNAS AL INTERIOR MITOCONDRIAS Y CLOROPLASTOS

miwcondrias y los cloroplastos son orgánulos rodeados por una doble membrana (se hl' en el Capítulo 14). Están especializ.1.das en la síntesis de ATP utilizando la energía

lucida mectiante el transporte electrónico y la fosfori lación oxidativa en las rnitocon­y mectiante la fotosíntesis en Jos cloroplastos. A pesar de que ambos orgánulos con ti e-u propio DNA, sus ribosomas y otros componentes necesarios para la sfmesis proteica, .yo na de sus proteínas están codificadas en el núcleo celular y son hnponadas desde el ,¡, Cada proteína importada tiene que alcanzar el subcompanimiemo detenninado en

11! <:1> funcional. En las mitocondrias existen dos su bcumparl i mi en tos: el espacio de la matriz y el espa­

hucrmembrana. Estos compartimientos están definidos por las dos membranas mito­'lrínlcs concéntricas: la membrana Interna, que forma extensas evaginaciones, las

:, y encierra el espacio de la matriz, y la membrana externa, que se halla en contacto ~1 citosol (Figura l2-21A). En los cloroplastos existen estos dos subcompartimientos

otro adicional, el llamado espacio Lilacnidnl, que está delimitado por la membrana tila­r/ (Figura 12-218). Cada uno de estos subcompartimientos de mitocondrias y cloro­os ron tiene una dotación espedfica de proteínas. !115 rnitocondrias y los cloroplastos se generan mediante el crecimiento de orgánulos Jswntes. seguido de su fisión (descrito en el Capftulo 14). Su crecimiento depende so-

odo de las proteínas que importa del citosol. Para ello es preciso que las proteínas sean portadas a través de varias membranas de forma sucesiva y se sitúen adecuadamente .

. al proceso del despla7..amiento de las proteínas a través de las membranas se le de­na trans/ocaciótl de pmtefnas. En esta sección explicamos cómo ocurre.

translocación a la matriz mitocondrial depende una secuencia señal y de translocadores de proteínas

lo general, las proteínas importadas a la mitocondria son captadas desde el citosol po­\t'gllndos o minutos después de su liberación de los ribosomas. A d iferencia de las pro-

MITOCONDRIA

mambrana externa

1

espacio de la matriz

espado intermembrana

membrana interna

(B) CLOROPLASTO

interna

espaCio intermembrana

membrana tllacoidal

estroma (espacio de la matriz)

713

CITOSOL

NÚCLEO 1 PEROXISOMAS

MITOCONDRIA PLASTOS

[ RET[CULO ENDOPLASMÁnCO

~T

ENDOSOMA TARDIO

LISOSOMA

GOLGI

ENDOSOMA TEMPRANO

fr

lVESICULAS DE 1 SECRECIÓN

EXTERIOR DE LA CÉLULA :=J

Figura 1 2-21 Subcompartimientos de la mitocondria y del cloroplasto. A diferencia de las crestas de la mitocondria (A), los tilacoldes del cloroplasto (B) no están conectados a la membrana interna sino que forman un compartimiento con un espacio interno independiente (véase la Figura 1 2-3).

714 Capftulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de protefnas

~1· M~ Met 1

1

l~u S~r le~

Arg" GJó:...: ;;;J . . (B) 5er,. 1~

Arg Ph,e

Phe :1..

ly~ Pro

1 Ata Thr

(A) ~-~ 18

~.Thr - l eu- -

= le u

teínas que se t.ranslocan en el ER, que describimos después, las proteínas mitocondriales son primero sintetizadas completamente en el citosol como proteínas precursoras mHo­condrlales y después son translocadas a la mitocondria mediante un mecanismo postratluc­cional. Una o más secuencias señal dirigen todas las proteínas precursoras mltocondriales a su subcompanimienro mitocondrial adecuado. Muchas proteínas que entran en el espacio de la matriz tienen una secuencia seí'lal en su extremo N-terminal que es eliminada de in­mediato después de la importación por una peptidasa seiial. Olras, incluyendo todas las de la membrana externa y algunas de la membrana interna, tienen una secuencia señal interna que no es eliminada. Las secuencias señal son necesarias y suficientes para inducir la im­ponación y la correcta localización de las proteínas: cuando se utili1.an técnicas de ingenie­ría genética para unir estas sei'lales a cualquier proteína citosólica, las señales dirigen la proteína hacia el subcompartimiento mitocondrial adecuado.

Las secuencias señal que dirigen las proteínas precursoras al espacio de la matriz mito­condrial son las mejor conocidas. Todas ellas forman una hélice a anfifílica, en la que todos los restos cargados positivamente se localizan en un lado de la hélice y todos los restos hi­drofóbicos no cargados se agrupan en el lado opuesto. l.as proteínas receptoras que inician la translocación reconocen esta configuración más que la propia secuencia de aminoácidos (Figura 12-22).

La translocación de proteínas a través de las membranas mitocondriales está mediada por complejos proteicos formados por varias subunidades que actúan como translocadores de proteínas (Figura 12-23): el complejo TOM transfiere proteínas a través de la membrana

membrana mitcx:ondnal externa

membrana mitcx:ondrial interna

Hsp70 mitocondrial importa ATPasa

COMPlEJO TIM23

COMPlEJO TOM

canal de translocacíón

receptores

CITOSOl

ESPACIO INTERMEMBRANA

COMPlEJO OXA

Agura 12-22 Secuencia señal para la importación de proteínas a la mitocondn• La cltocromo oxidasa es un gran complejo multiproteico localizado en la membrana mitocondrlallntema, donde actúa como 1.1 enzima terminal de la cadena de transpon• electrónico (se explica en el Capitulo 14). (A) Los 12 primeros aminoácidos del preciJr de la subunidad IV de esta enzima son suficientes como secuencia señal para dlnq el transporte de esta subunidad a la mitocondrla. (B) Cuando la secuencia sen.•l se pliega en forma de hélice a. los residuo~ • aminoácido cargados positivamente (en ro¡

se agrupan en una cara de la hélice mlentr ,,, que los residuos de aminoácido no polar e (en amarillo) se hallan agrupados sobre toci•J en la cara opuesta. los aminoácidos de ca•l lateral polar no cargada se muestran en 011

Todas las secuencias señal que dirigen las proteínas a la matriz mirocondrial tienen la capacidad de formar una hélice a. que es reconocida por protefnas receptoras especificas en la superficie mitocondrial (0 Estructura de la secuencia señal de la alcohol deshidrogenasa, otra enzima de 1.1 matriz mitocondríal, unida a un receptor de importación determinado por N M R. La hélice a anfifílica se une a esta cara hidrofol en la ranura del receptor. (C, adaptado de Y Abe etal., Ce/1100:551-560, 2000. Con la autorización de Elsevler.)

Figura 12-23 Translocadores proteicos en 1.11

membranas mitocondrlales. Los complejCJ TOM, TI M, SAM y OXA son conjuntos de proteínas multimérlcas de membrana que e llzan el transporte a través de las membran.• mrtocondriales. los componentes proterco· los complejos T1M22 y T1M23. que recubren • canal de translocación, son similares entre··· que sugiere un origen evolutivo común. Un de los componentes del centro de T1M23 ce • tiene una hélice a que se extiende hacia fu,., se inserta en la membrana mitocondrial ext na; la estructura de este complejo atravie~., vez dos membranas.

En la cara de la matriz, el complejo T1M2J ~ unido a un complejo proteico que contien•·l proteína Hsp70, que actúa como un importador de ATPa.sa utilizando la hidrólisr del ATP para pasar protefnas por el poro.

lANSPORTE DE PROTE[NAS AL INTERIOR DE MITOCONDRIAS Y CLOROPLASTOS

na y dos complejos TIM, los complejos TIM23 yTlM22, transfieren proteínas a través de mbrana interna. TOM yTIM son nombres que significan respectivamente transloca­de la membrana externa (translocatorofthe oucer membrane) e interna (trans/ocatorof

luner membrane). Estos complejos contienen algunos componentes que actúan como ores de los precursores de las proteínas nútocondriales y otros que forman los canales

rilnslocación. U complejo TOMes necesario para la importación de todas las proteínas mitocondria­

rodificadas por el núcleo celular. Es responsable del transporte de las secuencias señal el espacio imermembrana y ayuda a insertar las proteínas transmembrana en la mem­

<Jt!.xterna. Entonces. unas proteínas en conformación de barril~. que son especialmen­bundantes en la membrana externa, pasan sobre otro translocador, el complejo SAM, le ayuda a plegarse de forma adecuada sobre la membrana externa. El complejo TIM23 puna algunas proteínas solubles hasta el espacio de la matriz y facilita la inserción de rotelnas rransmembrana en la membrana interna. El complejo TIM22 media la inser­dc una subclase de proteínas de la membrana interna, incluyendo el transportador, que portan ADP. ATP y fosfato hacia dentro y hacia fuera de la mitocondria. Un tercer trans-:lor en la membrana mitocondrial interna es el complejo OXA, que media la inserción

proteínas de membrana interna sintetizadas en la mitocondria. También participa en re ión en algunas pro ternas de membrana interna importadas inicialmente transpor­

nl espacio de la matriz por otros complejos.

precursores de las proteínas mitocondriales son importados o cadenas polipeptídicas desplegadas

todo lo que se conoce acerca de los mecanismos moleculares de la importación de pro­por las mitocondrias procede de experimentos en los que se han utilizado sistemas de

llOrte reconstituidos, Libres de células, en los que mitocondrias purificadas importan fMtres proteicos marcados radiactivameme en un rubo de ensayo. Cambiando las con­~s de incubación es posible establecer los requerimientos bioquímicos para la im­:ón.

l.os precursores de proteínas mitocondriales no se pliegan en sus conformaciones después de ser sintetizados, sino que permanecen desplegados en el citosol gracias rdones con otras proteínas. Algunas de estas proteínas son protefnas cllaperonas de fi¡¡ Hsp70 (descritas en el Capítulo 6) mientras que otras son específicas de las pro­tnitocondriales y se unen a sus secuencias señal. Todas las proteínas que interactúan

lhuyen a evitar que los precursores de las proteínas se agreguen o se plieguen antes de 1 en contacto con el complejo TOM en la membrana mitocondrial externa. Como pri­Milpa en el proceso de importación, los precursores de importación del complejo TOM nula secuencia sei\al del precursor de la proteína mitocondrial. En ese momento, las

·nns que interactúan se separan y la cadena polipeptfdica desplegada es enviada -con acncia señal en primer lugar- a través del canal de translocación. n principio, una proteína puede alcanzar el espacio de la matriz mitocondrial cruzan­dos membranas, primero una y Juego la otra, o pasando a través de ambas membra-1¡¡ vrz Podemos distinguir entre estas dos posibilidades enfriando un sistema de

~

~ s •c 2s e m 1.) J + proteasa ,..,,, ---1 l + proteasa

~ m

715

Figura 12-24 Las protelnas que son transportadas a la matriz mitocondrlal atraviesan a la vez de forma transitoria tanto la membrana externa como la interna de la mitocondria. Cuando se Incuban mitocondrias aisladas a S •e con un precursor de una protelna, el precursor sólo se transloca parcialmente a través de las membranas mitocondrlales. En la matriz mitocondrial se elimina el péptido señal N-terminal (en rojo); pero la mayor parte de la cadena polipeptldica permanece fuera de la mítocondrla donde es accesible a enzimas proteolíticas añadidas desde el exterior. Al volver a calentar la preparación a 25 •e, el proceso de translocación se completa. Cuando se halla en el interior de la mitocondrla,la cadena polipeptldica está protegida de las enzimas proteollticas añadidas. Como control, cuando se añade un detergente para romper las membranas mitocondriales,las protelnas importadas pueden ser degradadas por la misma proteasa.

~ .,, ..... 1 + detergente

r----, 1 'IJ :t,-ll"' 1 ,, -:..:: •• 1 1 lt_Jt:..:.J} -----

716 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

protefna precursora

secuencia

ftl'(i~ UNIQNCON RECEPTORES DE IMPORTACION

receptores del complejo

TOM

comple¡o TOM ,--

membrana m1tocondrial externa ' membrana mitocondrial interna

CITO SOL

. ESPAOO DE complejO TIM23 CORTE POfl LA MATRIZ

"'-.._ lA PEPTIDASA & ""'-. SEÑAl

~"':;:~'"" 8L \ "•"'"' _ _ \ m1tocond~ial

madura p~pudo sel'\al cortado

importación mitocondrial libre de célula~ para detener las pro temas en algún paso imenne­dio del proceso de translocación. El resultado es que las protefnas paradas ya no comeman la secuencia ~enal de su extremo N-terminal, lo que indicaba que su extremo N-terminal ya habfa alcanzado el espacio de la matriz, donde se localit.a la peptidasa se1ial. Sin embargo, la mayor parte de la pro terna podía ser degradada desde el exterior de la mitocondria median­te proteasas anadidas exteriormemc (Figura 12-24). Claramente, las proteínas precur<;oras pueden pasar a través de ambas membranas mitocondriales a la vez para entrar en el cspa cío de la matriz (Figura 12-25). Se cree que en primer lugar el complejo TOM transporta la secuencia <;cñal a través de la membrana externa hasta el espacio intennembr-dlla, donde se une al complejo TIM y abre el canal del complejo; entonces, la cadena polipeptídica entra en el espacio de la matriz o se inserta en la membrana interna.

Aunque por lo general los complejosTOM y TIM trabajan juntos transportando las pro­teínas precursoras a través de las dos membranas a la vez, también pueden actuar indepen­dientemente. Por ejemplo, en membranas externas aislada~. el complejo TOM puede translocar la secuencia sen al de una proteína precursora mitocondriaJ a través de la mem­brana. De manera similar, si la membrana externa es eliminada de fonna experimental de mitocondrias aisladas, el complejo TIM23 aJ1ora expuesto, puede importar de forma efi­ciente proteínas precursoras aJ espacio de la m atril~

La hidrólisis de ATP y el potencial de membrana dirigen la importación de proteínas al espacio de la matriz

Fl transporte direccional requiere energía, que en la mayoría de los sistemas biológico\ es aportada por la hidrólisis de ATP. La importación de proteínas por la mitocondria es impulsa­da por la hidrólisis de AIP en dos lugares discretos: uno en el exterior de la mitocondria y el otro en la m atriz (Figura 12-26). Además, la importación de proteínas requiere otra fuente de energía, que es el potenciaJ de membrana a través de la membrana mitocondrial interna.

r.t primer requerimiento de energía ocurre en las etapas iniciaJes del proceso de uans­locación, cuando el precursor de la proteína desplegada, unida a las chaperonas. interac-

Hsp 70 citosólica

++++++

.. r- A~ +P1

;-m

-----~------

membrana mitocondrlal

externa

Agura 12-251mportaci6n de proteln.11 mitocondña. ,({,, la secuencia ~ N-terminal de la protefna m1tocondnal precursora es reconocida por los recept del compleJO TOM. Entonces, la proteiN es translocada por el complejo TIM23 ~ forma que transitoriamente atraviesa a membranas en los sitios de contacto o e de ellos. la secuencia señal es eliminact. acción de la peptldasa señal en la matriZ. forma la protefna madura. la secuencia liberada es degradada con rapidez (no M

muestra).

Figura 12-26 Papel de la energla en la Importación de protelnas al interior d• t. matriz mitocondrlal. (1) la protefna H1p cirosólica se separa de lc1 protefna med1anw un proceso que depende de la h1dróhs1\ dt ATP. Despu~s de la inserción Inicial de la secuencia señal y de las porciones adyacentes de la cadena polipeptldica en el complejo TOM, la secuencia señal interacciona con el complejo TIM. (2) la secuencia señal es translocada a la matriz; se trata de un proceso que requim un potencial de membrana a trav~s de la membrana mtema. (3) la protelna HspJO micocondrial, que forma parte de un comple¡o importador de AT?asa, se une a reglones de la cadena polipeptfdica a~ que se alcanza la matriz. •tirando" de la protelna hacia el canal de translocación

ESPACIO DE LA MATRIZ

membrana mitocondrial

interna

potencial de membrana

Hsp70 mitocondrial 7 '\ . m ADP camb10 conformacional

en Hsp70 dependiente de energía

+ P¡

NSPORTE DE PROTEINAS AL INTERIOR DE MITOCONDRIAS Y CLOROPLASTOS

ron los receptores de importación del complejo TOM. Como se describió en el ulo 6, la unión y la Liberación de polipéptidos recién sintetizados de las chaperonas de 1111ia 1 !sp70 requiere la hidrólisis de ATP. El requerimiento de Hsp70 y ATP en el citosol

5rr obviado si la pro terna precursora es desplegada artificialmente antes de ser aña­' las mitucondrias purificadas.

Una vez que la c;ecuencia señal ha pasado a uavés del complejo TOM y se ha unido al ¡llcJO TIM, para que prosiga la translocación a través del canal de translocación TIM

"' de un potencial de membrana, que es el componente eléctrico del gradiente elec­•hnico de H' a través de la membrana interna (véase Figura ll-4). El gradiente electro­

o es mantenido por el bombeo de Ji' de la malriz hacia el espacio intermembrana, •ls;tdo por los procesos de transpone de electrones de la membrana interna (se descri­cl Capítulo 14). La energía del gradiente electroquímico de 1 [• a través de la membra­

tcrna no sólo colabora en la síntesis de la mayoría del ATP celular, sino que también .ICt la translocación de las secuencias señal cargadas positivamente a través de los 'lejos TlM mediante electroforesis.

l.ns llsp70 mitocondriales también desempeñan un papel crucial en el proceso de im­lón. Las mitocondrias que contienen formas mutan tes de esta proteú1a son mcapaces

portar protcfnas precursoras. La Hsp70 forma parte de un ensamblaje proteico forma­r muchas subunidades que se encuentra unido al lado de la matriz del complejo TIM23

úa como un motor estirando la protefna precursora hacia el espacio de la matriz. mhma forma que su "pariente" citosóllca, la Hsp70 mitocondrialtiene una alta afini­

IKH las cadenas polipeptídicas desplegadas y se une con fuer1.a a una proteína de im­hín. en cuanto emerge desde cltranslocadorTIM al interior del espacio de la matríz.

tlnuadón, la llsp70 libera la proteína en un proceso dependiente de ATP. Se cree que clo de unión y separación de la proteína, dependiente de energía, es el que aporta la ¡¡necesaria para completar la importación de una proteína una vez se ha insertado en Jl)ejoTIM23 (véase la Figura 12-26). s la interacción inicial con la llsp70 mitocondrial, muchas proteínas importadas a la

St•n transferidas a otra proteína chaperona, la llsp60 mitocondrial. Como se ha des­Cil d Capftulo 6, la 1 !sp60 facilita el plegamiento del polipéptido desplegado mediante de unión y liberación con hidrólisis de ATP.

bacterias y las mitocondrias utilizan mecanismos similares insertar porinas en su membrana externa

mhrana miLOcondrial externa, del miJ.mo modo que la membrana externa de las bac­Cirnm-negativas (véase Figura 11-8), contiene una gran cantidad de proteínas prefor­

denorninadas porinas, por lo que es libremente permeable a iones inorgánicos y a 'olitos (aunque no a la mayoría de proteína<;). Las porinas son proteínas en barril ~

Figura 10-26) y en primer lugar son importadas a través del complejo TOM 12-27}. A diferencia de otras proteínas de membrana, que están ancladas a la mem­

a través de regiones de hélice ex, el complejo TOM no puede llevar a cabo la integración porinas en la bicapa lipfdica. En lugar de ello, las porinas son transportadas primero al fl lntermembrana, donde se unen de forma transitoria con proteínas chaperona es-'JJ(Ias que in1piden que las porinas se agreguen; entonces, se unen al complejo SAM

rncmbrana externa, que inserta la porina en la membrana externa y le ayuda a plegar­'onna apropiada.

COMPLEJO TOM

chaperonas

ESPACIO DE LA MATRIZ

COMPLEJO SAM

- protefna completamente

plegada

Figura 1 2- 27 Integración de las porinas en la membrana mitocondrial externa. Después de la translocación a través

717

del complejo TOM, unas protefnas en conformación de barril ~se unen a chaperonas en el espacio intermembrana. Entonces el complejo SAM inserta en la membrana externa la cadena polipeptídica desplegada.

718 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

CITOSOL

complejo TOM

protelna de la membrana interna

/ complejo TlM23

\ secuencia de paro de translocación

sitio · J de corte. ~

secue~cia ¡ - ~~ -......___ ~ segunda 1 secuencia ser'lal

(A)

corte por protefna del espacio la proteasa intermembrana

' \ S:: . c,o

~ 1 j .. PP..C:\S #@ig

(Q (O)

se"'al ti"

ESPACIO DE LA MATRIZ

(8)

interna

Una de las subunidades centrales del complejo SAM es homóloga a una proteína de membrana externa de las bacterias que colabora a insertar proteínas en barril ~en la mem­brana exterior de la bacteria desde el espacio periplasmático (el espacio topológicamentc equivalente al espacio intermembrana de las mitocondrias). Esta vía conservada para inser­tar proteínas en barril~ constiLUye otra evidencia del origen endosimbióntico de las mito­condrias.

El transporte a la membrana mitocondrial interna y al espacio intermembrana mitocondrial se produce a través de varias vías

El mismo mecanismo que transporta proteínas al espacio de la matriz, utilizando los trans­locadores TOM yTIM23 (véase Figura 12-25), también media la translocación inicial de mu­chas proteínas que son destinadas a la membrana mitocondrial interna o al espacio intermembrana.

En la ruta de translocación más común, sólo entra en el espacio de la matriz la secuen­cia señal N-terminal de la proteína transportada (Figura 12-28A). Una secuencia de amino­ácidos hidrofóbicos situada esLratégicamente tras la secuencia sei'lal N-terminal, actúa como secuencia de final de transferencia e impide la transferencia posterior a través de la membrana interna. El complejo TOM estira el resto de la proteína a través de la membrana externa hacia el espacio intermembrana; entonces, la secuencia señal es eliminada en lama­triz y la secuencia hidrofóbica, liberada de TIM23, queda anclada en la membrana interna.

En otra vía de transporte a la membrana interna o al espacio intermembrana, el com­plejo TIM23 inicialmente transloca toda la proteína al espacio de la matriz (Figura 12-288). Una peptidasa sei\al de la matriz elimina la secuencia señal N-terminal, exponiendo una secuencia hidrofóbica en el extremo N-terminal. Esta secuencia señal gufa la proteína al complejo OXA, que inserta en la membrana interna Las proteínas que están codificadas y traducidas en la mitocondria (véase Figura 12-23). Muy pocas proteínas importadas utilizan esta vfa. En la membrana plasmática de las bacterias y en la membrana tilacoidal de los clo­roplastos se encuentran translocadores muy semejantes al complejo OXA y parece que cola­boran en la inserción de pro temas de membrana mediante un mecanismo similar.

Muchas proteínas que utilizan esta vfa hasta la membrana interna permanecen ancla­das en ella a través de su secuencia señal hidrofóbica (véase Figura 12-28A y Bl. Otras, sin embargo, son liberadas en el espacio intermembrana por una proreasa que elimina el an­claje a la membrana (Figura 12-28C). Muchas de estas proteínas liberadas permanecen u ni -

SINTESIS DE PROTEINAS MITOCONORIALES

Figura 12- 28 Importación de proteína' desde el dtosol hacia la membrana mitocondrial interna y el espacio lntermembrana. (Al La secuencia señal N-terminal (rojo) inicia el proceso de Importación al espacio de la matriz (vea• Agura 12-25). Una secuencia hidrofóbk.• (naranja) que sigue a la secuencia de direccionamiento a la matriz se une al translocadorTIM23 de la membrana Interna y detiene la translocación. El rest• de la pro terna es • estirada" hacia el esp." lntermembrana, a través del translocadn• TOM de la membrana externa, y la secu .. n< hidrofóbica se libera dentro de la membr interna. (B) Una segunda ruta de integra• de la proteína en la membrana interna ht completamente la protefna en el espacio matriz. El corte de la secuencia señal (rOJ•' utilizado para la translocación Inicial, desenmascara una secuencia señal hidrofóbica adyacente (naranja) en el nu segmento N-terminal. Entonces esta sel'l·•' dirige la protefna al interior de la membw utilizando la misma vfa dependiente de OXA que inserta las protefnas que han s1d< codificadas por elgenoma mitocondrial y traducidas en el espacio de la matriz. (C) Algunas protefnas solubles del espac~< intermembrana también pueden seguir l.• que se muestra en (Al y (B) antes de quecl liberadas en el espacio lntermembrana p. acción de una segunda peptidasa señal Q•

se activa en el espacio lntermembrana y que elimina la secuencia señal hldrofóblc.• (D) Los transportadores de metabolitos to• secuencias señal internas y serpentean poc complejo TOM como un bucle. Entonces unen en el espacio lntermembrana con 1••· chaperonas, que gufan a las protefnas al complejo TIM22. El complejo TIM22 está especializado en la inserción de proteína\ de paso múltiple en la membrana interna

NSPORTE DE PROTEINAS AL INTERIOR DE MITOCONDRIAS Y CLOROPLASTOS

n la ~uperficie externa de la membrana rnitocondrial interna como subunidades perifé­d~ complejos proteicos que también contienen pro ternas transmembrana. l.tls mitocondrias son el principal lugar de sfntesis de ATP en la célula, pero también

n ·n numerosas enzimas metabólicas, como las del ciclo del ácido cftrico. Por ello, s de protefnas, las mitocondrias deben transportar pequeños metabolitos a través de

,cmbranas. A diferencia de la membrana externa, que presenta porinas que la hacen :nble a las moléculas pequeñas, la membrana interna no es permeable. Por el contra-

na familia de protefnas transportadoras especfficas de metabolito transportan un gran ro de pequeñas moléculas a través de la membrana interna. En levaduras estos trans­lorcs comprenden una familia de 35 protefnas, siendo las más abundantes el transpor­ArR ADP y fosfato. Son protefnas rransmembrana de multipaso que no tienen

ncias elimina bies en su extremo N-terminal, pero que contienen secuencias señal in­Cruzan el complejo TOM de la membrana externa y unas chaperonas del espacio

cmbrana las gufan al complejo TlM22, que las inserta en la membrana interna me­un proceso que requiere el potencial de membrana, pero no Hsp70 mitocondrial ni

Hgum 12-280). Es probable que la distribución energéticamente favorable de las re­hidrofóbicas transmembrana en la membrana interna también colabore en el desa­

de este proceso.

secuencias señal dirigen las proteínas a la membrana .oidal de los cloroplastos

porte de protefnas hacia el interior de los cloroplastos se parece al transporte al inre-1~ mitocondrias. Ambos procesos se producen después de la traducción, utilizan te} complejos uanslocadores en cada membrana, requieren energfa y utilizan se­

.~eñal N-terminales anfifnicas que son eliminadas después de haber sido utilizadas. bargo, con excepción de algunas de las moléculas de chaperona, los componentes pro-de los complejos de translocación son diferentes. Además, mientras que las mirocon­lltilizan el gradiente electroquímico de H• a través de su membrana interna para J1r el transporte, los cloroplastos, que tienen un gradiente electroqufrnico de H+ a tra­u membrana tilacoidal pero no a través de su membrana interna, utilizan la hidrólisis

1' y de ATP para impulsar energéticamenre la importación a través de su doble mem-Lns sunilitudes funcionales pueden ser, por tanto, la consecuencia de una evolución

rgcnte, reflejo de los requerimientos comunes de la translocación de proteínas a través doble membrana.

Jlesar de que las secuencias señal para la importación al interior de Jos cloroplastos mejantes a las descritas para el transpone a las mirocondrias, una misma célula ve­

llene tanto mitocondrias como cloroplastos y las protefnas deben distribuirse de adecuada entre ambos compartimientos. En plantas, por ejemplo, si una enzima

ilnna se une de forma experimental a una secuencia N-terminal de una proteína mito­,al, ~e dirige espedficamente a las mitocondrias, mienrms que si se une en un expe­to ·' una secuencia N-terminal de una proteína de cloroplasto, penetra en los cloro­

l'or lo tanto, es probable que los receptores de importación a cada orgánulo distin­tn las secuencias señal diferentes.

lh5 cloroplastos tienen otro compartimiento rodeado de membrana, el tllacolde. proteínas de los cloroplastos, entre las que se encuentran las subunldades proteicas

H.'tlla fotosintético y de la ATP sintasa (descrita en el Capfrulo 14), se hallan localizadas membrana tilacoidal. Como los precursores de algunas protefnas mitocondriales, el

rtr de estas proteínas precursoras desde el citosol hasta su destino final se produce lile dos etapas. Primero pasan a través de la doble membrana en lugares de contacto .le: hasta el espacio de la matriz (Llamado estroma. en los cloroplastos) y luego son

ilcadas a la membrana tilacoidal o al espacio tilacoidal (Figura 12-29A). Los precurso­ras proteínas tienen una secuencia señal hidrofóbica del tilacoide situada a con ti­

u de la secuencia sefial N-terminal del cloroplasto. Cuando la secuencia señal lnal ha sido utilizado para in1portar la proteína al estroma, es eliminada por una pro-r.f'lal del estroma, desenmascarando la secuencia señal del tilacoide, que inicia el 'rt~ a través de la membrana del tilacoide. 1, n al menos cuarro vías a través de las cuales las pro ternas se integran en la mem­

tllr coidal, que se diferencian por la necesidad de chaperonas del estroma y de fuentes 'rg1 (Figura 12- 298).

719

720 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

protefna precursora del tilacoide translocadores proteicos

1 membrana externa del cloroplasto secuencia sellal de tilacoide

secuencia sel'lal de cloroplasto

protelna receptora

(A)

membrana tilacoidal

espacio del tilacoide

~ 1 membrana interna del cloroplasto ,....- .-==--""] == _ j CITOSOL ~~---------~~L 1

\ ELIMINACIÓN DE LA SECUENCIA ESTROMA \ SENAL DEL ~ROPLASTO

TRANSLOCACIÓN AL ESTROMA DEPENDIENTE DEGTP OATP

[t!) ) • ~ecuencia sena! del ., Jr · tilacoide, expuesta

CUATRO RUTAS PARA LA TRANSLOCACION DE PROTEINAS AL INTERIOR DEL ESPACIO nLACOIOAL

tf e;, 1

C2) +

membrana tilacoidal

protelncl madura en el espacio del tilacoide

'1\1

......-necesidades de energla ~

ATP gradiente

electroquímico

ATP gradiente

electroqufmico grad1ente

de H' nmguna

ruta Sec (8)

Resumen

ruta similar a SRP ruta TAT inserción espontánea

A pesar dR que las mirocondrias y los cloroplasros tienen sus propios sistemas genéticos, sólo produ­cen una peque1ia proporción de sus propias proteinas. De hecho. ambos orgdnulos importan desde el citosolln mnyorfade s11s protefnas y utilizan mectmismos similares. Bn a miJOs casos, las proreínas son trallSporradas en un eiitndo r/e¡;p/egado. a tral'és de las membranas ex rema e illlema, lwsw el es­troma. En las mitocondrias, In rrnnslocación esrd impulsada ramo por lo lzirlrólisis de ATPcomo por el potencial de membrana a tra11és de la membrana imema. mientras que en lns cloroplastos la translocación sólo está impulsada por la hidrólisis de GTP )'de ATP. Las protefnas chaperontLS de la familitr de las Hsp70 citosólicns mamienenlas protefntLS precursoras en 1111 estado desplegado y 1111

segundo grupo de protefnas Hsp70 del espacio de la mlllriz o del escroma "e¡; tiran" la cadena poli­peptfdim al interior del orgámtlo. Sólo son translocadfLS itLS proteínas qrte contienen una secuencia seiia/ especifica. 1.11 secue11cia seilttl puede estar loca/iznda en el extremo N-termi11al y después de la im¡JOrtación se elimina. o es interna y se retie11e. H rmnsporte a la membrana interna a veces utili­za una segunda secuencia seiia/ llidrofóbica que es desemJULScarada cua11do se elimina la primera secuencia. En los cloroplastos, la importación desdr el estroma hasta el rilacoide se rea/iuz por mrias rutas que se diferencian por las cltaperonas y por la.~ fue mes de energla.

PEROXISOMAS Los peroxisomas se diferencian de las mitocondrias y de los cloroplastos en muchos aspec­tos, entre los que cabe destacar que estos orgánuJos están rodeados por una sola membrana y no presentan ni DNA ni ribosomas. Dado que no tienen geno m a, todas sus protefnas están codificadas en el núcleo. Los peroxisomas adquieren la mayor parte de sus proteínas me-

Figura 12- 29 Translocaclón de un pre<u proteico de dorop lasto al interior del

espado tilacoidal. (A) La protelna preciJ contiene una secuencia señal N-termlr\1

direccionamiento al doroplasto (en ro¡c seguida Inmediatamente por una secu• señal de direccionamiento al tilacoide

naranja). La secuencia señal del cloropl., inicia la rranslocación hacia el estroma A

través de un sitio de contacto median t.

mecanismo similar al que se util iza par.• translocación de las proteínas precurso

hacia la matriz mitocondrlal. Entonces.

elimina la secuencia señal y la señal d•· direccionamiento al tllacoide es desenmascarada, lo que inicia la

translocación a través de la membran<1 d tilacoide. (B) La translocación hacia el t del tilacoide o a su membrana puede ,,

una de las al menos cuatro rutas posibl· (1) la ruta Sec, denominada asf porque

utilizan componentes que son homóloq

a las protelnas Sec. proteínas Implicad,¡· la translocadón de protelnas a través d• membrana bacteriana (se describe m,!·. adelante); (2) una ruta sí m llar a SRP, denominada asl porque en ella partiCip .•

homólogo en el cloroplasto a la partícu11 reconocimiento de la señal, o SRP (de!- • más adelante); (3) la ruto TAT(twin argin • translocorlon¡ translocaci6n de dos argu• gemelas), denominada a si porque hay' t

arglninas criticas en la secuencia señal q dinge las prorernas en esta ruta, que d•·1 del gradiente de H 1 a través de la meml•f del tílacoide, y (4) una ruta de inserción espontánea que parece que no neces•t·• n•ngún translocador de proteínas.

1XISOMAS

IC importación selectiva desde el citosol aunque algunas de ellas entran ala membrana pcwxisoma a través del ER. (l.1do que no volveremos a tratar de los perox:isomas en otro a panado, antes de hablar • h10sfntesis vamos a detenemos a considerar algunas de las funciones de esta familia

de orgánulos. Todas las células eucariotas tienen peroxisomas. Contienen enzimas li\"J~. como la cat11lasa y la urato oxidasa a concentraciones tan altas que en algunas cé­lus peroxisomas se reconocen en electromicrograffas por la presencia de un nucleoide l ino (Figura 12-30).

Como en el caso de las mítocondrias, los perox:isomas son los principales lugares de u ti­Món de oxfgeno. Una hipótesis es que los peroxisomas sean un vestigio de un orgánulo

10. que en los antecesores primitivos de las células eucariotas realizaba todo el meta-mo del oxfgeno. Cuando el oxfgeno producido por las bacterias fotosintéticas se acu­cn la atmósfera, podría haber resultado altameme tóxico para la mayoría de las células.

Jlt~ruxisomas pudieron haber contribuido a disminuir la concentración de oxfgeno en células, a la vez que permitfan utilizar su reactividad química paro !.levar a cabo reac­' útiles de oxidación.

l>e acuerdo con este punto de vista, el desarrollo posterior de las mitocondrias hizo que HJ.Jtisomas se volvieran obsoletos, dado que muchas de las reacciones bioqufmicas .ntcs se realizaban en los peroxisomas sin producir energía- fueron acopladas a la for­n deATP por medio de la rosfori.lación ox:idativa. Por lo tanto, las reacciones de oxida­

que realizan en la actualidad los peroxisomas podrían ser aquellas cuyas funciones no n ti'>Umidas por las mitocondrias.

peroxisomas utilizan el oxígeno molecular 1 peróxido de hidrógeno para realizar dones de oxidación

roxisomas se denominan así porque generalmente comienen una o más enzimas que n oxígeno molecular para eliminar átomos de hidrógeno de sustratos orgánicos es pe­(designados como R) a través de una reacción de oxidación que produce peróxido de '1/0 (ll20 z).

RH2 + 0 2-+ R + H20 2

mtalasa utiliza el 1 120 2 generado por otras enzimas del orgánuJo paro oxidar diversas 1~ -como fenoles. ácido fónnico, formaldehfdo y alcohol- mediante una reacción

roxidación": H20¿ + R'll2 -+ R' + 2H20. Este tipo de oxida.ción es particularmente im­mc en el higado y en las células de riñón, donde los peroxisomas dcstoxifican una gran 140 de moléculas tóxicas que entran en la circulación. Alrededor del 25% del etanol que

1ft ) es oxidado a acetaldehfdo de esta manera. Además, cuando se acumula un exceso ;t)J ··n la célula, la catalasa lo transforma en 1 I20 mediante la reacción:

21lz0 2-+ 2llz0 + 0 2

.11111 de las principales funciones de las reacciones de oxidación realizadas en los pero­es la rotura de las moléculas de ácidos grasos. El proceso llamado {3 oxidación acor­

cndenas de los ácidos grasos de forma secuencial en hloques de dos átomos de o cada vez, transformando los ácidos grasos en acetil CoA. Entonces, los peroxisomas

11111 el acetil CoA al citosol para su reutili?..ación en reacciones biosintélicas. En células nufero, Ja f3 oxidación tiene lugar tanto en mitocondrias como en peroxisomas; s in reo en levaduras y en células vegetales esta importante reacción sólo se reali?..a en lo~

mas Jnn !unción biosintética esencial de los perox:isomas en animales es la catálisis de las

! reacciones de la síntesis de plasmnlógenos, que son los fosfolípidos más abundan-lamielina (Figura 12-31). Una deficiencia de plasmalógenos provoca profundas anor­:lcs en la mielinización de los axones de las células nerviosas, que es una de las causas murhas deficiencias perox:isomales provoquen anomalías neurológicas.

peroxisomas son orgánulos muy diversos: distintas células de un mismo organismo n contener incluso dislintos conjuntos de enzimas. También se adaptan de manera des­

a condiciones cambiantes. Por ejemplo, las células de levadura que crecen con azúcar ¡terox:isomas pequeños, pero cuando crecen en metano! desarrollan peroxisomas gran-

721

CITOSOL

f'll· 1 NÚCLEosl~t ¡ l PEROXISOMAS

MITOCONDRIA -~. l! PLASTOS ]

[_ RETICULO ENOOPLASMÁTICO

[ ~

r ENDOSO MA

TARDIO

l GOLGt

[usosoMAI J [ENDOSOMA TEMPRANO]

~

r r -

VESICULAS DE] SECRECIÓN

r-- EXTERIOR DE LA CE LULA =:J

L___j 200 nm

Agura 12-30 Electromicrografía de tres peroxisomas en una célula de hfgado de rata. Las inclusiones paracristalinas electrodensas están formadas por la enzima urato oxldasa. (Por cortesfa de Daniel S. Friend.)

722 Capítulo 1 2: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

Figura 12-31 Estructura del plasmalógeno. Los plasmalógenos son muy abundantes en las cubiertas mielfnlcas que aislan los axones de las células nerviosas. Constituyen entre el 80 y el90% de los fosfolrpidos de las membranas de mlelina. Ademi\s de un grupo de cabeza etanolamlna y de una cadena larga de i\ddo graso unido al mismo núcleo glicerol fosfato de los fosfollpidos,los plasmalógenos contienen un alcohol graso poco común que se une mediante un enlace éter (abajo a la izquierda).

des que oxidan metano!; y cuando crecen con ácidos grasos, desarrollan grandes peroxisomas capaces de degradar ácidos grasos hasta acetil CoA por medio de la ~oxidación.

También son importantes en las plantas. Se han estudiado en profundidad dos tipos de peroxisomas vegetales. Uno de ellos está presente en las hojas, donde participa en la fo­torrespiración (se describe en el Capftulo 14) (Figura 12-32A). El otro tipo de peroxisomas se halla presente en las semillas en germinación, donde transforma los ácidos grasos almace­nados en los lrpidos de las semillas en azúcares necesarios para el crecimiento de la planta joven. Dado que esta conversión de grasas en azúcares se realiza a través de una serie de reacciones conocidas como el ciclo del glioxilato, estos peroxisomas también son denomi­nados glioxisomas (Figura 12-328). En el ciclo del glioxilato, dos moléculas de acetil CoA, producidas por la degradación de un ácido graso en el peroxisoma, son utilizadas para fa­bricar ácido succfnico, el cual sale del peroxisoma y es transformado en glucosa. El ciclo del glioxilato no tiene lugar en las células animales, por lo que los animales son incapaces de transformar los ácidos grasos en carbohidratos.

Una corta secuencia señal dirige la importación de protefnas hacia los peroxisomas

Una secuencia especrfica de tres aminoácidos (Ser-Lys-Leu), localizada en el extremo C de muchas protemas peroxisomales, actúa como señal de importación (véase Tabla 12-3, p. 702). Otras proteínas peroxisomales tienen una secuencia señal cerca del extremo N. Si cualquiera de estas secuencias se une experimentalmente a una prote(na citosólica, la pro­terna es importada a los peroxisomas. El proceso de importación es aún bastante descono­cido, aunque se sabe que están implicadas proteínas receptoras solubles en el citosol que reconocen las secuencias de direccionamiento y prote(nas de anclaje en la superficie citosó­lica del peroxisoma. Al menos 23 protemas diferentes, denominadas peroxinas, participan como elementos del proceso de importación que es impulsado por la hidrólisis de ATP. Un complejo de al menos seis peroxinas diferentes forman un translocador de membrana. Dado que incluso las protefnas oligoméricas no tienen que desplegarse para ser importadas al peroxisoma, el mecanismo es diferente del que utilizan las mitocondrias y los cloroplastos. Al menos un receptor de importación soluble, la peroxina Pex5, acompaña a la proterna im­portada durante todo el proceso hasta el interior del peroxisoma y, después de liberarse de la

111m

CII2-CI12- NII 1

o 1 e

O=P-0 1 o 1

CH2 -CH-CH2 1 1 o o 1 1 CH C=O 11 1 CH CH2 1 1

(CH2ln (CH2ln 1 1

CH1 CH1

Figura 12-32 Electromlcrografla de dos tipos de peroxisomas encontrados en ctluiM vegetales. (A) Peroxisoma con un núcleo paracrlstallno de una célula del mesófilo' una hoja de tabaco. Se cree que la estr~h asociación entre el peroxisoma y el cloro¡ to facilita el intercambio de materiales e-nr estos orgi\nulos durante la fotorrespiracl• (B) Peroxlsomas de una célula almacenad• de lípidos en un cotiledón de una semill.1 tomate, 4 dfas después de germinar. En •· caso, los peroxlsomas (glioxisomas) están asociados con gotitas de llpidos en los qu almacena grasa, lo cual refleja el papel Cf'•

de estos glioxisomas en la movilización dr llpidos y en su utilización para la glucom génesis durante la germinación de la sen• (A. de S.E. Frederick y E.H. Newcomb, J Ctll

Biol. 43: 343-353, 1969. Con la autorización The Rockefeller Press; 8, de W.P. Wergin, PJ. Gruber y E.H. Newcomb,J. Ultrastruct H

30: 533-557,1970. Con la autorización de Academic Press.)

ULO ENDOPLASMÁTICO

·tlculo 1\ITI ~tico

proter.nas espedficas que catalizan ~ ~ '"mport•dóo ,.,, ... ,, : ... ;¡ ~ ... ~ e

vesicula r'0r ~ precursora peroxisoma 0 del perox1soma ' ' "!So ~ ; ' / -\ / ~ ·- ~. -

CRECIMIENTO POR INCORPORACIÓN DE PROTEINAS PEROXISOMALES ESPECIFICAS DESDE EL CITOSOL

peroxisomas hijOS

vut'lve de nuevo al citosol. Estos aspectos del transporte al peroxisoma recuerdan los ~-,s de transporte de protefnas al núcleo.

In (rnportancia de este proceso de importación y de los peroxisomas se pone dramática­de manifiesto en la enfermedad hereditaria humana denominada sfndrome~llweger.

í(lll! un defecto en las proteínas de importación a los peroxisomas conduce a una deli-11 peroxisomal profunda. Estos individuos, cuyas células presentan peroxisomas "va­llenen graves anormalidade~ en el cerebro, hígado, y riñones, y mueren poco después

r. La responsable de una forma de esta enfennedad es una mutación en el gen que co-unn proteína integral de la membrana de los peroxisomas, la peroxina Pex2, implicada nlportación de protefnas. La presencia de un receptor de importación defectuoso para lt~ncia señal N-terminal provoca una enfermedad peroxisomal hereditaria más leve. ha planteado la cuestión de s i los nuevos peroxisomas aparecen a partir de peroxiso­

llrccxistentes por crecimiento y fisión del orgánulo -y por tanto se replican de una tllnónoma como hemo!> mencionado para el caso de las mitocondrias y de los plasti-

,, 1h·rivan como un compartimiento especializado del reúculo endoplasmático (ER). En lad, de algún modo son ciertos algunos aspectos de ambos puntos de vista (Figura

La mayoría de las protefnas de membrana de los peroxisomas se simelizan en el ci-, . !iC insertan en la mcmbr8fla de perox:isomas preexistentes, mientras que otras se in­

primero en la membr8fla del ER desde donde viajan como vesículas especiali.zadas ltsuras de los peroxisomas. Estas vesículas precursoras pueden fusionarse unas con

empezar a importar proteínas peroxisomales adicionales utilizando su propia ma­ria de importación de proteínas para crecer y fom1a un peroxisoma maduro, el cual emrar en el ciclo de crecimiemo y fisión.

u m en

xi-o mas están especialiuulos en/a l'!'alización de reacciones de oxidación que utilizan oxfge­tlar. Generan peróxido de llidrógeno, que es lllilizado confines oxidatii'OS, y contienen ca­

'111· desm1ye el exceso. Como las mitocondrias y los cloroplastos, los peroxisomas son orgdnulos '1'/lcames. Pero CDmo no comienen ni DNA ni ribosomas, rodas sus procelnas están codificadas

·Lo. Algunas de es lOS prore!tLOS se transportan al peroxisoma desde el ER, pero la mayorfa de 111 smtetiuu./m en el citosol. Una secuencia especifica de eres aminodcidos sinuuia cerca del ex­

di' muciUlS de estas pr01elnas cirosólicas acnín como u/UI se tia/ de importación peroxisomal. nlsmo de imporwción de protef1ws es difel'!'nte del de mitocondrias y cloroplastos. ya que in­procefnas oligomt!ricas pueden ser importadas desde el citosol sin desr,legarse.

rrcuLO ENDOPLASMÁTICO la células eucariotas tienen un relfculo endoplasmático (ER: endoplasmic reticu­

Nurmalmente, su membrana constituye más de la mitad del total de la membrana de 1la !véase la Tabla 12-2, p. 697). El ER está organizado en forma de una red laberíntica bulos ramificados y de sáculos aplanados que se extiende por todo el citoplasma

723

Figura 12- 33 Modelo que explica cómo proliferan los peroKisomas y cómo pueden generarse nuevos peroxisomas. Se cree que las vesfculas precursoras de los peroxisomas aparecen por gemación del E R. No se conoce el mecanismo que impulsa el inicio de esta reacción ni cómo se seleccionan únicamente las protefnas peroxísomales para poder empaquetarlas en esas vesfculas -y no protelnas del ERo proteínas destinados a otros lugares en la célula. Las veskulas precursoras de los peroxisomas pueden fundirse con otras o con peroxisomas ya formados. la membrana de los peroxisomas contiene protefnas receptoras de Importación. Los ribosomas Cltosólícos sintetizan proteínas peroxisomales, Incluyendo nuevas copias del receptor de Importación, que después serán importadas al orgánulo. Probablemente también son importados los lfpidos necesarios para el crecimiento de la membrana de las veslculas precursoras de los peroxisomas, aunque algunos de ellos pueden provenir de forma directa del ER. (Más adelante se describirá el transporte de los llpidos sintetizados en el ER a través del citosol hasta otros orgánulos.)

CITO SOL

l NUCLEO PEROXISOMAS

MITOCONDRIA l PLASTOS J RET(CULO ENDOPLASMÁTICO

GOLGI c:T l ENO;--SOMA l

TARO~

[usoL] 1 !

[ENDOSOMA ~PRA~ojj il

-1J VESICULAS DE l

SECRECIÓN

Ti

e EXTERIOR 0-E-LA~C<-:-tL_U_LA~ - 1

724 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

211m IO¡Jm

(Figura 12-34). Los ni bulos y los sáculos están interconectados y su membrana es continua con la membrana nuclear externa. Así, la membrana del bR y la membrana nuclear forman una lámina continua que define un único espacio interno denominado Jumen del ERo tam­bién el espacio de las L'i'sfcultiS tlel ER, y que a menudo ocupa más del lO% del volumen ce­lular total (véa<,e la Tabla 12· l. p. 697).

El ER tiene un papel central en la bio-.fntesis celular y también constituye un almacén intracelular de Ca2• utilizado en las señalizaciones celulares (se describe en el Capítulo 15). La membrana del EH es el lugar de producción de todas las proteínas transmembrana y Lrpi­dos de la mayoría de los orgánulos celulares, incluyendo el propio bR, el complejo de Golgi, lot; lisosomas, los endosomas, las vesículas secretoras y la membrana plasmática. La mem­brana del ER también fabrica la mayor parte de los lípidos de las membranas de las mito­condrias y de los peroxisomas. Además, casi todas las proteínas que serán l>ecretm.las al exterior celular -además de las que acabarán en ellumen del ER, en el complejo de Golgi o en los üsosomas- son transportadas inicialmente allumen del ER.

El ERes estructural y funcionalmente diverso

Diferentes funciones del ER son esenciales para cada célula, pero la importancia relativa de cada una de ellas varía mucho entre los diferentes tipos celulares. Para asumir diversas demandas funcionales, diferentes regiones del EH se han especializado enormemente. Esta especialización funcional implica cambios ex"traordinarios de la estructura del ER, de forma que diferentes tipos celulares pueden presentar distintos tipos característicos de membrana de ER. Uno de los más destacables en el ER mgoso.

La& células de manúfero empiezan a importar la mayoría de proteúms al ER antes de que la cadena polipeptfdica se haya acabado de sintetizar, es decir, que la importación es un proceso cotraducclonaJ (Figura 12-35A). Por el contrario, la importación de las proteínas a

s·~3'

(A) TRANSLOCACIÓN

COTRADUCCIONAL

3'

dsl _: n5l

(B)

/

TRANSLOCACIÓN POSTRADUCCIONAL

Figura 12-34 Micrograffas de fluores< • del retk ulo endoplasmático. <TCG (Al Parte de la red del ERen una célul., de mamífero en cultivo, teñida con un anticuerpo que se une a una protefn.t retenida en el ER. El ER se extiende cor una red por todo el citoplasma de la cd de forma que todas las regiones del c,,, se hallan cercanas a alguna porción dt· membrana del ER. (B) Parte de la red d• en una célula vegetal que ha sido moct• genéticamente para expresar una prot• fluorescente en el ER. (A, cortesfa de H. Pelham; B, cortesfa de Petra Boevlnk y Chris Hawes.)

Figura 12-35 Translocación cotraduccional y postraduccional de proteínas. (A) Durante la translocación cotraduccional los ribosomas se unen a la membrana del ER (B) Por el contrario, después del proceso de translocación postraduccional, los ribosom,, completan la síntesis de la protefna y la liberan.

.O ENDOPLASMA neo 725

ER rugoso ER hso

(0 fumen del ER

Figura 12-36 El ER rugoso y liso. (A) Electrom1crografia que muestra el ER rugoso en una c~lula pancreática exocrina, que cada dla sintetiza y secreta grandes cantidades de enz1mas digestivas. El c1tosol está lleno de sáculos del ER saturados de ribosomas y estrechamente apilados. En la parte superior izquierda se observa una porción del núcleo y de su envoltura; nótese que la membrana nuclear externa, que es continua con el ER. tambi~n está recubierta de ribosomas. (B) Abundante ER hso en una c~lula secretora de hormonas esteroideas. Esta electromicrografía muestra una célula de Leydig secretora de testosterona del testículo humano. (C) Reconstrucción tridimensional de una región de ER liso y rugoso en una c~lula hepática El ER rugoso forma pilas de sáculos aplanados orientadas, con un espaCio fu minal de entre 20 y 30 nm de ancho. El ER liso está conectado a estos sáculos formando una red de tubos finos de un diámetro de entre 30 y 60 nm. (A. cortesía de Leho OrCI, B. cortesla de Daniel S. Friend; C, de R.V Krsti~. Ultrastructure of the Mammalian Cell. New York:

200 nm Springer.Verlag. 1979.)

o<:ondria~. a los cloroplas10s, al nucleo, y a lo!> peroxhomas e~ un proceso postraduc­al (Figura 12-358). Fn el tmn<,portc cotraduccional, el ribosoma que está sintetizando la

na c..,tá unido directamemc a la membrana del ER y permite que un extremo de la pro-lit:: esté tran<,locando al FR mtentra~ el resto de la cadena polipeprfdica todavía se está

mlo. Estos ribosomas unidos a la membrana tapizan la !>uperficil• del LR. generando es denominadas retfculo endoplasmático rugoso o ER rugoso (Figura 12-·36A).

lúS t·'giOne'> del IR que carecen de ribosomas unidos se denominan retfcu lo endo­mritlco liso o ER liso. La mayoría de las célula~ tienen regiones escasas de ER li'io; el EH wrw.íruido por zona;; ltsas y zonas rugosas. Las áreas del EH liso a partir de las que c;e ge­nl.tS vesículas de transporte que contienen protcfnas y lfpidos acabados de sinletizar

r transportados ha'>ta el complejo de Golgi se denominan rm de tran.~íci6n. En deter­.Jdas células especializadas, el ER liso es abundante y desempena otra., fw1ciones. Por plo predomina en células e.,peciali7.ada-; en mCLabolismo lipfdico como son las células hnctii'.an hormonas esteroideas a partir del colesterol; el FR liso muy desarrollado aco

.l.llas enzJma~ que fabrican colesterol y que lo modifican dando lugar a las hormonas (! 1,1 Hgura 12-366). U p:tncipal tipo celular del hfgado, el llepatocito, también tiene un RL liso abundante.

1 prlncrpallugar de producción de partlmlas lipoproceicas. que transportan IIpidos por la Ctlll' sanguínea a otros lugares del organismo. Las enzimas que sintetizan los compo

tcsl1 pldicos de las partfculas están localizada'> en la membrana del ER liso, que también ler11• enzimas que catalizan 1.eries de reacciones que destoxifican los fármacos liposolu­)' C· 11npuestos producidos por el metabolismo que resultan perjudiciales. Las reacciones

1jimci6n más estudiadas están catalizadas por la familia de enzimas de la familia de ·wnomo P450 las cuales catalizan una serie de reacciones en las que fármacos insolu­en agua o metabolitos. que de otro modo podrían acumularse a n.íveles tóxicos en las rrl ,anas celulares, son convertidos en moléculas lo bastante hidrosolubles como para nclonar la célula y ser secretadas por la orina. El ER rugoso no puede albergar un núme­.ufi 1entemente elevado de éstas y de otras enzimas necesarias para estos procesos, por lo

726 Capitulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

(A) L.J 200nm

. .

(B)

microsomas lisos y rugosos

'o 0 o8 ¡o9QQ¡ t}?180

tubo con un gradiente de concentraciones crecientes de sacarosa

cual una proporción imponante de membranas del hepatocito corresponde por lu general a ER liso (Figura 12- 36C; véase la Tabla 12-2)

Otm función crucial del ER en la mayorfa de célula~ eucariotas es la de secuestrar Cal• del citosol. La liberación de Ca21 al citosol a partir del ER, y su posterior recaptura, se produ­ce en muchas respuestas rápidas a las seriales extracelulares, tal como se explica en el Capítulo 15. Una bomba de Cal• transpona ea2~ desde el citosol hasta el lumen del ER, don de elevadas concentraciones de proteínas de unión a Ca2· facilitan la acumulación de Ca2•. En algunos tipos celulares, quiz.i.s en la mayorfa de ellos, existen regiones específicas del ER especializadas en el almacenamiento de Ca2•. Por ejemplo, las fibras musculares tienen una abundante región especializada del ER liso, llamada retfculosarcoplasmático. La liberación y la posterior recaptación de Ca2• por el retfculo sarcoplasmático dispara respectivamente la contracción rápida y la relajación de las miofibrillas durante cada ronda de un ciclo de con­tracción muscular (descrito en el Capítulo 16).

Para esiUdiar las funciones y las camcterfslicas bioqufmicas del ERes necesario aislarlo. En principio esto puede parecer una tarea imposible ya que el ER está muy entremetclado con otros componentes del citoplasma. Afonunadamente, cuando los tejidos o las células se rompen por homogeneización, el ER se rompe en fragmentos que se vuelven a sellar for­mando nwnerosas vesfculas pequei'\as (de unos 100-200 nm de diámetro) y cerradas deno­minadas microsomas. Los microsomas resultan bastante fáciles de purificar. Para el bioquímico, los microsomas representan versiones auténticas en miniatura del ER. que to­davía son capaces de translocar proteínas, gticosilar proteínas, captar y liberar Ca2• y sinte­tizar lípidos. Los microsomas derivados del ER rugoso están tapizados de ribosomas y reciben el nombre de microsomtJS mgosos. Los riboc;omas se encuentran siempre en la su­perficie exterior de dichos microsomas y su interior es bioquímicamente equivalente al es­pacio dellwncn del ER (Figura 12-37A).

En estos hornogenados celulares también se encuentran muchas vesículas de tamaño similar al de los microsomas rugosos, pero sin ribosomas. Estos microsomas lisos derivan en parte de porciones lisas del ER y en parte de fragmentos vesiculados de la membrana plas­mática, del complejo de Golgi, de los endosomas y de las mitocondrias (la proporción depende del tipo de tejido de que se trate). Por consiguiente, mientras que los microsomas rugosos derivan de porciones del ER nrgoso, el origen de los "microsomas lisos" preparados a partir de células homogeneizadas no resulta fácil de determinar. Una excepción im­portante la constituye los microsomas lisos preparados a panir del hígado o de células mus­culares. Debido a las enormes cantidades de ER liso o de retículo sarcoplasmático respecti­vamente, la mayor parte de los rnicrosomas lisos presentes en homogenados de estos tejidos derivan del ER liso. Los ribosomas unidos a los microsomas rugosos hacen que estos micro­somas sean más densos que los lisos. Como resultado de ello, se utiliza la centrifugación de equilibrio para separar los microsomas nrgosos de los lisos (Figura 12-376). Los microso­mas han resultado piezas clave en la determinación de los aspectos moleculares de la fun­ción del ER, como se explica a continuación.

centri­fugación

1 l

'ogg 000

1

Figura 12-37 Procedimiento de aislam..._ para purificar microsomas rugosos y 111011 partir del ER. (A) la electromicrografia <t. una sección ultra fina de fracciones de un ER rugoso purificado muestra una gran abundancia de veslculas recubiertas ele ribosomas. (B) Cuando se sed1mentan le» dot upos de microsomas hasta el equilibrio a trav~s de un gradiente de sacarosa, se separan los dos tipos de microsomas en biM a sus diferentes densidades. (A, cortesfa <t. George Palade.)

ULO ENDOPLASMÁTICO

tNA

(

ELIMINACION DEL PEPTIDO

SE~AL

subunidades ribosomales libres

)

cadena polipeptldica madura

ecuencias señal fueron descubiertas en proteínas ortadasaiERrugoso

CITOSOL

-.¡ptura determinadas proteínas desde el citosol a medida que son sintetizadas. Estas :n:1 ·. -;on de dos tipos: protefnns tmnsmembrana, que sólo son parcialmente trans.loca­U:ll('s de la membrana del P.R y que, por tamo, se mantienen incluidas en ella, y pro-olubles en agut1, que son translocadas por completo a través de la membrana del ER du~ allumen del ER. Algunas de las proteínas transmembrana actúan en el ER, pero otras están destinadas a residir en la membrana plasmática o en la membrana de

nrgánulo. Las proteínas solubles en agua están destinadas a residir en el lumen de un ,u lo o a la secreción. Toda~ estas proteínas, con independencia de su destino posterior,

lhigi<.las a la membrana del ER por una secuencia señal que inicia su translocación a de un mecanismo habitual.

l.n~ S«·cuencias seíial (y con ellas la estrategia basada en la utilización de un péptido se­rn dirigir el transporte de protemas) fueron de~cubienas por primera vez, a principios

.1t!<-ada de 1970, en proteínas de secreción translocadas a través de la membrana del ER .l primer paso hacia su descarga final de la célula. En el experimento clave, el mRNA co-n te de una proteína de secreción fue traducido mediante ribosomas in uitro. Cuando

i•.tema libre de células se omitían los microsomas, la proteína sintetizada era ligera­mayor que la proteína normal secretada; esta longitud extra era debida a la presencia

1'· ·11tido Uder N-terminal. No obstante, en presencia de microsomas derivados del ER 1., producfa una pro tema de tamaño correcto. De acuerdo con la llipócesís de la seiial,

ter" s una secuencia señal que dirige la proteína secretada hacia la membrana del ER, lo~ hidrolizada por una pepridtlStt de sella/ de la membrana del ER antes de que la ca­pohpeptídica se complete (Figura 12- 38). Los sistemas libres de células en los que se ICC transporte de pro temas han proporcionado potentes procedimientos de ensayo pa­

t;nlilicar, purificar y estudiar los diversos componentes de la maquinaria molecular res­hle del proceso de importación de proteínas al ER.

na partícula de reconocimiento de señal (SRP) dirige los péptidos al de ER a un receptor específico de la membrana del ER

tido señal es guiado hasta la membrana del ER por lo menos mediante dos componen­ma partfcuJa de reconocimiento de la señal (SRP: signal-recognitinn parricle), que se une

727

Figura 12-38 La hipótesis señal. Visión simplificada de la translocación de una proterna a través de la membrana del ER. tal como se propuso originalmente. Cuando la secuencia señal emerge del ribosoma, dirige al ribosoma hacia un translocador del ER que forma un poro en la membrana a través del cual el pollpéptido se transloca. Una peptidasa señal, que está estrechamente asociada con el translocador, corta la secuencia señal durante la traducción y la protelna madura es liberada en ellumen del ER justo después de su slntesis. El translocador se cierra hasta que se une el ribosoma, de modo que se mantiene en todo momento la barrera de permeabilidad de la membrana.

728 Capitulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

dominio de pausa de la traducción secuencia senal subunidad pequeña del ribosoma

bolsillo de unión de la secuencia senal

secuencia

subunidad grande del nbosoma

•

molécula del RNAde SRP

señal de , ..__

lacadena ~-~ pollpeptídica nacrente

(A) (B) partlcula de reconocimiento de la señal (SRP)

5ecuencia señal un1da al SRP

al péptido señal y viaja de fonna cíclica entre la membrana del ER y el citosol, y un receptor de SRP presente en la membrana del EH. La SRP es una partrcula compleja formada por seis cadenas polipeptfdicas unidas a una pequer1a molécula de HNA (Figura 12-39). En todas las células se han encontrado SRP y su receptor, lo cual indica que este mecanismo de direccio­namiento de proteínas apareció pronto en la evolución y que ha sido muy conservado.

Las secuencias señal del ER varfan mucho en su composición de aminoácidos, pero to­das ellas tienen ocho o más aminoácidos no polares en su centro (véase la Tabla 12-3, p. 702). ¿De qué forma el SRP puede unirse a secuencias tan diferentes? La respuesta se ha obtenido a partir de la estruclUra deducida de un cristal de proterna SRP, en la que se obser­va que el lugar de unión de la secuencia sei"lal es un gran bolsillo hidrofóbico recubierto con metioninas. Dado que las metioninas tienen una cadena lateral no ramificada y nexible, el bolsillo es suficientemente plástico para acomodar secuencias seriales hidrofóbicas diferen­tes en secuencia, forma y tamaño.

La SRP es una estructura semejante a w1 rodillo que envuelve la !.ubunidad mayor del ri­bosoma, de forma que uno de sus cXLremos se une a la secuencia señal cuando ésta emerge del ribosoma formando parte del péptido acabado de sintetizar. El otro extremo bloquea el lugar de unión del factor de elongación, en la interfa'>e entre las subunidades mayor y menor del ribosoma (Figura 12-39). Este bloqueo para la síntesis de proteínas en cuanto el péptido señal ha salido del ribosoma. Probablemente esta pausa da tiempo suficiente al ribosoma pa­ra unirse a la membrnna del ER antes de que se complete la srntesis de la cadena polipeptfdi­ca, asegurando así que la proteína no se liberará al citosol. Este dispositivo de seguridad puede !>er especialmente importante en el caso de las hidrolasas secretadas y las lisosomales, que liberadas en el cirosol podrfan tener consecuencias negativas; sin embargo, Jac; células que secretan grandes cantidades de hidro lasas toman la precaución añadida de disponer en su citosol de elevadas concentraciones de inhibidores de hidrolasas. La pausa también ase­gura que grc~ndes porciones de Wla proteína que se puede plegar fonnando una estmctura compacta, no lo haga antes de alcanzar el Lranslocador de la membrana del ER. Asf, a dife­rencia de la importación postraduccional de proteínas a la mitocondria y a los cloroplastos, las proteínas chaperonas no son necesarias para mantener desplegadas las proteínas.

Cuando el complejo ribosoma-SRP se ha fonnado, se une al receptor de SRP, que es un complejo proteico integral de membrana embebido en la membrana del HH rugoso. Esta in­teracción w1e el complejo SRP-ribosoma a un translocador de pro ternas. Tanto el SRP como el receptor de SRP son entonces liberados y el Lranslocador transfiere la cadena polipeptídi­ca en crecimiento a Lravés de la membrana (Figura 12-40).

Este proceso de transferencia cotraduccional da lugar a dos poblaciones de rihosomas en el citosol, separadas espacialmente. Los ribosomas wúdos a membrana. anclados a la cara dtosólica de la membrana del ER, participan en la síntesis de proteínas que se Lranslo­can al ER. Los ribosomas Ubres, no unidos a ninguna membrana, sinteli7~n todas las de­más proteínas codificadas por el geno m a nuclear. Los ribosomas unidos a membrana y los ribosomas libres son estructmal y funcionalmente idénticos. Sólo se diferencian en el tipo de proteína que están sintetizando en un momento dado.

Dado que sobre una sola molécula de mRNA se pueden unir muchos ribosomas de for­ma simultánea, por lo general se forman polirribosomas. que quedan unidos a la membrana del ER d irigidos por la<; secuencias señal de muchas cadenas polipeptfdicas en crecimjento (Figura 12--41A). Los ribosomas individuales asociados con una molécula de mRNA de este

Figura 12- 39 Partlcula de reconocimlent de la señal (SRP: s/gnol-recognítion part1• (A) Una SRP de mamífero es un complej• • alargado en forma de rodillo, formado p<.

seis subunidades proteicas y una molé<u de RNA (se muestra en rojo). El RNA del r,1 constituye el esqueleto que une el dom" del SRI, que contaene el bolsillo de unión secuencia señal, al dominio responsablt· . 1

pausar la traducción. La forma tridimen~· del SRP (mostrada en grís) se determinó 1

microscopia crioelectrónica. Las estructu, cristalinas de las diferentes paezas del SRI están encajadas en la envoltura y se muestran como diagramas de varillas. Ur secuencia senal unida se muestra como ullll hélice verde. (B) SRP unido al rlbosoma, visualizado por microscopia crioelectrón• 8 SRP se une a la subunidad mayor del rlbosoma de forma que su bolsillo de u ni· a la secuencia señal queda situado cerca · t lugar de aparición de la cadena nacientt: su dominio de pausa de la traducción qu• ., l en la Interfase entre las 5ubunídades del ribosoma, donde Interfiere con la unión o factor de elongación. (Adaptado de M. Hui

et al., Noture427:808 814,2004. Con la autorización de Macmillan Publishers Ltd

ULO ENDOPLASMÁTICO

translocador proteico

ELSRP UNIDO ALRIBOSOMA

SE UNE AL RECEPTOR DE

SRP DE LA MEMBRANA

DEL ER

protelna receptora del SRP en la membrana del ER rugoso

12 -40 Manera en que las secuencias señal de ER y la SRP dirigen los ribosomas a la membrana del ER. ITCC Se cree que la SRP y la proteína

729

'ni de SRP actuan de forma concertada. La SRP se une a la secuencia señal y al ribosoma, induciendo una pausa en la traducción. El receptor de SRP de br a na del ER, que esté\ formado por dos cadenas pollpeptldlcas, une el complejo SRP-ribosoma y lo dirige al translocador. A trav~s de una reacción muy poco conocida, la SRP y su receptor son liberados, deJando al ribosoma unido al translocador en la membrana del ER. Entonces el translocador

A la (adena pollpeptfdica en la membrana y la transloca a trav~s de la bicapa lipldlca. Una de las protelnas de SRP y las dos cadenas del receptor de SRP en lugares de unión a GTP, por lo que parece que los cambios conformaclonales que ocurren durante los ciclos de unión a GTP e hidrólisis (descritos pítulo 15) aseguran que la liberación de SRP sólo se produzca despu~s de que el ribosoma se una de forma correcta al translocador de la membrana

El translocador esté\ cerrado hasta que el ribosoma se ha unido a ~1. con lo que la barrera de permeabilidad que tiene la membrana del ER •tiene siempre.

mRNA que codifica protefnas citosólicas libres en el citosol

1

\ S'

-3'

5'

polirribosomas libres en el cltosol

CICLO DE LOS RIBOSOMAS LIBRES

~'

~

acervo común de subunidades de ribosomas en el citosol

CICLO SRP '-

~ _,.....3' ' ""' CICLO DE RIBOSOMAS UNIDOS A MEMBRANA

5' t

1 1

el mRNA que codifica una protelna dirig1da al ER

permanece unido membrana del ER a la membrana

1 pollrribosoma unido a la

membrana del ERa través de muchas cadenas

polipeptldicas nacientes

membrana del ER polirrlbosoma

400 nm

a 12 41 Ribosomas libres y rlbosomas unidos a la membrana. (A) Un conjunto común de rlbosomas sintet1zan tanto las protefnas que permanecerán tor.ol como las que serán transportadas al ER. La secuencia señal de ER de una nueva cadena polipeptídica se une a un SRP, que dirige al ribosoma C!Stá traduciendo hacia la membrana del ER. La molkula de mRNA permanece unida de forma permanente al ER formando parte de un polirribosoma, ·11~ los ribosomas que se despla.zan por esta cadena son reciclados; al final de cada ciclo de sfntesis proteica, las subunidades ribosomales se separan y :orporan al conjunto común de subunidades de ribosomas del cltosol. (B) Electromlcrografla de una sección de polirribosomas unidos a la membrana El plano de la sección corta en algunos lugares el ER rugoso paralelo a la membrana y ofrece un aspecto de patrón en forma de rosetón de los

mas. (B, cortesla de George Palade.)

730 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de protefnas

tipo pueden volver al citosol cuando han acabado el proce!.o de traducción y mezclarse con el acervo de ribosomas libres. Sin embargo. el rnRNA permanecerá unido a la membrana del ERa través de la población cambiante de ribosomas, cada uno de los cuales lo une transito­riamente a la membrana a través de su translocador (Figura 12-41 B).

la cadena polipeptídica pasa a través de un poro acuoso del aparato de translocación

Durante mucho tiempo fue objeto de controver;ia si las cadenas polipeptrdicas son transfe­ridas a través de la membrana del ERen contacto directo con la bicapa lipfdica o a travé~ de un poro de un translocador proteico. ri debate finalizó con la identificación del transloca­dor; se demostró que forma un poro acuoso en la membrana a través del cual la cadena po­lipeptfdica atraviesa la membrana. El corazón del translocador. denominado complejo Sec61, está formado por tres subunidades altamente conservadas desde las bacterias hasta las células eucariotas. Recientemente se ha determinado la estructura de Sec61 mediante cristalografía de rayos X. La estructura sugiere que unas hélices Ct de la subunidad mayor en­vuelven un poro cemral a través del cual la cadena polipeptfdica atraviesa la membr.ma (Agura 12-42). El poro se cierra mediante una corta hélice que parece que mantiene cerra­do eltranslocador cuando está inactivo y que se desplaza hacia un lado cuando participa en la transferencia de la cadena polipeptrdica. De acuerdo con este modelo, el poro es una es­tructura cerrada dinámicamente que se abre de forma transitoria cuando una cadena polt­peptfdica atraviesa la membrana. Es importante que un translocador inactivo mantenga cerrado el poro de forma que la membrana permanezca impermeable a los iones. como el Ca2 ·• ya que en caso contrario podrfan salir del ER.

La estructura del complejo Sec61 sugiere que el poro también puede abrirse a lo largo de una junta de uno de sus lados. Esta apertura permite que una cadena peptfdica que se es­tá translocando acceda al corazón hidrofóbico de la membrana, un proceso que es impor­tante tanto para la liberación al interior de la membrana del péptido '>eñal una vez cortado de la cadena (véase Figura 12-38) como para la integración en la bicapa, de proteínas de membrana, como se describirá más adelante.

En las células eucariotas, cuatro complejos Sec61 forman un gran ensamhla¡e tramlo­cador que se puede visualizar sobre los ribosomas tras la solubilización con detergentes de las membranas del FR (Pigurn 12-43). Es probable que en un translocador eucariota no par­ticipen directamente en la translocación de la proteína los cuatro complejo!. Scc61. Algunos de eUos tienen que estar inactivos, proporcionando lugares de unión para el ribosoma y para proteínas accesorias que colaboran en el plegamiento de la cadena polipeplidica a medida que entra en el ER. De acuerdo con e!.te punto de vista, los ribosomas unidos forman una unión estrecha con el translocador, de modo que el espacio del interior del riboso­ma forma un continuo con el lumen del EH y no pueden escaparse moléculas del ER. Alternativamente, la estructura del complejo Scc61 sugiere que el poro del translocador pue de formar un diafragma unido con fuerza alrededor de la cadena que se está translocando e impedir que se escapen del ER otras moléculas.

¡unta lateral

péptido señal

(B)

CERRADO

ABIERTO

tapón

crecimiento de la cadena polipeptldica

tapón desplazado

Figura 12-42 Estructura del complejo Sec61. (A) Vista superior de la estructura ct.l complejo Sec61 de la arquea MethanococM }annaschii, desde el lado c•tosólico de la membrana. En azul y en roJO, se muestra la subunidad a de Sec61; las dos pequeñas subunidades ~y y se muestran en gris. La corta hélice amarilla forma un tapón que sella el poro cuando eltranslocador está cerrado. Para abrirlo, el complejo se reorganiza retirando la hélice del camino de translocaclón. Parece que el poro del complejo Sec61 también puede abrirse lateralmente a lo largo de una junta. (B) Los modelos de los estados cerrado y abierto del translocador Ilustran cómo podrf. ser liberada a la membrana una secuencia señal después de la apertura de la junta lateral. (A, de B. van der Berg et al., Nature 427:36-44, 2004. Con la autorización de Macmíllan Pubhshers Ltd.)

!CULO ENDOPLASMÁTICO

subunidad ribosómica pequeña

subunidad ribosómica grande ......,_

(C)

complejo Sec61

lugar de salida de la cadena naciente en el ribosoma

(O)

lugar de unión al ribosoma

protelnas accesorias

11

lJl translocación a través de la membrana del ER ,o siempre requiere que se esté produciendo 1 crecimiento de la cadena polipeptídica

canal de la subunidad grande por el que

emerge la protelna

translocador proteico en la membrana del ER

mn hemos visto, la translocación de pro temas en el interior de las mitocondrias, los clo­'IIIMOs y los peroxisomas es postraduccional, es decir, que se produce después de que la u:ína haya sido completamente sintetizada y se haya liberado al citosol, mientras que lo ~eneral Ja translocación a través de la membrana del ER tiene lugar durante la traduc­

n (t·s decir, es cotraduccional). Este fenómeno explica por qué los ribosomas se unen a la mhrana del ER pero no a otros orgánulos. Sin embargo, algunas proteínas sintetizadas por completo son importadas por el ER, lo

J demuestra que la rranslocación no siempre requiere de la traducción. La translocación tcica postraduccional es especialmente frecuente a través de la membrana del ERen cé­s de levaduras y a través de la membrana plasmática bacteriana (la cual se cree que está

ionada desde un punto de vista evolutivo con el ER; véase la Figura 12-4). Para poder '.Itr una translocación postraduccional, el transJocador necesita proteínas accesorias lmroduzcan el polipéptido en el poro e impulsen la translocación (Figura 12-44). En las

tc.rias, la proteína motor de translocación, la ATPasa SecA, se une a la cara citosólica del ,lm:ador, donde sufre cambios conformacionales impulsados por la hidrólisis de ATP. vez que una molécula de ATP es hidrolizada, una porción de SecA se introduce en el de translocación y empuja a su interior un corto fragmento de la proteína transportada.

mo resultado de este mecanismo de trinquete, la protefna SecA empuja de forma progre­ala cadena polipeptídica de la proteína transportada a través de la membrana. la célul.as eucariotas utilizan un juego diferente de proteínas accesorias del complejo t 1 stas prote(nas atraviesan la membrana del ER y utilizan un pequeño dominio en la lurninal de la membrana del ER para situar una pro terna chaperona similar a Hsp70 (de­Ir! Ida BiP: binding protein; protefna de unión) sobre la cadena polipeptídica a medida ~ ta emerge en el lumen del ER. La translocación unidireccional es impulsada mediante

de unión y liberación de BiP. como se ha descrito previamente para las proteínas Hsp70 ;e mdriales que atraen las protefnas a través de las membranas mitocondriales. l JIS prote(nas que son transportadas al interior del ER, mediante un mecanismo de locación postraduccionaJ, en primer lugar son liberadas en el citosol, donde evitan ple­uméndose a chaperonas, como hemos descrito al considerar las proteínas destinadas

nutocondrias y a los cloroplastos.

Figura 12-43 Un ribosoma unido a la proteina translocadora eucariota.

731

(A) Reconstrucción del complejo a partir de imágenes tangenciales obtenidas mediante microscopia electrónica. (B) Una visión del translocador visto desde ellumen del ER. Se cree que el translocador tiene cuatro copias del complejo Sec61. (C) Esquema de un ribosoma unido a membrana que se une al translocador con el túnel de la subunidad mayor del ribosoma, a través del cual la cadena pollpeptfdica en crecimiento sale del ribosoma (véase Figura 6-70). (D) Un modelo esquemático de cómo se pueden organizar en el translocador cuatro complejos Sec61 y varias protefnas accesorias. Los puntos rojos Indican los sitios de unión al ribosoma, vistos en una reconstrucción por microscopia electrónica; la circunferencia roja muestra la posición del final del túnel de salida del rlbosoma. No se conoce cuál de los cuatro complejos Sec61 participa activamente en la translocación de la protefna. Los dominios de las protelnas accesorias se extienden a través de la membrana y forman la protuberancia luminal que se ve de perfil en (A). (A, By C, adaptado de J.F. Ménétret et al., J. Mol. Blol. 348:445-457, 2005. Con la autorización de Academic Press.)

732 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y dasificación de protefnas

MECANISMO COTRADUCCIONAL MECANISMO POSTRADUCCIONAL

CITO SOL

LUMEN DEL ER

{A)

BACTERIAS

ARQUEAS

EUCARIOTAS

complejo Sec61

(B) EUCARIOTAS {0

CITOSOL --ESPACIO EXTRACELULAR

BACTERIAS

Figura 12-44 Tres maneras mediante las que se produce la translocaclón de protefnas a través de translocadores estructuralmente similares. (A) Translocación cotraduccional. El ribosoma es arrastrado a la membrana por el SRP y su receptor y se engarza con la proteína translocadora Sec61. La cadena polipeptídica en crecimiento se desliza a través de la membrana a medida que se sintetiza. No hace falta energla adicional, ya que el unico camino posible para la cadena en crecimiento es atravesar la membrana. (8) Translocación postraduccional en células eucariotas. Un complejo adtcional formado por las proteínas Sec62, Sec63, Sec71 y Sec72 se une al translocador Sec61 y deposita las moléculas BiP sobre la cadena que se transloca a medtda que esta emerge en ellumen del ER. Ciclos de unión y separación de BiP Impulsados por la hidrólisis de ATP atraen la protelna hacia ellumen, un mecanismo que recuerda el mecanismo de importación de protelnas mltocondriales de la Agura 12-26. (C) Translocaclón postraduccional en bacterias. La cadena polipeptldlca completa es introducida en el translocador de la membrana plasmática desde el lado citosólico por la ATPasa SecA. Los cambios conformacionales impulsados por la htdrólisis de ATP producen un desplazamiento stmtiM al de un pistón en SecA. que empuja en cada ciclo aproximadamente 20 aminoácidos de la cadena polipeptidtca a través del poro del translocador La vía Sec utilizada por el translocador proteico a través del tilacotde en los cloroplastos utiliza un mecan1smo similar (véase Agura 12-298).

Mientras que tanto los translocadores Sec61, SRP como el receptor de SRP se encuentran en todos los organismos, SecA sólo se encuentra en bacterias y las proteínas Sec62. Sec63, Sec71 y Sec72 en células eucariotas. (Adaptado de P. Walter y A.E. Johnson. Annu. Rev. Ce/l. Bio/. 10:87-119, 1994. Con la autorización de Annual Revlews.)

En las proteínas transmembrana de paso único, queda una sola secuencia señal interna de ER, en la bicapa lipídica, que adopta forma de hélice a y atraviesa la membrana

Parece que la secuencia sei'tal de la cadena polipeptfdica en crecimiento desencadena la apertura del poro de la protcfna translocadora: después de que la secuencia sei'tal se ha libe­rado del SRP y que la cadena en crecimiento ha alcanzado una longitud suficiente. la ~>C­cuencia serial se une a un sitio de unión situado en el mismo poro y abre asf el poro. Por lo tanto, la secuencia E.R es reconocida dos veces: primero por un SRP en el citosol y después por un lugar de unión en el poro del translocador proteico, donde actúa como señaJ de Inicio de transferencia (o péptido de inicio de transferencia) que abre el poro (en la Agura 12-45 se ilustra para el caso de una protefna soluble del EKJ El reconocimiento dual colabora a asegurar que únicamente entrarán en el lumen del EH las protefnas adecuadas.

1\.lientras está unida al poro de translocación, una secuencia señal está en contacto no sólo con el complejo Scc61. que forma las paredes del poro, sino también con el núcleo lipf­dico hidrofóbico de la membrana. Este hecho fue demostrado mediante experimentos de entrecruzamiento en los que se pueden unir de forma covalente la secuencia seiial y las ca­denas hidrocarbonadas de los lípidos. Cuando la cadena polipeptfdica naciente ha crecido bastante, la peptidasa señal de ER corta las secuencias señal y las libera desde el poro a la membrana plasmática, donde rápidamente son degradadas a aminoácidos por otras pro­teasa'> de la membrana del P.R. Para liberar la secuencia señal en la membrana, el transloca­dor debe abrirse de forma lateral. Por lo tanto, el translocador se abre en dos direcciones: fom1ando un poro a través de la membrana que permite a las regiones hldrofílicas de las protefnas atravesar la bicapa lipídica o lateralmente dentro de la membrana permitiendo que las regiones hldrofóbicas de las proteínas puedan situarse en el interior de la bicapa. La apertura lateral del poro es una erapa crucial durante el proceso de integración de las pro­teínas de membrana.

'CULO ENDOPLASMÁTICO

~

NHl

Dn~locador de ptOtelnas Inactivo

NH2 CITO SOL

1 ~ LUMEN DEL ER

g,.2 UJOOH

protefna madura soluble en el lumen del ER

In integración de las protefnas de membrana requiere que algunas zonas de la cadena ptídica sean translocadas a través de la bicapa lipfdica mientras que otras no lo sean. r de esta complejidad adicionaJ, todos los tipos de inserción de las protefnas de mem­son variantes de la secuencia de acontecimientos descrita para la transferencia de

dna~ solubles en la luz del ER. Empezaremos describiendo las tres vías a través de las las proteínas transmembrana de paso único (véase Figura L0-19) son insertadas

li:R rn d caso más sencillo, una secuencia senal N-terminal inicia la translocación iguaJ que cuso de una proteína soluble, pero un segmento hidrofóbico adicional de la cadena po­tftlíca para el proceso de transferencia antes de que toda la cadena polipepúdica se ha­n&locado. Esta señal de paro de la translocaclón ancla la protefna en la membrana 1~ de que la secuencia señal del ER (sei1aJ de inicio de translocación) haya sido libera­ltranslocador y eliminada (Figura 12-46). El mecanismo de apenura lateraJ del poro Ol!rt•la secuencia de paro al interior de la bicapa, donde permanece como un segmen­nsmembrana único en forma de hélice a, con el extremo N-terminal de la proteína en

luminal de la membrana y el extremo C en la cara citosólica. 1 n los otros dos casos. la secuencia señaJ no se localiza en el extremo N-terminal de la jna sino que es interna. Al igual que ocurre en las secuencias señaJ N-terminaJes, el

IMnbién se une a una secuencia interna. El SRP une el ribosoma que sintetiza la pro­. o 1.1 membrana del ER y actúa como señal de inicio de transferencia que empieza la 1t~eación de la protefna. Después de liberarse del translocador, la secuencia interna

secuencia sei'la 1 hidrofóbica de paro de translocación

lugar de unión de la secuencia sei'lal hidrofóbica de inicio de translocación

L.__-----------' protefna translocadora

protefna transmembrana madura en la membrana del ER

733

Figura 12-45 Modelo que explica cómo puede ser translocada una protelna soluble a través de la membrana del ER. Al unirse a la secuencia señal del ER (que actúa como señal de Inicio de translocación), el translocador abre el poro de translocación permitiendo el paso de la cadena polipeptfdica a través de la bicapa lipfdica como un bucle. Cuando toda la cadena polipeptfdlca ha sido translocada, el poro se cierra y se abre lateralmente para que la secuencia señal difunda en la bicapa, donde es degradada con rapidez. (En esta y en las tres figuras que siguen, se han omitido los ribosomas para mayor claridad.)

A gura 12-46 Cómo se integra en la mem­brana del ER una proteína transmembrana de paso único después de la eliminación de la secuencia señal. En este modelo, el proce­so de translocación cotraduccional se inicia por una secuencia señal N-terminal del ER (en rojo) que actúa como señal de Inicio de translocación, como en la Figura 12-45. Sin embargo, además de la secuencia de inicio de translocación, la protelna también contie­ne una secuencia de paro de translocación (en naranja). Cuando la secuencia señal de paro de translocación entra en el translocador e interactúa con un lugar de unión determinado, el translocador cambia de conformación y descarga la proteína lateralmente en la blcapa llpldica.

734 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

de inicio de transferencia permanece en la bicapa lipfdica como una hélice ex que atravie­sa la membrana.

Las secuencias internas de inicio de transferencia se pueden unir al aparato de translo­cación en una de las dos orientaciones; este hecho determina qué segmento proteico (el an­terior o el posterior del péptido de inicio de transferencia) se desplazará a través de la membrana hacia ellumen del ER. En un caso, la protefna de membrana resultante tendrá su extremo e -terminal en la cara luminal (paso A en la Figura 12-47) mientras que en el otro caso, en el lado luminal estará su extremo N-terminal (paso B en la Figura 12-47). La orien­tación de la secuencia de inicio de translocación depende de la distribución de los aminoá­cidos cargados vecinos, tal como se describe en la figura.

Combinaciones de señales de inicio y de paro de translocación determinan la topología de las proteínas transmembrana de paso múltiple

En las proteú1as transmembrana de paso múltiple, la cadena polipeptfdica atraviesa repe­tidamente, de una parte a otra, la bicapa lipfdica (véase la Figura 1 0-19). Se cree que en estas proteínas un péptido señal interno actúa como señal de inicio de transferencia iniciando la translocación, la cual continúa hasta que se alcanza un péptido de paro de translocación. Por ejemplo, en las pro ternas de doble paso, el polipéptido se libera de la bicapa en esta eta­pa (Figura 12-48). En las proteínas de paso múltiple, más complejas, en las cuales existen muchas hélices ex hidrofóbicas que atraviesan la bicapa, una segunda secuencia de inicio de

proteína transmembrana madura en la membrana del ER

proteína transmembrana madura en la membrana del ER

Rgura 12-471ntegracl6n de una protem• transmembrana de paso único con una secuencia señal interna en la membran.t del ER. Una secuencia señal interna del [ 1

que actúa como señal de inicio de translocaci6n, puede unirse altranslocc1!10f de una de las dos vlas diferentes, guiand•. fumen del ER tanto el segmento C-termu •·1 (vía A) como el segmento N-terminal (VId ti de una proteína de membrana. las prote son dirigidas a una u otra de las dos vias según las características de la cadena pollpeptidlca que flanquea la secuencia Interna de inicio de la transferencia: si en '·• cadena hay más aminoácidos cargados positivamente inmediatamente antes dt'l núcleo hidrof6bico de la secuencia de int• de translocaci6n de los que hay despué~. protelna de membrana se Inserta en el translocador en la orientación mostrada t:' ·

vía A, mientras que si hay más aminoácid• cargados positivamente justo después de• núcleo hidrof6bico de la secuencia de lnl• de translocaci6n, la protelna de membran., Insertará en el translocador en la orientac mostrada en la vla B. Debido a que no se puede Iniciar la translocación antes de qu• secuencia de inicio de translocaci6n salga • ribosoma, la translocacl6n del fragmento N-terminal de la proteína mostrada en (Bl solamente tendrá lugar tras la síntesis completa de esta secuencia.

Obsérvese que existen dos rutas que permiten la Inserción de una proteína transmembrana de paso único cuyos aminoácidos N-terminal se sitúen en el fumen del ER: el que se muestra en la Figura 12-46 y el que se muestra en (B).

ULO ENDOPLASMÁTlCO

lugar de lugar de unión de la unión de la secuencia sella! secuencia sei'lal hidrofóbica hidrofóbica de paro de de inicio de translocación translocación

protefna translocadora protelna transmembrana

madura en la membrana del ER

,lt><::lción reinicia la translocación de la cadena, la cual se produce hasta que se alcan7..a 1lc·nte secuencia de final de translocación. y así sucesivamente para posteriores se-as de inicio y de final de translocación (Figura 12-49).

Una secuencia sei'laJ hidrofóbica determinada actuará como una secuencia de inicio o ro dependiendo de su localización en la cadena polipeptfdica. ya que su función se cumhiar si se modifica su posición en la proteína mediante técnicas de DNA rccom-

tc. Así, la distinción entre secuencias de inicio y de paro de translocación depende, nwntalmente, del orden en el que se suceden en la cadena polipeptfdica naciente. que la SRP empieza buscando los segmentos hidrofóbicos de la cadena polipeptfdi­

plcgada empezando por su extremo N-temlinal, y va progresando hacia el extremo 11inal, en la misma dirección en la que se va sinteli7..ando la proteína. La SRP reconoce

mcr segmento apropiado y, por lo tanto. lija la "pauta de lectura" correspondiente para ••¡;roc1ón en la membrana: tras el inicio de la translocación, el translocador reconoce el 1110 segmento hidrofóbico en el sentido de la translocación como una secuencia de pa­trnnsJocación, lo cual originará que la región de la cadena polipeptfdica comprendida mhos segmentos hidrofóbicos se insene a trav6s de la membrana. Un proceso similar .queda continúa hasta que todas las regiones hidrofóbicas de la proteína se han inser-

COOH

100 200 número de aminoácidos (C)

1 inicio paro l 1 inicio paro OOH

1 1 inicio paro l

735

Figura 12-48 integración en la membrana del ER de una proteína transmembrana de paso doble con una secuencia señal de ER interna. En esta proteína, una secuencia señal de ER interna actúa como señal de inicio de translocación (como en la Figura 12-47) e inicia la translocación de la región e-terminal de la proteína. En algún momento después de que la secuencia de paro de translocación penetre en el translocador, éste descarga lateralmente la secuencia en la membrana.

Figura 12-49 Inserción de la rodopsina, una protelna de membrana de paso múltiple, en la membrana del ER. La rodopsina es la protelna sensible a la luz de los fotorreceptores de las células de la retina de los mamlferos (descrita en el Capitulo 15). (A) Un gráfico de hidrofobicidad identifica siete cortas regiones hidrofóbicas en la rodopsina. (B) La región hidrofóbica próxima al N-terminal actúa como señal de inicio de translocadón, haciendo que la reg16n N-terminal anterior atraviese la membrana del ER. Los péptidos hidrofóbicos siguientes actuarán alternativamente como señales de Inicio y de paro de translocación. (C) La rodopsina integrada por completo tiene su extremo N-terminal situado en el lumen del ER y su extremo ( -terminal localizado en el citosol.los hexágonos azules representan oligosacáridos unidos covalentemente. Las flechas indican las parejas de señales de inicio y de paro que se han insertado en el translocador.

736 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

Puesto que las proteínas de membrana siempre son insertadas a partir de la cara cito­sólica del ER, si se sigue este sistema programado todas las copias de la misma cadena poli­peptfdica tendrán la misma orientación general en la bicapa. Esto genera una membrana del ER asimétrica en la que los dominios de proteína expuestos en una cara son diferentes de los que están expuestos en la otra cara. Esta asimetría se mantiene durante los diversos pro­cesos de gemación y fusión de membrana que se producen al transportar las proteínas fa­bricadas en el ERa otras membranas celulares (explicado en el Capítulo 13). Por lo tanto, la vía por la cual una proteína recién sintetizada es insertada en la membrana del ER determi­na la orientación de la proteína también en otras membranas.

Cuando en el laboratorio se disocian proteínas de una membrana y se reconstituyen en vesfcuJas lipídicas artificiales, por lo general se obtiene una mezcla al azar de orientaciones dentro-fuera de las proteínas. Por eUo, parece que la asimetría de las proteínas que se obser­va en las membranas celulares no es debida a las propiedades inherentes de la proteína sino que es el resultado del proceso por el que las proteínas son insertadas en la membrana del ER desde el citosol.

Las cadenas polipeptídicas translocadas se pliegan y se ensamblan en ellumen del ER rugoso

Muchas de las proteína~ presentes en ellumen del ER sólo están en tránsito, en nua hacia otros deslinos; sin embargo, otras residen normalmente en el ER y se hallan en elevadas con­centraciones. Estas proteínas residentes del ER presentan en su extremo C-terminal una señaJ de retención e n el ER de cuatro aminoácidos, que es responsable de que la proteína quede retenida en el ER (véase la Tabla 12- 3; descrito en el Capítulo 13). Algunas de estas proteínas actúan como catali7.adorcs que ayudan a otras muchas proteínas, que son trans locadas al ER, a plegarse y a ensamblarse de forma correcta.

Una protefna importante residente en el F.R es la protefna disulfuro isomerasa (PDI), que catali'l..a la oxidación de los grupos sullhidrilo libres (SI 1) de las cisternas fonnando enlaces disulfuro (S-Sl. Casi todas las cisternas de los dominios proteicos expuestos al espacio extra celular o allumen de los orgánulos en la vía endocflica o secretora están unidos por enlace~ disulfuro. Por el contrario, se forman muy pocos enlaces disulfuro en los dominios expues­tos al citosol debido a que es un ambiente reductor.

Otra protefna residente del ERes la proteína chaperona DI P. Ya hemos explicado cómo BiP atrae las proteínas después de su traducción hacia el interior del ERa través del translo­cador del ER. Como otras chaperonas, BiP reconoce a las protefnas plegadas de forma incorrecta, así como a las subunidades proteicas que aún no se han ensamblado en sus com­plejos olígoméricos. Realiza esta función uniéndose a secuencias de aminoácidos expuestos que normalmente están escondidos en el interior de las cadenas polipeptídicas que están plegadas o ensambladas de forma correcta. Un ejemplo de un lugar de unión de BiP es una secuencia de aminoácidos hidromicos e hidrofóbicos que habitualmente estarfan ocultos en una lámina ~- Cuando BiP se ha unido a la proteína, evita su agregación y ayuda aman­tener las proteínas en el ER (y por tanto fuera del complejo de Golgi y de otras etapas poste­riores de la ruta de secreción). Como en el caso de otros miembros de la famiüa de proteínas Hsp70, que se unen a proteínas no plegadas y facilitan su importación a las mitocondrias y a los cloroplastos, la proteína BiP hidroliza ATP obteniendo la energía necesaria para ayudar a las proteínas a Lranslocarse postraduccionalmente al interior del ER. Thmbién facilita el plegado de éstas y otras proteínas.

La mayoría de proteínas sintetizadas en el ER rugoso son glucosiladas por la adición de un oligosacárido común unido a N

la adición covalente de azúcares a las proteínas es una de las principales funciones biosin­téócas del ER. Alrededor de la mitad de las proteínas eucariotas están glucosiladas. la ma­yoría de las proteínas solubles y unidas a la membrana que son fabricadas en ellumen del ER -incluyendo las destinadas a ser transportadas al complejo de Golgi, los lisosomas, la membrana plasmática o al espacio extracelular- son glucoproteínas. Por el contrario, muy pocas proteínas del citosol están glucosiladas y las que lo están contienen una modificación de azúcares muy senci.llo: la adición de un grupo N-acetilglucosamina a un residuo serina o treonina de la proteína. '"

CULO ENDOPLASMÁTICO

Agura 12-50 El precursor del oligosacárido unido a asparagina (unido a N) que es añadido a la mayorla de las protefnas en la membrana del ER rugoso. Los cinco residuos de azúcar mostrados n la zona gris forman la •región central" de este oligosacándo. En el complejo de Golgi se produce

una profunda reordenación y recorte de los azúcares y en muchas glucoprotefnas únicamente sobreviven a este proceso estos cinco residuos. Sólo se glucosilan las asparaginas que se hallan en la secuencia Asn·X·Ser o Asn·X·Thr (siendo X cualquier aminoácido que no sea la prolína). Estas dos secuencias se presentan en frecuencias mucho menores en glucoprotefnas que en protefnas citosólicas no glucosiladas; sin lugar a dudas, durante la evolución de las protefnas ha habido una presión selectiva en contra de estas secuencias, probablemente porque la glucosilación en demasiados residuos podrfa interferir con el plegamiento de la protefna.

Un avance importante en la comprensión del proceso de glucosllaclón proteica fue el :ubrimiento de que en el ER se transfiere en bloque a las protcfnas un oligosactírido pre­

'llo (compuesto de N-acetilglucosamina, manosa y glucosa, con un total de 14 residuos licar). Dado que este oligosacárido siempre es transferido al grupo NH2 de la cadena la-

1 de un residuo de asparagina, se le denomina N-oligosacárido o unido a asparagina un 12-50). La transferencia está catalizada por un complejo eru.imático, una oligosacá­transferasa, que se halla unida a la membrana, y cuyo sitio activo está expuesto a la su­

fide luminal de la membrana del ER, lo cual explica por qué las protefnas citosólicas no glucosiladas de esta manera. Una molécula lipfdica especial, denominada doUcol, man-

ci oligosacárido precursor en la membrana del ER. Transfiere esta cadena de oligosa­ln a la asparagina diana a través de una sola etapa enzimática inmediatamente después

<IUC este aminoácido aparezca en ellumen del ER durante la translocación de la protefna ~m 1 2-51). Una copla de la oligosacárido transferasa está asociada a cada translocador

llrOtcfna, permitiéndole escanear y glucosilar de forma eficiente la cadena polipeptfdica lllt:

1~ oligosacárido precursor está unido allipido dolicol mediante un enlace fosfato de al­·ncrgfa, el cual proporciona la energfa de activación necesaria para la reacción de gtuco­lón ilustrada en la Figura 12-51. El oligosacárido completo se construye azúcar a azúcar

esta molécula de U pido unido a la membrana y después es transferido a una proteína. :ticares son activados primero en el citosol mediante la formación de intennediarios r·nucleótido, que ceden su azúcar (directa o indirectamente) allfpido, siguiendo una ncla ordenada. En pane a través de este proceso, el oligosacárido unido al lfpido es tocado con la ayuda de un transponador, desde la cara citosólica a la luminal de la brana del ER (Figurn 12-52).

H O ;-N-C-~-;xL-iScrb - 1 1 J l Thrl . -'

H{CH1 cadena 1 lateral de C =O asparagina 1

NH 1

glucosa .. ....... manosa= .

N-acetll glucosamma •

737

Agura 12- 51 Glucoslladón de una protefna en el ER rugoso. Casi inmediatamente después de que la cadena pollpeptfdica entre en ellumen, se glucosila sobre los residuos de asparaglna diana. El oligosacárido que se muestra en la Figura 12-50, se transfiere a la asparagina en bloque, en una reacción que cataliza la enzima oligosacdrldo transferasa. Como en el caso de la peptldasa senal, una copia de esta enzima está asociada con cada uno de los translocadores de protefnas en la membrana del ER. (El rlbosoma no se muestra.)

738 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

lUMEN DEL ER

(Man)9(GicNAch

(Gic)J(Man)g(GicNAch -< P

bicapa lipldica de la membrana del ER

CITO SOl

L m f---rroi>

t-GicNAc

+ UMP

p ~· p r- (GicNAch

- Man

P..- (GicNAch(Man)s

dador de manosa producrdo a partir de dollcol fosfato y de GOP-manosa

- dador de glucosa producido a partir de dolicol fosfato y UOP-glucosa

Toda la diversidad de estructuras de N-oligosacáridos que se preseman en las gluco­protefnas maduras se produce por modificación posterior de la estructura del oligosacárido precursor. Todavía en el ER, se eliminan rápidamente de los oligosacáridos de la mayorfa de las glucoprote[nas tres residuos de glucosa (véase Figura 12-50) y uno de manosa. Más adelante se analizará la importancia de la eliminación de las glucosas terminales. Estos "re­cortes" o "procesamiento" del oligosacárido continúan en el complejo de Golgi, como se describe en el Capítulo 13.

Los N-oligosacáridos son, con gran diferencia, los oligosacáridos más comunes de los que se encuentran en el 90% de todas las glucoproteinas. Con menos frecuencia, los oligo­sacáridos están unidos al grupo hidroxilo de la cadena lateral de un residuo de serina, treo­nina o hidroxilisina. Estos 0 -oligosacdridos se forman en el complejo de Golgi.

los oligosacáridos actúan como etiquetas que marcan el estado del plegamiento de las proteínas

Existen varias hipótesis para explicar por qué la glucosilación es una modificación tan co­mún en las proteínas que entran en el ER. Una observación especialmente clarificadora es que algunas proteínas requieren ser N-glucosiladas para poderse plegar de forma correcta en el ER. aw1que parece que la posición de los oligosacáridos wtidos a la superficie de la prorefna no es importante. Una clave para entender el papel de la glucosilación en el plega­miento de las proteínas procede del estudio de dos proteínas chaperonas del ER denomina­das calnexina y calreticulina porque ambas requieren Ca2+ para su actividad. Estas chaperonas son proteínas de unión a carbohldratos, o lectinas, que se unen a los oligosacá­ridos de proteínas plegadas de forma incompleta y las retienen en el ER. Como otras chape­ro nas, evitan que proteínas plegadas de forma incompleta se agreguen irreversiblemente. Tanto la calnexina como la calreticulina también facilitan la asociación de proteínas plega­das de forma incompleta con otras chaperonas del ER que se unen a cisternas que aún no participan en enlaces di~ulfuro.

Tanto la calncxina como la calreticulina reconocen N-oligosacáridos que contienen una sola glucosa en posición terminal, por lo que sólo se unen a proteínas después de que las ER

Agura 12-52 Sin tesis del precursor del oligosacárido unido a lipldo en la membrana del ER rugoso. El oligosacárrd•) se va construyendo azúcar a azúcar, sobll· lipido portador dolicol (un poliisoprenoid• véase Panel 2-S, pp. 114-1 15). El dolicolt largo y muy hidrofóblco: sus 22 unidade·. • cinco carbonos pueden atravesar el groso• la bicapa lipidica más de tres veces, de fo11 que el oligosacárido que se une a él qued.• firmemente anclado a la membrana. El primer grupo de azúcar se une al dolicol través de un enlace pirofosfato. Este enla• de alta energia activa el oligosacárido par su rransferencla desde elllpido hasta un.J cadena lateral de la asparagina de un polipéptldo naciente sobre la cara lumin.r del ER rugoso. Como se ha indicado, la sintesis del oligonucleótido comienza en 1

cara dtosólica de la membrana del ER y continúa sobre la cara luminal, después d• que el lipido intermediario (Man)s(GlcNAr) haya sido transferido a través de la membrana. Todas las reacciones siguientt de transferencia de grupos glucosilo, qu1 producen en la cara luminal del ER, imph<·• el transporte de dolicoi-P-glucosa y de dollcoi-P-manosa; estos monosacáridos activados unidos a lipidos, se sintetizan a partir de dolicol fosfato y de UDP-9Iucosa o de GDP·manosa (lo más apropiado) soi.Jr1 la cara citosólica del ER y parece que posteriormente son transportados (flip-flop) a través de la membrana del ER GlcNAc - N-acetllglucosamina; Man = manosa; Glc = glucosa.

CULO ENDOPLASMÁTICO

idasas hayan eliminado dos de las tres glucosas del oligosacárido precursor. Cuando diminado la tercera glucosa, la proteína se separa de su chaperona y puede por lo tan­

hnndonar el ER. iCómo es posible, entonces, que calnexina y calreticulina diferencien de forma adecua­'lltrc proteínas plegadas de forma completa o de forma incompleta? La respuesta radica ,tm enzima del ER, una glucosil transferasa que añade una glucosa a aquellos oligosacá­

t¡ue han perdido su última glucosa. Sin embargo, sólo añade la glucosa a los oligosacá­t¡ue se encuentran unidos a proteínas desplegadas. Así pues, una proteína desplegada dclos continuos de eliminación de glucosas (por glucosidasas) y de adición de gluco-

1!01 glucosil transferasas), manteniendo su afinidad por la calnexina y por la calreticulina il que se pliega por completo (Figura 12-53).

proteínas mal plegadas son exportadas desde el ER degradadas en el citosol

:~r de la acción de las chaperonas, muchas moléculas proteicas (más del 80% en algu-t"n<ios) translocadas al ER no llegan nunca a plegarse correctamente o a oligomcrizar.

proteínas son exportadas desde el ER de nuevo al citosol y degradadas. El mecanismo trotranslocación, también denominado dislocación, todavía es desconocido, pero es

hahlc que sea similar a otros sistemas de translocación postraduccionales. Por ejemplo, ~)en el caso de la translocación a las mitocondrias o a los cloroplastos es probable que llt~esarias las chaperonas para mantener la cadena polipeptídica en un estado desple­nntes y durante el transporte. De forma similar, se necesita una fuente de energía para

nonar la direccionalidad del transpone y para atraer la proteína hacia el citosol. Por :lo probablemente es necesario un translocador compuesto por algunos de los mismos ll<lllentes que se utilizan para el transpone hacia el ER (como Sec61). Comprender el proceso de selección de proteínas del ER para su degradación constitu­l,vía un reto. Las proteínas mal plegadas o las subunidades proteicas no ensambladas

11 •l'f degradadas, pero no las proteínas acabadas de sintetizar. todavía a medio plegar. 1 :osacáridos unidos a N colaboran en este proceso de diferenciación entre ambos ti­

te proteínas, ya que actúan como temporizadores que miden cuánto tiempo ha pasado proteína en el ER. Parece que la lenta hidrólisis de una manosa particular del cora7.6n tbol de oligosacárido por una enzima (una manosidasa) del ER genera una nueva es­uro de oügosacárido que reconoce el aparara de retrotranslocación. Por tanto, las pro­

que se pliegan y salen del ER más rápidamente que la acción de la manosidasa, Jlar \n de la degradación.

~N'-(¡_.AS

(}

p. cosa

~

glucosll transferasa

membrana del ER

) ( _)

\ glucosidasa

calnexína

SAUOA DEL ER

oligosacárido unido a N

LUMEN DEL ER

CITOSOL

739

Figura 12-53 Papel de la glucoslladón en N en el plegamiento de las protelnas en el ER. La calnexina, protelna chaperona unida a la membrana del ER, se une a las protelnas plegadas de forma incompleta que sólo contienen una glucosa en sus oligosacárídos unidos a N, reteniéndolas en el ER. La eliminación de la glucosa terminal por una glucosidasa separa la proteína de la calnexlna. Una glucosil transferasa es la enzima critica que determina si la protelna está bien plegada o no: si la protelna aún está incorrectamente plegada, la enzima añade una nueva glucosa al oligosacándo un1do a N a partir de UDP-glucosa, renovándose su afinidad por calnexina que la retiene en el ER. El ciclo se rep1te hasta que la protelna se ha plegado por completo. La calretlculina funciona de una manera similar, con la diferencia de que se trata de una proteína soluble residente en el ER. Otra chaperona del ER, ERp57 (no mostrada), colabora con la calnexina y la calretículina en la retención en el ER de las protelnas mal plegadas.

740 Capítulo 12: Compartimientos int racelulares y clasificación de proteínas

CITOSOL

\ chaperona

ubiquitlna '

N-91ucanasa

protelna mal plegada

.~· ,,.,., ••

1 proteosoma

Cuando una proteína mal plegada ha sido retrotranslocada al citosol, una N-glicanasa elimina sus cadenas de oligosacáridos en bloque. El polipéptido desglucosilado es ubiquiti­nizado con rapidez por enzimas con jugadoras de ubiqultina unidas al ER y es introducido en los proteosomas (descrito en el Capítulo 6), donde será degradado (Figura 12-54).

Las proteínas mal plegadas en el ER activan una respuesta a proteínas desplegadas

Las células controlan cuidadosamente la cantidad de proteínas mal plegadas que hay en va­rios compartimientos. Por ejemplo, una acumulación de proteínas mal plegadas en el cito­sol desencadena una respuesta a choque cénnico (descrita en el Capítulo 6), que estimula la transcripción de los genes que codifican las chaperonas citosólicas, las cuales ayudarán a volver a plegar las proteínas. De una manera similar, una acumulación de proteínas mal ple­gadas en el ER desencadena una respuesta a protefn as desplegadas, que incluye un au­mento de la transcripción de genes que codifican las chaperonas del ER, proteínas que participan en la retrotranslocación y degradación de protefnas en el citosol, y muchas otras proteínas que colaboran a incrementar la capacidad de plegamiento de proteínas del ER.

¿Cómo pueden las proteínas mal plegadas en el ER enviar una señal al núcleo? Existen tres vfas paralelas que ejecuta la respuesta a proteínas desplegadas (Figura 12-SSA). La pri­mera vfa, que se descubrió en células de levadura, es en especial destacable. Las proteínas desplegadas en el ER activan una proteína quinasa transmembrana del ER que hace que la quinasa oligomerice y se autofosforile. (Algunos receptores de superficie de la membrana plasmática se activan de forma similar, como se explica en el Caprtulo 15.) La oligomeriza­ción y autofosforilación activa un domlnlo endorribonucleasa en la porción citosólica de es­ta molécula, que rompe en dos posiciones una molécula de RNA citosólica determinada y elimlna un inrrón. Los exones separados se unen por una RNA ligasa, generando un mRNA maduro que es traducido y produce una protefna reguladora de genes activa. Esta proteína activa la transcripción de genes que participan en la respuesta a proteínas desplegadas (Figura 12-558).

Las protefnas mal plegadas también activan otra quinasa rransmembrana del ER, que fosforila e inhibe un factor de iniciación de traducción, reduciendo así la producción de más protefnas en toda la célula. Una consecuencia de la reducción de la traducción proteica con­siste en reducir el flujo de proteínas al ER, limitando la carga de proteínas que necesitan ser plegadas. Sin embargo, algunas proteínas son traducidas sobre todo cuando los factores de transcripción son escasos (véase p. 490); una de ellas es una proteína reguladora de genes que ayuda a activar la transcripción de genes que codifican proteínas activas en la respues­ta a proteínas desplegadas.

Por último, una tercera prote!na reguladora de genes es inicialmente sintetizada como una proteína integral de membrana del ER. Dado que está unida de forma covalente a la membrana, no puede activar la transcripción de genes en el núcleo. CUando se acumulan

Figura 12-54 Exportación y degradación de protelnas mal plegadas del ER. Las protefnas solubles mal plegadas del lum del ER, son devueltas al cítosol; en esta l<

son desglucosiladas. ubiquitlnizadas y degradadas en proteosomas. Las protefnas de membrana mal plegadas siguen una ruta similar.

ICULO ENDOPLASMÁTICO 741

(A)

(B)

,----sensores de protelnas mal plegadas

1

• LA FOSFORILACIÓN INACTIVA El FACTOR DE INICIO DE LA TRADUCCIÓN

REDUCCIÓN 1 DE PROTEfNAS

QUE ENTRAN AL_~R

LA MADURACIÓN CONTROLADA TRADUCCIÓN

DEL mRNA INICIA SELECTIVA DE LA TRADUCCIÓN DE . -

PROTE[NA 1 PROTE[NA 2 REGULADORA DE GENES REGULADORA DE GENES

'\ .

LA PROTEOLISIS REGULADA

LIBERA

• PROTEINA 3 REGULADORA DE GENES

ACTIVAciÓN DE GENES QUE AUMENTAN- LA cAPACIDAD DE PLEGAMIENTO DE LA PROTEINA EN EL ER

Figura 12-55 la respuesta a las protelnas desplegadas. (A) Mediante tres vlas paralelas

de senalización intracelular, la acumulación

de protefnas mal plegadas en el ER envla una

señal al núcleo, induciendo la activación de

la transcripción de genes que codifican

protelnas que ayudan a la célula a gestionar

est a gran cantidad de proteínas mal plegadas

del ER. (B) La maduración controlada del

mRNA es una pieza clave en la vfa 1 de

respuesta a protelnas desplegadas .

protefna mal plegada unida a chaperona

protefna mal plegada 1 LAS PROTEfNAS MAL PLEGADAS EN EL

ER ENVIAN UNA SEtiiAL QUE ESTIMULA LA PRODUCCIÓN DE MÁS CHAPERONAS DEL ER, ACTIVANDO UNA QUINASA TRANSMEMBRANA

protelna' quinasa transmembrana

(sensor) -pre·mRNA

LUMEN DEL ER

p

dominio

~ 3

ribonucl~asa

::...... ~ • mtrón - \ 4 mRNA Jlllll!l-111!1

exón exón

'""'~ ''9"'''"' ,, l la expresión génica -

mRNA de chaperona

2 LA QUINASA ACTIVADA ADQUIERE ACTIVIDAD RIBONUCLEASA

) LA ENDORRIBONUCLEASA CORTA MOL~CULAS DE mRNA ESPECIFICAS EN DOS SITIOS, ELIMINANDO UN INTRÓN

4 LOS DOS EXONES SE UNEN Y FORMAN UN mRNA ACTIVO

-,

S EL mRNA ES TRADUCIDO PRODUCIENDO UNA PROTEINA REGULADORA DE LA EXPRESIÓN G~NICA

6 LA PROTEINA REGULADORA DE LA EXPRESIÓN G~NICA ENTRA EN • EL NÚCLEO Y ACTIVA GENES QUE CODIFICAN CHAPERONAS DEL ER J

7 LAS CHAPERONAS SE SINTETIZADEN EL ER DONDE AYUDAN A PLEGAR CORRECTAMENTE LAS PROTEINAS

f! ts mal plegadas en el ER, la proteína transmembrana es transportada al complejo de . dunde encuemra proteasas que separan su dominio citosólico, el cual ahora puede r al núcleo y colaborar en la activación de la transcripción de genes que codifican pro·

s 1¡ue participan en la respuesta a proteínas desplegadas. La importancia relativa de una de estas tres vías es distinta en tipos celulares diferentes, permitiendo que cada

celular diseñe una respuesta específica a protefnas desplegadas de acuerdo con sus ne­l;ttll's particulares.

742 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

Algunas proteínas de membrana adquieren un anclaje covalentemente a glucosilfosfatidilinositol (GPI)

Como se ha explicado en el CaprtuJo 10, algunas enzimas citosólicas catalizan la adición co­valente de una cadena de ácido graso o de grupo prenilo a determinadas p roteú1as. Los lrpidos unidos contribuyen a dirigir estas proteínas hacia las membranas celulares. Determinadas enzimas del FR catalizan un proceso relacionado con éste, que consiste en unir covaJeme­mente un anclaje glucos llfos fatldllinosltol (GPI: glycosylphosplwridylinosico{) al extremo C de algunas proteínas de membrana deMinadas a la membrana plasmáuca. Esta unión se for­ma en ellumen del ER donde, al mismo tiempo, o;e elimina el segmemo transmembrana de la proteína (Figura 12-56). De esta manera son modificadas un gran número de proteínas de la membrana plasmática. Dado que estas proteínas están unidas a l exterior de la membrana plasmática exclusivamente a través de MI anclaje GPI, en principio pueden ser Liberadas de las células en fom1a soluble en respuesta a señales que activen una fosfolipasa de la mem­brana plasmática. Por ejemplo, la especie panisita tripanosoma u u liza esw mecanismo pa· ra liberar su cubierta de proteínas unidas a GPI cuando sufre el ataque del sistema inmunitario. Los anclajes GPltambién ... e utilizan para dirigir a las proteínas hacia las balsas lipídicas y asi separar'>e de otra'> proteínas, como -.e desnibe en el CapíttJio 13.

La mayoría de las bicapas lipídicas de membrana son ensambladas en el ER

La membrana del ER sintetiza casi todas las clases imponantes de lfpidos mcluyendo los fos­folípidos y el colesterol necesarios para la elaboración de nuevas membranas celulares. U principal fosfolípido fabricado es lafosfmidilcolina (también llamado leciclna). que puede formaro;e en tres etapas a partir de colina, dos ácidos grasos y glicerol fosfato (Figura 12-57). Cada etapa está catalizada por enzimas de la mcmbrdna del ER que tienen sus lugares acu vos dispuestos hacia el citosol, donde se encuentran los metabolitos necesarios. Por lo tan-

CITOSOL glucosilfosfatidilinositol

.3 COOH

1 NH2

péptido C·termlnal eliminado

1 proteína un•da covalentemente a la membrana mediante un anclaje GPI

Figura 12- 56 Unión de un anclaje GPl a una proteína en el fR. Inmediatamente después de que la proteína sea sintetizada, el precursor permanece anclado a la membrana del ER mediante una secuencia señal ( -terminal hidrofóbica de 1 S a 20 ammoácldos; el resto de la proteína se encuentra en ellumen del ER. En menos de un minuto, una enzima del ER corta la proteína,liber~ndola de su extremo C·termmal unido a la membrana y, de forma simultánea, une el nuevo extremo (-terminal a un grupo amlno de un intermediario GPI preformado. La cadena del azúcar contiene un mositol unido a los lipidos, de lo que proviene el nombre de GPI (glycosylphosphotidylinosítof). El resultado es una glucosamína y tres manosas. La manosa terminal se une a una fosfoetanolamína que proporciona el grupo de amino~cídos necesario para unir la proteína. La señal que especifica esta modificación se encuentra en la secuencia hidrofóbica C. terminal y en algunos aminoácidos adyacentes a ella sobre la cara luminal de la membrana del ER; sí esta señal es añadida a otras proteínas, éstas también son modificadas de esta forma. Debido a este anclaje lipídíco covalente,la proteína permanece unida a la membrana: al principio, con todos sus amino<kídos expuestos en la cara luminal del ER y, finalmente, en el exterior celular.

CULO ENDOPLASMÁTICO

8 R

LUMEN DEL ER

q_ glicerol 3 fosfato

p

T CH - CH-Cit 1 1 1 2

OH OH

ácido fosfatldico

P,

4 J -

CDP-<olína

011 1

CH2-CI-i-GI1 1 1 o o

diacilglícerol

743

p

p

r CH2-CH-Cit1 1 1 o o

Figura 12-57 Slntesis de fosfatldllcollna. Como se Ilustra, este fosfollpldo es sintetizado a partir de glicerol 3-fosfato, citidina-difosfocolina (CDP-collna) y ácidos grasos liberados en el ER por protelnas que unen ácidos grasos.

fntesis de fosfolfpidos sólo tiene lugar en la cara citosólica de la membrana del ER. 11 que los ácidos grasos no son solubles en agua, son transportados desde su lugar de

is en el ER por unas proteínas de unión a ácidos grasos del citosol. Tras llegar a la mem­dd ER y ser activados por CoA. las acil-transferasas añaden consecutivamente dos áci­

srnsos al glicerol fosfato produciendo ácido fosfatrdico. El ácido fosfatfdico es lo bastante 'luhle en agua como para permanecer en la bicapa lipfdica después y no ser extraído de

pa por las proteínas de unión a ácidos grasos. Por lo tanto, esta etapa es la que hace r la bicapa lipfdica del ER. Las últimas etapas determinan el grupo de cabeza de lamo­

l¡¡ lipfdka recién ~intctizada y, por tanto, la naturale7.a quhnica de la bicapa. pero no su­n un crecimiento neto de la membrana. Los otros dos fosfolfpidos mayoritarios de 1hrana - la fosfatidile tanolamina y la fosfatidilserina- al igual que el fosfolfpido minori­rosfatidilinositol (PI: pltosphatidylillosito() son sinteti1.ados de esta manera.

l.u sin tesis de fosfolípidos tiene lugar en la mitad citosólica de la bicapa lipfdica del ER, lo que debe existir algún mecanismo que transfiera alguna de las moléculas de fosfolfpi­

:ién sintetizadas hacia la mitad luminal de la bicapa. En bicapas lipfdicas sintéticas, los :los no son capaces de "saltar" ("nip-flop"l de esta manera. En el EH. sin embargo. los fos­du~ se equilibran a través de la membrana en cuestión de minutos, lo cual es al menos IIJO.OOO veces más rápido de lo que puede representarelllip-llop espont..1neo. Este des­miento rápido transbicapa está mediado por un translocador de fosfolfpidos mal ca­rl7.ndo, denominado escramblasa (del inglés scramble, "barajar" o "mezclar"), que

hiJita el equilibrio de la concentración de fosfotrpidos entre las dos hojas de la bicapa li­(1 igura 12-58). Asf pues, parece ser que los diferentes tipos de fosfolfpidos son distri­

~os por igual entre las dos hojas de la membrana del ER. l.n membrana plasmática contiene o tro tipo de translocador de fosfolfpidos que perte­o h familia de las bombas de tipo P (descritos en el Capítulo L ! ). Estasjlipasaseliminan :fficamente los fosfolfpidos que contienen en su grupo cabeza grupos ami no libres (fos­

.hls<·nna y fosfatid iletanolamina, véase Figura 1(}-3) de la capa extracelular y utili7.an la ·a de hidrólisis del ATP para transferirlos direccional mente a la cara cilosólica de la

1hmna. Como consecuencia de ello, la membrana plasmática tiene una composición de ·llpldos muy asimétrica, mantenida activa por acción de las flipasas (Figura J(}-16). I.a hr,ma plasmática también contiene una escramblasa pero, a diferencia de la del ER que JL'mpre activa, la de la membrana plasmática está regulada y sólo se activa en algunas

744 Capít ulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

(Al MEMBRAN~

CITOSOL

ñfiñ

I.Hlnflnñ ~~~aie~~~~~~~ica . ·--·--: l U U U 11 u U endoplasmático .. ~'t;.

l LA SfNTESIS DE FOSF09PIDOS LOS ANADE A LA MITAD CITOSÓLICA DE LA BICAPA .•.•.. , .•

nnlíñnNnfrnn M ~~ y~~

J LA ESCRAMBLASA CATALIZA LA TRANSLOCACIÓN DE MOL~CULAS DE FOSFOLfPIDO

IHHI0ñ1í w~~~~ J

bícapa lipldica asimétrica de la membrana plasmática

CITO SOL .. -..

n n rrn l LLEGADA DE NUEVA

l,lJ U MEMBRANA POR EXOCITOSIS

1 LA FLIPASA CATALIZA LA TRANSLOCACIÓN DE DETERMINADOS FOSFOLfPIDOS A LA MONOCAPA CITOSÓLICA

Figura 12- 58 El papel de los translocadores lipldicos en la bioslntesis de la blcapa lipldica. (A) Debido a que las nuevas moléculas lipldicas se van añadiendo exclusivamente a la mitad cltosólica de la blcapa y no pueden "saltar• de forma espontánea de una monocapa lipldica a la otra, para que la membrana crezca como una bícapa es necesaria la actividad de un translocador de fosfolfpidos de membrana (denominada escramblasa, del inglés scramble, "mezclar• o "barajar") que transporta moléculas lipldlcas de la mitad cltosóllca a la mitad luminal de la membrana. La escramblasa no es especifica de fosfollpidos con un grupo polar de cabeza determinado, por lo que equilibra la distribución de todos los fosfollpidos entre ambas monocapas. (B) Impulsada por la hidrólisis de ATP. una flipasa específica de fosfolfpidos, con un determinado grupo polar de cabeza situada en la membrana, transloca de forma específica fosfatídil serina y fosfatidll etanolamlna direccionalmente desde la monocapa extracelular hacia la citosólica, generando una asimetrla en la composición de lfpldos que es caracterlstlca de la bicapa lipfdica de la membrana de las células animales (véase laRgura 10-16).

situaciones, como en la apoprosis y en la activación de las plaquetas, donde elimina la asi­metrfa lipfdica; la exposición resultante de fosfatidil serina sobre la superficie de las células apoptólicas acnía como señal para las células fagocíticas para ingerir y degradar la célula muerta.

El ER también produce colesterol y ceramida (Figura 12-59). La ceramida es fabricada por condensación del aminoácido serina con un ácido graso y forma el amino alcohol esfi.n­gosina (véase la Figura 1 0-3); luego se ariade un segundo ácido graso, creándose la ceramida. La ceramida es exportada al complejo de Golgi, donde actúa como precursor de la sfntesis de dos tipos de lfpidos: se añaden cadenas de oligosacáridos formando los glucoesfi.ngoUpidos (glucolfpidos; véase la Figura 10-18), y se transfieren los grupos de cabeza de la fosfocolina de la fosfatidilcolina a otras moléculas de cerarnida, formando esfi.ngomielina (se describe en el Capítulo 10). Así, ambos glucolípidos y la esfingomielina son producidos relativamen­te tarde en el proceso de sfntesis de membrana. Dado que son producidos por enzimas ex­puestas allumen del complejo de Golgi, sólo se encuentran en la mitad no-citosólica de las bicapas lipídicas que los presentan.

Como se describe en el Capítulo 13, la membrana plasmática y las membranas del com­plejo de Golgi, de los lisosomas y de los endosomas forman parte de un sistema de mem­branas que se comunica con el ER por medio de vesículas de transporte que trartSfieren tanto proteínas como lfpidos. Sin embargo, las rnitocondrias y los plastidios no forman parte de este sistema, por lo que requieren mecanismos diferentes para importar proteínas y lípi-

OH OH 1 1 Clt--CH --CH2 1 1

CH NH JI 1 CH C=O 1 1

(CH2l12 (CH2)16 1 1

CH3 CHl

CE RAM IDA

Figura 12-59 Estructura de una ceramida.

LEMAS

.ra su crecimiento. Ya hemos visto que imponan la mayoría de sus protefnas desde el t .-\unque las mitocondrias modifican algunos de los Upidos que importan, no sinteti­:pldos de 110110 sino que deben obtener estos lípidos por transferencia desde el ER di­mente o indirectamente a través de otras membranas celulares. En cualquier caso, se

n mecanismos especiales para esta transferencia. Su conocemos los detalles sobre cómo está catali7-<~da y regulada la distribución de los

<'lltre düerentes membranas. Parece que unas protefnas de transporte solubles en tli nominadas protefnas de intercambio de fosfoUpidos (o protefna.~ de transferencia de

rpidos) transfieren moléculas de fosfolfpidos entre membranas, actuando como las ·luas de unión a ácidos grasos, que conducen los ácidos grasos a través del citosol.

s, en electromicrograffas a menudo se pueden ver mitocondrias en yuxtaposición es­nm membranas del ER. de forma que pueden existir mecanismos de transferencia

.dos que actúen entre membranas adyacentes.

umen

'rpd del FR actlia de factorfa de producción rle cnsi todos los lfpirlos Cl'lulares. Arlemds, La

te de ill símesis proteica celular tiene lugar en La superficie citosólica del ER: todas las pro­

·inadas a la secreción y todas /ns protefnns destinadas al propio BR, al complejo de Golgi,

t.wmas, a Los endosomns y a la meml1m1ra plasnuitica, primero son imporuulas al interior

•/¡-sdee/ citosol. En el lumen del ER.las prowínas se pliegan yo/igomerizan, se forman/os en­

u/furo y se aiiaden Los oligosacáridos unidos a N. El patró11 de la N -glucosilación se utiliza

Ualf el grado de plegamiento de las protefnas, deforma que las procefnas abandonen el ER

ndo están plegadns de forma corrrcta Las proteínas que 110 se pliegan o no oligomerizan co­

'111• so11 rranslocadas de mteL'o al citosol, donde so11 desglucosilatftls, ubiqttitiniu1das y de­

l'Jl proteosonws. Si se acum u /an e:ccesitm protefnas mal plegadas en el éR. desencadenan

twsta a protefnas desplegadas, que activa/os ge11es apropiados en elntícleo nect>sarios ¡x1ra :¡¡ llu pueda arrr!glar.

·son importadas al interior del ER ltu protefnas que presentan ww sectu:ncia señal ltidro­

ln s nwncin se1íal es reconocidt1 por tma partícula de reconocimiewo de se11a/ (SRP) que se

c11tiC'na po/ipeptídica naciellte y al ribosomll y dirige todo el conjumo a u11a protef1w

:m tlt ltl superficie de la membrana del FR. Esta unión a la membrana i11icla 1111 proceso de

'l)n queamutm w1 (l.S(I de la Ctldelltl polipeprfdica a mwés ele In membrana del ER por un

lmjilico di! una proteina tmnsloclldom.

prorelnas solubles - tlesrintulas allumen del ER. a ser secretadas o a ser transferidas al/u­

otros orgánulos- primero pasan por completo al interior dellumen del ER. ÚIS proteínas

lbrmw destinadas alERo ti otras membrmws de la célttla son translocatlas a trtwés de In

·na del ER, pero 110 son liberadas al imerior dellwnen sino que permanecen ancladas a In

mwés de ww o !lUis fl'giones de hélice a de su cadena polipeptfdicn, que atraviesan

•rrma. Estas porciones llidrof6bicas de la protefna pueden actuar durante el proceso de

irín como secuencia de inicio de tmns/ocación o como sella/ de poro de tmnslocación.

un polipéplido cowiene tl(lrias secuencias a/tenuullu de inicio y de poro de rranslocación,

rtl hacía un lado y otro la /Jicnpa mucllas t'l'Ces. comtituyendo una proteínntmnsmembra­

:0 mrílriple.

imctría de La inserción y de la glucosilaci6n de las proteínas en el FR establece la polaridad

·mil ranas de todos los orgñnulos que son abastecidos con proteínas de memiJmna por el ER.

745

S LEMAS firmacíones son ciertas? Explicar por qué sí

(¡Uéno

12-3 Para obviar la inevitable congestión que ocurriría si se per­mitiera el tráfico de doble sentido a través de un mismo poro, los complejos de poro están especiali1..ados de forma que unos de ellos median la importación y otros media la exportación al núcleo.

Como ellumen del ER, el interior del núcleo es topológi­tc equivalente al exterior de la célula.

l.os ribosomas unidos a membrana y los ribo somas libres, 11lcl "nlicos desde un punto de vista estructural y funcional, difl·rencian en las protefnas que simeüzan en un momcn-

12-4 Sólo se encuentran peroxisomas en algunos tipos de célu­las eucariota especializadas.

12-5 En las protcú1as transmembrana de mulripaso, los seg­mentos transmembrana de número impar (contados a partir del N-terminal) actúan como señales de inicio de transferencia mien­tras que los de número par actúan como seiiales de paro de trans­ferencia.

746 Capitulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

Resolver los siguientes problemas

12-6 ¿Cuál es el destino de una proteína que no tenga señal de clasificación?

12-7 Se ha modificado una serie de genes cada uno de los cuaJes codifica una proteína con un par de secuencias señal conflictivas que especifican diferentes compartimientos. Si los genes se expresan en una célula, predice qué señal ganará en ca­da una de las siguientes combinaciones. Explicar el razona­miento.

A. Senales para importación al núcleo y para importación al EH.

B. Señales para importación a los peroxisomas y para importa­ción al ER.

C. Señales para importación a la mitocondria y de retención en el ER.

D. Señales para importación al núcleo y para exportación desde el núcleo.

12- 8 El RE rugoso es el lugar donde se sintetizan muchas clases diferentes de proteínas de membrana. Algunas de estas proteínas permanecen en el ER mientraS que otras son clasificadas y envia­das a compartimientos como el complejo de Golgí, los lisosomas y la membrana plasmática. Una medida de la dificultad del pro­blema de la clasificación es el grado de "purificación" que se tiene que conseguir durante el transpone desde el ER. Las proteínas que van a quedar unidas a la membrana plasmática ¿son comu­nes o son raras emre todas las del ER?

Una consideración senciUa permite contestar esta pregunta. En una célula típica en crecimiento que se divide una ve7 cada 24 horas, cada día debe pasar por el ER el equivalente a una nue­va membrana plasmática. Si la membrana del ERes 20 veces ma­yor que el área de la membrana plasmática, ¿cuál es la relación entre las proteínas de membrana plasmática y las proteínas de las otras membranas en el ER? (Asumir que en su camino hacia la membrana plasmática, todas las proteínas permanecen en el ER durante 30 minutos de promedio antes de salir, y que la relación entre proteínas y IIpidos en el ER y en la membrana plasmática es aproximadamente la misma.)

12- 9 Antes de que los complejos de poro nuclear fuesen bien conocidos, no se sabía si las proteínas nucleares difundfan de for­ma pasiva al interior del núcleo y se acumulaban altr uniéndose a proteínas residentes del núcleo como los cromosomas, o si eran transportadas activamente y acumuladas con independencia de su afinidad por componentes nucleares.

Un experimento clásico dirigido a solucionar este problema utilizó diferentes formas de nucleoplasmina radiactiva, una gran proteína pentamérica que participa en el ensamblaje de la cromatina. En este experimento, tanto la proteína intacta como las cabezas de nucleoplasmina, las colas o las cabezas con una sola cola, se inyectaron en el citoplasma o en el núcleo de tm oo­cito de rana (Figura Pl2.-1). Todas las formas de nucleoplasmi­na, excepto las cabezas, se acumularon en el núcleo tras ser inyectadas en el citoplasma, y todas las formas quedaron reteni­das en el núcleo cuando se inyectaron en el núcleo.

A. ¿Qué parte de la molécula de nucleoplasmina es responsa­ble de la localización en el núcleo?

B. ¿De qué forma estos experimentos distinguían entre trans­pone activo, en el que una señal de localización nuclear induce el transporte por un complejo de poro nuclear, y la difusión pasiva,

intacta

una cola

cabezas

colas

preparación de inyección inyección en la nucleoplasmina en el núcleo el citoplasma

* ~ o

,.,./, ...._,

~ ~

~ ~ ~ ~ ~

Figura P12-1 Localización celular de nucleoplasmina y de compone• de la nucleoplasmina tras su inyección en una célula (Problema 1 El esquema de autorradiograflas muestra el citoplasma y el núcleo co• localización de la nucleoplasmina Indicada en áreas de color rojo.

en la que un lugar de unión para un componente nuclear pt te la acumulación en el núcleo?

12-1 o Asumiendo que son necesarios 32 millones de octáru de histona para empaquetar el genoma humano, ¿cuánta5 111

culas se deben transportar por segundo y por complejo dt· 1 en las células en la que el núcleo contiene 3000 poros nucl!·.• la célula se divide una vez cada día?

12-11 Las estructuras de Ran-GDP y Ran-GTP (de hech•• Ran-GppNp, un análogo estable del GTP) son muy diferenh· mo muestra la Figura P l2-2. No es sorprendente que Ran \ se una a un juego diferente de proteínas que Ran-GTP.

Para observar la captación de Ran por el núcleo de célula' meabilizadas, se une una marca fluorescente a una cadena l.tt de una cisterna de Ran, para hacerla visible. Esra Ran modiftt es importada al núcleo normalmente. La Ran-GDP fluore~r, sólo es captada por el núcleo si se añade citoplasma, mic>nt que una forma mutante, RanQ69L-GTP, que es incapaz de h1d tizar GTP, no es captada rú en presencia ni en ausencia dt.• e plasma. Para identiñcar la proteína citoplasmática que es cr •• para la captación de Ran-GDP. se construyen unas column•• afinidad, en las que se ha unido Ran-GDP o RanQ69L-GTI' hace pasar plasma a su través. El citoplasma que ha pasado .a

vés de la columna de Ran-GDP ya no activa el transpon•

Ran-GDP Ran-GppNp

Figura P1 2-2 Estructuras de Ran-GDP y de Ran-GppNp (Problema 1 Las zonas rojas de las estructuras muestran el segmento de Ran que e· más claramente diferente cuando se une GDP o el análogo de GTP.

LEMAS

kd 158. 116. 97.

68·

46.

27 •

20 . 14. 7

G-q_

(:>Qq_ roo," ~ ~

~'li ~'li<::'

2

Figura P12-3 Proteínas eluidas de columnas de afinidad de Ran-GDP (carrill) y de RanQ69L-GTP (carril2) (Problema 12 11 ). A la derecha se muestran los pesos moleculares de proteínas estándar (De K. Ribbeck et al., EMBOJ. 17:6587-6598, 1988. Con la autorización de Macmlllan Publlshers Ltd.)

(-;J)p al núcleo mientras que el citoplasma que ha pasado a de la columna de RanQ69L-GTP mantiene esta actividad. 1~ de eluir las prOLefnas que se han unido en cada columna l1.ar en una elcctroforesis en gel de poliacrilamida SOS, se 11 diferencias que permitan identificar el factor necesario

l;t captación nuclear de Ran (Figura P12- 3).

l'or qué se ha utilizado RanQ69L-GTP en lugar de Ran-GTP os experimentos? ¿Ran-GppNp habrfa podido servir en lu­ll.mQ69L-GTP?

Cu:\1 de entre las muchas protefnas eluidas a partir de las lumnas diferentes de afinidad es una buena call(lidata a ser

lor tlue activa el transporte de Ran-GDP al núcleo?

Qué otra protefna o protefnas sería lógico que Ran-GDP p:tra realizar su función?

(A~mo podrfa confirmarse que el factor identificado es ne-o para estimular la captación nuclear de Ran?

Los componentes del complejo TIM, el transportador nu­onnado por muchas subunidades de la membrana nuclear n, son mucho menos abundantes que los del complejo lnil:ialmente fueron identificados utilizando una estrategia a. El gen de levadura Ura3, cuyo producto está localizado

lo general en el citosol, donde es esencial para la sfntesis de lo, fue modificado para transportar una sei'lal de importa·

la matriz de la mitocondria. Una población de células que Jlurtaban el gen Ura3 modificado se hizo crecer en ausencia ello. La mayorfa de las células murieron; las escasas células

J'C("¡, ~ron eran deficientes en el sistema de importación mito­rlal Fxplicar de qué forma esta selección identifica células

defectos en los componentes necesarios para la importación ondrial ¿Por qué las células normales pero con el gen Ura3 flc:tdo no crecen en ausencia de uracilo? ¿Por qué las células

tlenl"n un defecto en el s istema de importación mitocondrial n t!n ausencia de uracilo?

Si la enzima dihidrofo lato reductasa (DHFR), que normal­( tü localizada en el citosol, se modifica de forma artificial

trnn.,formar una secuencia de identificación mitocondrial 1 extremo N-terminal, es importada de forma eficiente a la

1dria. Si la DI-IFR modificada es incubada con metotrexa-!C 5c une con fuerza a su lugar activo, la enzima permanece-1lltosol. ¿De qué forma la unión del metotrexato interfiere

lil importación a la mitocondria?

4 lPor qué una mitocondria necesita un imaginario trans­dol para importar proteínas a través de la membrana exter-

747

na? Sus membranas externas tienen grandes poros formados por porinas.

12-1 S La catalasa, una enzima que se encuentra en los peroJti­somas, está presente en cantidades normales en las células que no tienen peroxisomas visibles. Resulta posible determinar la lo­calización de la catalasa en estas célu.las utilizando microscopfa de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos contra la catalasa. En la Figura Pl2-4 se presentan micrograffas de fluo­rescencia de células normales y de células deficientes en peroxi­somas ¿Dónde está localizada la catalasa en las células sin peroxisomas (Figura P12-4B)? ¿Por qué la ca tal asa se presenta co­mo pequeños puntos de fluorescencia en las células normales (Figura Pl2--4A)?

(A) (8) '---! lO¡¡m

Figura P12-4 Localización de la catalasa en células, determinada por microscopía de fluorescencia (Problemd 12 15)). (A) Células normales. (8) Células deficientes en peroxísomas. Las células se hicieron reaccionar con anticuerpos específicos contra la catalasa, se lavaron y se tiñeron con un segundo anticuerpo marcado con fluoresceína, especifico contra la cata lasa. Los dos paneles tienen los mismos aumentos. (De N. Klnoshita et al., J. Biol. Chem. 273:24112-24130, 1998. Con la autorización de American Society for Blochemístry and Molecular Biology.)

12 16 Examinar la protefna transmembrana de muJtipaso que mostramos en la Figura Pl2- 5. ¿Cuál será el efecto de transfor­mar el primer segmemo hidrofóbico transmembrana en un seg­mento hidrorrlico? Esbozar la distribución en la membrana del ER de la protefna modificada.

12 17 Todos los nuevos fosfolfpidos se añaden a la hoja citoplas­mática de la membrana del ER, pero la membrana del ER tiene una distribución simétrica de diferentes fosfolfpidos en sus dos ca­ras. Por el contrario, la membrana plasmática, que recibe todos sus componentes de membrana en último término del EH, tiene una distribución muy asimétrica de fosfoUpidos en las dos hojas de su bicapa Jipfdica. ¿Cómo se genera la s imeoia en la membrana del ER y como se genera la asimetrfa en la membrana plasmática?

COOH 3 5

CITOSOL

LUMEN DEL ER

Figura Pl 2-5 Distribución de una proteína transmembrana multipaso en la membrana del ER (Problema 12- 16). Los hexágonos representan ollgosacáridos unidos de forma covalente.

748 Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas

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T1ráfico vesicular intracelular

, las células deben alimentarse. comunicarse con el exterior y re'>pondt•r con rapidez a rnhios del entorno. Para poder realizar sus funciones, las célula!-. ajustan continua­la composictón de su membrana plasmática en respuesta a su'> necesidades. Utili7.an

m piejo sistema de membranas internas para añadir y eliminar proteinas de superficie Incluidas en la membrana tales como receptores, canales iónicos y transportadores.

nte el proceso denominado exocitosis. la rllfn de secn.>ción 11io.ülltétim·secn'tOra su mi­proteínas de nueva síntesis. carbohidratos y lfpidos tanto a la membrana plasmática 1 exterior celular. H proceso complementario, la endocitosis (Figuro 13-1 J. pcnnite a

lulas eliminar t·omponeme~ de la membrana plasmática transpon<indolos a compar­tos intracelulares denominados endosomas, desde los que pueden ser reciclados hacia

ma o diferente área de la membrana plasmática o pueden ~erdirigidos a los liso!-.omas u degradación. Las células también emplean la cndocitosis para captar nutrientes

tt:mtes como vitaminas, lfpidos, colesterol y hierro; é~tos <,on ingeridos junto con las omnléculas a las que '>e unen y son liberados en los endosomas o lisosomas y trans­Jos al citosol donde c;on utilizados en diferentes proceso'> biosintéticos.

Fl espacio interior, o lumrn, de cada uno de los compartimiento<; delimitados por mem­dt! las rutas bio\itllética-~ecretora y endocítica e~ topológicamentc equivalente al 'de la mayoría de los otros compartimientos membrano~os y aJ exterior telular. Las nas pueden desplazarse en ese espacio sin tener que atrave:.ar membranas y pasan o n otro compartimiento mediante numero<;os contenedores de transporte mem­os. Algunos de estos contenedores son pequeña'> rlf!sfcultL~ esféricas, mientras otros :ndes vesícula'> irregulares o tú bulos formados a partir del compartimiento dador. remos el término vesículas de transporte para referimos a toda~ estas formas de con-

ntro de una célula eucariota se forman constantemente las ve'>fculas de transporte memhmna} o,e fuo,ionan con otra, transportando componentes de membrana y mo­oluhles que se denominan carga (Figura 13-21 Este tráfico de membrana fluye a lo

de nllas direccionales muy organizadas, que permiten a la célula secretar, alimentarse •dclarsu nwmbrana plasmática. La vía biosintética-secretora ~e dirige al exterior, des· tículo endoplasmático (l· lll hacia el complejo de Golgt y la superficie celular, con una ión hacia los lisosoma!>, mientras que la mta endocttica se dirige hacta el interiordes­

nwmbrana plasmática L:.n cada cac;o, el flujo de membrana entre los compartimientos uilibrado con mecanismos de recuperación que, transportando membranas y prote­lcccionadas hacia el compartimiento de origen. equilibran el flujo en ambos sentidos

1'1113-3).

ra poder realizar su función, cada vesícula de transporte que emerge de un compar­to debe ser ~electiva . Tiene que tomar las moléculas adecuadas y sólo debe fusionarse membrana diana apropiada. Así, por ejemplo, una vesícula que va del complejo de

la membrana plasmática, no puede llevarse protefnas que deben residir en piejo de Golgi y sólo debe fusionarse con la membrana plasmática y no con otros or-

rnp ·t.aremos este capítulo considerando los mecanismos moleculares de la vesícula­de l.t fusión en los que se basa todo el transporte vesicular. Posteriormente se expon­

los problemas fundamentales de cómo, a pesar del transporte, las células mantienen frr~ tcias entre compartimientos. Finalmente, se considerarán las funciones del com­dé (,olgi, lisosomas, vesfculas de secreción y endosomao;, a medida que se describan las qm conectan estos orgánulos.

En este capítulo

MECANISMOS 750 MOLECULARES DE TRANSPORTE DE MEMBRANA Y DE MANTENIMIENTO DE LA DIVERSIDAD DE LOS COMPARTIMIENTOS

TRANSPORTE DESDE 766 EL ER A TRAVtS DEL COMPLEJO DE GOLGI

TRANSPORTE DESDE LA 779 RED DEL TRANS GOLGI A LOS LISOSOMAS

TRANSPORTE HACIA EL 787 INTERIOR DE LA (~LULA DESDE LA MEMBRANA PLASMÁTICA: ENDOCITOSIS

TRANSPORTE DESDE 800 LA RED DEL TRANS GOLGI HACIA EL EXTERIOR CELULAR: EXOCITOSIS

750 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

• •

-(A) exocitosis

. -

(B) endodtosls

MECANISMOS MOLECULARES DE TRANSPORTE DE MEMBRANA Y DE MANTENIMIENTO DE LA DIVERSIDAD DE LOS COMPARTIMIENTOS EILransporte vesicular provoca un intercambio constante de componentes entre los más de diez companimientos membranosos que, colectivamente, rorman las vías biosintética­secretora y endocítica y que son quimicarnente diferentes. Con este intercambio masivo, ¿cómo puede cada uno de los compartimientos mantener su identidad? Para poder contes­tar a esta pregunta hay que considerar en primer lugar qué es lo que define un comparti­miento. Por encima de todo, parece que es la naturaleza de la membrana que los delimita: marcadores moleculares expuestos en la superficie citosólica de la membrana actúan de gufa para el tráfico de entrada, asegurando que las vesículas de transporte sólo se rusionen con el compartimiento adecuado. Sin embargo, muchos de estos marcadores de membrana se encuentran en más de un compartimiento y la combinación especffica de marcadores determina la dirección molecular única de cada compartimiento.

¿Cómo se mantienen los marcadores de membrana en una concentración elevada en un companimiento y baja en otro? Para responder a esta pregunta, es necesario comprender cómo las áreas de membrana, enriquecidas o empobrecidas en determinados componentes de membrana específicos, generan vesículas en un compartimiento y son transportadas a otro. El Panel 13-1 plantea algunas de las estrategias genéticas y bioqu!micas básicas que se han utili7..ado para estudiar la maquinaria molecular implicada en el transporte vesicular.

En primer lugar, se explicará cómo las células segregan proteínas en diferentes domi­nios de membrana mediante el ensamblaje de una cubierta proteica específica en la cara citosólica de la membrana. Después expondremos cómo se forman las cubiertas, cuáles son sus componentes y cómo son utilizados para seleccionar detem1inados componemes de

CITOSOL

-

COMPARTIMIENTO DADOR

FUSIÓN

Figura 13- 1 Exocitosis y endocitosis. (A) En la exocitosis, una veskula de transporte se fusiona con la membrana plasmática. Su contenido es liberado en el espacio extracelular mientras que la membrana de la vesfcula (rojo) queda Incorporada en la membrana plasmática (B) En la endocitosis, una región de la membrana (ro¡o) es lnternalizada formando una vesfcula de transporte. Su contenido procede del espacio extracelular.

Figura 13- 2 Transporte vesicular. Las vesfculas de transporte emergen por gemación de un compartimiento y se fusionan con otro. Como se muem al hacerlo transportan material del/umtn (el espacio interior de un compartimic n~ delimitado por membrana) y de la m< m del compartimiento dador, allumen y a 1.1 membrana del compartimiento de d< ~~ Es Importante destacar que el proceso d formación de vesfculas por gemación y de fusión de las vesfculas no son símt!tr la formac1ón de vesfculas por gemación requiere un acontecimiento de fusión d membranas Iniciado a partir de la cara luminal de la membrana, mientras qu la fusión de la.s vesfculas requiere un acontecimiento de fusión de membrana Iniciado a partir de ambas membram.s, la dadora y la aceptara.

GEMACIÓN ;J~' COMPARTIMIENl

--- . e ·~ ~ DE DESTINO

R • •

ml!D:bt¡J~ .J·. "~~ • • • • • . . . -~ J '.!lllllldllll .

ANISMOS MOLECULARES DE TRANSPORTE DE MEMBRANA 751

lisosoma

~ end

~osoma tardlo

membrana nuclear . . VESICULAS l

SECRETORAS ~ ""'d·:~~~·:~Y9 .Jt· ~ / o¡ .. o~ Ó1 /

0 ~ ~~~osoma

~O"" temprano

CITOSOL

. !:::::::;: --~-

QJ(~~~ o O Q ctsterna

L_ -- ___J complejo de Golgt (8)

mbrana que serán transportados a otro compartimiento. Por úhimo, se describirá 1." vesícuJas de transpone se anclan en la membrana aceptara apropiada, fusionán­m cUa y liberando su carga.

varios tipos de vesículas recubiertas

"11 ia de las vesfcuJas de transporte se fom1an a partir de regiones recubiertas especia­de las membranas. Geman como vesícuJas recubiertas que presentan una maUa IHtica de proteínas que recubre su cara citosólica. Antes de que las vesículas se fu­' un la membrana aceptora pierden su cubierta y permiten que las dos caras citosóli­'·•~ membranas entren en contacto y se fusionen. ntbierta tiene dos funciones principales. La primera, concentrar determinadas pro­lt·la membrana en una región especializada de la misma a partir de la cual se forma­•·mbrana de la vesfcula. De esta manera selecciona las moléculas adecuadas para el •rtc La segunda, moldear la vesícuJa eñ formación. Las proteínas de cubierta se en­n en forma de mallas curvadas en forma de cesta que deforman el área de la mem­l.tndo forma a la vesícula. Este hecho podría explicar la observación de que vesfculas 11ismo tipo de cubierta tienen un tamaiio y forma relativamente similares. 1 tres tipos de vesículas recubiertas bien caracterizados. que se diferencian por sus 1 ~ de cubierta: las recubiertas de clatrina, las recubiercas de COPI y las recubienas de

llgura 13-4). Cada tipo participa en diferentes etapas de transporte. Por ejemplo, las 1, recubiertas de clatrina están implicadas en el transporte desde el complejo

:• y desde la membrana plasmállca, mientras que las vesícuJas recubiertas de COPJ y de t·,tán fundamemalmente implicadas en el transpone desde el ER y desde las cisternas ,1~:1 (figura 13-5). Sin embargo hay mucha más variedad de vesfcuJas recubiertas y de ' tones de lo que sugiere la corta lista anterior. Como se describirá más adelante, hay

1 tp()S de vesfcuJas recubiertas de el a trina, cada una de las cuales está especializada en pa de transporte diferente, y las vesfcuJas recubiertas de COPl y de COPU también

nsamblaje de la cubierta de clatrina controla la formación vesículas

lc:uJas recubiertas de clatrina, las primeras vesícuJas recubiertas que fueron descri­n.,portan ma teriales desde la membrana plasmática y entre Jos endosomas y los com­··ntos del Golgi. Las vesículas recubiertas de COPJ y las vesícuJas recubiertas de

--vesfcula secretora

Figura 13-3 "Mapa de carreteras• de las vlas bioslntética-secretora y endocítica. (A) En este •mapa de carreteras· sobre el tráfico de las proteínas bioslntetlzadas, que fue presentado en el Capitulo 12, aparecen destacadas con flechas verdes y rojas las rutas endocltica y biosrntétlca-secretora, respectivamente. Además, las flechas azules señalan las vlas de recuperación mediante las cuales se asegura el flujo retrógrado de los componentes. (B) Los compartimientos de una célula eucariota que están Implicados en el transporte vesicular. El lumen de cada compartimiento delimitado por membrana es topológicamente equivalente al exterior celular. Todos los compartimientos que se muestran, se comunican entre sr y con el exterior celular mediante las veslculas. En la ruta biosintética-secretora (flechas rojas), las moléculas de protelnas son transportadas desde el ERa la membrana plasmática o ( vfa endosomas tardfos) a los lisosomas. En la ruta endodtica (flechas verdes), las moléculas son Ingeridas mediante vesfculas que se forman a partir de la membrana plasmática, conducidas a los endosomas tempranos y (vla endosomas tardfos) a los llsosomas. Muchas moléculas endocitadas se recuperan de los endosomas tempranos y vuelven a la superficie celular, donde son reutilizadas; de forma similar, algunas moléculas son recuperadas de los endosomas tardíos y vuelven al complejo de Golgi, y algunas son recuperadas del Golgl y devueltas al ER. Todas estas rutas de recuperación se indican con flechas azules, como en el apartado (A).

SISTEMAS LIBRES DE CÉLULAS PA RA EL ESTUDIO DE LOS COMPONENTES Y DEL MECANISMO DEL TRANSPORTE VESICULAR

El transporte vesicular puede ser reconstituido en sistemas libres de células. La primera vez que se consiguió fue para el caso de los dictiosomas del complejo de Golgi. Cuando se aislan dictiosomas y se incuban en presencia de citosol y de ATP como fuente de energfa, las vesfculas emergen por gemación desde los bordes de los dictiosomas y parece que transporten protefnas entre las cisternas. S1guiendo el procesamiento progresivo de los oligosacáridos de una glucoprotelna y su desplazamiento entre un compartimiento del Golg1 y el siguiente, es posible seguir el proceso de transporte vesicular.

Para seguir el transporte, se incuban juntas dos poblac1ones de dictiosomas de Golgi. La población Ndadora~ se aisla a partir de células mutantes que carecen de la enz1ma N-acetilglucosamina (GicNAc) transferasa 1 y que han sido mfectadas con un virus; deb1do a la mutación, la principal glucoproteina vlrica no puede ser modificada con GlcNAc

en el complejo de Golgf que tienen las células mutantes. Los dictiosomas "aceptares" son aislados a partir de células salvajes no infectadas y que, por lo tanto, contienen una copia correcta de GlcNAc transferasa 1, pero carecen de la glucoprotefna vfrica. En la mezcla de dictiosomas del Golgi, la protelna vírica adquiere GlcNAc, lo cual indica que el Golgl dador debe haber sido transportado entre los d1ctiosomas del Golgi -presumiblemente por vesículas que se forman en el compartimento c1s del complejo de Golgi dador y se fusionan con el compartimiento medio del complejo de Golg1 aceptor o bien mediante fusión homotipica entre cisternas de dos dictiosomas. Este transporte dependiente de glucos1· ladón puede seguirse midiendo la transferencia de 3H-GicNAc desde UDP-3H-GicNAc a la glucoproteína vfrica. El transporte sólo se produce en presencia de ATP y de citosol. Fraccionando el citosol, se han Identificado protelnas especificas citosólicas necesarias para la formaCión y la fusión de las veslculas de transporte.

SE INCUBAN JUNTOS+ CITOSOL + ATP + JH·GicNAc ¡- ----------- ------¡

DICTIOSOMA DEL GOLGI DADOR DICTIOSOMA DEL GOLGI ACEPTOR

trans e · • -:] e: . e --J modio ~ 1 1 3 ~''"'''" 'H-<I<NA< l - __ transporte ~ . . --o/ ... -o ...

vt:: <g_ ~~ 1.!:1,. ' ... :J:>-

"' .. ~e -o-¡¡ C1) -o ....

,.0 g. ~ ...

&..3

cls ( 1

1 1 1 ~- --" 1 1 ~ ( ~ glucoprotelna -' )

vfrica no se añade GlcNAc

a la glucoprotelna vírica se añade 1H-GicNAc a la

glucoproteina en la císterna media

... e~

o.. 1 "- ~ .E .. 00 tiempo -

Sistemas libres de células similares a éste se han utilizado para estudiar el transporte desde la red media hasta la red del trans Golgi, desde la red del trans Golgi hasta la membrana plasmática, desde los endosomas hasta los lisosomas y desde la red del trans Golgi hasta los endosomas tardlos, asl como para el estudio de la fusión homotip1ca entre compartimientos similares, como los endosomas y las veslculas de secreción inmaduras.

A PROXIMA CIONES GENÉTICAS AL ESTUDIO DEL TRANSPORTE VESICULAR

Los estudios genéticos de células de levadura mutantes deficientes en la secreción a temperaturas elevadas han permitido identificar más de 25 genes que participan en la vía de secreción. Muchos de estos genes mutantes codifican protelnas sensibles a temperatura, las cuales a 25 oc actúan normalmente, pero cuando las células mutantes (A-1) se exponen a una temperatura superior, de 35 °C, algunas no pueden llevar a cabo el transporte de protelnas desde el ER hasta el complejo de Golgi, desde una cisterna a otra del Golgi, y desde el complejo de Golgi hasta la vacuola (el lisosoma de las levaduras) o hasta la membrana plasmática.

Cuando, por este sistema, se identifican algunas protelnas necesarias para que se produzca la secreción, se pueden identificar genes que codifican protelnas que interaccionan con ellas mediante un fenómeno llamado supresión multicopia. A temperaturas elevadas, a menudo una protelna mut ante sensible a fa temperatura elevada tiene una afinidad demasiado baja por fas protefnas con las que habitualmente interacciona. Sin embargo, si las proteínas de interacción se producen a una concentración muy superior a

la normal, se produce una unión sufiCiente para paliar est defecto Para construir una situación experimental en qu se produzcan esas elevadas concentraciones de ligando, procede a transfectar células mutantes de levadura (con mutación sensible a la temperatura en un gen implicado transporte vesicular) con un vector plasmfdico de levadura cual se han clonado fragmentos al azar de DNA genómico levadura. El plásmido se mantiene en las células en un nú de copias elevado, por lo que los que porten genes intact01 sobreproducirán el producto normal del gen y permitirán consecuencia, que un reducido número de células puedan sobrevivir a temperaturas elevadas. Los fragmentos de ONI\ relevant es, que probablemente codifican proteínas que interaccionan con la protelna mutada original, pueden ser aislados de las células supervivientes.

Las aproximaciones genéticas y bioquímicas se complem y muchas de las proteínas involucradas en el transporte vesicular han sido identificadas de forma independiente 11 través de estudios bioqulmicos de sistemas libres de ct uf mamíferos y a través de est udios genéticos en fevadur;)S

LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN CON GFP HAN REVOLUCIONADO EL ESTUDIO DEL TRANSPORTE INTRACELULAR

Una manera de seguir el rastro de una proteína en las células vivas es construir protelnas de fusión, en las que la proteína fluorescente verde (GFP) se une mediante tecnícas de ingenierla genética a la proteína de interés. Cuando un cONA que codifica una de estas protelnas de fusión se expresa en una célula, la protelna es visible snmediatamente en un microscopio de fluorescencia, permitiendo su seguimiento en las células vivas a tiempo •ea l. Afortunadamente, para muchas de las protelnas •·studiadas, la unión de GFP a la protelna no altera la tunción de la protelna.

Las proteínas de fusión con GFP se utilizan con frecuencia para estudiar tanto la localización como ('1 desplazamiento de las protelnas en las células. Por •·¡emplo, el uso de GFP unida a protelnas que entran y alen del núcleo facilita el estudio del transporte nuclear

1 su regulación. GFP unido a proteínas mitocondriales o del Golgi se utiliza para estudiar el comportamiento tE' estos orgánulos. GFP unido a protelnas plasmáticas se ·~a para medir la cinética de su movimiento desde el ER • través de la vía de secreción. Se pueden ver ejemplos lt• estos expenmentos en forma de vídeo en el OVO 111e acompaña este libro.

fl estudio de las protelnas de fusión con GFP se combina on frecuencia con técnicas de FRAP y de FLIP (técnicas

dl'scritas en el Capítulo 10), en las que la protelna GFP elE' regiones seleccionadas es blanqueada mediante una •1tensa luz láser. Es posible medir la velocidad de difusión :• de transporte de la proteína GFP no blanqueda en esa ltrea para obtener estimaciones del transporte o difusión 1~ la proteína en fa célula. Por ejemplo, de este modo se

'•·l determinado que muchas enzimas del Golgi se ro·ciclan entre el complejo de Golgi y el ER. GCTG

lA O, por cortesía de Jenntfer Lippincott-Schwartz lab.)

bloqueado en {)

~H~u~

•• r• ,. __ .,

(A) En este experimento, se ha expresado GFP unida a una proteína de cubierta del virus de la estomatitis vesicular -denominada proteína de la cubierta del virus de la estomatitis vesicular- en células en cultivo. la protelna vírica es una protefna integral de membrana que normalmente se desplaza a lo largo de la vía de secreción desde el ER a fa superficie celular, donde el virus se ensambla en aquellas células que expresan los demás componentes víricos. la protelna vírica contiene una mutación que permite su exportación desde el ER sólo a baja temperatura. Así pues, en las condiciones de alta temperatura que se muestran, la protelna tiñe el ER.

(B) A medida que la temperatura se reduce, fa proteína de fusión GFP se acumula con rapidez en los sitios de salida del ER.

(C) la protelna de fusión se desplaza al comple¡o de Golgi.

(O) Por último, fa proteína de fusión es liberada en la membrana plasmática donde la proteína libre difunde en la membrana plasmática (fas flechas señalan un proceso de fusión). A partir de estos estudios se puede determinar la cinética de cada una de fas etapas en fa vía.

754 Capitulo 13: Tráfico vesicular intracelular

(A) el a trina (B) COPI (C) COPII L__j 100 nm

COPil transportan matcriaJcs en las etapas iniciaJes de la ruta de secreción: las vesículas re­cubiertas de COPil gcman en el ER y las vcsfcuJas recubiertas de COPI lo hacen en los com­partimientos del Golgi (véase Figura 13-5). Describiremos en primer lugar las vesículas recubiertas de da trina pues son un buen ejemplo de cómo se fonnan las vesículas.

La protefna mayoritaria de las vesfculas recubiertas de clatrina es la propia clatrlna. Cada subunidad de clatrina está formada por tres cadenas polipeptfdicas grandes y tres pequeñas que, junta~. forman una estructura de tres brazos denominada trisque/ion. Los trisqueliones de da trina se ensamblan en estructuras convexas formadas por una red de he­xágonos y pentágonos similares a cestos o canastos que forman las depresiones recubiertas en la cara citosólica de Las membranas (Figura 13-6). En el tubo de ensayo, bajo condiciones apropiadas, los trisqueliones aislados se ensamblan de forma espontánea y forma jaulas po­liédricas típicas, incluso en ausencia de las vesículas de membrana que habituaJmente rodean estos pollmcros (Figura 13-7). Asf pues, los trisqueliones de clatrina determinan la geometría de la red de clatrina.

Las proteínas adaptadoras, otro componente mayoritario de las cubiertas de las vesí­culas recubiertas de clatrina, forman una segunda capa discreta de la cubierta que se encuentra situada entre la red de clatrina y la membrana. Unen la cubierta de clatrina a la membrana y atrapan varias proteínas transmembrana, incluyendo a los receptores transmembrana - los denominados receptores de transporte- que se unen en el interior de la vesfcuJa a las moléculas solubles a transportar. De esta forma, una serie de proteínas trans­membrana seleccionadas. junto con proteínas solubles que interaccionan con cUas, son em­paquetadas en cada nueva vesícula recubierta de clatrina (Figura 13-8).

Se conocen aJgunos Lipos de proteínas adaptadoras. Las mejor caracterizadas están for­madas por cuatro subunidades proteicas; otras son proteínas con una sola subunidad. Cada

CLAVE:

1 • clatrina

~ 1 COPI

o COPII

ER

endosoma tardlo endosoma

cisternas

complejo de Golgi

temprano

vesícula secretora

Figura 13-4 Electromicrografias de van veslculas recubiertas de clatrina, COPI y COPll. Todas las electromicrografías están a la misma escala. (A) Veslculas recubiertas de da trina. (B) Cisternas del (flechas) en un sistema libre de células en que se forman vesículas recubiertas de C, (C) Vesículas recubiertas de COPII. Obs que las veskulas de clatrina tienen una estructura más regular. (A y B, deL Orci, B. Gllck y J. Rothman, Ce//46: 171-184, 1 Con permiso de Elsevier; C, cortesla de Charles Barlowe y Lelio Orci.)

Figura 13- 5 Utilizacíón de dlferentn cubiertas en el tráfico vesicular. Dífcr protefnas de cubierta seleccionan car diferentes y dan forma a las vesfcula\ de transporte que realizan cada una etapas del transporte en las rutas bioslntética-secretora y endocítica. el las diferentes cubiertas actúan en I1J

diferentes de la célula, pueden inco1 diversas proteínas de cubierta que r sus propiedades (no se muestra). M1 células diferenciadas tienen vías adic además de las que se muestran en la incluyendo una ruta de clasiflcaciórl red del trans Golgi a la superficie aplc~ una célula polarizada y una ruta es de reciclaje para proteínas de las v slnápticas en las sinapsis de las neur

ISMOS MOLECULARES DE TRANSPORTE DE MEMBRANA

:1 de protefna adaptadora es especffica de una serie de receptores de transporte y su utili­ión permite formar diferentes vesfculas recubiertas de clatrina. Las vesfculas recubiertas clatrina que se forman a partir de diferentes membranas utilizan diferentes protefnas

[.adnptadoras y como consecuencia de eUo contienen diferentes receptores de transporte y de ,léculas transportadas.

El ensamblaje sucesivo de complejos de adaptadores y de moléculas de da trina en la citosólica de la membrana genera fuerzas que permiten la formación de las vesículas re-

IIUbiertas de clatrina Las interacciones laterales entre los complejos de adaptadores y entre moléculas de clatrina contribuyen a la formación de la vesfcula.

todas las cubiertas forman estructuras de tipo cesta

todas las cubiertas forman estructuras tan regulares y universales como sugieren los nnJos de las cubiertas de clatrina y COP. Algunas cubiertas se podrfan describir mejor

complejos proteicos especializados que forman agregados dedicados a proteínas es­de carga. Un ejemplo es la cubierta denominada retrómero, que se ensambla en

endoso mas y forma vesículas que devuelven receptores de llidrol.a.sas ácidas, como el de manosa-6-fosfaJo, a1 complejo de Golgi (Figura 13-9). Describiremos más adelan­

importancia de estos receptores en el transporte de enzimas a los nuevos lisosomas. FJ retrómero es un complejo multlprotcico que sólo se ensambla en una cubierta en los

~1somas cuando:

Puede unirse a la cola citosólica de los receptores de carga.

Puede interaccionar directamente con una bicapa lipfdica curva.

Puede unirse a un lfpido fosfatidllinositol fosforilado específico (unfosfoinositol), que actúa como marcador endosó mico, como se describirá más adelante.

Oado que estos tres requerimientos se han de cumplir simultáneamente, parece que el ~mero es un detector de coincidencia que sólo se ensambla en el lugar y momento a de­

Después de su unión como dfmero e~tabiliza la curvatura de la membrana lo que in­ta la facilidad de unión de nuevas subunidades en las proximidades. Asf pues, el

cooperativo del retrómero permite la formación y gemación de una vesícula de rte que lleva su carga al complejo de Golgi .

cadena ligera

... ~ .. ':~-· : ... ,, :>;·~~:~:?~·: ::::":~···~)· •;:·~·. ~~:. :"'~·;·':'·~·;.: .. ..... ·:;···· :- - ... . ·• ~ ..... :~·:'· ... ·~ .. :!~ :::·,'~··· 1-*: .. ·; .~·: ;_:~:;· , =-· ·, . ~~r·:·:: :;_ ... .. . ..... . . _._,., .. ,:1. ~· ... ¡¡·:-":··· ... ' _,• :.·· ·· ::¡·:;~~·$;~:;·~ ... v~-~

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0,2 )1m

Figura 13-6 Depresiones recubiertas de da trina y veslculas. Esta eiectromlcrograRa de grabado por congelación muestra numerosas depresiones recubiertas de clatrina y veskulas en la superficie Interior de la membrana plasmática de fibroblastos en cultivo. Las células se congelan rápidamente en helio liquido, se fracturan y se graban por congelación para exponer la superficie de la membrana plasmática. {De J. Heuser, J. Ce// Blol. 84:560-683, 1980. Con permiso de The Rockefeller University Press.)

25 nm

Figura 13- 7 Estructura de la cubierta de clatrina. <TATI> (Al Electromicrografla de trlsqueliones de clatnna sombreados con platino. Tal como se muestra en (B) cada trisquelion está formado por tres cadenas pesadas y tres cadenas ligeras de datrina. (C y O) Críoelectromicrografia tomada de una cubierta de clatrina formada por 36 trlsqueliones en una malla de 23 pentágonos y 6 hexágonos, en la que se han coloreado las cadenas pesadas (C) y las ligeras (O). Los brazos entrecruzados de los trisqueliones de clatrina forman una cubierta exterior desde la que se proyectan los dominios N-terminales de los trisqueliones hacia el interior formando una capa Interna que es posible ver por los orificios de la estructura. Esta capa interna es la que establece contactos con las proteinas adaptadoras que se muestran en la Figura 13-8. Aunque la cubierta mostrada es demasiado pequeria para envolver una veslcula membranosa, está organizada de la misma forma que las cubiertas de clatrina que recubren las veslculas, presen-tando 12 pentágonos y un gran número de hexágonos, en una estructura que recuerda a la cubierta de un balón de fútbol. (A. de E. Ungewickell y D. Branton, Nature 289:420-422, 1981; C y D, de A. Fotin et al., Nature 432: 573-579, 2004. Todo con permiso de Macmillan Publishers Ltd.)

756 Capítulo 1 3: Tráfico vesicular intracelular

•

clatrina

vesfcula recubierta

' 'v/6~ ,r,r;_A1

j_

ENSAMBLAJE DE LA CUBIERTA Y SELECCIÓN DE LA CARGA

FORMACIÓN DE LA YEMA

FORMACIÓN DE LA VESICULA DESENSAMBLAJE

Lns protefnas adaptadoras que se encuentran en las vesrculas recubiertas de da trina también se un en a fosfoinositoles, que no sólo tienen una importante función en la detenni­nación de dónde y cómo se ensamblan las cubiertas en la célula, sino que son ampliamente utilizados como determinantes moleculares de la identidad de los compartimientos. Esto facilitará, como veremos más adelante, el control de los procesos de tráfico de membrana.

Los fosfoinositoles como marcadores de orgánulos y de dominios de membrana

Los fosfoHpidos de inositol son por regla general menos del lO% del totaJ de fosfolrpidos de una membrana, pero tienen importantes funciones reguladoras. Pueden seguir ciclos rápi­dos de fosforilación ydesfosforilación en las posiciones3' , 4 ·y s· del grupo inositol que pro­ducen varios tipos de fosfoinositoles (PIP). La interconversión de fosfatidilinosi tol (PI) y PIP está muy comparúmenrada: en los diferenres orgánulos de la ruta endodtica y biosintética-

VPS26 VPS26

10nm

Figura 13-8 Ensamblaje y desensambla) de una cubierta de datrlna. El ensambla la cubierta de clatrlna Induce una curvatull en la membrana que conduce a la formac de yemas revestidas de tamaño untfol'l'Tle Las protefnas adaptadoras se unen tanto a los trisquellones de clatrlna como a los receptores de carga unidos a membrana mediando así el reclutamiento select1vo tanto de la membrana como de las moléculas de carga al interior de la vesfcuiJ El revestimiento de clatrina se elimina inmediatamente después de la formación de la vesícula.

Figura 13- 9 Modelo de ensamblaje del retrómero en las membranas endosóm Las cuatro subunldades del retrómero, VPS29, VPSJS y VPS26 forman dominios recubiertos en la membrana endosómie<l capturan y clasifican en vesfculas moltc carga, entre las que se incluyen proteína' transmembrana como los receptores de hidrolasas ácidas, que vuelven a la red d distribución del trans Golgi. VPS35 se unt1 a la cola cltosólica de las protefnas de transmembrana. La protefna SNXl con diferentes dominios proteicos: un dom que se une a fosfatidillnositol fosforilado PI(J)P. y un dominio BAR que está lmplí en la dimerización y unión a membrana' muy curvadas. Tanto los dominios PX como los BAR son módulos proteicos que se encuentran en muchas proteínas en 141 que tienen funciones similares. Todo! lo' componentes se han representado a ulll escala comparable con la excepción de que se ha aumentado para aumentar su visibilidad. (Adaptado de J5. BonifaCino y R. Rojas, Nat. Rev. Mol. Ce// Biol. 7:568-579 Con permiso de Macmillan Publishers l t1

~NI~Mu~ MOLECULARES DE TRANSPORTE DE MEMBRANA

H~ VrJ

OH ? O= P O

1 o 1

CH - CH - CH¡ 1 l 1 o o -·~ OzC

o 1 6

p

PI

(B)

b 2 ®

(0

p 1

/ P1(3,5)P2 ~

PI(3)P ~ PI - PI(S)P

H lt U PI(3,4)P2 ~ PI(4)P ~ PI(4,S)P1

(O) " PI(3,4,5)P¡ /

(E) (F)

.. e encuentran diferente~ tipos de PI y PIP quinasa y PIP fosfatasa (Figura 13-10).

r1huc ión, regulación y equilibrios locales de estas cnzunas determinan la concentra­.t,Kionaria de cada una de la1o e'>pecies de PI P. Asf pues, la distribución de PIP vuria r¡canulos y. frecuentenwnte demro de una misma membrana, entre d ifert•ntes regio­fi rlit•ndo dominios o regiones especificas de membrana.

lud1as proteínas implicadas en las diferentes etapas del transporte vesicular presentan que se unen con elevada e~pecificidad a las cabezas polares de ciertos PI P. distin­

' rntre diferentes fom1as fosfori ladas. El control local de las PI y PI P quinasa y de las ül a'>a puede srr usado como un mecanismo de control rápido de unión de proteínas wmbrana o región de membrana. La producción de un lipo part icular de PIP permite proteínas que contengan regiones de unión espedficas a ese PI P. A.<,í, estas proteínas

a PIP contribuyen a regular tanto la formación de vesículas como otras etapas del de membrana (llgura 13-1 1) Esta misma estrategia es muy utilizada para reclu-

hlfnas de señalización intmrclular en la membrana plasmática como respuesta a se­trarelulares (de~crito cm el capítulo 15).

~ración de la vesícula y el desprendimiento de la cubierta regulados por proteínas citosólicas

e• está formando una vesícula recubierta de clatrina. unas protemas citosólicas so­rure las que se incluye la dlnamlna, se ensamblan formando un anillo alrededor del

de rada un a de las vesículas (Figura 13-12) La dinamina contiene un dominio de ai'H·I.5)P2. qur anclu la proteína a la membrana, y un dominio (iTPasa que regula la

a la que las vesículas se separan de la membrana. 1 n el proceso de separación '>C

-mm mucho la'> do~ capas no citosólicas de la membrana y se fusionan, sellando la ve­l'ltra poder reali?.ar e!:ita función, la dinamina recluta otras proteínas del cuello de la

t•n formación que, junto con la dinarnina, contribuyen a deformar la zona de mern­dio;torsiomm directamente la estructura de la hicapa lipídica. cambiando su cornposi­'r la acción de enzimas modificadoras de lípidos, o mediante ambos mecanismos.

ulo se ha separado de la membrana, la vesícula rápidamente pierde su cubierta de llna PIP fosfatasa que se encuentra fonnando pane de la cubierta de la vesícula

de clatrina destruye el PI(4,5)P2 de la membrana. debilitando la unión de las pro­:tptadoras. Además una proteína chaperona 1 !sp70 actúa como ATJ>a<;a de elimina-

larubierta y utiliza la hidrólisis del ATP para separar las proteínas de la cubierta de l'arece que otra proteína de la cubierta denominada muilina activa la AI'Pa'>a. La 1 recubierta dura más tiempo que la cubierta proteica sobre la vesícula, por lo que '"tir mecanismos de control que eviten que la da trina sea eliminada antes de que

.da \e fom1e por completo (se trata más adelante).

757

Figura 13-10 Fosfat ldilinositol (PI) y fosfoinositoles (PIP). (A, B) la estructura de PI muestra los grupos hidroxilo libres del azúcar lnositol que, en principio, pueden ser modrficados. (C) La fosfonlaclón de uno, dos o tres de los grupos hidroxilo en PI por PI quinasa y PIP quinasa produce una gran variedad de especies PI P. Se denominan de acuerdo con el numero de grupos fosfato (en subíndiCe) y su posición en el anillo (en paréntesis) ariadido a PI. Se muestra la estructura de P1(3,4)P2. (O) Las células ammales t1enen algunas PI quinasa y PIP quinasa y un numero similar de PIP fosfatasa, que se localizan en los diferentes orgánulos donde cata !Izan, de manera regulada, la producción de determrnados PI P. Las fechas rojas y verdes destacan las reacciones quinasa y fosfatasa, respectivamente. (E, F) Los grupos de cabeza de los fosfo~nositoles son reconocidos por dominios proteicos que discriminan entre las diferentes formas. De esta manera, cienos grupos de proteínas que contienen esos dominios pueden ser reclutadas en reg1ones de membrana donde se encuentran presentes estos fosfolnositoles. En la figura se muestran P1(3)P y Pl(4,5) P2. (0, modificado de MA de Matteis y A. Godi, Nar. Ce// Sío/6:487 -492, 2004. Con permiso de Macmlllan Publishers Ltd.)

758 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

-o - <fii)

fagocitosis \ \0)250 ,

endocitosos

- o - -exocitosos regulada

--..()_ exocitosis const1tutova

CLAVE: PI(3)P

PI(4)P

P1(4.5)P,

PI(3,4,5)Pl

Unas GTPasas monoméricas controlan el ensamblaje de la cubierta

Para equilibrar el tráfico vesicular desde y hacia un compartimiento es necesario que las pro­teínas de cubierta se ensamblen solamente cuando sea necesario. Aunque la producción lo­cal de PIP parece tener un papel crucial en la regulación del ensamblaje de las cubierta:. de clatrina en la membrana plasmática y el complejo de Golgi, las células tienen mecanismos adicionales para regular la formación de las cubiertas. Por ejemplo, las GTPruas deconrrol de reclutamiento de la cubierta comrolan el ensamblaje de cubiertas de clatrina en los endoso­mas y de cubiertas de COPI y COPII en el Golgi y en las membranas del ER.

Muchas de las etapas del Lransporte vesicular dependen de una serie de proteínas de unión a GTP que controlan tanto los aspectos espaciales como temporales del intercambio de membranas. Como se describe en el Capítulo 3, algunas proteínas de unión a GTP regu­lan la mayorfa de los procesos en las células eucariotas. Actúan como interruptores mole­culares que oscilan entre un estado activo unido a GTP y un estado inactivo unido a GDP. Dos clases de proteínas regulan el paso de uno a otro estado: los factores intercambiadores de nucleótidos de guanina (GEF: gucmine-nucleotide-exchange factors), que activan a las

(A) dínamina y proteínas asociadas

bloqueado por algunas

mutaciones de la dinamina

1

200 nm

Figura 1 3- 11 l ocalización Intracelular d•! los fosfolnosltoles. Los diferentes tipos de PIP se encuentran situados en diferente.) regiones de membrana, donde es frecuent que se encuentren asociados a procesos concretos de transporte vesicular. Por ejemplo, la membrana de las vesfculas de secreción contiene P1(4)P. Cuando las veslculas se fusionan con la membrana plasm~tlca, una PIS-quinasa que se encuentra allf transforma el P1(4)P en PI(4,5)P2, que a su vez ayuda a reclutar protefnas adaptadoras, inicl~ndose la formación de una depresión recubierta de clatrina como primera etapa de la endocit mediada por da trina. Una vez que la vesr, recubierta de clatrlna se separa de la membrana plasmática, la acción de una PI(S)P fosfatasa hidrollza el PI(4,5)Pz. lnestabllizando la unión de las protefnas adaptadoras y la el lita el desensambla¡e d cubierta de la vesfcula. M~s adelante en e mismo capitulo se describe la diferencia e~ la exocitosis regulada y la constitutiva (Modiflcado de M.A. de Matteis y A. God• Nar. Ce// Btol. 6: 487-492, 2004. Con permiso de Macmlllan Publlshers Ltd.)

Agura 13- 12 Papel de la di na mina en¡, separación de las vesfculas recubiertas clatrlna de la membrana. (A) La dinamln.a se ensambla en forma de anillo alrededor cuello de la depresión. Se cree que el an de di na mina recluta otras protelnas al de la vesfcula que, junto a la dinamina. desestabilizan las bicapas llpídicas de fom que las capas no citosólicas de las bicap.n lipidlcas fluyen una en la otra. La vesfcul~ recién formada se separa de la membran1 Determinadas mutaciones de la dinamir\4 pueden tanto activar como bloquear el proceso de separación. (B) La di na mina fue descubierta como la protefna que era defectuosa en el mutan te shibire de Drasophila. Estas moscas mutantes quedan paralizadas porque la endocitosis que cstJ mediada por da trina se detiene; las sina nerviosas son incapaces de reciclar y se bloquea la señalización sináptica. En esm electromicrografia se muestran profund" depresiones recubiertas de da trina for en las células nerviosas de la mosca, con anillo ensamblado alrededor del cuello,q se asume que es la dlnamlna mutada. FJ proceso se detiene porque no se produc fusión de la membrana. (B, de J.H. Ko•~nig y K. lkeda,J. Neurosci. 9:3844-3860, 1909. permiso de la Soclety of Neuroscience 1

C-ANISMOS MOLECULARES DE TRANSPORTE DE MEMBRANA

lilas al catalizar el intercambio de GDP por GTP. y las proteínas activadoras de laactivi­'. /Pasa (GAP: GTPase-activating proreins) que inactivan la~ proteínas activando la hi­'' del GTPunido a GDP (véase Figura 3-71). Aunque tanto las proteínas de wuón a GTP

ornéricas (GTPasas monoméricas) como las heterotriméricas de unión a GTP (proteí­GJ tienen papeles importantes en el tráfico vesicular, se conoce mejor el que desempe­

,, GTPasas monoméricas y, por ello, la exposición se centrará en ellas. 1 ·" GTJ>asas de reclutamiento de la cubierta son miembros de la familia de las GTPasas •méricas. Incluyen a las proteínas Arf, responsables tanto del ensamblaje de las cu­,, COPI como de da trina en las membranas del Golgi, y a la proteína Sarl, responsable ,,amblaje de las cubiertas COPll en la membrana del ER.

•··" GTPasas de reclutamiento de cubierta se encuentran habitualmente a concentra-1.-\:ada en el citosol, en un estado inactivo, unidas a GDP. Cuando se tiene que fonnar

,.,ícLLia recubierta de COPII a partir de la membrana del ER, una proteína Sarl-GEF es­. J unida a la membrana del P.R se une a Sarl citosólico, haciendo que Sar 1 libere GDP

• , IP en su lugar. (l lay que tener presente que los niveles de GTP en el citosol son muy • •res a los de GDP y que, por tanto, tenderá a unirse espontáneamente a GTP una vez e ,f)P.) En este estado unido a GTP.Ia proteína Sarl expone una hélice anfipática que se

ti• t•n la cara cito~ólica de la bicapa lipídica de la membrana del ERe inicia la vesicwa­llgura 13-13). Las otras proteínas GEF y GTPasa.s de reclutamiento actúan de forma si­··n otras membranas.

Al~:unas subunidades de proteínas de cubierta también actúan, aunque más débílmente, J·. grupos de cabeza polar de ciertas moléculas lipídicas, sobre todo ácido fosfatídico y ""itoles, asr como con las colas citoplasmáticas de algunas de las proteínas de mcm­¡uc son reclutadas en la depresión. Todas estas interacciones proteína-lípido y proteína­"' unen con fuer1.a la cubierta a la membrana, lo que provoca la deformación de la r.llla y la aparición de una depresión, que se separará como una vesfcula recubierta.

1 • r•dutamiento de las GTPasas de cubierta también tiene un papel en el desensambla­' rubierta. La hidrólisis de GTP unido a GDP causa un cambio conformacional de la

(B)

__J

25 nm (O)

Sec24 Sec23

carga

veslcula recubierta de COPII

l

proteínas de membrana seleccionadas

membrana dadora

759

Figura 13-13 Formación de una veslcula recubierta de COPII. (A) La proteína Sarl es una GTPasa de reclutamiento de cubierta . Cuando está inactiva, Sarl -GDP se une a un Sar1-GEF en la membrana del ER; este hecho provoca la liberación del GDP de Sar1 y su unión a GTP. La proteína Sarl -GEF (también denominada Sec12) fue descubierta como uno de los mutantes sensibles a los cambios de temperatura que bloquean el transporte desde el ERal complejo de Golgi (véase Panel 3- 1 ). Un cambio conformacional regulado en Sar1 expone una hélice anflpátlca que se inserta en la capa citosólica de la membrana del ER, iniciando la curvatura de la membrana. (B) Sarl unido a GTP se une a un complejo de dos proteínas de cubierta COPII, denominadas Sec23/24. La estructura de un cristal de las proteínas Sec23/24 junto con Sarl permite predecir el modo en que la hélice anflpátlca de Sarl ancla el comple¡o en la membrana. Sec24 tiene sitios diferentes de unión para colas citoplasmáticas de los receptores de carga. Toda la superficie del complejo que se une a la membrana está ligeramente curvada y se adapta al diámetro de las vesículas recubiertas de COPII. (C) Un complejo de dos proteínas COPII adicionales, denominadas Sec13/31, forma la capa exterior de la cubierta. De manera similar a la clatrina, Sec13/31 solas pueden pollmerizar formando mallas regulares con las dimensiones adecuadas para rodear una veslcula recubierta de COPII. (0 ) Sarl GTP

activo y unido a la membrana recluta subunidades COPII a la membrana. Esto provoca la formación de una depresión en la membrana que incluye determinadas proteínas transmembrana. Un proceso de fusión posterior separa la vesícula de la membrana.

Se cree que otras vesículas recubiertas se forman de una manera similar. La GTPasa de reclutamiento de cubierta Arf también presenta una hélice antipática pero, a diferencia de Sart , la hélice tiene unido covalentemente un ácido graso que contribuye a su hidrofobicidad. Como en Sarl.la hélice anflpática regulada está oculta en el estado unido a GDP y expuesta en el estado unido a GTP. Como se describirá más adelante, las protelnas GTPasa Rab regulan su unión a las membranas de un modo similar a éste (véase Figura 13-14). (C, modificada de S.M. Stagg et al., Nature 439:234-238, 2006. Con permiso de Macmillan Publishers Ltd.)

760 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

GTPasa que extrae su cadena hidrofóbica de la membrana, provocando el desensamblaje de la cubierta de la vesícula. Aunque no se conoce qué es lo que desencadena la hidrólisis del GTP, :;e ha propuesto que el funcionamiento de las GfPasas es similar al de un temporizador, hidrolizando GTP con una frecuencia baja pero predecible. Por ejemplo, las cubiertas COPII aceleran la hidrólisis de GTP mediante Sar 1 y provocan el desensamblaje de la cubierta un cierro tiempo después de que se iniciara el ensamblaje. Asf pues, una vesícula sólo se for­mará por completo cuando el proceso de vesiculación sea más rápido que el de desprendí­miento de la cubierta; de no ser así, el desensamblaje se produciría antes de que la vesícula se separase de la membrana y el proceso tendría que empezar de nuevo en un lugar y mo­memo más apropiado.

No todas las vesículas de transporte son esféricas

Aunque la formación de vesículas que se produce en diferentes regiones de la célula tiene muchos elementos en común, en cada una de las membranas celulares presenta ciertas par­ticularidades. Por ejemplo, la membrana plasmática es relativamente plana y rfgida, debido a su riqueza en colesterol y a la presencia de un citoesquelcto cortical. En ese caso, las cu­biertas de clatrina llenen que producir fuerzas considerables para introducir curvatura; so­bre todo en el cueUo de las vesículas en fonnación, la dinamina y sus proteínas asociadas deben facilitar la curvatura necesaria para el proceso de separación. Por el contrario. en mu­chas membranas intracelulares la formación de vesículas se produce en regiones que ya es­tán curvadas, como el borde de las cisternas del Golgi o el final de los tú bulos de membrana. En estos lugares. la principal función de las cubiertas es capturar la carga adecuada más que deformar la membrana.

Las vesfculas de transporte pueden tener diferentes formas y tamaños. Cuando se ob­servan al microscopio células vivas, modificadas genéticamente para que ell:presen compo­nentes fluorescentes de membrana, se puede ver cómo, tanto desde los endosomas como desde la red del trans Golgi, se emiren de forma continua largos tú bulos. Las proteínas de cu­bierta se ensamblan sobre los rúbulos y ayudan a reclutar las moléculas a transportar. Los tú bulos pueden o bien separarse o bien formar vesículas con la ayuda de proteínas similares a la dinamina, actuando como vesículas de transporte. Dependiendo de las eficiencias rela­tivas de tubulación y fragmentación de las membranas, se pueden formar vesículas de dife­rentes formas y tamaños. Así pues, el transporte vesicular no siempre tiene Jugar a través de vesículas esféricas de un tamafto uniforme, SlllO que puede suponer la participación de grandes fragmentos del orgánulo dador.

Los tu bulos tienen una relación de superficie a volumen muy superior a la de los orgá nulos desde los que se forman. Están por tanto relativamente enriquecidos en proteínas de membrana respecto a proteínas solubles. Tal como se indicará esta propiedad es titi l en la clasificación de proteínas en los endoso mas.

Las proteínas Rab guían el direccionamiento de las vesículas

Para asegurar un flujo ordenado del tráfico vesicular, las vesfculas de Lransportc han de c;er muy selectivas en el reconocimiento de la membrana diana con la que se fusionarán. Debido a la existencia de una gran diversidad de sistemas de membrana y a lo atestado que está el interior celular, es probable que una vesícula se encuemre con muchas membranas diana antes de encontrar la correcta. La especificidad en el direccionamiento está asegurada porque todas las vesfculas presentan marcadores de superficie que las identifican con su origen y con su tipo de carga y porque las membranas diana presentan receptores comple­mentarios que reconocen a Jos marcadores apropiados. Este crucial proceso de recono­cimiento está controlado por dos tipos de proteínas: las protefnas Rab que dirigen la vesícula a ptmtos específicos sobre la membrana diana adecuada. y las proteínas SNARE que partici­pan en la fusión deJas bicapas lipídicas.

Las proteínas Rab desempeñan un papel esencial en el transporte vesicular. De manera similar a las GTPasas de reclutamiento de las cubiertas, que hemos descrito anteriormente (véase Figura 13 13), también son GTPasas monoméricas. Con alrededor de 60 miembros. fom1an la familia más numerosa de GTPAsas monoméricas. Cada una de las proteínas Rab se asocia con uno o más orgánulos membranosos de la vía biosintétíca-secretora o endocftica; cada uno de estos orgánulos tiene al menos una protefna Rab en su superficie citosólica

MECANISMOS MOLECULARES DE TRANSPORTE DE MEMBRANA

Tabla 13- 1 Localización subcelular de algunas proteínas Rab

red del cis Golgl

veslculas sinápticas, gránulos de st>ereción

endosomas tempranos

membrana plasmática, vesículas revestidas de clatrína, endosomas tempranos

endosomas tempranos

cisternas del medio y trans Golg1

endosomas tardíos

vesfculas de secreción (basolaterales)

endosomas tardíos, red del trans Golg1

13-l). Su distribución altamente especifica sobre 105 diferentes sistemas de membra-hnt·cn de las proteínas Rab marcadores moleculares ideales para identilicar cada uno de

ipos de membrana y para dirigir el tráfico vesicular entre ellos. Las protefnas Rab pueden -:-lunar sobre las vesfculas de transpone, las membranas diana o sobre ambas.

l>t.•la misma forma que para las GTPasa<; de reclutamiento de las cubiertas, las protef­Rah oscilan entre la membrana y el citosol y regulan la unión reversible de complejos

-~lws sobre la membrana. En su estado unido a GDP son inactivas y se encuentran u ni­• ntm protefna CCDI: Rab-GDP dissociation i nltiiJitor) que la<; mantiene solubles en el

mien tras que en su estado unido a GTP son activas y se encuentran estrecha-unidas a la membrana de un orgánulo o de una vesícula de transporte. Las protefnas F unidas a la membrana activan a las protefnas Rab tanto en las vesfculas de trans­

cumo en la membrana diana pues la activación de Rab parece ser necesaria en ambos . llna vez unida a Gl P y anclada en la membrana a través de un Upido hidrofóbico, se

1 otras protefna-.. las denominadas efectores Rab , que facilitan el transporte vesicular, el K·imiento de membrana y la fusión (Figura 13-14). La hidrólisis de GTP ajusta la con­ión de Rab activo en la membrana y, como consecuencia, la concentración de su .. obre dicha membrana.

A diferencia de la estructura, muy conservada, de las protemas Rab, la estructura de ltt·tores de Rab varía mucho de una proteína Raba otra. Algunos efectores Rab son

~litiS motoras que propulsan vesfculas a lo largo de los filamentos de actina o de mi­~hulos hacia su diana apropiada. Otra'> son proteínas de unión, algunas de las cuales

larga~ estmcturas lilamentosas que actúan como "hilos de pescar" que se extienden dos membranas separadas más de 200 nm; otras protefnas de unión son grandes

-.,lt'ios proteicos que enlazan dos membranas cuando ~e encuentran bastante próxi-

v-SNARE

carga

Figura 13- 14 Anclaje de una veslcula a la membrana diana. Las proteínas efectoras

761

de Rab interaccionan a través de las proteínas Rab act1vas (Rab-GTP, amarillo) localizadas en la membrana diana, de la veslcula o en ambas, estableciendo el primer contacto entre las dos membranas que se fusionarán. En el ejemplo que se muestra, el efector Rab es una proteína de unión filamentosa (verde). A continuación, las proteinas SNARE de las dos membranas (rOJO y azul) se aparean anclando la veslcula a la membrana y catalizando la fusión entre las dos bicapas lipídicas próximas.

762 Capítulo 1 3: Tráfico vesicular intracelular

Rab5-GDP

reclutamiento de más Rab5-GEF activo

RabS-GEF

hélice ' \ ;;:. _ antipática ~

PI 3-qui nasa

membrana endosómica

actiVO

lfpidos unidos covalentemente

dominio de membrana Rab5

mas. Los efectores Rab también pueden interactuar con las proteínas SNARE y acoplar el

anclaje a la fusión.

La misma proteína Rab puede unirse a muchos efectores. El ensamblaje de las proteínas

Rab y de sus efectores sobre una membrana es un proceso cooperativo que conduce a la de­limitación de áreas grandes y especializadas en la membrana. Por ejemplo, Rab5 se ensam­

bla sobre las membranas endosómicas y participa en la captura de vesículas recubiertas de

el a trina que llegan desde la membrana plasmática. Recluta proteínas de unión para cazar las

vesfculas q ue entran. lnicialmeme Rab5-GEF recluta Rab5 al endoso m a que pasa a su forma activa, w1ida a GTP. y queda anclado en la membrana (Figura 13-J5). La proteína Rab5 ac­

tivn recluta más Rab5-GEF al endosoma, estimulando de ese modo el reclutamiento de más Rab5 en la misma área. Además, Rab5 activo activa una PI 3-quinasa que convierte local­

mente PI a Pl(3)P que, a su vez, une a algunos efectores de Rab5. Este ripo de retroalimen­

tación positiva incrementa en gran medida el proceso de ensamblaje y ayuda a establecer

diferentes regiones de membrana funcionalmente diferentes en una membrana continua.

La membrana endosómica es un buen ejemplo de cómo las diferentes proteínas Rab y s us efectores comribuyen a generar muchos dominios especializados, cada uno de ellos con

su propia serie de ñmciones específicas. Así pues, mientras que los dominios Rab5 actúan

como receptores de vesículas de entrada procedentes de la membrana plasmática, se cree

que unos dominios diferentes de RabJ 1 y Rab4 organizan en la misma membrana la fonna­

c ión de vesfcuJas de reciclaje que devuelven las proteínas desde el endosoma a la membra­

na plasmática. Una vez ensamblados estos dominios coexisten en la misma membrana

durante largos periodos.

Las proteínas SNARE participan en el proceso de fusión

Cuando la vesícula de transporte se ha unido a su membrana diana. libera su carga despu6s

de fusionar su membrana. Para que se puedan fusionar las membranas es necesario aproxi­

mar las bicapas lipfdicas hasta una distancia de 1 ,5 nm una de otra de manera que puedan

juntarse. Cuando las membranas se encuentran tan próximas, los lfpidos pueden fluir de

w1a a otra. Para que se produzca esta aproximación. el agua tiene que desplazarse de la su­

perfic ie hidrofílica de la membrana y este proceso es muy desfavorable desde el punto de vista e nergético. Parece probable que la superación de esa barrera energética sea posible por

la acción de proteí11ns de fusión especializadas que catalizan todas las fusiones de membra­

na en la célula. Ya se ha descrito el papel de la dinamina en una tarea s imilar durante la se­

paración de las vesículas recubiertas de clatrina (véase Figura 13-12).

Las proteínas SNARE (o simplemente SNARE) catalizan las reacciones de fusión de

membrana en el transpone vesicular. También aportan especificidad adicional en el proceso

de transporte contribuyendo a asegurar que sólo se fusionen las vesícu las dirigidas correc­

tamente. Se conocen al menos 35 SNARE diferentes en las células animales cada una de las

cuales está asociada a un orgánulo particular en la ruta biosintética-secreLOra o endocftica.

Figura 13-15 Formación de un dominio Rab 5 en la membrana endosómica Una GEF espedfica de RabS de la membrana del endosoma se une a la protefna RabS e induce el intercambio de su GDP por GTP. La unión o GTP modifica la conformación de la proteína Rab que expone una hélice antipática y un grupo lipfdico unido covalentemente, a través de los cuales RabS-GTP se ancla a la membrana. Rab5 activa la Pl3-quinasa. la cual transforma PI en P1(3)P. Ambos compuestos, PI(3)P y RabS, unen una amplia variedad de protefnas efectoras de Rab qu" contienen lugares de unión a PI(3)P. como protefnas de unión filamentosas que se unen a vesfculas recubiertas de clatrina en formación a partir de la membrana plasmática. Rab5 activo también recluta mái RabS·GEF activando aún más el ensamblaJe de Rab5 en la membrana.

Parece que los ciclos regulados de hidróli e Intercambio GDP-GTP regulan el tamaño y las actividades de los dominios Rab de una manera dinámica. A diferencia de las prorelnas SNARE. que son protefnas transmembrana, el ciclo GDP/GTP. ya sea acoplado a su posicionamiento en la membrana o soluble en el cítosol, dota a la proteínas Rab de un mecanismo de control rápido de su ensamblaje o desensamblaje sobre la membrana. Por ejemplo, durante~ transporte entre los endosomas temprano\ y tardfos, RabS puede ser desplazado y sustituido por Rab7, 1o que determina que la carga sea destinada a degradación. (Adaptado de M. Zeriai y H. McBríde, Nor Mol. Cei/Biol. 2:107 117,2001. Con permiso de Macmillan Publishers ltd.l

SMOS MOLECULARES DE TRANSPORTE DE MEMBRANA

v-SNARE (sinaptobrevina)

t-SNARE (smtaxina)

veslcula sináptica

CITOSOL

membrana plasmática de la célula nerviosa

t-SNARE (Snap25)

13-16 Estructura de un complejo trans-SNARE. Las SNARE responsables del anclaje de las ~inapricas en la membrana plasmática de los terminales nerviosos son tres proteínas.

lf• \NARE sinaprobrevma y la t-SNARE sinraxma son proteínas transmembrana y cada una de ellas ~ye con una hélice ex al complejo. La t -SNARE Snap25 es una proteína periférica de membrana 111 contnbuye con dos hélices a al haz de cuatro hélices a. Están conectadas por un bucle (no -.wnt.Jdo en la figura) que se sitúa paralelo a la membrana y tiene cuatro cadenas de ácidos grasos

que la ancla a la membrana. En muchas otras t-SNARE. cada hélice a procede de una proteína que está anclada a la membrana a través de su dominio transmembrana. Los complejos

SHARE siempre están formados por cuatro hélices a estrechamente enrolladas, tres aportadas por y una por v-SNARE. La t-SNARE está formada por varias cadenas, una de las cuales siempre es

..,.otrina transmembrana y aporta una hélice a, y una o dos cadenas ligeras adicionales que pueden transmembrana y que aportan las dos hélices a restantes al haz de cuatro hélices del complejo

• UIARE. En la figura, se representa la estructura de un cristal de un complejo estable de las cuatro enrolladas de dichas proteínas en el contexto de la proteína completa Las hélices a están

-..ntadas por cilindros para simplificar la figura. (Adaptado de R.B. Sutton et al. Narure 395:347-353, ·()11 permiso de Macmillan Publishers Ltd.)

IJWtcínas lr'dnsmembrana existen como pareja~ complememarias -con una v-SNARE localizada en la membrana de las vesfculas y una t-SNARE que se encuentra

lf.'llcral en las membranas diana (véase Figura 13-14). Una v-SNARE riene una única polipcptfdica mientras que una t-SNARE está formada por dos o más protefnas 13-16). Las v-SNARE y t-SNARC tienen unos dominios helicoidales caracterfsticos; una v-SNARE interacciona con una t-SNARE, los dominios helicoidales de ambas se 11110 sobre otro ronnando un haz estable de hélices. 8 complejo tmns ·5NARf' rcsul­.ntiene unidas las dos membmnas en estrecha proximidad.

klntlc han sido mejor caracterizadas las SNARh ha s ido en las neuronas, donde, en el !ll·liberación de neurotransmisores, controlan el anclaje y la fusión de vesículas si­t•n la membrana plasmática de las tenninales nerviosas. La bacteria que produce el

nl'l botulismo l>Ccreta potentes neurotox.inas que penetran en neuronas espcdficas -mwn proteínas SNARE en las tenninales nerviosas. De esta manera, las toxinas blo-

lll~ transmisiones sinápücas provocando frecuentemente la muerte 'Crt't' que los complejos rram-SNARE cata! izan la fusión de las membranas utili.t.ando

que se libera cuando las hélices que interaccionan se enrollan una sobre otra lllúnu111do las dos membranas y expulsando de forma simultánea a las moléculas de agua

1tertase (Figura 13-17). Cuando se me:tclan liposomas que contienen v-SNARE puri­wnliposomas que contienen t-SNARE complementarias, sus membranas se fusio­nque con lentitud. En la célula, otras protemas reclutadas en el sirio de fusión,

-...m·nte efectores Rab, cooperan con las SNARE acelerando la fusión. fusión no siempre se produce justo después de que se apareen v-SNAR.E y 1-SNARE. •~·ribiremos más adelante, en el proceso de exocitosis regulada la fusión se retrasa qut~ la secreción se activa mediante una señal extracelular específica. En este caso es

a de Ca2• locali?..ada la que desencadena la fusión, probablemente liberando inhibidoras que impiden que se Ueve a cabo el enrolJarniemo completo de los , transSNAHE.

protefnas Rab, que pueden regular la accesibilidad de proteínas SNARI:., ejercen un duna! de control. Las t-SNARE de las membranas diana se encuentran asociadas

HEMIFUSIÓN

FUSIÓN

IOnm

Figura 13-17 Modelo sobre cómo las proteínas SNARE pueden concentrarse en la fusión de membrana. La fusión de membranas tiene lugar en varias etapas. Un apareamiento intimo entre proteinas v-y t-SNARE situa a las bicapas lipídicas en una gran proximidad y expulsa a las moléculas de agua de la interfase. Algunas moléculas lipidicas sttuadas en

763

las dos monocapas fluyen entre las membranas formando un tallo de conexión. Los líptdos de las otras dos monocapas entran en contacto formando una nueva bicapa que amplia la zona de fusión (hemifusión o medio-fusión). La rotura de la nueva bicapa completa la reacción de fusión.

764 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

con proteínas inhibidoras que se han de liberar antes de que t-SNARE pueda actuar. Las pro­teínas Rab y sus efectores desencadenan la liberación de estas proteínas inhibidoras de l-SNARE. De esta manerd, las proteínas t-SNARE se concentran y activan en las regiones adecuadas de la membrana, donde las proteínas de anclaje capturan a las vesículas entran­tes. Las proteínas Rab aceleran el proceso por el cual se encuentran las proteínas SNARE apropiadas de dos membranas.

Para que el transporte vesicular se produzca con nom1alidad las vesfculas de transporte deben incorporar las proteínas SNARE y llab apropiadas. No es de sorprender, por tanto, que muchas vesículas de transporte sólo se formen si incorporan en su membrana los compo­nentes necesarios SNAJm y Rab. Cómo se produce este crucial proceso de control durante la formación de las vesículas continúa siendo un misterio.

Las S N ARE unidas tienen que ser separadas antes de volver a ser usadas

La mayoría de las proteínas SNARE de las células han participado en muchas rondas de transporte vesicular y ocasionalmente se encuentran formando parte de complejos estables de membrana con SNARE complementarias. Los complejos se han de disociar antes de que las SNARE puedan participar en nuevas rondas de transporte. Una proteína esencial deno­minada NSP oscila entre las membranas y el citosol catali1..ando el proceso de desensambla­je. Se trata de una ATPasa que utiliza la energía de hidrólisis del ATP para deshacer las uniones estrechas que se forman entre los dominios helicoidales de las proteínas SNARE apareadas (Figura 13-18). El requisito de la reactivación de SNARE mediante NSF para la disociación de los complejos SNARE ayuda a evitar que las membranas se fusionen de forma indiscriminada: si la t-SNARE de una membrana diana permaneciera siempre activa, cual­quier membrana que contuviera una v-SNARt. complementaría podría fusionarse siempre que an1bas membranas establecieran contacto. No se sabe cómo se controla la aCLividad de NSF para que la maquinaria SNARE se active en el lugar y momento apropiado, pero los efectores Rab son candidatos probables para desempeñar esa función.

Las proteínas de fusión virales y las SNARE pueden utilizar mecanismos de fusión similares

La fusión de membranas no sólo es importante en el transporte vesicular sino también en otros procesos. La membrana plasmática del espermato7..oide y del oocito se fusionan du­rante la fecundación (descrito en el Capftulo 21 l y los mioblastos se fusionan entre sí durante e l desarrollo de la fibra muscular multínucleada (tratado en el Capftulo 22). De manera similar las mitocondrias se fusionan y se dividen (expuesto en el Capftulo 14). Todas las fu­siones de membrana requieren protefnas especiales y están sujetas a controles estrictos ase­gurando que sólo se fusionan las membranas adecuadas. Los controles son cruciales para el mantenimiento tanto de la identidad de las células como de la individualidad de cada uno de los compartimientos intracelulare!>.

Las fusione5 de membrana catalizadas por las protcfnas de fusión virales son las mejor conocidas. Estas proteínas desempeñan un papel esencial al permitir la entrada del virus recubierto {que tiene una cubierta basada en una bicapa lipfdica) al interior de las células que infectan (descrito en los Capftulos 5 y 24). Por ejemplo, los virus - tales como el virus de la inmunodeñciencia adquirida humana (! IJV), que causa sida- se unen a receptores de la superficie celular y se fusionan con la membrana plasmática de la célula diana

disociación de SNARE

Figura 13-18 Disociación de parejas SN por la acción de NSF después de complt un ciclo de fusión de membrana. Despub de que las v-SNARE y t-SNARE hayan participado en la fusión de una vesfculd transporte con la membrana diana, NSF une al complejo SNARE, con la ayuda d4 proteínas accesorias, hidroliza ATP y separ¡t las protefnas SNARE.

ANISMOS MOLECULARES DETRANSPORTE DE MEMBRANA

receptor de citoquinas

NACD4 UNIÓN A RECEPTOR DE CITOQUINAS

INSERCIÓN EN LA MEMBRANA

200nm

~~ CAMBIO

CONFORMACIONAL FUSIÓN

765

ESPACIO EXTRACELULAR

CITOSOL

ENTRADA DE LA NUCLEOCÁPSIDE VIRAL

Figura 13 19 Entrada de virus recubiertos en las células. (A) Electromicrograffas que muestran como HIV entra en la célula por fusión de su membrana con la membrana plasmática de la célula. (B) Modelo del proceso de fusión. En primer lugar HIV se une a la proteína CD4 en la superficie de la célula diana. Esta interacción está mediada por la protefna viral gp120 que está untda a la proteína de fusión de HIV. Una segunda protelna de la superficie celular, que normalmente actúa como receptor de quimloqulnas (descrito en los Capítulos 24 y 25), Interacciona con gp120. Esta interacción libera a la protefna de fusión de gp120 permitiendo que el antes oculto pépttdo de fusión hidrofóbico se inserte en la membrana plasmática de la célula diana. La proteína de fusión, que es un trímero (no mostrado), queda anclada, temporalmente, como proteína tntegral de dos membranas opuestas simultáneamente. La protefna de fusión se reorganiza de forma espontánea y se colapsa en un haz de seis hélices estrechamente empaquetadas. La energía liberada por esta reorganización en muchas copias de la protelna de fusión aproxima mucho las dos membranas y permite superar la elevada energfa de activación que por lo general impide la fusión de membranas. Asi, de una forma similar a la de una trampa para ratones, la protelna de fusión de HIV contiene una reserva de energía potencial que cuando se libera permite realizar un trabajo mecánico. (A, de B.S. Steln el al., Ce//49:659-668, 1987. Con permiso de Elsev1er; B, adaptado de un dibujo de Wayne Hendrickson.)

:13 19). Esta fusión permite al ácido nucleico viral del interior de la nucleocápside 1 1'11 el citosol, donde se replica. Otros virus, como el virus de la gripe. primero en­l.t célula mediante endocitosis mediada por receptor (descrita más adelante) yac-

'' los endosomas; el pll bajo de los endosomas activa una proteína de la envohura e rataliza la fusión de las membranas virales y endoso males, liberando el ácido nu­

\'h :ti en el citosol.

t ·trucnua tridimenc;ional de las protefnas de fusión del virus de HIV y de la gripe t111a valiosa información acerca del mecanismo molecular de fusión de membranas

lo por estas proteínas. La exposición de la proteína de fusión de HIV a los receptores mbrana de la célula diana, o la ex:po!>ición de la proteína de fusión del virus de la gri-

1 pl l bajo, descubre regiones hidrofóbicas ocultas. Estas regiones, denominadas pép-1/lstón, se insertan de forma directa en la bicapa lipídica de la membrana de la célula

1 ,.. esta manera, las proteínas de fusión virales son temporalmente proteínas trans­,,\,llil en dos bicapas lipfdicas separadas. Reorganizaciones estructurales de las pro­ck fusión aproximan mucho las dos bicapas lipídicas. y las desestabilizan, de forma

11 •1rapas se fusionan (véase Figura 13-19). Asf pues. las proteína!> de fusión virales y las ¡1romueven la fusión de bicapas lipídica~ de manera similar.

766 Capítulo 1 3: Tráfico vesicular intracelular

Resumen

El rransporte dirigido y selectivo de componentes particulares de membrana, desde 1111 comparli­miento delimitado por memlJrana de una célula eucariota notro, mantiene las diferencias e/llre estos comparrimiemos. LtlS ve.~íwlas de transporte, que pueden ser esféricas, tubulares o de fonnas ii7T!­gulares se fonnan a partir de regiones recubierUIS especialiwdas de la membrana de origen. El en­samblaje de la cubierta facilita el reclutamie/1/o de la membrana y el transporte de solubles por las moléculas dirige la formación de la uesfcula.

Hay diferentes tipos de uesfculas recubierws. Las mejor cararteriwdas .son /a.1 l'esfculas rerlf!sti­das de clatrina. que median el transporte tlf!sicular selectivo desde la membmnrr plasmáricn y la red del trans Golgi, y las t•esiculclS recubierras de COPI y de COPJI, que permiten el mm.~porte entre los cistemtlS del Golgi y enrre el ER y el complejo de Golgi, respectivamente. En las L'esfculas recniJierllls de c/atrina, las protefnas cuiaptadoras unen la clatrina a la memlJmna df! la vesfcultl y también atrapan especfjicammte moléculas de carga. que serán empt¡quetadas en/a uesfcrlia. Después de In formación de la tlf!Sfcula. la cubierta se desprende con rapidez y permite que la rlf!sfculn pueda fu­sionarse con la membrana diana apropiada.

Lll sfnwsis local de fosfoinositoles genera lugares de unión que aceleran el ensamblaje de la cu­bierta y la formación de la rlf!Sfcula. Además, las GTPasas monoméricas ayudan n regular algunas etapas en el transporte toesicu/ar; incluyendo tanto lafot mación de la wsfcu/a como su anclaje. /..as

GTPasas de reclwamiento de la wbierta, incluyendo a las protefnas Sarl y Arf. regulan el ensam­blaje de la cubierta y su desprendimiento. Una gran familia de protemas RaiJ nenia como GTPasa.s de direccionamiento de vesículas. Las proreflws RalJ son reclutadas en t'esfcu/as de transporte J' en las membranas diana. El ensamblaje y dcsensamiJlaje de proteínas Rt1b y de sus efectorc>s en domi­nios de membrana especializados está controlado de fonna dbufmica por la unión e /ridrólisis de GTP.I as protefnas Rab actit•as reclman efectores Rab. como las protefnas motoras, que tramportan lns r1esfculas sobre los fila memos de actina o los microttibulos, asf como protefnns de unión fila­mentosa.~. qut> colllribuyen a asegurar que las l'esíwlas entreguen su comen ido sólo ni comparti­miemo membranoso correcto. Las protefnas 11-SNARE en/a uesicula de traJzsporte y t-SNARE e11 la membrana diana forman complejos estables trans-SNARB, que aproximan las dos membrantlS /u¡s­ra que sus capas lipfdietlS pueden fusionarse.

TRANSPORTE DESDE EL ERA TRAVÉS DEL COMPLEJO DE GOLGI Como se ha sei'talado en el Capítulo 12, las proteínas recién sintelizadas atraviesan la mem­brana del ER desde el citosol y entran en la ruta biosintética-secretora. Durante su transpor­te posterior, desde el ERal complejo de Golgi y desde éste a la superficie celular o a cualquier otro sitio, estas proteínas son sucesivamente modificadas mientras pasan a través de una se­rie de compartimientos. El transporte de un compartimiento al siguiente implíca un equili brío delicado entre las vías de transporte hacia delante y hacia atrás (recuperación). Algunas vesículas de transporte seleccionan las moléculas a transportar y las desplazan hacia el si­guiente compartimiento de la vfa, mientras que otra.s recuperan las moléculas escapadas y las devuelven al compartimiento donde actúan normalmente. Asf pues, la vfa desde el ER hasta la membrana celular incluye numerosas etapas de clasificación, que de manera conti­nua seleccionan membrana y proteínas luminales solubles para su empaquetamiento y transporte en vesículas o fragmentos de orgánulos que emergen desde el ER y el complejo de Golgi.

En esta sección nos centraremos en el complejo de Golgi (también denominado aparato de Golgi). Es el lugar donde se realiza la mayoría de la !>fnw::.is de carbohidratos, así como el lugar de clasificación y envío de productos del ER. La célula produce muchos de sus poli­sacáridos en el complejo de Golgi, incluyendo la pectina y la hemicelulosa de las paredes celulares de las plantas, y la mayoría de los glucosaminoglucanos de la matriz extracelu­lar animal (descrita en el Capítulo 19). FJ complejo de Golgi también constituye una zona de paso de los productos del ER, de manera que una gran parte de los glúcidos que fabrica e l Golgi se unen como cadenas de oligosacáridos a las proteínas y lfpidos que el ER le envía. Algunos de estos oligosacáridos actúan como señales que dirigen determinadas proteínas hacia vesículas que las envia.rán a los lisosomas. Pero la mayoría de las proteínas y lfpidos, una vez adquiridos los oligosacáridos apropiados en el complejo de Golgi, son reconocidos por otros mecanismos y dirigidos mediante vesículas de transporte a otros desónos.

RETICULO ENDOPLASMÁTICO

GOLGI

írf . 11 ~~ 1 VESICULA$ ENDOSOMA

TARDIO

1 LISOSOM; 1 lll [ENOOSOMAj TEMPRA;;o l

........_ -

DE SECRE

[ .~ EXTERIOR DE LA CÉLULA

N S PORTE DESDE EL ERA TRAVtS DEL COMPLEJO DE GOLGI

s proteínas abandonan el ERen vesículas de transporte ubiertas de COPII

111iciar su ruta a Jo largo de la vfa biosintética-secretora, las proteínas que han entrado 1 1 H y están destinadas al complejo de Golgi o más allá, son empaquetadas en primer 1 ··n pequeñas vesfcuJas de transpone recubiertas de COPll. Estas vesfculas se forman en III'S especializadas del ER denominadas lugares de salidn del ER, cuya membrana carece h•1~omas unidos. La mayoría de las células animales tienen los lugares de salida del ER Nls de forma aleatoria a través de la red del ER.

En un principio se pensó que todas las protefnas que no estaban retenidas en el ERen­'dll por defecto, en las vesfculas de transpone. Sin embargo, en la actualidad parece el a­

,. habitualmente la entrada en las vesfculas que abandonarán el ER es un proceso til 11. En dichas vesfculas se reclutan muchas proteínas de membrana, donde son con­md,ts.

S.· nee que estas proteínas que serán cargadas presentan señales de salida (transporte) uperficie citosólica. que son reconocidas por componentes de la cubierta de COPII

1 •• 13-20); esto!> componentes de la cubierta actúan como receptores de carga y son re­,¡, de nuevo al ER después de liberar su carga en el complejo de Golgi. Las protefnas

,1,., que han de ser transportadas desde ellumen del ER tienen señales de salida que les ro·n unirse a receptores de carga transmembrana que a su vez tienen señales de salida • olas citosólicas que les permiten unirse a La cubierta de COPII. Con una frecuencia

nlt•rior, incluso algunas protefnas que no tienen señales de salida pueden entrar en las 1.1\, de manera que incluso las protef11as que por lo general tienen su función en el ER •wminadas protefnas residentes del ER) pueden salir lentamente del ER y ser trans­

¡{l.h hasta el complejo de Golgi. De forma similar, las proteínas secretoras que se sinte­llt>levadas concentraciones pueden abandonar el ER sin la ayuda de señales de salida ¡u ores de clasificación.

mayoría de las señales de salida que dirigen las proteínas solubles fuera del ER, hacia IJIIl'jo de Golgi y más aUá son desconocidas. Algunas proteínas transmcmbrana que • rumo receptores de carga empaquetando algunas proternas de secreción en las vesí-

l OPrr son lectinas que se unen a oligosacáridos. Por ejemplo, la lectina ERG!C53 se '••anosa y se cree que reconoce la presencia de este azúcar en dos factores de coagula­lilguineos secretados (factor V y factor VIII). contribuyendo a su empaquetamiento en 1.1, de tr.msporte en el ER.

nmsiguió descubrir el papel que desempeña ERGIC53 en el transporte de proteínas 1 que algunas personas que carecen de ella, por presentar una mutación heredada,

1mvcles reducidos de los factores V y VIII y, como consecuencia, suman hemorragias

señal de salida en la protefna carga

unida a la membrana

\l•ñal de salida n el receptor

de carga

"al de salida " la protefna

urga soluble

CITOSOL

vesfcula de transporte del ER en formación

¡--

protefnas chaperonas unidas a las protelnas desplegadas o mal plegadas

Sarl-GTP

, subunidades de las cubiertas COPII

- señal de salida

c.

en el receptor de carga

767

Figura 13- 20 Reclutamiento de las moléculas de carga en las veslcula.s de transporte del ER. Mediante la unión directa o indirecta a la cubierta COPII, las proteínas de carga, tanto de membrana como solubles respectivamente, son concentradas en las vesículas de transporte a medida que abandonan el ER. Las proteínas de membrana son empaquetadas en vesfculas de transporte en formación mediante Interacciones de las sella les de salida en sus regiones citosólicas con la cubierta COPII. Algunas de las protefnas de membrana atrapadas por la cubierta actúan como receptores de carga, uniendo a las protelnas solubles en ellumen y ayudando a empaquetarlas en vesículas. Una veslcula de transporte tfpica de 50 nm contiene alrededor de 200 protefnas de membrana que pueden ser de muchos tipos diferentes. Como se indica, las proteínas mal plegadas o mal ensambladas permanecen unidas a chaperonas que fas retienen en e l ER.

768 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

CITOSOL

cadena pesada de anticuerpo

RETENIDO EN EL ER

cadena ligera de anticuerpo

1

vesicula de transporte en formación

SECRETADO

Sólo pueden abandonar el ER las proteínas que están correctamente plegadas y ensambladas

Para salir del EH, las proteínas han de estar correctamente plegadas y, si son subunidades de complejos proteicos multiméricos, puede ser necesario que estén bien ensambladas. Aquellas que están mal plegadas o ensambladas se quedan en el ER, donde permanecen unidas a proteínas chaperonas (descrito en el Capítulo 6), tale5 como BiP o ca/nexina. F.sta~ chaperonas bloquean las señales de salida o. de alguna manera, retienen las proteínas en el ER (Figura 13-21 ). Posteriormente, estas proteínas fallidas son transportadas de nuevo al citosol donde son degradadas por los proteosumas (descritos en los Capítulos 6 y 12). Esta etapa de control de calidad impide el transporte hacia adelante de proteínas mal plegadas o mal ensambladas que podrían llegar a interferir con el funcionamiento de las proteínas nor­ma.les si fueran transportadas. Se producen una sorprendentemente gran cantidad de ac­ciones correctivas. Por ejemplo, más del 90% de las subunidades de nueva síntesis del receptor de la célula 1 (tratado en el Capítulo 25) y del receptor de acetilcolina (descrito en el Capítulo l l) son degradados nonnalmente sin que nunca alcancen la superficie celular don­de actúan. Así pues, las células han de sintetizar un gran exceso de muchas moléculas pro­teicas para producir w1as cuantas seleccionadas que se pliegan, se ensamblan y funcíonan de forma correcta.

El proceso de degradación continuo de una parte de las proteínas del ER también forma pnnc de un sistema de ale na del sistema inmune en respuesta a una infección viral. Mediante transportadores ABC especiali.tado::., el ER importa fragmentos peptfdicos de proteínas vira­les producidos por la acción de las proteasa~ en el protcosoma. Los péptidos extraiios son unidos a proteínas MI IC de clase 1 en ellumen dell:.R y transportados a la superficie celular. Los linfocitos T reconocen los péptidos como antígenos no-propios y destruyen las células infectadas (descrito en el Capítulo 25).

Sin embargo, en algunas ocasiones, este selectivo mecanismo de control de calidad es pemicioso. Las mutaciones más frecuentes que causan la fibro~is qufstica, una cnfennedad hereditaria común, producen una forma ligeramente mal plegada de una proteína de mem­brana que es imponame para el transporte del Cl . Aunque la proteína mutame podría fun­cionar perfectamente, si alcanzara la membrana plasmática, permanece en el EH. Esta grave enfermedad es consecuencia no de una mutación que inactive la proteína sino de que la proteína activa es descartada antes de que alcance la membrana plasmática.

Agregados tú bulo-vesiculares realizan el transporte desde el ER hasta el complejo de Golgi

Después de que las vesículas de Lransporte se hayan formado en los lugares de salida del EH, y se hayan desprendido de la cubierta, empiezan a fusionarse entre sí. Esta fusión de mem-

Figura 13-21 Retención en el ER d e moléculas de anticuerpo ensambladas de forma incompleta . Los anticuerpos están compuestos por dos cadenas pesadas y do~ cadenas ligeras (descrito en el Capitulo 25¡ que se ensamblan en el ER. Se cree que la chaperona BiP se une a todas las molécul, ,s de anticuerpo ensambladas de forma Incompleta y bloquea su señal de salida. Asf pues, sólo los anticuerpos que están perfectamente ensamblados salen del ER y son secretados.

S PORTE DESDE EL ERA TRAVEs DEL COMPLEJO DE GOLGI

NSF NSF

ETAPA 1 ETAPA 2 ETAPA 3

del mismo compartimiento se denomina fUsión honwtlpica, para diferenciarla de la lll'terotípica, en la que la membrana de un compartimiento se fusiona con la mem­dt• otro compartimienro distinto. Como en la fusión heterotípica,la fusión homotfpi­

'l'uere w1 conjunto complementario de SNAAE. Sin embargo, en este caso, la 11 rón es simétrica con ambas membranas aportando tanto proteínas t-SNARE como nas v-SNARE (Figura 13-22).

la-. t•structuras formadas cuando las vesfculas derivadas del ER se fusionan unas con ,. denomjnan agregados túbulo-vesiculares, por su aspecto replegado al ser observado m~copio electrónico (Figura J3-23A). Estas agrupaciones forman un nuevo compar-1 t11 que está separado del EH y que carece de muchas de las proteínas que ac11ían en el 11· compartimiento se forma constantemente y actúa como un contenedor que lleva d desde el ER hasta el complejo de Golgi. Las agrupaciones tienen una vida media re­

n•·nte corta, ya que se desplazan con rapidez a lo largo de microtúbulos hacia el corn­Il•· (,olgi , con el que se fusionan liberando su contenido (Figura 13-238).

1 l uanto se forman las agrupaciones tübulo-vesicuJares, de ellas empiezan a formar­twr\as vesículas. A diferencia de las vesículas recubiertas de COPil que se forman en el 1, vesfculas están recubiertas de COPI. Devuelven al ER tanto las proteínas residentes

111 escapado como las proteínas que, como los receptores de carga, participan en las '•nes de vesiculación en eii::R. Este proceso de recuperación es una muestra de los ex­' mecanismos de control que regulan las reacciones de ensamblaje de las cubiertas. llnblaje de la cubierta de tipo COPI comienza sólo segundos después de que las cu­' OPll se hayan desprendido. Todavfa constituye un misrerio cómo se controla este

• • de sentido deJ ensamblaje de las cubiertas. ltmnsportede recuperación (o retrógrado) continúa mientras se desplazan las agrupa­tubulo-vesiculares hacia el complejo de Golgi. Asf pues, las agmpaciones maduran de

¡.~do túbulo-vesicular

ER

769

Figura 13-22 Fusión homotípica de membrana. <AAAA En la etapa 1, pares idénticos de proteínas v-SNARE y t-SNARE de ambas membranas se mantienen separados por NSF (véase Figura 13-18). En las etapas 2 y 3, interaccionan los SNARE complementarios separados, situados sobre membranas idénticas adyacentes, y provocan la fusión de las membranas y la formación de un compartimiento continuo, denominado agregado túbulo-vesicular. A continuación, el compartimiento crece por fusión homotípica con vesiculas del mismo tipo de membrana que contienen proteínas SNARE complementarias. la fusión homotípica no está limitada a la formación de agrupaciones tú bulo-vesiculares; un proceso similar de fusión de endosomas genera endosomas mayores. Las proteínas Rab ayudan a regular la extensión de la fusión homotfpica y, por tanto, el tamaño de los compartimientos en una célula (no mostrado).

Figura 13- 23 Agregados túbulo-vesiculares. (A) Electromicrografla de una sección de agregados tubulo-vesiculares formados a partir de la membrana del ER. Muchas de las estructuras similares a veslculas que se aprecian en las micrografías son secciones transversales de tubos que se extienden por encima y por debajo del plano de la sección y que están interconectados. (B) los agregados túbulo-vesiculares se desplazan a lo largo de los mtcrotúbulos transportando proteínas desde el ERal complejo de Golgi. Cubiertas COPI participan en la formación de vesículas que vuelven al ER desde dichos agregados. Como se indica, las cubiertas se desprenden poco después de que las veslculas se hayan formado. (A, cortesía de William Balch.)

microtubulo

red del cis Golgt

agregados /...., túbulo­

Q vesiculares

- O · ¿ L 0 ..1 (B) transporte de recuperación

0,2¡~m

770 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

agregados tú bulo-vesiculares en el complejo de Golgi

(A)

proteína de secreción

protefna receptor de KDEL

proteína soluble

residente en el ER

cubierta COPII ~

..... ~ ...... VIAANTE­RÓGRADA

- (¡),

'--- ____J

(B) ER

forma continua, cambiando gradualmente su composición a medida que determinadas protefnas seleccionadas son devueltas al ER. Un proceso de recuperación similar a 6ste se pro­duce en el complejo de Golgi, después de que las agrupaciones tt!bulo-vesiculares hayan en­tregado su carga.

La vra de recuperación del ER utiliza señales de clasificación

La vfa de recuperación para devolver las proteínas de nuevo al ER depende de señales de re­CIIperación al ER. Por ejemplo. las protefnas de membrana residentes en el ER contienen señales que las unen directamente a las cubiertas de COPI, empaquetándose por tanto en vesfculas de transporte COPT para la entrega retrógrada al ER. La señal de recuperación mejor caracteri?.ada está formada por dos lisinas, seguidas por otros dos aminoácidos cual­quiera, en el extremo e -terminal de la protefna de membrana del ER. Se denomina la secuencia KKXX, según el código de una letra para los aminoácidos.

Las protefnas solubles residentes en el ER. tales como BiP, también presentan una se­cuencia de recuperación corta en su extremo e -terminal, pero es diferente: está formada por una secuencia Lys-Asp-Giu-Leu o similar. Si esta señal (denominada semencin KDEL) es eli­minada de BiP mediante ingenierfa genética, la proteína es secretada lentamente por lacé­lula. Si la señal es transferida a una protefna que por lo general se secreta, la proteína es devuelta con eficiencia a l ER. donde se acumula.

A diferencia de las señales de recuperación al ER de las protefnas de membrana que pueden interaccionar de forma directa con la cubierta COPI, las protefnas solubles residen­tes del ER han de unirse a unas pro ternas receptoras especializadas como el receptor KDEL: una proteína de paso múltiple que se une a la secuencia KDEL y que empaqueta cualquier protefna que la presente en las vesfculas de transporte re trógrado recubiertas de COPI (Figura 13-24). Para poder cumplir con esta función especffica. el propio receptorKDELde­be ciclar entre el ER y el complejo de Golgi, y su afinidad por la secuencia ICDEL debe ser di­ferente en cada uno de estos dos compartimientos. El receptor debe tener una mayor afinidad por la secuencia KDEL en las agrupaciones túbulo-ves iculares y en el complejo de Golgi para poder capturar con la eficacia necesaria las protefnas solubles rc~itlentes en el ER que se han escapado y que se encuentran dispersas a baja concentración. Sin embargo, debe tener una baja afinidad por KDEL en el EH para poder separarse de la secuencia KDEL a pe­sar de que en el ER hay una elevada concentración de proteínas residentes que contienen la secuencia KDEL

¿Cómo cambia la afinidad del receptor KDEL seg(m el compartimiento en el que se en­cuentre? La respuesta es desconocida, pero podría estar relacionada con Las diferentes con­diciones iónicas y de pii caracterfstico de cada compartimiento que está regulado por Lranportadores de iones en e l compartimiento de la membrana. Tal como se describirá más adelante, estas interacciones proteína-proteína sensibles al pH son la base de muchas de las etapas de clasificación en la célula.

l____..J L__ __j '-----

red del dlctiosoma red del cis Golgi trans Golgl

Figura 13- 24 Modelo sobre la recuperación de las protelnas residentes en el ER. Aquellas protefnas residentes en el ER que escapan son devueltas al ER mediant proceso de transporte vesicular. (A) El re<:eptor KDEL presente en las agrupacione túbulo-veslculares y en el complejo de Gol captura las proteínas residentes en el ER solubles y las transporta en vesfculas re<:ubiertas de COPI de vuelta al E R. Despú~ de unir sus llgandos en este compartlmlen de pH bajo, el re<:eptor KDEL puede cambia~ su conformación facilitando su reclutam en las vesículas recubiertas de COPI que están en formación. (B) La re<:uperación de protefnas del ER se Inicia en agregados túbulo-veslculares y continúa en cada un¡¡ de las reglones del complejo de Golgi. En ER, con un pH neutro, las proteínas del ER se separan del receptor, que es devuelto al Golgl para su reutilización.

NSPORTE DESDE EL ERA TRAVÉS DEL COMPLEJO DE GOLGI

1 .t mayoría de las proteÚlas de membrana que actúan en la interfase entre el ER y el J•h'¡o de Golgi, incluyendo las proteínas v- y t-SNARE y algunos de los receptores 11~porte, entran en la vía de recuperación de vuelta al ER. Mientras que el reciclaje de

'l.t'> de estas proteínas depende de la presencia de señales, para algunas otras no parece r m.e señal. Mientras las señales de recuperación aumentan la eficacia del proceso de

¡¡•·ración, algunas proteínas - incluyendo algunas enzimas del Golgi- entran al azar en 1 ,1;,~ que se dirigen al ER y son devueltas al ER pero con menor frecuencia. Muchas en­dl'l Golgi están viajando constantemente emre el En y el Golgi, pero su velocidad de "'al En es lo bastante lenta como para que la mayoría de la pro tema se encuentre en •piejo de Golgi.

chas proteínas son retenidas selectivamente 1 compartimiento en el que actúan

,¡l. recuperación KDEL sólo explica en parte cómo las proteínas residentes del En per­'•·n en el ER. Como era de esperar, las células que expresan prote[nas residentes del ER r .tdas genéticamente, de la~ que se ha eliminado la señal KDEL, secretan estas pro­Pero la tasa de secreción es mucho menor que la de una protema de secreción nor­

l'<lll·ce que existe un mecanismo independiente de la señal KDEL que ancla las proteí­identes en el ER y que sólo aquellas proteínas que escapan de la retención son

,uJas y devueltas vía el receptor KDEL Uno de los mecanismos sugeridos para explicar u Ión de las proteínas residentes del ER consiste en que estas proteínas se unan unas , lnrmando complejos demasiado grandes para emrar de forma eficiente en las vesí­

dt· transporte. Dado que las proteínas residentes del ER ~>e encuentran en el ERa con­;tnnes elevadas (se estima que en el rango milimolar), interacciones de una afinidad rnente baja podrían ser suficientes para mantener unidas a la mayoría de las protef-

' ltchos complejos.

.tgregación de proteínas que tienen su función en el mismo compartimiento- deno­rt'CO/Iocimiento kin- es un mecanismo general que utilizan los companimientos para

[

1 ¡.un

CARA cis veslcula del Golgi

CARA trans

envoltura nuclear

ER rugoso

agregados túbulo­vesiculares

red del crs Golgi

Figura 13-25 El complejo de Golgi. (A) Reconstruccíón tridimensional del complejo de Golgl a partir de electromicrograflas de una célula secretora animaL La cara cis del dictiosoma es la más próxima al ER (B) Electromiaografla de una sección ultrafina en la que destaca la región de transición entre el ER y el complejo de Golgi en una célula animal

771

(C) Electromicrografla de un complejo de Golgi de una célula vegetal (del alga verde Chlamydomonas). visto en sección transversaL Por lo general, en las células vegetales el complejo de Golgi es más aparente y está más separado de los otros sistemas membranosos intracelulares. (A. redibujado de A. Rambourg e Y. Cler­mont, Eur.J. Cei/Biol. 51:189-200, 1990; Con permiso de Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft; B, cortes la de Brij J. Gupta; C. cortesla de George Palade.)

772 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

(A) (B)

organizar y mantener a sus proteínas residentes. Por ejemplo, las enzimas del Golgi que ac­túan juntas también se unen unas a otras limitando su entrada en las vesículas de transporte que dejan el complejo de Golgi.

El complejo de Golgi está formado por una serie de compartimientos ordenados

Debido a su estructura grande y regular, el complejo de Golgi fue uno de los orgánulos des­critos por los primeros microscopistas. Está formado por una serie de companimientos de­limitados por membrana denominados cisternas, de forma aplanada, y que de alguna manera se parecen a un montón de tortitas. Cada apilamiento del Golgi, un dictiosoma, es­tá formado por entre cuatro y seis cisternas (Figura 13-25), aunque en algunos protozoos flagelados puede haber hasta sesenta. En las células animales muchos dicúosomas están uni­dos entre sí mediante conexiones tubulares entre las cisternas correspondientes, fonnando un solo complejo que habitualmente se localiza en las proximidades del núcleo, cerca del centrosoma (Figura 13-26A). Esta localización depende de los microtúbulos. Si los microtú­bulos se despolimerizan experimentalmente, el complejo de Golgi se reorganiza en dictio­somas individuales que se distribuyen por todo el citoplasma en la proximidad de los lugares de salida del ER. Algunas células, incluyendo muchos tipos celulares de plantas, tienen ha­bitualmente cientos de dictiosomas del Golgi dispersos en el citoplasma (Figura 13-26B).

Durante su paso a través del complejo de Golgi, las moléculas transportadas sufren una serie ordenada de modificaciones covalentes. Cada uno de los dicúosomas del Golgi tienen dos caras distintas: una cara cis (o cara de entrada) y una cara tmns (o cara de salida). Ambas caras cis y trans están estrechamente asociadas a unos compartimientos especiales, formados por una red de estructuras tubulares y cisternas: la red cis GQigJ (CGN: cis Golgy network) y la red tratas GolgJ (TGN: trans Go/gy network), respectivamente. El CGN es una colección de agrupaciones túbu.lo-vesiculares fusionadas que proceden del ER. Las proteínas y los lfpidos entran por la red cis Golgi y saJen por la red trans Golgi en vesfcuJas de transporte con destino a la superficie celular o a otro companimiento. Ambas redes son importantes en la clasifica­ción de las proteínas: las proteínas que entran en el CGN pueden o bien seguir a través del Golgi o bien volver al ER. De manera similar, las proteínas que saJen del TGN se mueven hacia delante y son clasificadas hacia su siguiente destino: lisosomas, vesículas de secreción o la su­perficie celular. También pueden ser devueltas a un compartimiento anterior.

Como se ha descrito en el CapituJo 12, en el ER se añade un mismo tipo deN-oligosacá­rido en bloque a muchas proteínas diferentes, que es modificado mientras la proteína aún permanece en el ER. Los intermediarios de oHgosacáridos generados en las reacciones de síntesis contribuyen aJ plegado de las proteínas y a la salida hacia el cítosol de las proteínas maJ plegadas donde serán degradadas. As( pues, tiene un papel esencial en el control de ca­Hdad de las proteínas que saJen del ER. Una vez cumplida dicha función, la célula queda U­bre para modificar y rediseñar los oligosacáridos para nuevas funciones. Esto ocurre en el complejo de Golgi donde se producen las estructuras heterogéneas que se encuentran en las proteínas maduras. Cuando llegan al CGN, las proteínas pasan a través de la red del cis Golgi antes de entrar en el primer compartimiento de procesamiento del Golgi (la cisterna cis). Después se desplazan al siguiente compartimiento (la cisterna media) y finalmente a la cisterna trans, donde se completa la glucosilación. El turnen de la cisterna trans se cree que forma un continuo con el TGN, el lugar donde las proteínas son clasificadas en diferentes paquetes de transporte y dirigidas hacia su destino final.

Figura 13-26 Localización del complejo de Golgi en células de animales y plantas. (A) El complejo de Golgi de un fibroblasto en cultivo teñido con un anticuerpo fluorescen que reconoce una proteína residente en el Golgi (rojo). El complejo de Golgi aparece polarizado y se sitúa en el sentido en el que se desplazaba la célula antes de su fijación. (8) El complejo de Golgi de una célula vegetal que lleva a cabo la expresión de una proteína de fusión que consiste en una protelna residente en el Golgl unida a la proteína fluorescente verde. Los puntos naranja brillantes (falso color) son dlctiosomas del Golgi. (A, cortesía de John Henley y Mark McNiven; 8, cortesía de Chrls Hawes.)

DESDE EL ERA TRAV~S DEL COMPLEJO DE GOLGI

Agura 13-27 La compartimentación molecular del complejo de Golgl. La serie de electromlcrograflas muestra el complejo de Golgi (A) sin contrastar; (B) contrastado con osmio, que es reducido sobre todo por las cisternas del compartimiento cis, y (C y O) contrastado revelando la localización de enzimas especificas. La nucleósido difosfatasa se halla en las cisternas del trans Golgi (C), mientras que la enzima fosfatasa ácida se encuentra en la red del trans Golgi (O). Es de destacar que habitualmente se tiile más de una cisterna. Por tanto, parece que las enz¡mas se encuentran especialmente enriquecidas más que localizadas de forma precisa en una cisterna determinada. (Por cortesra de Daniel S. Frlend.)

Estas rutas de procesamiento de oligosacáridos tienen lugar siguiendo una secuencia ada en el dictiosoma, en el que cada cisterna contiene una gran cantidad de enzimas

procesamiemo. Las protefnas se modifican a través de sucesivas etapas a medida que dr cisterna en cisterna a través del dictiosoma, de forma que las cisternas constituyen unidad de procesamiemo múltiple. Esta compartimentación podría parecer innece­

ya que cada enzima sólo actúa sobre su glucoprotefna después de que haya sido nientemente procesada por la enzima anterior. Sin embargo, parece claro que el pro­

-miento tiene lugar tanto en una secuencia espacial como en una secuencia bioqur­asf, las enzimas que ca tal izan las primeras etapas se localizan en las cisternas más cis

dlctiosoma, mientras que las que catalizan las últimas etapas se encuentran en las ~s más trans.

Los investigadores han descubierto las diferencias funcionales entre las subdivísiones malia y trans del complejo de Golgi mediante la localización, tanto por fraccionamien­

:o del orgánulo como por microscopía electrónica marcando con anticuerpos las en­implicadas en el procesamiento de los N-oligosacáridos en distintas regiones del

_,-¡ulo. Por ejemplo, se encontró que la separación de los residuos de manosa y la adición ilglucosamina tenia lugar en el compartimiento medio, mientras que la adición de y de ácido siáJico ocurría en el compartimiento crans y en la red del crariS Golgi

13-27). La Figura 13-28 resume la compartimentación funcional del complejo de

FJ mmplejo de Golgi es en especial abundante en las células que están especializadas ll'Creción de glucoprotefnas, como las células mucosecretoras del epitelio intestinal,

tecretan grandes cantidades de moco al in te!> tino (Figura 13-29). En estas células se for­ftl el extremo trans del complejo de Golgi vesículas inusualmente grandes que se diri­

hltia el dominio de la membrana plasmática donde se produce la secreción.

complejo de Golgi

ER

J red del CIS Golgi

J ci_sterna CIS

~ k : ~·· . L ~ ~] cisterna media

dictiosoma (apilamiento de cisternas)

llsosoma membrana vesícula de plasm<itica secreción

J cisterna trans

]

red del trans Golgi

(8)

(0

111m

Figura 13-28 El procesamiento de ollgosacáridos en el complejo de Golgl.

773

La localización de cada una de las etapas de procesamiento que se muestran en la figura ha sido determinada por medio de la combinación de técnicas, entre las que se encuentran el subfraccionamlento de las membranas del complejo de Golgi y la microscopia electrónica tras la tinción con anticuerpos especlficos contra algunas de las enzimas específicas de procesamiento. Las enzimas de procesamiento no están restringidas a una única cisterna sino que su distribución es gradual a través del dictiosoma, de forma que las enzimas que actúan al principio se encuentran presentes fundamentalmente en las cisternas del cis Golgi y las enzimas que actúan al final se localizan sobre todo en las cisternas del trans Golgi.

774 Capítulo 13:Tráfico vesicular intracelular

Las cadenas de oligosacáridos son procesadas en el complejo de Golgi

Mientras que el ER está lleno de protemas solubles residentes y enzimas, las protefuas re­sidentes en el complejo de Golgi son todas transmembrana. Parece ser que las reacciones enzimáticas que se realiz..an en el complejo de Golgi tienen lugar siempre sobre su membra­na. Todas las glucosidasas y glucosiltransferasas son proteínas transmcmbrana de paso úni­co, muchas de las cuales están organizadas en forma de complejos multienzimáticos, Así

pues, los dos orgánulos biosintéticos en la ruta biosintética-secretora, el ER y el complejo de Golgi . están organizados de manera claramente diferente.

Sobre las glucoprotefnas de los mamíferos se encuentran unidos dos grandes tipos de N-oligosacáridos. los oligosacáridos complejos y los oligosacáridos ricos en manosa (Figura 13-30). En ocasiones es posible encontrar ambos tipos de oligosacáridos unidos a la misma cadena polipeptídica (en diferentes lugares).

Los o ligosacáridos complejos se forman cuando los N-oligosacáridos originales aña­didos en el ER son modificados y se les añaden nuevos azúcares. Por el contrario. los oligo­sacáridos ricos en manosa son procesados pero no se les añaden nuevos azúcares en el complejo de Golgi. Contienen sólo dos N-acetilglucosaminas y muchos residuos de manosa. frecuentemente los mismos que se encuentran en el oligosacárido unido a lfpido que se en­cuentra como precursor en el EH. Los oligosacáridos complejos pueden contener más de las dos N-acetilglucosaminas originales, asf como un número variable de galactosa y ácido siá­llco y. en algunos casos. fucosa.

El ácido siálico es de especial importancia pues es el único azúcar en las glucoproteínas que presenta una carga negativa. Si un oligosacárido debe quedarse en la forma de rico en

(A)

1

1

NH 1 1

Asn~....._. 1

X 1 -

Ser o Thr 1 1

co

CLAVE

REGIÓN CENTRAL

_ = N-acetllglucosamina (GicNAc)

• = manosa (Man)

(, =galactosa (Gal)

fiJ= N·acetilneuramlniCO (acído siálico o NANA)

(B) OLIGOSACÁRIDO COMPLEJO

~,_.

(C) OLIGOSACÁRIDO RICO EN MANOSA

Figura 13-30 las dos clases principales de oligosacáridos unidos a asparagina (N-oligosacáridos) encontrados en glucoproteínas maduras de mamlfero. (A) Tanto los ollgosacáridos complejos como los ricos en manosa comparten una región central que procede del oligosacárldo unido a asparag1na original que fue añadido en el ER (véase Figura 12- 50) y que contiene dos N-acetllglucosaminas (GicNAc) y tres manosas (Man). (B) Cualquier oligosactlrido complejo consta de una región central, junto con una región terminal que contiene un numero variable de una unidad especial de trlsacáridos (N·acetilglucosamina galactosa-ácido siá/ico) unidas al núcleo de manosas. Con frecuencia la región terminal está truncada y sólo cont1ene GlcNAc y galactosa (Ga~ o sólo GlcNAc. Además, se puede añadir un residuo de fucosa al núcleo de GlcNAc unido a la asparaglna (Asn). Asl pues, aunque las etapas de procesamiento y posterior adición de azúcares están ordenadas estrictamente, los oligosacáridos complejos pueden ser heterogéneos. Además, aunque el oligosacárido complejo mostrado t1ene tres ramas, también son comunes formas de dos y de cuatro ramas, dependiendo de la glucoprotefna y de la célula en que se producen. {() Los ollgosacáridos ricos en manosa no son recortados hasta alcanzar la región central y contienen res1duos adioonales de manosa. También se encuentran ollgosacáridos hlbridos (no mostrados) en los que una rama es Man y otra GlcNAc y Gal.

Los tres ammoácldos que se presentan en esta figura en color constituyen la secuencia reconocida por la enzima oligosacaril transferasa que añade el oligosacárido inicial a la protelna. Ser= serina; Thr = treonina; X= cualquier amlnoacido excepto prolína.

mucus

complejo de Golg1

nucleo

10 ~1m

Figura 13-29 Célula caliciforme del intestino delgado. Este tipo de célula estA especializada en la secreción de mucus, una mezcla de varias glucoprotemas y de proteoglucanos sintetizados en el ER y en comple¡o de Golgi. Como todas las célula epiteliales, las células caliciformes están altamente polarizadas, con el dominio a de su membrana plasmatica dirigido hacl.l lumen del Intestino y el dominio basolat dirigido hacia la lámina basal. El complejo de Golgi también está muy polarizado. lo cual facilita la descarga del mucus medi exocitosis en el dominio apical de la membrana plasmática. (De R. V. Krstic. llustrated Encyclopedia of Human Hist New York: Springer-Verlag, 1984. Con permiso de Springer-Verlag.)

lia&NC\PORTF DESDE EL ERA TRAVÉS DEL COMPLEJO DE GOLGI

~o tiene que ser procesado hacia un oligosacárido complejo depende fundamental-ilr dt• su posición en la proteína. Si el oligosacárido es accesible a las enzimas de pro­lllit'nto en el complejo de Golgi. es probable que sea convertido en una forma compleja; Inaccesible a estas enzimas, porque sus azúcares están estrechamente unidos a la tfkie de la proteína, es probable que permanezca en su forma rica en manosa. El pro­IUt•nto que genera cadenas de oligosacáridos complejos sigue la secuencia ordenada

•tn·iones que se muestran en la Figura 13-31. Más allá de estas reglas comunes en el procesamiento de los oligosacáridos que son

~rtidas por todas las células, los productos de las modificaciones de los carbohidratos Mi n•;llizan en el complejo de Golgi son muy complejos y han provocado la aparición de IIUt"\'a especialidad denominada glucobiología. Por ejemplo, el genoma humano codifica

dt• glucosiltransferasas diferentes del complejo de Golgi, que se expresan de manera t•n uno u otro tipo celular, lo que da lugar a una gran variedad de fonnas glucosila-

&k! una proteína o lípido concreto dependiendo del tipo celular y de su estado de di fe­ion, y que estará en función de la colección de enzimas expresadas por la célula. La

~tiidad de las modificaciones no está limitada a los N-oligosacáridos sino que también en los 0 -oligosacáridos, como veremos más adelante.

proteoglucanos se ensamblan en el complejo de Golgi

fl .,.m las cadenas de N-oligosacarido de las proteínas las que son alteradas a medida proteínas pasan a través de las cisternas del Golgi, en s11 camino desde el ER a sus finales; muchas proteínas también son modificadas de otras fonnas. Algunas tienen

glucostdasa 1

manosidasa 1 del Golgl •••

; nosídasa del ER _j_ ~ ~

1 1 1 J 1 '

i!: 2

LUMEN DEL ER

._ •

olígosacarido rico en manosa

3

LUMEN DEL GOLGI

5 . ._

el próximo se añade aqul

775

L_ _ _ __ _.

oligosacarido complejo

etilglucosamina (GicNAc) e = manosa (Man) Q =glucosa (Gic) • galactosa (Gal) ~"' acido N-acetilneuraminico (ácido sialico o NANA)

t J-31 Procesamiento de los oligosacáridos en el ER y en el complejo del Golgl. El proceso es secuencial, esto es. cada uno de los pasos depende ~10nes anteriores de cada serie. Etapa 1: el procesamiento com1enza en el ER con la eliminación de los residuos de glucosa del oligosacárido

tntcialmente a la protelna. A contmuación, una manosidasa presente en la membrana del ER elimtna un determinado residuo de manosa etapas sigutentes tienen lugar en los dictlosomas, donde en primer lugar la manosldasa 1 elimina tres residuos más de manosa. Etapa 3: la

IIIIQ!ucosamina transferasa 1 añade un residuo de N-acetilglucosamina. Etapa 4: la manosidasa 11 elimina a continuación dos residuos más de manosa. lit*ient' el núcleo flnal de tres residuos de manosa que se presenta en un oligosacárido complejo. En este estadio, el enlace que existe entre los

de N-acetilglucosamfna del núcleo del oligosacárido se vuelve resistente al ataque de una endoglucosfdasa altamente especifica (endo-H) Dado las estructuras posteriores son resistentes a endo-H, se utiliza el tratamiento con esta enzima para distinguir los complejos de oligosacáridos ricos

Etapa 5 por último, como se muestra en la Rgura 13-30, se añaden residuos de N-acetllglucosamina, galactosa y ácido siálico. finales de la síntesis de los oligosacáridos complejos ocurren en las cisternas del complejo de Golgi. Tres tipos de glucosll transferasas actúan de

Utilizando como sustrato azúcares que han sido activados por unión al nucleótido que se indica. Las membranas de fas cisternas del Golgi proteínas transportadoras espectflcas que permiten la entrada de cada uno de Jos azúcares-nucleótido intercambiados por los nucleósidos fosfato an después de que el azúcar se una a la proteína en la cara Juminal.

quf' como orgánulo bioslntético que es, el complejo de Golgi se diferencia esencialmente del ER: todos los azúcares son ensamblados en ellumen t~ucleótidos-azúcar Por el contrario, en el ER el N-oligosacJrido precursor es ensamblado parte en el Cttosol y parte en ellumen; todas las reacciones utilizan como sustrato azúcares unidos a dolicol (véase Rgura 12-52).

776 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

N·GLUCOSILACIÓN 0-GLUCOSILACIÓN

adena pro~i5a_- -e-------'------ 1

cadena proteica ------------c------CHz

¿=O asparaglna 1 NH

~. N-acetllglucosamina

O H H 1 adena H resto de a e . osacé\rido ~ H NHCOCHl lateral del ohg

, ,

resto de la cadena lateral del ollgosacárido

1

HlC-CH 1 ()

treonina

N-acetllgalactosamlna

H H

NHCOCH3

azúcares afladjdos a grupos OH de las cadenas laterales de detenninadas serinas o treoninas. Como en el caso de la N-glucosilación, esta 0 -glucosllaclón (Figura 13-32) está catalizada por series de enzimas glucosil transferasas que utilizan compuestos azúcar-nucleótido en el lumen del Golgi, afladjendo residuos de azúcar, uno a uno, a una proteína. Habitualmente primero se aflade la N-acetilgalactosamina y, a continuación, un número variable de resi­duos de azúcar, desde unos cuantos hasta más de 10.

De todas las protefnas glucosiladas, las que lo están más son las mucinas, las glucopro­teínas de las !>CCreciones mucosas {véase Figura 13-29). y algunas protelnas núcleo de pro­teoglucanos, las cuales son modificadas produciendo proteoglucanos. Como se explica en el Capftulo 19, este proceso implica la polimerización de una o más cadenas de glucosamino­glucano (largos pol!meros no ramificados compuestos por unidades repetidas de rusacáridos; véase Figura 19-58) a través de una unión a xilosa en las serinas de una proteína central. Muchos proteoglucanos son secretados y pasan a ser componentes de la matriz extrdcelular, mientras que otros permanecen anclados a la membrana plasmática. Otros constituyen el componente principal de sustancias como el mucus que es secretado formando una cu­bierta protectora sobre muchos epitelios.

Los azúcares incorporados a los glucosammoglucanos son altamente sulfatados justo después de que los polfmeros se hayan formado en el complejo de Golgi, Jo cual contribuye a la elevada carga negativa que presentan los proteoglucanos. Algunos residuos de tirosina también son sulfa tados poco después de salir del complejo de Golgi. En ambos casos, la sul­fatación depende de un dador de sulfato 3'-fosfoadenoslna-5'-fosfosulfato (PAPS: 3'-phos­p/wadenosine-5'-phosphosulfate) (Figura 13-33), que es transportado desde el citosol has­ta ellumen del compartimiento transdel Golgi.

¿Cuál es el propósito de la glucosilación?

Existe una diferencia importante entre la construcción de un oligosacárido y la símesis de otras macro moléculas como el DNA, el RNA o las proteínas. Mientras que los ácidos nuclei­cos y las proteínas son copiadas de un molde a través de una serie repetida de pasos idénticos y utilizando la misma enzima o grupo de enzimas, los carbohidratos complejos requieren una enzima düerente en cada paso, de forma que cada producto de una reacción es recono­cido como el sustrato exclusivo por la enzima siguiente de la serie. La amplia abundancia de glucoprote(nas y las complejas vías que han terudo que evolucionar para sinreúzarlas pare­cen sugerir que los oligosacáridos de las glucoprotefnas y los glucoesfingotrpidos cumplen funciones muy imponantes.

Por ejemplo, la N-glucosilación es predominante en todos los eucariotas, incluyendo las levaduras. También se encuentran N-oHgosacáridos de forma similar en la pared celular de las arqueas, lo que sugiere un origen evolutivo remoto de toda la maquinaria sintética re­querida para su producción. La N-glucosilación contribuye al plegamiento de las protefnas de dos maneras. En primer lugar facilita la solubilidad de Jos intermediarios de plegamiento y evita de ese modo su agregación. En segundo lugar, las modificaciones secuenciales de los N-oligosacáridos establece un "glucocórugo" que determina la progresión del plegamiento

Flgura 13-32 N- y 0-glucosllación. En cada caso sólo se muestra el azúcar que est~ directamente unido a la cadena proteica.

N;;-N HAN~N)__H o o

WH2-~-o-6- o H

HO O 1

-0-P=O 1 o-

3'-fosfoadenosfn-5'-fosfosulf; to (PAPS)

Flgura 1 3- 33 Estructura de PAPS.

SPORTE DESDE EL ERA TRAV~S DEL COMPLEJO DE GOLGI

h ~") f GlcNAc .._,......_....,

_:(~":;"'

l, GlcNAc 1

/ ":'. 1 1

l

1110tefnas y participa en la unión de la proteína a las chaperonas {descritas en el tlo 12) y lectinas, por ejemplo, en el direccionamiento del transporte ER hacia el Golgi.

,. indicará más adelante, las lectinas también participan en la clasificación de pro­nta red deltransGolgi.

ludo a que las cadenas de azúcares tienen una flexibilidad limitada, incluso un pe­\ oligosacárido que se proyecta desde la superficie de la glucoproteína puede limitar •mación de otras macromoléculas a la superficie proteica {Figura 13-34). De esta por ejemplo, la presencia de oligosacáridos tiende a formar glucoprotefnas más re­a la digestión por la acción de enzimas prOLeolfticas. Es posible que los oligosacári-

l.t superficie celular formaran una cubierta protectora en las células ancestrales . . tdo con la rígida pared bacteriana, la cubierta de mucus tiene la ventaja de que per­

la rélula cambiar de forma y moverse. 'adenas de azúcar han sido modificadas para realizar también otras funciones. Por la cubierta mucosa en el epitelio pulmonar y en las células intestinales protege contra patógenos. El reconocimiento de las cadenas de azúcar por las lectinas en el espacio

·luJar es importante en muchos procesos de desarrollo y en el reconocimiento célula­JI• 1r ejemplo, las selectinas son lectinas que participan en la adhesión célula-célula du­

rlllgración de los linfocitos, como se describe en el Capítulo 19. La presencia de uados puede modificar las propiedades antigénicas de una proteína haciendo de la

" tón un factor importame a considerar en la producción de proteínas con finalidad •lógica.

,:lucosilación también tiene una función reguladora importante. Por ejemplo, la ctr>n a través del receptor de superficie celular Notch es importante para la deter-11 del comportamiento de las células en el desarrollo. Notch es una proteína trans­na que es 0-glucosilada por adición de una simple fucosa a algunos residuos de

lll'flllina o hidroxilisina. Algunos tipos celulares expresan además otra glucosiJtrans­~'''-'· en el complejo de Golgi, añade una N-acetilglucosamina a cada una de esas

1 .. la adición cambia la especificidad del receptor Notch para las proteínas de señal ¡wrficie celular que activan al receptor.

n~porte a través del complejo de Golgi se lleva a cabo :ante transporte vesicular o maduración de cisternas

olt·.,conocemos de qué forma el complejo de Golgi adquiere y mantiene su estruc­)rit.ada y cómo las moléculas se desplazan de una cisterna a otra. Las evidencias fun­·lportadas por los ensayos de transporte in vitro y la observación de numerosas de transporte en las proximidades de las cisternas del Golgi llevaron a la conclusión ,,., vesículas transportan proteínas entre las cisternas, formándose en una cisterna

o.1ndose con la siguiente. De acuerdo con este mode.lo de transporte vesJcular, el '' de Golgi es una estructura relativamente estática, con sus enzimas colocadas en 1. mientras que las moléculas en tránsito se desplazan a través de las cisternas de for-

777

Figura 13-34 Estructura tridimensional de un pequeño N-oligosacárido. La estructura fue determinada por análisis cristalográfico de rayos X de una glucoprotefna. Este oligosacárido tan sólo contiene 6 residuos de azúcar, mientras que el oligosacárido transferido inicialmente a las proternas en el ER tiene 14 residuos de azúcar (véase Figuras 12- 50 y 12-51 ). (A) Modelo del esqueleto del compuesto, en el que se muestran todos los átomos excepto los de hidrógeno. (B) Modelo espacial en el que la asparagina se identifica por átomos oscuros. (B, cortesfa de Richard Feldmann.)

778 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

o o ER

agregado túbulo­vesicular

1 ,

cisternas r- ---, cis trans

CGN 1 media 1 TGN r-•r'-1,----., r--,1 ,

-o-....tJ .. o, 1 \_,~_,o o ­' ()()-.. )/' .. -o-..¿5,.

, .. o_, c¡j?• .. ~ ~ ~ ,

_ o 1 t,.,yu~+ o -_, ..._. , - o -u0t)\):' 1 o~ o~ / f ""t...,.,, 1'0 - o o o o - oo c{b o

(A) MODELO DE TRANSPORTE VESICULAR

protefnas de la matriz

(B) MODELO DE MADURACIÓN DE CISTERNAS

ma secuencial. transportadas por las vesículas de transporte (Figura l3-35A). Un Oujo re­trógrado de vesículas recupera las moléculas que escapan del ER y del Golgi y la~> devuelve a los compartimientos anteriores. Es posible conseguir un flujo direccional permitiendo a las moléculas carga que han de avanzar. el acceso a vesículas de movimiento anterógrado. Aunque probablemente tanto las vesículas de transporte anterógrado como retrógrado tienen cubiertas de tipo COPl,las cubiertas pueden contener diferentes proteínas adaptadoras que confieran la especificidad de empaquetamiento de las moléculas carga. Una posibilidad alternativa es que las vesículas de transporte que se desplazan entre las cisternas del Golgi podrían no ser dirigidas, transportando materiales al azar adelante y atrás; el direcciona­miento se mamendrfa por el aporte continuo de materiales en la cisrerna cis y la extracción del mismo en la cisterna 1rans.

Una hipóresis diferente, denominada modelo de maduración de cisternas, considera al complejo de Golgi como una estructura dinámica en la que las propias cisternas se despla­?..an. Las agrupaciones túbulo-vesiculares que proceden del ER se fusionan unas con otras formando la red del cis Golgi. De acuerdo con este modelo, esta red madura de forma progre­siva hasta formar una eL~ terna cis, después una cisterna media, y así cada vez. Así pues, en la cara cis de un dictiosoma cominuamente se forman nuevas cisternas. las cuales migrarán a través del d.ictiosoma a medida que vayan madurando (Figura 13-35B). Este modelo viene apoyado por observacione~> micro!>cópica~ que demuestran que grandes estructuras como las fibriUas de colágeno en los fibroblastos y las escamas de ciertas algas -que 1.on demasiado grandes para caber en las vesículas de transporte clásicas-- se desplazan progresivamente a través del dictiosoma.

En el modelo de maduración de cisternas, el flujo retrógrado explica la distribución ca­racterística de las enzimas del Golgi. Todo se desplaza continuamente en dirección ameró­grada con la cisterna en maduración, incluyendo las enzimas de procesamiento que son propias del inicio del complejo de Golgi. Pero las \'esfculas recubiertas de COPI que se forman recolectan continuamente las enzimas apropiadas, casi todas ellas proteínas de membrana, y las transportan hacia atrás, hacia la cisterna anterior. en la que actúan. Una cisterna cis formada de nuevo recibirá su complemento normal de enzimas residentes sobre todo de la cisterna que se encuentra justo por encima de ella y después las pasará a la nueva cisterna cis que se formará.

Como se de!>cribirá más adelante, cuando una cisterna finalmente se desplaza hacia adelante formando parte de la red del trans Golgi, a partir de ella se generan varios tipos de vesfculas recubiertas. hasta que la red desaparece y es reemplazada por la cisterna en ma­duración que se encuentra justo por debajo. Al mismo tiempo, otras vesículas de transporte están constantemente recuperando membrana de los compartimientos post-Golgi y devol­viéndola a la red del rrans Golgi.

Los modelos de transporte vesicular y de maduración de cisternas no son mutuamen­te excluyentes. Por el contrario, las evidencias sugieren que el transporte puede ocurrir por una combinación de los dos mecanismos, en las que algunas moléculas rransportadas se desplacen con rapidez en vesículas de rransporte, mienrras que otras sean más lentas a me­dida que el complejo de Golgi se va renovando a través de la maduración de las cisternas.

Figura 13-35 Dos posibles modelos que explican la organlzac.lón del complejo de Golgi y el transporte de protelnas desde una cisterna a la siguiente. Es posible qul! r transporte a través del Golgi en sentido had.l adelante (flechas rojas) implique elementos de los mecanismos que se muestran. (A) En el modelo de transporte vesicular, la\ cisternas del Golgi son orgéinulos estáticos que contienen un juego característico de enzimas residentes. El paso de moléculas 11 través del Golgl se realiza mediante veskul.t de transporte que se desplazan hacia adelante, formándose en una cisterna y fusionándose con la siguiente en sentido d. ds hacia trans. (B) De acuerdo con el mod alternativo de maduración de las cisterna1, cada una de las cisternas del Golg1 madura medida que migra a través de un dictioson En cada etapa, las protefnas residentes en el Golgl, que han sido transportadas hada adelante en una cisterna, son devueltas atrás a la cisterna anterior mediante vesi recubiertas de COPI. Cuando una cisterna formada de nuevo se desplaza, por ejem hacia la posición media, las enzimas del cís Golgi ·sobrantes· deberc\n ser extrafd' y transportadas hacia atrás a una nueva cisterna cís. De la misma forma, las enzirm\ medias serán recibidas mediante tran,;pot retrógrado desde la cisterna que se encuentra justo por delante. De esta forma, una cisterna cis podría madurar n cisterna media a medida que se desplaz• hacia el exterior.

lbNc;;PORTF DESDE LA RED DEL TRANS GOLGI A LOS LISOSOMAS

Las proteínas de la matriz del complejo de Golgi organizan dlctiosoma

arquitectura especial del complejo de Golgi depende tanto del citoesqueleto de micro tú­. romo ya se ha descrito, como de proteínas citoplasmáticas de la matriz del Golgi, que

·man un esqueleto entre cisternas adyacentes y confieren al dictiosoma su integridad es­tura!. Algunas de las protefnas de la malriz forman cordones largos, filamentosos, que

:e que ayudan a mantener las vesículas de transporte en la proximidad del orgánuJo. do una célula se prepara para d.ividirse, las proteínas quinasa mitóticas fosforilan las rnas de la matriz del Golgi, provocando la fragmentación y dispersión del complejo de pur el citosol. Entonces los fragmentos del Golgi son distribuidos de forma uniforme las dos células hijas donde las protefnas de matriz son desfosforiladas, permitiendo el

1\Umblaje del complejo de Golgi. Uuy que destacar que las protefnas de la matriz del Golgi pueden ensamblarse en dic­

_,mas localizados en las cercan fas del centrosoma a pesar de que experimentalmente se que las protefnas del Golgi salgan del E R. Ello sugiere que las protefnas de la mauiz

'-'principales responsables de la estructura y la localización del complejo de Golgi.

protc'illas correctamente plegadas y ensambladas en el é"R son emfXUfuNadas en tl(•sfculas de ....... ,e recubiertas de COP/1 que se forman e11 la membrana del ER. Poco desp11é, las wsfculas

.\ ti cubierta y se fusiotllltl u11as con otras formando agrupaciones tlibulo-l'e.siculares. lru agrupacio11es se desplazan siguie11do los microllíbulos hacia el complejo de Golgi,

SI' fusiotlllll e11tre sf formando la red del cis Golgi. Cualquier proteítm resideme en el PR que llf·l ERes devuelta allf desde las agrupaciones l!íbulo-wsimlares y el complejo de Golgi me­trrlll..~porte retrógnulo en t~sfmlas recubiertas de COPI. mm piejo de Golgi. a diferencia del FR. contiene muchos azúcares, que sonutiliuulos poren­

glucosil trarufemsas para realizar r('{lccione.s de glucosilación de lfpidos y de protefnas a me-11M' tKISfln a rraves del complejo de Golgi. Con fm:uencia, las manosas de los N-oligo.~dridos uiltulen a las protelnas en el ER son elimituulas dt• manosru y posteriormente se añaden nue-

..,.Wllll'S. Ademds. t•n el complejo de Golgi es donde tiene lugar la O -glucosilaciótl y donde las ca­~ dtl Rlucosaminoglucanos son aiuuliLias a las protefnas centrales fonnando los proteoglumnos. ~tación de los azlicares de los proteoglucanos y de determinadas tiros/nas también se produ-

~ mmpartimwnro tarrlfo del Golgi. ctlmp/ejo de Golgi modifica las mtmerOStiS proteftuiS y lfpidos que recibe desde el ER, y las

IUlLiLI la membratul pltiSmdtica, /isosomas y t't'slcuiliS de secrrción. Fl compleJO de Golgi es •r~~aura polarizadt1 que COII..~íste 1'11 11110 o mds api/amiemos de cisternas en forma de disco,

16-tfwt,mas. Catla u11odeellos se organiza en al me11os tres compartimientosfuncionalme/1/edi­ltiS cisterntiS cis. media y trans. l.as cistemas cts y trans estd11 conectadtts a estructuras de

~ión e.specitllizadas, denomillatlas la red del cis Golgi y la red deltrans Golgi, respectiv{/­IILI proteilllU y lipidos se desplazan a través de los dictiosomas en sentido decis a tran~. Este

~1111iemo puede ocurrir medittme tratiSporte t~t•sicular. por nlllLiumción progresitl(J de la cis­'' medida que migra d1• forma continua a trtwés del dictiosoma. o, mlis prolKiblemente,

combinación de ambos mecanismos. Parece que t!l mante11imiento de las enzimas concen­m ltl cisterna donde se necesitan se consig11e metliame llfl trallSportt• retrógrtulo co/1/itwo .. ci.~ter1m siguiente. /.as proteínas nuevas, acabadtiS, alcmiUin la red deltram Golgi, donde

._,lltMJIIetadas 1'11 tll!sfcu/as de tratiS¡JOrte y enviadas ti SLIS destinos especfjicos en la célula.

S PORTE DESDE LA RED DEL TRANS GOLGI S LISOSOMAS

dt•l trans Golgi clasifica todas las pro lemas que pasan a uavés del complejo de Golgi las que son retenidas en él como residentes permanentes) de acuerdo con su des­

lnal. El mecanismo de clasificación esLá especialmente bien estudiado para el caso de ~rlnas destinadas allumen de los lisosomas. En esta sección vamos a considerar este

• de transporte selectivo. En primer lugar, se efectuará tma breve descripción de la -.-tUra y la función de los lisosomas.

n9

RETICULO ENDOPLASMÁTICO

GOLGI ¡-- -1 ~-~~,...,_-.......J

[ENDOSOMA J

TARDIO _ \

1 1 VESICULAS DE SECRECIÓN

r ' 1

l LISOSOMA : 1 ·, 1 ~ 1 1

.......

1

LENDOSOMA TEMPRANO

r . e- EXTERIOR DE lA CÉLULA ~~ - J

780 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

los lisosomas son el lugar principal de digestión intracelular

Los lisosomas son compartimientos delimitados por membrana rellenos de enzimas hidro­líticas solubles que controlan la digestión intracelular de macro moléculas. Contienen alre­dedor de 40 tipos de enzimas hidroliticas, enrre las que se encuentran proteasas, nucleasas, glucosidasas, U pasas, fosfolipasas, fosfatasas y sulfatasas.1odas ellas son hJdrolasas áddas. Para actuar en condiciones óptimas necesitan por una parte c;er activadas mediante un corte proteolítico y por otra un medio ácido, como el que tiene el lisosoma que mantiene el pli alrededor de 4,5-5,0 en su interior. En este sentido, el citosol está doblemente protegido contra el ataque de su propio sistema digestivo: la membrana dellisosoma mamiene las en­zimas alejadas del citosol, pero incluso en el caso c.le que se produzca alguna fuga pueden hacer poco dario en el citosol, ya que tiene unas condiciones de pl l de aproxrmada­mente7,2.

Como en el caso de otros orgánulos intracelulares, el lisosoma no sólo contiene una do­tación única de enzimas sino también una membrana envolvente con propiedades caracte­rísticas. Por ejemplo, la mayorfa de las protefnas de membrana lisosómrcas están muy glucosiladas,lo que las protege de las proteasas Lisosómicas dellumen. Los transportadores de la membrana Lisosómica transportan los productos finales de la digestión de las macro­moléculas -como por ejemplo aminoácidos, azúcare.s y nucleótidoc;-al cito~ol, donde podrán ser reutili7.ados o excretados.

Una ATPasa de Jf+ vacuolarsituada en la membrana del lisosoma uWi7.a la cnergfa de hi drólisis delATP para bombear u· al interiordel lisosoma, manteniendo así ellumen a un pll ácido (Figura 13--36). La bomba de H · lisosómica es un miembro de la familia deAJPasas de tipo V que tiene una estructur.t similar a las ATP sin tasas de la mitocondria y del cloroplasto (ATPasas de tipo F), que convierten la energía almacenada en el gntdiente de H ·en ATP (véa se Figura 11- 12). Sin embargo. a diferencia de estas enzirnas, laATPasa de H' v-c~cuolar actúa en el sentido opuesto, bombeando 11 ' en el orgánulo. ATPasas de tipo V similares o idénticas son las responsables de la acidificación de todos los orgánulos endociticos y exociticos, in­cluyendo lisosomas, endosomas, compartimientos concretos del complejo de Golgi y mu­chas vesículas de transpone y de secreción. El bajo pll propio del medio imcrior es adecuado para que se produzcan las reacciones propias dellumen del orgánulo y es una fuente de ener gia que dirige el transporte de metabolitos pequeños a través de la membrana.

los lisosomas son heterogéneos

Los lisosornas fueron dcscubrenos mediante el fraccionamiento bioqufmico de extractos ce­lulares y. más tarde, fueron observados con el microscopio electrónico. Aunque son extraor· dinariamente djversos en cuanto a forma y tamai'to, se demuestra que son miembros de una familia única de orgánulos mediante tinción con anticuerpos específicos. También pueden identificarse mediante técnicas histoqufmicas, utilizando el precipitado producido por la acción de una hidrolasa ácida sobre su sustrato, para mostrar qué orgá11ulos cont ienen la hidro! asa (Figura 13--37). Utilizando este criterio, los lisosomas se hallan en todas las células eucariotas.

La heterogeneidad de la morfología lisosómica contrasta con la uniformidad relativa de la mayoría de los otros orgánulos celulares. La diversidad refleja la amplia variedad de fun­ciones digestivas mediadas por las hidrolasas ácidas. como la digestión de desechos intra y extracelulares, la digestión de microorganismos fagocitados e incluso la nutrición celular. La diversidad de morfología de los lisosornas es un reflejo de la manera corno se forman: endo­somas tardío~ que contienen material procedente tanto desde la membrana plasmática como hidrolasas ácidas de nueva síntesis. Los endoso mas tardíos se fusionan con lisosomas pree­xistentes formando estructuras denominadas entlolisosonws, que a su vez se fusionru1 unos

Figura 13-37 Visualización histoqulmica de los lisosomas. Estas electromicrografias muestran dos secciones de una célula, contrastadas para poner de manifiesto la locaiÍlación de la fosfatasa ácida, una enzima marcadora de lisosomas. Los grandes orgánulos envueltos de membrana, que contienen prectpitados densos de fosfato de plomo, son lisosomas. Su diversa morfologla refleja variaciones de la cantidad y de la naturaleza del material que están digiriendo. Los precipitados se producen cuando el tejido fijado con glutaraldehido (para fijar las enzimas en su sitio) se incuba con un sustrato de la fosfatasa en presencia de iones plomo. En el panel superior, se indican mediante flechas rojas dos pequeñas veskulas que probablemente transportan hidrolasas desde el complejo de Golgi. (Por cortesía de Daniel S. Friend.)

.Q.2-<l,S !Jm;__ _ _ _ ....,

I)H-7,2

HIDRO LASAS ÁODAS nucleasas proteasas

glucosldasas U pasas

fosfatasas sulfatasas

fosfolipasas

Figura 13- 36 Llsosomas. Las hldrola!lils ácidas son enzimas hidroHticas que estjn adtvas en condiciones ácidas. En la membrana, una ATPasa de tipo V bombea W hacia el mterior delllsosoma y manti~ su lumen a pH ácido.

DESDE LA RED DEL TRANS GOLGI A LOS LISOSOMAS

compartimientos de pH bajo, hidrolfticamente activos - - -----,

~ ~ 1

o o c0°~ - ~o~ - I'C;\ o~ c ~· e ~ ~ \..!...:) ... ....______

endosoma tardio endolisosoma lisosoma

'""(Figura 13-38). Cuando ha sido digerido la mayor parte del material endocilado ) de w1 endolisosoma, sólo permanecen en su interior aquellos materiales de diges­'·'' lenta o indigeribles, y a estos orgánulos se los denomina lisosomas "clásicos". Son •mente densos. redondos y pequeiios, pero pueden volver a entrar en el ciclo fusionán­•n endoso mas tardíos o con endolísosomas. Así pues no existe una diferencia real entre nas tardíos y lisosomas: son el mismo orgánulo excepto que se encuentrru1 en dife­

,.,¡ados del ciclo de maduración. Por esta razón, a veces se considera a los lisosomas co­' roleccíón hClerogénea de orgánulos distintos cuya única característica común es .• do contenido de enzimas hidro líticas. Como veremos a continuación, en las células

1•·, es especialmeme diffcil aplicar una definición más ajustada.

vacuolas de las plantas y de Jos hongos son lisosomas versátiles

oria de células vegetales y de hongos (incluyendo las levaduras) tienen una o varias '·"muy grandes y llenas de fluido, llrunadas vacuolas, que ocupan por lo general más . del volumen celular y cerca del90% en algunos tipos celulares (Figura 13-39). Las ''están relacionadas con los lisosomas de las células animales y contienen numero-• mas hidrolíticas, pero sus funciones son muy diversas. Las vacuolas vegetales pue­'"ar como almacén de nutrientes y de productos de desecho, como compartimiento •adación, incrementando el volumen celular de una forma económica (Figura v cont:rolru1do la presión tle 111rgencin (la presión osmótica que empuja hacia afuera l relular y que impide que la planta se marchite). Una misma célula puede tener di­' vacuolas con distintas funciones como, por ejemplo. digestión y almacenamiento. '<tcuola es importame como aparato homeostático y permite a las células vegetales f:randes variaciones de su cmorno. Por ejemplo, cuando el pll del medio disminuye,

cloroplasto

vacuola

pared celular

10~m

781

Agura 13-38 Modelo de maduración dellisosoma. La hetereogeneidad de la morfología dellisosoma refleja, al menos en parte. la naturaleza diversa de los materiales que son transportados al orgánulo así como las diferentes etapas del ciclo de maduración que se muestran.

Figura 1 3-39las vacuolas de una célula vegetal. Esta electromicrografra de células de una hoja joven de tabaco muestra el citoplasma como una delgada capa que contiene numerosos cloroplastos, apretados contra la pared por la enorme vacuola. La membrana de la vacuola recibe el nombre de tonoplasto. (Por cortesía de J. Burgess.)

782 Capftulo 13: Tráfico vesicular intracelular

núcleo

1

i 'SS ~

membrana plasmática

cordones dtoplasmáticos

pared celular ----f

vacuola

~ el flujo de J (+hacia el citosol es controlado, al menos en parle, aumentando el transpone de H• a la vacuo la, de manera que tiende a mantener constante el pll del citosol. De forma pa­recida, muchas células vegetales mantienen una presión de turgencia casi consta me a pesar de que se produzcan grandes cambios en la osmolaridad del fluido que les rodea. Esto lo consiguen cambiando la presión osmótica del citosol y de la vacuola; en pane por la hidróli­s is y resíntesis controlada en la vacuola de algunos polfmeros como el poüfosfato y, en par­te, por la alteración del transporte de azúcares, aminoácidos y otros metabolitos a través de la membrana plasmática y vacuo lar. La presión de turgencia regula las actividades de los di­ferentes transportadores de cada membrana para controlar los flujos.

Los seres humanos recolectan frecuentemente las sustancias almacenadas en las va­cuelas de las plantas. En diferentes especies van desde la goma al opio o al aromati1.ante del ajo. Muchos productos almacenados tienen una función metabólica. Por ejemplo, las pro­teínas pueden ser almacenadas durante años en las vacuo las de algw1as células de muchas semillas, como los guisantes y las judfas. Cuando estas semillas germinan, las protcfnas son hidroli?.adas y los aminoácidos dan alimento al embrión. Los antocianas, pigmentos que se encuentran en las vacuolas, dan color a los pétalos de muchas Dores atrayendo los insectos polinizadores, mien tras que las moléculas nocivas. liberadas de las vacuolas cuando una planta es comida o dañada, proporcionan un sis tema de defensa comra los depredadores.

Varias vías aportan materiales a los lisosomas

En general, los lisosomas son puntos de encuentro en los que convergen diferentes corrien­tes del tráfico intracelular. Una ruta que se dirige hacia fuera desde el ER vfa complejo de Golgi entrega la mayorfa de las enzimas digestivas, mientras que al menos tres vfas desde di­ferentes orígenes imroducen sustancias en los lisosomas para su degradación.

De estas vfas, la mejor estudiada es la de las macro moléculas que son tomadas del fluido extracelular mediante endocilosis. Como se describirá, las moléculas endocitadas son entre­gadas en forma de pequeñas vesículas a orgánulos intracelulares de formas irregulares deno­minados endosonws tempranos. Alli los materiales endocitados se encuentran con las hidrolasas ácidas lisosómicas, transportadas al endosoma desde el complejo de Golgi. Algunas de las moléculas endocitadas son seleccionadas y recicladas a la membrana plasmá­tica. mientras que otras se dirigen a los endosomas tardios. El interior de los endoso mas tar­dfos es medianamente ácido (pH -6) y se cree que es el lugar donde empieza la digestión hidrolftica de las moléculas endocitadas. Tal como se ba indicado, los Lisosomas maduros se forman por maduración a partir de los endosomas tardíos acompañados de un descenso más pronunciado del pH interno. A medida que los Usosomas maduran, las proteínas de mem­brana endosómicas son recuperadas seleclivamente desde el lisosoma en desarrollo por ve­sículas de transporte que las entregan a los endosomas o a la red del trans Golgi.

En todas las células existe una segunda ru ta que aporta materiales a los lisosomas para su degradación y mediante la cual pueden ser destruidas partes obsoletas de la propia célu­la: el proceso denominado autofagia En una célula hepática, por ejemplo, Lma mitocondria

Figura 13-40 El papel de la vacuola en el control del tamaño de las células vegetal Una célula vegetal puede aumentar notablemente su volumen sin incrementar el volumen del cltosol. La relajación local de la pared permite una expansión celular Impulsada por la turgencia que conlleva la captación de agua en el interior de una vacuola en expansión. Por último, el citoplasma queda confinado a un delgado estrato periférico, comunicado con la

región perlnuclear mediante cordones de citoplasma estabilizados por haces de filamentos de actina (no mostrado).

-.a.JcD/"'\DTc DESDE LA RED DEL TRANS GOLGI A LOS LISOSOMAS

una vida media de 10 días. En Las imágenes de microscopía electrónica de células nor­'t' pueden observar lisosomas conteniendo (y probablemente digiriendo) mitocon-1'.1 proceso de digestión se inicia al quedar rodeado el orgánulo por una doble

l. -.nhrana de origen desconocido, generándose un awofagosoma, que se fusiona con un li­. El proceso c!>lá muy regulado, de forma que durante la remodelación celular se seleccionar diferentes componentes celulares y ser destinados a su destrucción. Por

_.....PIII. el ER liso que prolifera en una célula hepática, como una respuesta detoxificadom al·ompuesto<o de naturaleza lipfdica como el fenobarbital (descrito en el Capítulo 12),

de forma c;electiva por medio de autofagia cuando se retira el compuesto. l)c la misma manera otros orgánulos obsoletos, incluyendo peroxisomas senescentes o

pueden <oer marcados SPIE'Ctivamente para degradación mediante autofagia. En .... iclunes de ayuno grandes porciones del citosol son capturados de manera no selectiva en ~¡tulisosomas. Los metabolitos derivados de la digestión del material capturado contri-

a la supervivencia celular cuando la disponibilidad de nutrientes externos es limitan te. Además de comrihuir al correcto equilibrio de funciones celulares básicas y a destruir

panes de la célula que el>tán obsoletas, la autofagia desempeiia un papel en el de­' y en la salud. Ayuda a la reestructuración de las células en diferenciación eliminan­

•aquellas estructuras que ya no son necesariac, y participa en los mecanismos de defensa la Infección de virus y bacteri;c,. La autofagia es el mecanismo del que dispone la célu­

la eliminación de orgánulos completos y complejos proteicos que la degradación ~1mal no puede rcal11..ar.

AUn'e conoce muy poco sobre la formación de los autofagosomas o cómo se controla _.,., .... " de a utofagia dingiéndolo a orgánulos especrflcos. Se han identificado más de

que participan en el proceso en levaduras y en células animales. La autofagia se rn matro etapas: ( l) nucleación y extensión de una membrana en una estructura en dt• 11 que delimita una porción de cito~ol, (2) cierre del autofagolisosoma en un com­•lt'nto cerrado y delimitado por una doble membrana, (3) fusión del nuevo compani-

cun lisosomas y (4) digestión de la membrana interna del autofagolisosoma y de su (Figura 13-41). Aún quedan muchos misterios por resolver, incluyendo la idemi­

dl'l sistema de membranas a panir de la<; que se forma la envoltura del autofagoli­Y t·ómo algunos orgánulos diana pueden ser envueltos con tanta especificidad.

muse describirá más adelante, la tercera ruta que proporciona materiales a los liso­MIIutiene lugar en células que están especializadas en la fagocitosis de grandes partí­lit• microorganismos. Estas células (macrófagos y neutrófilos en los venebrados) in~o~crir grandes objetos y formar unfttgosoma. Parece que el fagosoma se transforn1a

........... ..,,. de la misma forma que hemos explicado para el caso del autofagosoma. La

teceptor de manosa 6-fosfato reconoce las proteínas icas en la red del trans Golgi

,ludiaremos la ruta que conduce a las hidrolasas ácídas y a las proteínas de membra­u~osomas. Ambos tipos de proteínas son transponadas cotraduccionalmcnte en el

y son transponadas a través del complejo de Golgi hasta el TGN. Las vesículas de que conducen estas proteínas hasta los endosomas (desde donde las protefnas

I.Wllil!'o a los lisosomas) pancn del TGN. Las vesículas incorporan las protefnas lisosó-t'Xrluyen a muchas otras protefnas, que serán empaquetadas en otras vesículas.

o~ o~ o" @o o . o _, o o ..___,..., oo

o--' nucleación y extensión

citosot y orgánulos englobados

CIERRE

hidrolas¡¡s ácidas·

tisosoma

Figura 13-41 Un modelo de autofagla. Después del proceso de nucleación en el Citoplasma, se forma una estructura de membrana en forma de U por la fusión

783

de vesículas de ongen desconocido. Posteriormente, el autofagosoma se cierra mediante fusión de la membrana y rodea una porción del citoplasma de la célula mediante una doble membrana. A continuación, el autofagosoma se fusiona con lisosomas que contienen hidrolasas ácidas, digiriendo su contemdo.

784 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

FLUIDO EXTRACELULAR (A)

CITOSOL

\ fagosoma

fagocitosis ~ membrana

___/ \ pl"m'""

,. :-.. endosoma temprano

-endocltosis

LISOSOMA

o ~ -

autofagia

autofagosoma

iCómo son reconocidas y seleccionadas las proteinas lisosómica~ con la preci'lión ne­cesaria? Conocemos la respuesta para las hidro lasas Hsosómicas. Estas hidrolasas presentan un solo marcador en forma de grupos manosa 6-fos[ato (M6P). los cuales son añadidos ex­clusivamente a los N-oligosacárídos de estas enzimas lisosómicas solubles, probablemente mientras están en ellumen de la red del cis Golgi (Figura 13-43}. Proteínas receptoras de M6P transmembrana de M6P presentes en el TGN reconocen los grupos M6P. Las proteínas receptoras se unen a las hidrolasas lisosómicas en el lado luminal de la membrana y a las proteínas adaptadoras, en el proceso de ensamblaje de las cubierta<; de da trina, por el lado citosólico. De esta manera ayudan a empaquetar las hidrolasas en vesfculas recubiertas de clatrina que se forman a partir del TGN. Las vesfculas pierden su cubierta y entregan después

su contenido a un endosoma temprano.

El receptor M6P viaja como una lanzadera entre determinadas

membranas

El receptor ~16P une su oligosacárido especffico a pi 1 6,5-6,7 en el TGN y lo libera a pl l6. que es el pH del interior de los endoso mas tardíos. Asf, a medida que el pi-1 se reduce a lo largo de la maduración del endosoma, las hidrolasas lisosómicas se separan del receptor de M6P e inician la hidrólisis del material capturado mediante enducitosis. Una fosfatasa ácida elimi­na e l gmpo fosfato de la manosa destmyendo la seiial y contribuyendo a la liberación de las hidrolasas ácidas del receptor de MGP. Una vez han liberado las enzimas, los receptores M6P son introducidos en vesfculas recubiertas de retrómero que se forman en los endosomas; los receptores son devueltos al TGN para su reutilización (Figura l3--44). El transporte en cualquier dirección requiere la existencia de seii.ales en la cola citoplasmática del receptor M6P que dirigen el transporte de la pro reina hacia el endosoma o de vuelta al complejo de Golgi. Estas señales son reconocidas por el complejo de retrómero (véase Figura 13-9) que recluta receptores MGP en vesfculas en los endosomas. El reciclaje del receptor M6P tiene un gran parecido al del receptor KDEL descrito, aunque se diferencia en cuanto al tipo de ve­

sfculas recubiertas implicadas en este transporte. No todas las moléctúas de hidrolasas que están marcadas con M6P alcanzan el lisosoma.

Algunas consiguen escapar del proceso de empaquetamiento en la red del rmns Golgi. y son transportadas, "por defectoH. a la superficie celular, desde donde son secretadas al fluido extra­celular. No obstante, algunos receptores M6P también toman un desvío hacia la membrana plasmática, donde recapt:uran a las hidro lasas lisosómicas escapadas y las devuelven median­te una endocitosis mediada por receptor a los lisosomas vía endoso mas tempranos y tardfos. Dado que las hidro lasas lisosómicas precisan de un medio ácido para su actividad, pueden provocar pocos daños en el medio extracelular que tiene habitualmente un pH neutro de 7,4.

Figura 13-42 Tres rutas para la degradación en loslisosomas. (A) Cada ruta conduce a la digestión Intracelular de materiales procedentes de diferentes orlgenes. Nótese que el autofagosoma tiene una doble membrana. (B) Electromicrografia de un autofagosoma que contiene una mitocondria y un peroxisoma. (B. cortesía de Daniel S. Friend, de D.W. Fawcett. A textbook of Histology, 12.• ed. New York. Chapman and Hall, 1994. Con permiso deKiuwer.)

(B)

manosa 6-fosfato (M6P)

P - Oa- CHz

HO O J

oligosacárido _ unido a N

hidrolasa lisos6mica

111m

Figura 13-43 La estructura de la m• 6-fosfato en una enzima lisosómicas.

N S PORTE DESDE LA RED DEL TRANS GOLGI A LOS LISOSOMAS

TRANSPORTE DEPENDIENTE DE RECEPTOR

UNIÓN AL RECEPTOR M6P ---

cubierta de clatrina

vesícula de transporte

-DISOCIACIÓN ApH ÁCIDO

+ P,

'\ •

785

precursor de hidrolasa lisosómica

RECICLAJE DEL RECEPTOR receptor M6P en las vesículas recubiertas

red del trans Golgi

de clatrlna que emergen por gemación

complejo de Golgl

región señal en la cadena polipeptídica proporciona lave para la unión de M6P

111<1 de clasificación que segrega las hidrolasas lisosómicas y las dirige hacia los endo­l.trdfos funciona porque en el complejo de Golgi sólo se añaden grupos de manosa ''' a las glucopro teínas adecuadas. Este marcaje espedfico requiere un reconocí­' también específico de las hidro lasas por la enzima del Golgi responsable de a nadir qms M6P. Dado que rodas las glucoproteínas abandonan el EH con las cadenas de ,,Jcáridos idénticas, la seiial para ruiadir las unidades de M6P a los oligosacáridos lie­ll'~idir en alguna parte de la cadena polipeptfdica de cada hidrolasa. Experimentos 11icrfa genética han mostrado que la señal de reconocimiento es un grupo de amino­' t•cmos sobre la superficie de cada proteína que forman una región se1ial.

talición de grupos de MGP a las hidrolasas lisosómicas está catalizada por dos enzimas ,,,m de manera secuencial. La primera es una Glc-NAc fosfotransferasa en el cis Golgi P~pedficamente la hidrolasa y ruiade GlcNAc-fosfato a uno o dos de los residuos m a­

' r.tda cadena de oligosacárido (Figura 13-45). Entonces una segunda enzima en el ·lRI elimina el residuo GlcNAc, dejando un marcador MGP, acabado de generar. Como ludrolosas lisosomales contienen múhiples oligosacáridos, adquieren muchos resi-

1t ,JI} proporcionan una senal de alta afinidad para el receptor de MGP.

humanos, los defectos en la GlcNAc fosfotransferasa n una enfermedad de acumulación lisosómica

genéticos que afectan a una o más de las hidrolasas lisosómicas son la causa de ,. de enfermedades de almacen amiento Usosórnico en la especie humana. Estos provocru1 una acumulación en los lisosomas de sus sustratos no digeridos. Esta

·~~'IOn tiene consecuencias patológicas profundas, frecuentemente en el sistema ner­" la mayorfa de los casos se producen como consecuencia de una mutación en un 111 Lural que codifica una hidrolasa lisosómica Este es el caso de la enfennedad de

11 la que la enzima necesaria para la rotura de cierto tipo de cadenas de glucosami­tul es defectuosa o está ausenre. La forma más grave de enfermedad de acumula­(•mica es una alteración muy poco frecuente denominada enfennedad de inclusión

··11jérmedad celular-1). En esta situación, la mayorfa de las enzimas hidrolfticas han . ,........,.,Jn~ 1do de los lisosomas de los fibroblastos y sus sustratos no digeridos se acumulan

grandes inclusiones en las células de los pacientes. • 11fermedad celular-1 es debida a un solo defecto génico que, como en el caso de la

dt• las deficiencias genéticas, es recesivo, es decir, sólo presentan la enfermedad los

Figura 13-44 Transporte a los llsosomas de las hidrolasas llsosómicas recién sintetizadas. La acdón secuencial de dos enzimas en las redes del cis y del crans Golgl añade grupos manosa 6-fosfato (M6P) a los precursores de las enzimas lisosómicas (véase Figura 13--45). Son separadas de todas las demás protelnas en el TGN porque unas protelnas adaptadoras monoméricas de la cubierta de datrina se unen a los receptores de M6P que a su vez reconocen y unen a las hidrolasas ácidas lisosómicas modificadas. Las veskulas recubiertas de clatrina formadas en el TGN pierden su cubierta y se fusionan con los endosomas tempranos. Al bajo pH de los endosomas tardios, las hldrolasas se disocian de los receptores de M6P; los receptores vados son reciclados en vesfculas recubiertas de retrómero hasta el complejo de Golgi, para rondas posteriores de transpone. En los endosomas, el fosfato es eliminado de los residuos de manosa unidos a las hidrolasas con el fin de asegurar que las hidrolasas no vuelvan al complejo de Golgi con el receptor.

786 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

hidrolasa lisosómica

N-oligosacárido con un residuo terminal de manosa

UNIÓN DE LA ZONA

~AL LUGAR DE

t.::_:' _... ONOCIMIENTO

~ lll TRANSFERENCIA zona 11i11 DEL GRUPO

Figura 13-45 Reconocimiento de una hidrolasa lisosóm ica. La enzima GlcNAc fosfotransferasa, que reconoce las hidrolasas

llsosómicas en el complejo de Golgl, tiene un lugar catalltico y un

lugar de reconocimiento, separados. El lugar catalltico procede alá unión de N-ollgosacáridos ricos en manosa y UDP-GicNAc. El lugar

de reconocimiento se une a una zona señal que sólo se encuentr• sobre la superficie de las hidrolasas llsosómicas Una segunda

enzima elimina la PGicNAc y deja expuesta la M6P.

DJ-lP:-tp UDP-GicNAc

sella! ) . GlcNAc ~ P A

P) ~- @ UNA MANOSA

-----

(~) ~. -~ !:1 DEL LUGAR

Ó •

. CATALITICO UNI N AL LUGAR ~ .r---o. .I't\ ~ ~ CATALITICO

G leNA e-fosfotra nsf e rasa

- p UMP

lugar catalftlco lugar de reconocimiento

individuos que tienen defectuosas las dos copias del gen. En los pacienres de e1úermedad celular-! todas las hidrolasas que han desaparecido de los lisosomas se hallan en la sangre. Debido a que la deficiencia se produce por un error en el proceso de clasificación de estas hidrolasas en el complejo de Golgi, son secretadas en lugar de ser transportadas a los lisoso­mas. Este error de clasificación es debido a una GlcNAc-fosfotransferasa defectuosa o ausen-te. En este caso, las enzimas lisosómicas no son fosforiladas en la red del cis Golgi, por lo que los receptores M6P no las reconocen ni clasifican en las vesfcuJas de transporte apropiadas en el TGN. Por el contrario, las hidro lasas lisosómicas son transportadas a la superficie celu-lar y son secretadas por la ruta por defecto.

En la enfermedad celular-1, los lisosomas de algw1os tipos celulares, como los hepato­citos, contienen una dotación normal de en:r.imas lisosómicas. Este hecho implica que tiene que existir otra vía para dirigir las hidrolasas a los lisosomas, la cual se utiliza en algunos tipos celulares pero no en otros. Se desconoce la naturaleza de esta vía independiente de M6P. De manera similar, una ruta independieme de M6P presente en todas las céluJas selec· dona las proteínas de la membrana lisosómica desde el TGN para su transporte hacia los endosomas tardíos, por lo que su distribución es normal en la enfermedad celular-l. Estas proteínas de membrana salen del TGN en vesículas recubiertas de da trina que son diferen­tes de aquellas que transportan las hidrolasas ácidas con señal M6P y emplean diferentes proteínas adaptadoras.

Todavía se desconoce por qué las células necesitan más de una vía de clasificación pa­ra construír lisosomas, aunque quizá no sea sorprendenre que en proteínas solubles y uni­das a membrana actúen mecanismos diferentes, en especial porque -con la excepción de los receptores de M6P- estas proteínas de membrana son residentes en ellisosoma y no es necesario devolverlas al TGN.

Algunos lisosomas son exocitados

El direccionamiento de material a los lisosomas no es necesariamente el final de la ruta. La secreciónlisosómica de su contenido no digerido permite a la céluJa eliminar los restos no di­geribles. En la mayoría de las células esta vía parece ser menor y sólo se utiliza cuando las cé­lulas están estresadas. Pero algunos tipos celuJares contienen lisosomas especializados que han adquirido la maquinaria para la fusión con la membrana plasmática. Por ejemplo, los meltmocitosde la piel producen y almacenan pigmentos en sus lisosomas. Estos mela/loso­

mas rellenos de pigmento lo liberan al espacio extracelular de la epidermis mediante cxoci­tosis. Entonces, el pigmento es captado por los queratinocitos, que confieren a la piel la pigmentación normal. En algunos trastornos genéticos. defectos en la exocitosis de los me­lanosomas bloquean este proceso de transporte, lo que provoca el albírtismo.

Resumen

Los lisosomas están especializados en la digestión intracelular. Contienen proreftUJS de membraua

caracterfsticas y una amplia variedad de emimas hidrolfricas solubles que trabajan mejor a pll5.

Una bomba de ATP de su membrana, que impulsa protones, mantiene el pH bajo. /,as protefnas Ji-

LIBERACIÓN

hidrolasa llsosómica con un grupo GlcNAc ~ P unido a una manosa de un ollgosacár

1 eliminad~' deGicNA

llluJc:of"'on: HACIA EL INTERIOR DE LA CÉLULA DESDE LA MEMBRANA PLASMÁTICA: ENDOCITOSIS 787

11s recién sintetizadas son transferidas allwnen del ER, son transportadas a través del com­, · < .olgi y luego conducidas por tnedio de vesfculas de transporte desde la red del trans Golgi a

~¡, "mnas tardfos mediante vesfculas de trallSporte recubiertas de clatrina. llidrolasas lisosómicas contienen N-oligosacáridos que son modificados comlentemente de

wu caracterlstica en la red del cis Golgi, de manera que sus residuos de manosa son fosfori­[Jrm grupos de manosa 6-fosfaro (M6P) son reconocidos por Wl receptor de la red del trans ·/•ual separa las hidro/asas del resto de lns moléculns y ayuda a empaquetarlns en el illlerior das de transporte que descargan su comen ido en los endoso mas. El receptor M6P oscila, ha­ulte y hacia atrás, entre la red deltrans Golgi y estos endosomas. El bajo pH de los endoso-

¡,, ¡•fiminación del grupo fosfato de la M6P facilitan la disociación de las llidrolasas . ,,.,~de estos receptores y dirigen e/ transporte de las llidrolnsas en un solo sentido. Un sisre­'•IIISporlP diferellfe utili:w ueslculas de transporre recubierTas de clatrina para transporTar ', de membrana residellles en los lisosomas desde la red del trans Go/gi.

:ANSPORTE HACIA EL INTERIOR DE LA CÉLULA DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA: ENDOCITOSIS

que llevan hacia los lisosomas desde la superficie celular empiezan con la endoci­lh'lliante la cual las células captan macromoléculas, sustancias particuladas y, en casos

··~. otras células. En este proceso, el material que va a ser ingerido es rodeado pro­m•me por una pequeña porción de la membrana plasmática, que primero se inva­

ltwgo se estrangula formando una vesfcula endocfrica que contiene el material o l.t ingerida. Se pueden distinguir dos tipos de endocitosis en función del tamaño de e 11las que se forman. En la fagocitosis ("comida de la célula"), se ingieren panfculas

mediante grandes vesículas llamadas Jngosomas (generalmente de un diámetro 11: En la pinocitosis ("bebida de la c6lula"), se ingieren fluido y solutos vía pequeñas 'pinocíticas (de aproximadamente 100 nm de diámetro). La mayoría de las células '·" ingieren continuamente fluidos y solutos por pinocitosis; las grandes partfculas ''idas con más eficacia por células fagocfticas especializadas.

unas células fagocíticas especializadas pueden ingerir .ndes partículas

hosis es una forma especial de endocitosís en la que una célula utiliza grandes ve­··ndocfticas denominadas fagosomas para ingerir grandes partículas, tales como mi­tU,mos y células muertas. IC \'1 En los protozoos, la fagocitosis constituye un lit• alimentación: las grandes particulas atrapadas en los fagosomas acaban en los ''y los productos de los procesos digestivos posteriores pasan al citoplasma donde

¡,,,dos como alimento. Sin embargo, en los organismos pluricelulares son pocas las e .1paces de ingerir grandes partfculas de forma eficiente. Por ejemplo, en el intestino turnales las partículas de alimento son digeridas mediante procesos que se reali7..an l.t~ células y éstas importan los productos de hidrólisis de pequeño tamaño.

!.1 mayoría de los an imales, la fagocitosis es importante con finalidades diferentes a ltt!lrición y la llevan a cabo principalmente células especializadas: las denominadas

wofesionales. Fn los mamíferos actúan como fagocitos profesionales dos ripos de hlancos: los macrófagos y los neutrófilos. Estas células, que se desarrollan a partir "madre hematopoyéticas (descritas en el Capítulo 23), ingieren microorganismos

"' defendiéndonos de las infecciones. Los macrófagos también desempeñan un im­,. papel al recoger a las células moribundas ya las que han muerto porapoptosis (des­..¡ Capítulo 18). En términos cuantitativos, la eliminación de células senescentes y ,., de lejos la función más importante. Por ejemplo, los macrófagos fagocitan más

• h· eritrocitos viejos a diario en cada uno de nosotros. !Jilras que las vesículas endocíticas implicadas en la pinocitosis son pequeñas y

11•'':>, los fagosomas tienen un diámetro que está determinado por el tipo de partí­;¡lll' ingieren y pueden llegar a ser tan grandes como la propia célula fagocílica it :1 :{-46). Los fagosomas se fusionan con los lisosomas dentro de la célula: entonces,

r 1.11 ingerido es degradado. Cualquier sustancia no digerible permanecerá en el in­los lisosomas y formará cuerpos residuales que pueden ser excretados de las cé-

l . RETICULO END,?PLASMÁTICO _j r

GOLGI

ENDOSOMA TEMPRANO

....

1fr VESICULAS DE

SECRECIÓN

EXTERIOR DE LA CELULA 1~

788 Capitulo 13: Tráfico vesicular intracelular

lulas mediante exocitosis, como hemos descrito. Algunos de los componentes de la mem­brana plasmática internalizada nunca alcanzan ellisosoma porque son recuperados del fagosoma mediante vesículas de transporte y son devueltos a la membrana plasmática.

Para que una partícula sea fagocitada, primero debe unirse a la superficie del fagocito. Sin embargo, no se ingieren todas las partículas que se unen. Los fagocitos tienen toda una gama de receptores de superficie especializados que se encuentran unidos funcionalmente a la maquinaria fagocítica de la célula. La fagocitosis es un proceso regulado. Es decir, para que se inicie la respuesta hace falta que los receptores activados transmitan la ~eñal al interior de la céluJa. Por el contrario, la pinocitosis es un proceso constitutivo. Se produce de forma constante con independencia de las necesidades de la célula. Los agentes desencade­nantes de la fagocitosis mejor caracterizados c;on los anticuerpos, que nos protegen contra los microorganismos infecciosos uniéndose a su superficie y formando una cubierta en la que la región de las colas de los anticuerpos se hallan expuestas al exterior. Esta región de la cola es el denominado fragmento Fe (descrito en el Capítulo 25). La cubiena de anticuerpos es reconocida entonces por los receptores Fe de la superficie de los macrófagos y de los neutrófilos; la unión induce a la célula fagocítica a extender pseudópodos que rodean la par­tícuJa y se fusionan por sus extremos para formar el fagosoma (Figura 1 ~7A). La polimeri­zación local de actina iniciada por GTPasas de la familia Rho y por sus activado res Rho-GEf (descritos en los Capítulos 15 y 16) da forma a los pseudópodos. Una GTPasa de Rho activa provoca la activación de las PI quinasa locales y se inicia la polimerización local de actina co­mo respuesta a una acumulación local de PI(4,5)P2 en la membrana (véase Figura 13-11). Para cerrar el fagosoma y completar el proceso de engullimiento, la actina se despolimeriza en respuesta a una reducción de PI(4,5)P2 que es fosforilado por acción de una Pl3-quinasa, la cual lo convierte en PI(3,4,5}P1 Este compuesto es necesario para que pueda cerrarse el fa­gosoma y podría también dar una nueva fom1a a la red de actina que facilita la invaginación del fagosoma en formación (Figura 1 3--476). Así la síntesis y del,rradación de fosfoinositoles regula las etapas secuenciales de la formación del fagosoma.

Se han caracterizado algunas otras clases de receptores que provocan fagocitosi!>. Algunos reconocen componentes del complememo, que colaboran con los anticuerpo!. mar­cando a los microorganismo!. para su destrucción (de!.crito en el Capítulo 24). Otros reco­nocen directamente células que han mueno por apoptosis. Las células apoptóticas pierden la caracterfc;tica distribución de fosfolípidos en su membrana plasmática. Como conse­cuencia de ello, la fosfatidilserina cargada negativamente que por lo general se encuentra confinada a la cara citosólica de la bicapa lipidica se expone en el exterior de la célula, don­de activa la fagocitosis de la célula muena.

Sorprendentemente los macrófagos fagocitan una serie de partículas inanimadas co­mo cristal. bolas de vidrio o látex y fibras de asbesto- mientras que no fagocitan células a ni-

pseudópodo bacteria

bacteria

- - · pseudópodo

S 11m

Figura 13-46 Fagocitosis por un macrófa Electromicrografla de barndo de un macrófago de ratón que está fagocitando dos entroc1tos modificados qulmicamentc Las flechas rojas lnd1can los bordes de las finas extensiones (pseudópodos) del macrófago que se proyectan a modo de collares engullendo los entroc1tos. (Conesla de Jean Paul Revel.)

membrana plasmatica

Pl(4,5)P1 - PI(3,4,5)PJ

&

(A) 1J.1m

(B) PI 3-quinasa

Agura 13-47 Un neutrófilo deformando su membrana durante la fagocitosis. (A) Electromicrografla de un neutrófllo fagocitando Un.'l

bacteria que se hallaba en proceso de división. (B) La extensión de pseudópodos y la formación del íagosoma son consecuencia de la polimerización y reorganización de filamentos de actina en respu acumulación de fosfoinos1toles en la membrana del fagosoma t!n f ción. (A, cortesía de Dorothy F. Bainton, Phagocytíc Mechanísm 1n and Dí sea se. New York; lntercontinental Medica! Book Corporation,

NSPORTE HACIA EL INTERIOR DE LA CÉLULA DESDE LA MEMBRANA PLASMÁTICA: ENDOCITOSIS 789

> vivas. Parece que las célulac; vivas muestran señales de "no me comas" en forma de lna~ de supe rficie celular que se unen a receptores de inhibición en la superficie de los

r••lagos. Los receptores inhibidores reclutan tirosina fosfatasas que antagonizan los pro­de señalización intracelular que son necesarios para iniciar la fagocitosis, inhibiendo

1ma local el proceso fagocítico. Asr pues, la fagocitosis, como muchos otros procesos lll''• es la consecuencia de un equilibrio entre seña les positivas que activan el proceso O'lll''> negativas que lo inhiben. Se cree que en las células apoptóticas ocLUre tanto una rl!ln de señales de "cóm eme" (como la presencia en la superficie exLraceluJar de fosfa­·rinaJ como la pérdida de señales de "no me cornac;", lo que provoca que sean rápi­ml' fagocitadas por lol. macrófagos.

vesículas de pinocitosis se forman en la membrana plasmática ,artir de depresiones revestidas

1· "las la células eucariolas ingieren continuamente zonas de su membrana plasmática ,¡,na de pequeñas vesfculas pinodticas (endocíticas) que posteriormente retornan a la nne de la célula. La velocidad a la que se internaliza la membrana plasmática en este o de pinocitosis varia de un tipo celular a otro, pero es bastante elevada. Por ejemplo,

,, rcifago ingiere cada hora una camidad de !luido igual al 25% de su propio volumen. :nifica que cada minuto debe ingerir un 3% de su membrana plasmática, es decir. Wl

e-n media hora. Los fibroblastos presentan una velocidad menor (1% de su membrana •lll'a por minuto), mientras que algunas amebas ingieren la membrana plasmática to­

m.is rápidamente. Dado que el área de la superficie y el volumen celular no varean du­"-ll' proceso, está claro que toda la membrdlla que es eliminada por endocitosis debe ht·ndose por el proceso complementario de exocitosü. Fn este sentido, endocitosis y o .. ,., son procesos ligados que se puede considerar que constituyen un ciclo endocícico­r, El acoplamiento entre la exocitosis y la endocitosis es especialmente estricto en t••ras que se caracterizan por el recambio rápido de membrana como es el caso de la

neuronal. 1 lo general, la parte endocítica de este ciclo empieza en regiones especializadas de la

1 .m a plasmática lianJada~ depresiones recubiertas de clatrina que ocupan alrededor del área total de la membrana plasmática La \~da media de las depresiones reves­

' ·da trina el. corta: un minuto después de haber sido formadas, se invaginan hacia el 11 de la célula y se separan de la membrana fonnando las vesículas revestidas de cla­l•gura 13-48). En fibroblastos aislados, se ha estimado que aproximadamente cada

'11500 vesículas revestidas de clatrina abandonan la membrana plasmática. Estas ve­

tt·\estidas son más transitorias incluso que las depresiones revestidas: segundos más e 'cr fonnadas, se despojan de su revestimiento siendo asr capaces de fusionar~e con Jo,omas tempranos. Dado que las depresiones revestidas de clatrina están llenas de 'traceluJar, cuando se invaginan fonnando veskulas revestidas también se interna­,ustancias disueltas en el !luido extraceluJar: un proceso denominado endocitosis de

Figura 13-48 Formación de vesículas recubiertas de clatrina en la membrana plasmática. Estas electromicrograffas ilustran la secuencia probable de acontecimientos que se producen durante la formación de una vesfcula recubierta de clatrina a partir de una depresión revestida de clatrina. las depresiones y las vesfculas revestidas que aparecen en las fotograflas son mucho mayores que las que se presentan en las células de tamaño normal. Intervienen en la captación de lipoproteinas en un gran oocito de gallina y forman la yema del huevo. En la superficie extracelular de la membrana plasmática -que se corresponde con la superficie Interior de la vesrcula- puede verse una capa electrodensa que corresponde a las lipoprotefnas asociadas a sus receptores. (Cortesfa de M.M. Perry y A. B. Gilbert, de J. Ce// Scl. 39:257-272, 1979. Con el permiso de The Company of Biologists.)

l__j 0,1 ¡¡m

790 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

(A)

(B)

No todas las vesículas pinocíticas están recubiertas de clatrina

Además de las depresiones recubiertas de clatrina y de las vesfculas, existen mecanismos mediante los cuales las células pueden formar vesículas de pinocilosis, aunque son menos conocidos. Una de estas vfas se inicia en las caveolas (en latín "pequeñas cavidades"). re­conocidas originalmente por su capacidad para transportar moléculas a través de las cé­lulas endoteliales, que forman la superficie in tema de los vasos sanguíneos. Las caveolas están presentes en la membrana plasmática de la mayoría de los tipos celulares y en algunos de ellos mediante microscopía electrónica se observan como invaginaciones pronunciadas !Figura l3-49). Se cree que se forman a partir de las denominadas balsas lipfdicas o "lipid-raftH que son regiones de membrana plasmática especialmente ricas en colesterol, glucoesfingolfpidos y proteínas unidas a la membrana de tipo GPI (véase Figura IQ-14). La protefna estructural mayoritaria de las caveolas son las caveolinas, una familia de proteínas integrales de membrana con una estructura poco frecuente, en las que la cadena polipeptídica se inserta en forma de bucle en la membrana por la cara cito­sólica sin llegar a cru1.ar la membrana.

A diferencia de las vesículas recubiertas de clatrina, de COPI y de COPll, se cree que las caveolas son capaces de invaginarse y concentrar proteínas de transporte gracias a la com­posición lipfdica de la membrana caveolar, más que por el ensamblaje de proteínas de cu­bierta citosóUcas. Las caveolinas pueden estabilizar las balsas lipídicas, que se encuentran enriquecidas en ciertas proteínas de membrana. Las caveolas se separan de la membrana gracias a la dinamina y liberan su contenido en un compartimiento similar a los endoso mas (denominado caveosoma) o, en una célula polarizada, en la membrana plasmática de la membrana opuesta (en un proceso denominado transcitosis que se describe más adelante). Dado que las caveolinas son proteínas integrales de membrana no se separan de las vesícu­las después de la endocitosis y son transportadas a los compartimientos diana en los que se mantienen asociadas a dominios discretos de membrana. Algunos virus animales como SV40 y papilomavirus (que producen verrugas) entran en las células en vesfculas derivadas de caveolas. Los virus son transportados en primer lugar al caveosoma, desde donde se des­plazan en vesículas de transporte especializadas al ER. El genoma viral sale del ER través de su membrana y alcanza el ci tosol desde donde es importado al núcleo iniciando el ciclo de infección.

Las vesículas endodticas también pueden formarse a partir de balsas libres de caveoUna y entregar su carga a los caveosomas. Las moléculas endocitadas a través de caveolas evitan el paso a través de endosomas y lisosomas y, por tanto, están protegidas de la exposición a un pi J bajo y a las hidrolasas ácidas; se desconoce cómo son transportadas desde el caveo­soma a otros destinos en la célula.

Figura 13-49 Caveolas situadas en la membrana plasmática de un fibroblasto. (A) Esta electromicrograffa muestra una membrana plasmática con una gran densidad de caveolas. Obsérvese que no distingue ninguna cubierta cltosólica (8/ E· Imagen de grabado por congelación m u la textura de·coliflor" de la cara cltosólic.. de la membrana de las caveolas. Parece qu~ola textura regular es debida a los agregados de caveollna en la membrana. En la esqulnt superior derecha puede observarse una depresión recubierta de clatrina. (Corte~ra de R.G.W. Anderson, de K.G. Rothberg e11 Ce//68:673-682, 1992. Con el permiso de Elsevler.)

HACIA EL INTERIOR DE LA CtLULA DESDE LA MEMBRANA PLASMÁTICA: ENDOCITOSIS 791

células utilizan la endocitosis mediada por receptor importar macromoléculas extracelulares seleccionadas

mayoría de células animales, las depresiones y las vesículas revestidas de da trina cons­una ruta eficiente para captar determinadas macromoléculas del fluido extracelular.

tt> proceso, denominado endocltosls mediada por receptor. las macromoléculas se a receptores transmembrana complementarios de la superficie celular, se acumulan

i11 drpresiones revestidas y entran en la célula en forma de complejos receptor-macromolé­rn vesículas recubiertas de clatrina (véase rigura 13-48). Dado que los ligandos son

_..urados selectivamente por los receptores, la endocitosis mediada por receptor propor­' un mecanismo de concentración selectivo que incrementa más de cien veces la efi­la de la imemalización de determinados ligandos. De esta forma, incluso componentes

del fluido extracelular se pueden captar de forma espedfica y en grandes can­sin intemaHzar un gran volumen de fluido extracelular. Un ejemplo bien conocido y

~gicameme importante es eJ proceso mediante el cual las células de los mamíferos sue­aptar el colesterol. Muchas células animales captan colesterol por endocitosis mediada por receptor y así

ren la mayor parte del colesterol que necesitan para la síntesis de las membranas. ingestión se bloquea, el colesterol se acumula en la sangre y puede contribuir a la for­en las paredes de los vasos sanguíneos (arterias) de placas areroscleróticas, depósitos

lpidos y de tejido fibroso que causan apoplejías y ataques cardíacos al impedir la circu­.. anguínea arterial. De hecho, fue un estudio de humanos con una alta predisposición

a la merosclerosis el que permitió identificar por primera vez el mecanismo de en­. mediada por receptor.

~ mayor parte del cole!.terol se transporta en la sangre unido a proteínas, fonnando partículas conocidas como Upoproteú1as de baja densidad (WL: low-den.sity lipopro­tl-l gura 13-50). Cuando la célula necesita colesterol para la sínresis de membranas,

proteínas receptoras de LDL y las inserta en su membrana plasmática. Una vez en mhrana, los receptores de WL difunden hasta asociarse con depresiones revestidas de

que se hallan en proceso de formación (Figura 13-Sl A). Dado que las depresiones ~uuas se separan constantemente de la membrana formando vesículas revestidas, cual­

partícula de LDL que se halle unida a los receptores en las depresiones revestidas es izada con rapidez. Después de desprenderse de su cubierta de da trina, las vesfcuJas

1citosis liberan su contenido en los endosomas tempranos, que se encuentmn cerca pt•riferia celular. Una vez que las I.DL y los receptores LDL se encuentran al pll bajo t•ndosomas, las LDL se separan de su receptor y son transportadas. vfa endoso mas

a los lisosomas. En estos orgánulos, los ésteres de colesterol de las partículas LDL hadrolizados dando lugar a colesterol libre, que de esta forma queda a disposición de la

para la biosíntesil> de membrana. Si se acumula demasiado colesterol libre en la célu­detiene tanto la sfntests de colesterol como la sfntesis de receptores de LDL. con lo

111 n~lula produce y absorbe menos colesterol. ... ta vfa regulada para la absorción del colesterol está perturbada en algunos individuos

twrcdan unos genes defectuosos para la producción de receptores de LDL. Los niveles

(A)

(B)

receptor proteico de LOL

lugar de unión a la 1 ._. 1

depresión revestida depres1ón revestida de datrina

receptor proteico de LOL con el lugar de unión a la depresión revestida, defectuoso

CITOSOL

membrana plasmática

22 nm .---- -- --- ---·· l

protrusión superficial de la molécula proteica

molécula de éster de colesterol

Figura 13-50 Esquema de una partlcula de lipoproteína de baja densidad (LDL: low denslty 1/poprotein). Cada partfcula esférica tiene una masa de 3 x 1 rl' daltons y un núcleo de alrededor de 1500 moléculas de ésteres de colesterol estenficado con ácidos grasos de cadena larga. Una monocapa lipídica formada por unas 800 moléculas de fosfollpido y unas 500 moléculas de colesterol no estenficado rodea el núcleo de ésteres de colesterol. Una única molécula de proteína, de unos 500.000 daltons, organiza la partfcula y es la responsable de la unión especifica de las LDL a los receptores LDL de la superficie de las células.

Agura 13-51 Receptores normales y mutantes de LDL. (A) Proteínas receptoras de LDL unidas a una depresión revestida de la membrana plasmática de una célula normal. El receptor humano de LDL es una glucoproteína transmembrana de paso único compuesta por unos 840 residuos de aminoácido, de los cuales únicamente 50 se hallan en el lado citoplasmático de la membrana. (B) Célula mutan te en la que las proteínas receptoras de LDL son anormales porque carecen del dominio citoplasmátlco que les perm1te unirse a las proteínas adaptadoras en las depresiones recubiertas de clatrlna. Estas células unen LDL pero no pueden ingerirlo. En la mayoría de las poblaciones humanas, uno de cada 500 individuos tiene alterado uno de los genes que codifica los receptores de LO y, como consecuencia de ello, tiene una elevada probabilidad de morir prematuramente de un ataque cardiaco debido a aterosclerosis.

792 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

elevados de colesterol en sangre resultantes prectisponen a estos individuos a una ateroscle­rosis prematura y muchos de ellos pueden morir a una edad temprana de tm ataque car­diaco como consecuencia de alteraciones de las arterias coronarias si no son tratados con fármacos que reduzcan sus niveles de colesterol sanguíneo. En algunos casos, las células no tienen receptor. En otros, los receptores son defectuosos - bien en su lugar de unión extrace­lular para las LDL o bien en el lugar de unión imracelular que lija el receptor al recubrimien­to de las depresiones revestidas con clarrina (véase Figura 13-518). En este último caso, el número de receptores LDL es nonnal, pero no pueden localizarse en las depresiones reves­tidas de clatrina de la membrana plasmática. Aunque las LDL se unen a la superficie de es­tas células mutantes, no se incorporan a la célula. Este hecho demuestra directamente la importancia que lienen las depresiones revestidas de clatrina para la endocitosis mediada por receptor del colesterol.

Se han descrito más de 25 receptores diferentes que participan en la endocitosis me­ruada por receptor de diferentes tipos de moléculas. Aparentemente todos ellos utilizan la ruta de internali,.ación dependiente de da trina y se concentran en vesículas recubiertas de da trina gracias a señales presentes en sus colas citoplasmáticas que se unen a las proteínas adaptadoras de la cubierta de da trina. Muchos de estos receptores, como el receptor de las LDL, entran en las depresiones revestidas con independencia de si se han unido o no a sus U­gandos especfficos. Otros entran sobre todo cuando se han unido a su ligando específico. lo cual sugiere que es necesario un cambio conformacional inducido por el ligando para Uegar a las depresiones. No obstante, no todas las proteínas de la membrana plasmática se acu­mulan en depresiones revestidas de clarrina, lo cual indica que estas depresiones actuan co­mo filtros moleculares recogiendo ciertas proteínas de la membrana plasmática (receptores) y excluyendo a otras.

Estudios de microscopía electrónica de células en cultivo expuestas de forma simultá­nea a diferentes ligandos marcados han demostrado que en una misma depresión recubier­ta pueden agruparse muchos tipos de receptores diferentes, mientras que otros receptores sólo se concentran en depresiones revestidas de clatrina diferentes. l.a membrana plasmáti­ca de una depresión recubierta de clatrina puede acumular unos 1000 receptores de varias clases. Aunque parece que todos los complejos receptor-ligando que utilizan esta ruta en­docítica terminan en el mismo compartimiento cndosómico, el destino posterior de las mo­léculas endocitadas varía, como se explica a continuación.

El material endocitado que no es recuperado por los endosomas termina en los lisosomas

El compartimiento endosómico de una célula puede ser complejo. Puede ser reconocido al microscopio electrónico añadiendo al medio extracelular una molécula fácilmente detecta­ble, como la enzima peroxidasa, y permitiendo que las células la capten por endocitosis a di­ferentes tiempos. La distribución de la molécula después de set captada revela que el compartimiento endosómico es como una serie de túbulos heterogéneos rodeados de membrana y vesículas que se distribuyen desde la periferia de la célula hasta la región perinuclear, donde a menudo se pueden observar cerca del complejo de Golgi. Mediante es­los experimentos de marcaje pueden distinguirse con rapidez dos tipos de endosoma<>. Las

moléculas tra¡r.adoras aparecen en un minuto en los endosomas tempranos, justo por de­bajo de la membrana plasmática. Después de entre 5 y 15 minutos, se despla7.an a los endo­somas tardíos, cerca del complejo de Golgi y del núcleo. Los endosomas tempranos y tardíos difieren en su composición proteica. Por ejemplo, la transición de endosoma temprano a tardío se acompat1a de la liberación de Rab5 y la unión de Rab7.

Como ya mencionamos, la presencia en la membrana del endosoma de wm AfPasa vacular. que bombea H~ desde el citosol hacia el endosoma, mantiene ácido ellumen del compartimiento endosómico (pll - 6,0). En general, los endoso mas tardíos son más ácidos que los tempranos. Este gractiente de ambientes ácidos desempeña un papel crucial en la función de estos orgánulos.

Los materiales endocitados se mezclan en los endosomas tempranos con lúdrolasas li­sosómicas recién sintetizadas y es probable que acaben en los lisosomas. No obstante, mu­chas moléculas se salvan especflicamente de su destmcción. Son recicladas desde los endosomas tempranos hacia la membrana plasmática mediante vesículas de transporte. Sólo las moléculas que no son recuperadas a los endoso mas son en negadas a los lisosomas para su degradación. Aunque en los endosomas tempranos se puede iniciar una primera di-

SPORTE HACIA EL INTERIOR DE LA C~LULA DESDE LA MEMBRANA PLASMÁTICA: ENDOCJTOSIS 793

'' t suave, muchas hidro lasas son sintetizadas y entregadas en forma de proenzimas, de­liadas zimógenos, que presentan dominios inhibidores extra en su extremo N-terminal Jl.ultienen a la hidrolasa inactiva hasta que dicho dominio es eliminado por proteolisis. dmlasas son activadas cuando los endoso mas tardíos se convierten en endolisosomas

J ' nnsecuencia de la fusión con Usosomas preexistentes que comienen la dotación lll'!a de hidrolasas ácidas y que digieren los dominios inhibidores de las enzimas de 1 'in tesis. Además, el pll de los endoso mas tempranos no es suficientemente bajo pa­' .tr a las hidrolasas ácidas de manera óptima. Son estas raz.ones las que explican cómo rla puede recuperar la mayorfa de las protefnas de membrana desde los endosomas mos reciclándolas hacia la membrana plasmática.

terminadas proteínas son recuperadas de los endosomas pranos y devueltas a la membrana plasmática

".losomas tempranos forman un compartimiento que actúa como la estación princi­' l.tsificación en la ruta endocítica, tal como lo hace la red del cis y delcrans Golgi en la

mtética-secretora. En el ambiente ligeramente ácido del endosoma temprano, m u-' r•ptorcs internalizados cambian su conformación y liberan su ligando. como ya se ha

t• • t'n el caso de los receptores M6P con sus hidro lasas lisosómicas en los endosomas wdavía más ácidos. Por lo general, los ligandos endocitados que se disocian de sus rt·s en el endoso m a temprano están predestinados a ser destruidos en los lisosomas •n los otros contenidos del endosoma no unidos a membrana. No obstante, algunos :.mdos endocitados permanecen unidos a sus receptores y companen su destino.

~ h·stino de los receptores -y de algunos ligandos unidos a ellos- varía según el tipo de r d~· que se trate: (1) la mayorfa de los receptores son reciclados y vuelven al mismo

:o lle la membrana plasmática de donde proceden: (2) algunos viajan a un dominio rhrana plasmática diferentes, mediante rranscitosis, y (3) algunos se dirigen a los li­' donde son degradados (Figura 13-52).

1 •Tcptor de LDL sigue la primera de estas rutas. Se disocia de su ligando LDL en el en­'\ es reciclado hacia la membrana plasmática para su reutilización, mientras que la ., argada es transportada a los lisosomas (Figura 13-53). Las vesículas de transpone l,tjc se forman a partir de tubos largos y estrechos que se extienden a panir de los

·nr.t' tempranos. Es probable que la geometrfa de estos tubos contribuya al proceso :lk<tción: debido a que los 1úbulos tienen una gran superficie de membrana rodean-

CITO SOL -EUMINACIÓN DEL REVESTIMIENTO endosoma de reciclaje g;.

RETORNO DE LOS RECEPTORES DE LDLA LA MEMBRANA PLASMÁTICA

colesterol libre ...... . : ... :. . . . . .

endosoma temprano

llsosoma

~-/

enzimas hidrollticas

APARICIÓN DE VESICULAS

DE TRANSPORTE

2. transcrt osis

3:-degradación t 60?

1. ~vesiculas

~ rsosoma / de

~!'-.. ~,sporte

lendosoma O \ temprano ~

o" l . reciclaje e_ocitosis.___ ~ r

Figura 13-52 Posibles destinos de los receptores transmembrana que han sido endocitados. Se muestran tres rutas que parten del compartimiento endosómlco en una célula epitelial. Los receptores recuperados son devueltos (1) al mismo dominio de membrana del que procedían (reciclaje) o (2) a un dominio diferente de la membrana plasmática (tranmtosis).

Los receptores que no han sido recuperados específicamente de los endosomas siguen la ruta que va desde el compartimiento endosómico hasta los llsosomas. donde son degradados (degradación). La formación de agregados de ollgómeros en la membrana endosómica puede ser una de las sena les que guíe a los receptores hacia la vfa de degradación. SI el ligando que es endocítado con su receptor permanece unido al receptor en el medio ácido del endosoma, sigue la misma vía que el receptor; en caso contrario es entregado a los lisosomas.

Figura 13-53 Endocitosis de LDL mediada por receptor. GCTA. Nótese que en el ambiente ácido del endosoma, las LDL se disocian de su receptor. Después de una serie de pasos (véase Figura 13-55), las LDL acaban en los lisosomas, donde se degradan y se libera el colesterol, en una forma no esterificada, que contenfan. Los receptores protercos de LDL vuelven a la membrana plasmática vfa veslculas de transporte recubiertas de clatrina que, tal como se muestra en la figura, brotan de la región tubular del endosoma. Para simplificar el esquema, se muestra un solo receptor de LDL que entra en la célula y que retorna a la membrana plasmática. Esté ocupado o no, cada receptor de LDL realiza un ciclo completo, hacia adentro y de nuevo hacia la membrana de la célula, cada 1 O mrnutos, dando un total de varios cientos de vueltas en su vida media de 20 horas.

794 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

endosoma temprano

endoso m a tardlo

10 11m

endosoma de reciclaje

do un pequeño volumen. las proteínas de membrana tienden a concentrarse en ellos. Las vesículas de transporte que devuelven el material a la m embrana plasmática comienzan a formarse en los tú bulos, pero también pueden separarse porciones tubulares de los e ndoso­mas tempranos y fusionarse entre sr formando los denominados endosomas de reciclaje, que sirven como una estación de paso para el tráfico existente entre los endoso mas tempranos y la membrana plasmática. Esta ruta de reciclaje actúa sin parar y compensa la endocitosis que tiene lugar continuamente en la membrana plasmática.

El receptor d e transferrin a sigue una ruta de reciclaje similar a la d el receptor LDL, pero e n este caso el ligando también se recicla. La transferrina es una proteína soluble que transporta el hierro en la sangre. El receptor de la transferrina de la superficie celula r des­carga la rransferrina, con el hie rro unido, en los endosomas tempranos mediante un proceso de endocitosis mediada por receptor. El bajo pH del endosoma hace que la trans­ferrina libere el hierro que transporta. La transfcrrina libre de hierro (llamada apouansfe­rrina) permanece unida a su receptor. El complejo receptor-apotransferrina entra en las estructuras tubulares de los endoso mas tempranos y a partir de alli es reciclado de vuelta a la membrana plasmática (Figura 13-54). Cuando la apotransferrina vuelve al pH neutro del fluido extracelular, se disocia del receptor y queda libre, pudiendo captar más hierro y com enzar de nuevo el ciclo. De esta forma, la transferrina actúa como una lanzadera entre el fluido extra celular y el compartimiento endosómico, evitando entrar en contacto con los lisosomas y entregando el hierro en el interior celular a medida que es necesario para el crecimiento y proliferación celular.

La segunda ruta que pueden seguir los receptores endocitados a partir de los endoso­mas es la que siguen muchos receptores de señalización, incluyendo los receptores opiáceos (véase Figura 13-54) y el receptor que une e l factor de crecimiento epidérmico (EGF: epider­mal growth factor). El EGF es una proteína pequeña de señalización extracelular que esti­mula la división de las células de la epidermis y de otros tipos celulares. A diferencia de los receptores de LDL, estos receptores sólo se acumulan en depresiones revestidas después de haber unido EGF, y la mayoría de eUos no se reciclan sino que son degradados en los lisoso­m as junto con el EGF captado. Por consiguiente, la unión de EGF produce en primer lugar la activación de las vfas de señalización intracelulares y, como consecuencia de e llo, reduce la concentración de los receptores de EGF en la superficie celular, un proceso llamado regu­lación por disminució11 (dow11-regulation), que reduce la sensibilidad de la célula al EGF (véase Figura 15-29).

Agura 13- 54 Clasificación de las proteln de membrana en la ruta endodtica. Los receptores de transferrina están implicados en la captación de nutriente: desplazándose entre los endosomas y 1.1 membrana plasmática. Por el contrario, lo~ receptores de opiáceos son inhibidos por endocitosis seguidos de degradación en los hsosomas cuando son activados por opl como la morfina y la herolna, así como por péptidos endógenos denominados encefalinas y endorfinas. La endoc1tosis de ambos tipos de receptores se Inicia en las depresiones recubiertas de clatrina A continuación son transportados a los endosomas tempranos, desde donde sus caminos dlvergen: los receptores de transferrlna son clasificados hacia los endosomas de reciclaje mientras que los receptores de opiáceos lo son hacia lo~ endosomas tardfos. La micrografla muestr• ambos receptores - marcados con diferen colorantes fluorescentes- 30 min despuH la endocitosis (los receptores de transfer marcados en rojo y los receptores op1áccot en verde). En ese momento, algunos endosomas tempranos contienen ambos receptores y se ven como estructuras amarillas, debido a la superposición de 1• verde y de la luz roja procedentes de lo~ colorantes fluorescentes. Por el contrario. los endosomas de reciclaje y los endo tardfos están especialmente enriquectde» receptores de transferrina o en receptOI~ de opiáceos respectivamente, mostrán como estructuras rojas o verdes. (Coru de Mark von Zastrow.)

NSPORTE HACIA EL INTERIOR DE LA CÉLULA DESDE LA MEMBRANA PLASMÁTICA: ENDOCITOSIS 795

1.1 cndocitosis mediada por receptor y dependiente de da trina es un proceso muy re­ll•' f·n primer lugar, los receptores son modificados covalentemente con la pro reina pe­

' ubiquitina. Pero, a diferencia de la poliubiquitiniwción que añade una cadena de 1111ina que marca a la proteú1a para su degradación por los proteosomas (descrito en puulo 6}, la unión de ubiquitina en la clasificación de protemas en la ruta endocítica

o diente de el a trina une sólo una o dos moléculas de ubiquitina a la pro tema: es el pro-<t.·nominado monoubiquitiniZilción o multiubiquitiniwción, respectivamente. Las n.ss de unión a ubiquitina reconocen la ubiquitina unida y ayudan a dirigir los recep­

rnudificados hacia las depresiones recubiertas de claoina. Después de su entrega en los "mas, otras proteínas de unión a ubiquitina las reconocen y las ayudan a superar las posteriores de clasificación.

la ruta hacia los endosomas tardíos se forman cuerpos ltivesiculares

'a hemos descrito, muchas de las moléculas endocitadas se desplazan desde los 11nas tempranos hasta los tardíos. En este proceso, los endosomas tempranos mi­

lt ntamentc a lo largo de los microtúbulos hacia el interior celular, emitiendo tú bu­membrana y vesículas que reciclan material hacia la membrana plasmática y

N, ·\1 mismo tiempo, la membana que delimita los endosomas en migración forma lunes hacia el interior que vesiculan y producen vesiculas internas: los cuerpos

rln·<,iculares (Figura 13-55). Finalmente, los cuerpos multivesiculares pueden fu­,,. con un companimiento endosómico tardío o entre sf formando los endosomas

\1 final de la vía, los endosomas tardios se convterten en lisosomas como conse-J l<tnto de su fusión con lisosomas preexistentes como de su progresiva acidifica­

fll(ura 13-56).

· cuerpos multivesiculares contienen aquellas prOLefnas de membrana endocitadas ,, rle degradarse. Como parte del proceso de clasificación de protefnas, los receptores .du., a degradación, como los receptores EGF ocupados que se han descrito, se con­'1 de forma específica en las membranas que invaginan en los cuerpos mullivesícula­, . .,te modo tanto los receptores como cualquier molécula de señalización unida

,,,mente a ellos será accesible en su totalidad a las enzimas digestivas, que la degra­l l~ruTa 13-57). Además de las protcfnas de membrana endocitadas, los cuerpos mul-

membrana plasmática

~ \ 1 o o o \ / s:]

endosoma H ~-Yo ~ temprano -~. -.....

l -¡ " o-TRANSPORTE J - cuerpo red del MEDIADO POR ~¡ multivesícular trans MICROTÚBULOS

1 Golgi

._ microtúbulo

endosoma ~ tardlo

l endollsosoma ~

' lisosoma o

dictiosoma O,S¡¡m

Figura 13-55 Electromicrografla de un cuerpo multivesicular de una célula vegetal. La gran cantidad de membrana In tema será entregada a la vacuola, el equivalente vegetal allisosoma, para su degradación.

Figura 13- 56 Detalles de la vla endodtica que va desde la membrana plasmática hasta los lisosomas. La maduración de los endosomas tempranos a tardíos tiene lugar a través de la formación de los cuerpos multivesiculares, que contienen grandes cantidades de membrana Invaginada y veslculas internas (de ahí su nombre). Los cuerpos multivesiculares se desplazan hacia el interior a lo largo de microtúbulos, mientras forman vesículas de transporte que reciclan componentes a la membrana plasmática. Se transforman gradualmente en endosomas tardíos, bien mediante fusión unos con otros o bien fusionándose con algunos endosomas tardíos preexistentes. Los endosomas tardíos ya no envían vesículas a la membrana plasmática.

796 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

Figura 13-57 Secuestro de proteínas endocitadas en las membranas internas de los cuerpos multivesículares. Finalmente, las proteasas y las llpasas de los lisosomas dig1eren la totalidad de las membranas internas en los cuerpos multivesiculares formadas por invaginaciones. Los procesos de invaginación son esenciales para conseguir la completa digestión de protelnas de membrana endocitadas: por ejemplo, dado que la membrana exterior del cuerpo multivesicular se mantiene formando un continuo con la dellisosoma, las hidrolasas lisosómicas no pueden digerir los dominios dtosólicos de las protefnas transmembrana, como el receptor de EGF que se muestra, si no se encuentran en las vesfculas Internas.

tivesiculares también contienen la mayoría del contenido soluble de los endosomas tem­pranos destinado a los endosomas tardíos y a su digestión en los lisosomas.

La clasificación hacia las vesículas internas de los cuerpos multivesiculares requiere de una o más etiquetas de ubiquilina, que se añaden en las regiones citosólicas de las proteínas de membrana. Estas etiquetas ayudan en primer lugar a dirigir las proteínas hacia las vesí­culas recubiertas de clatrina. Una vez entregadas en la membrana endosómica, las etiquetas de ubiquilina son de nuevo reconocidas por una serie de proteínas citosólicas, denominadas ESCRT-0, -/, -1! y -ll/, que se unen secuencialmente pasando la carga de un complejo al siguiente y por último participan en el proceso de clasificación de las proteínas hacia las vesículas internas en los cuerpos multivesiculares (Figura U~-58) La invaginación de mem­brana en los cuerpos muJtivesiculares también tlepende de una quinasa de lfpidos que fos­forila fosfatidilinositol produciendo PI(3JP. que es utilizado como sitio de anclaje adicional de los complejos ESCRl; para poderse unir a la membrana endosó mica estos complejos re­quieren tanto P)(3)P como la presencia de moléculas carga ubiqultinizadas. !Jna segunda PI quinasa añade otro grupo fosfato a Pl(3)P y produce PI(3,5)P2, requerido por ESCRT-111 para

endosomas tempranos

, ubiquitina l

1 SEPARACIÓN t (SECUESTRO)

proteasa llsosómica ~

endosoma tardfo o ltsosoma

,. •

lisosoma

cuerpo multivesícu!

•

•

\ /

1

\ ESCRTII ESCRT-1 ESCRT·O ESCRT-1 ;. l ~ y(2 J

ESCRT-111

CITOSOL

carga

PI(3,5)P2

~

membrana endosómica

Figura 13-58 Clasificación de las protefnas de membrana endocitadas en las vesículas internas de un cuerpo multivesicular. Una serie de complejo fenómenos de unión pasan las protefnas carga ubiquitinízadas de uno a otro complejo ESCRT y las concentran en las áreas de membrana que se invag desde el citosol hacia ellumen del endosoma formando las vesículas de membrana internas del cuerpo multiveslcular. Los complejos ESCRT son solu el cltosol y son reclutados por las membranas cuando son necesarios. En primer lugar, ESCRTO se une tanto a la ubiquitlna unida a ia proteína carga grupo de cabeza del P1(3)P. ESCRT-0 se separa de la membrana pasando la protelna cargada sobre ESCRT-1. A continuación ESCRT-1 se disocia, cediendo proteína cargada al complejo ESCRT·II; ai final, ESCRT-11 se disocia y el complejo ESCRT-111 se une a la membrana. A diferencia de ESCRT-0, -1 y -11, ESCRT une de forma directa a la proteína carga ubiquitinizada. Por el contrario, se cree que su polimerización en estructuras multiméricas confina la carga ln específicas de membrana que entonces se invaginan, dejando a los componentes ESCRT en la superficie de la membrana endosómica. Una AAA-ATPaw (cilindros rojos) despolímeríza los complejos ESCRT-111 para que puedan ser reutilizados.

NSPORTE HACIA EL INTERIOR DE LA CtLULA DESDE LA MEMBRANA PLASMÁTICA: ENDOCITOSIS 797

11.1r grantles complejos mullíméricos en la membrana. Se desconoce cómo el ensambla­. los complejos F..SCRT produce en último lugar la invaginación de membrana y la se­uón de las vesículas internas, ya que los complejos ESCRT no forman parte de las

l•hranas que invaginan.

1 a~ células muta mes con déficit de función F..SCRT tienen deficiencias de señalización. lils células, los receptores activados no pueden ser inhibidos mediante endocitosis ni

•.u¡uetados en cuerpos multivesiculares por lo que la señal es más prolongada, lo que lt- producir una proliferación descontrolada y cáncer.

1 .1 misma maquinaria ESCRT que dirige la vesiculación interior en la membrana del en­rna temprano formando los cuerpos multivesiculares es utilizada por el virus HJV. el , 1 hola y otros virus recubiertos, para vesicular desde la membrana plasmática al es­' t·xtracelular. Los dos procesos son equivalenres desde el punto de vista topológico, ya ·11 ambos casos se trata de la fonnación de vesículas desde la superficie citosólica de la luana (Figura 13-59).

·transcitosis transporta macromoléculas a través de monocapas células epiteliales

"'"receptores de superficie de las células polarizadas epiteliales transportan específi­·nw moléculas de un espacio extracclular a otro mediante transcitosls (Figura 13-60).

"'ceptores son endocitados y siguen una ruta que va desde los cndosomas hacia un rdo de membrana diferente (véase Figura 13-52). Por ejemplo. las ratas recién nacidas ~>·n anticuerpos de la leche materna (que les ayudan a protegerse de las infecciones)

r•ortándolos a través de su epitelio intestinal. FJ lumen del intestino es algo ácido: a qu rH, los anticuerpos de la leche se unen a receptores espec(ficos de la superficie .thsortiva) de las células epiteliales del intestino y son imemalizados a través de de-

dominio basolateral de la membrana plasm~tica

endosoma temprano

FLUIDO EXTRACELULAR -----.....

endosoma de reciclaje

veslcula de transporte de transcrtosls

veslcula de transporte

t

(

\ veslculas de transporte d ··~;d•J•

\

dominio apical de la membrana plasmatica

\

CITOSOL

~ o partlcula viral

Figura 1 3-59los complej os ESCRT en la

formación de los cuerpos multivesiculares

y la vesiculación viral. En los dos procesos

topológicamente equivalentes indicados por las flechas, los complejos ESCRT

deforman las membranas en yemas que protuyen desde el cítosol.

Figura 13-60 El papel que desempeñan los endoso mas de reciclaje en la t ranscitosis.

Los endoso mas de reciclaje son u na estación de paso en la vía transcitótica. En el ejemplo

mostrado, un receptor de anticuerpos de una célula Intestinal se une al anticuerpo y es

endocitado, transportando finalmente el

anticuerpo hasta el dominio basolateral de la membrana. El receptor se denomina receptor Fe porque se une a la región Fe del

anticuerpo (descrito en el Capitulo 25).

798 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

célula no estimulada

receptor de insulina

l

transportador de glucosa

;¡lmacen intracelular de transportadores de glucosa en endosomas de reciclaje especializados

célula estimulada con insulina

insulina

la señal provoca la migración de los receptores de glucosa en la membrana pl;¡smatica, aumentando notablemente 1;¡ captación de glucosa por la célula

presiones y de vesículas revestidas de clatrina; al final, son transferidos a los endosomas tempranos. Los complejos permanecen intactos en los endosomas y se recuperan en vesí­culas de transporte que se fusionan con el dominio basolareral de la membrana plasmática. Al ser expuestos al pi I neutro del fluido extracelular, los anticuerpos se disocian de sus re­ceptores y entran en el torrente circulatorio de las crías.

La vfa transcitótica que va desde los e ndosomas tempranos hasta la membrana plasmática no es directa. En primer lugar, los receptores se desplazan desde los endoso­mas tempranos a un compartimiento endosó mico intermedio. el endosoma de recicla­je descrito (véa~e Figura 1 3-60). La gran variedad de rutas que pueden seguir los diferentes receptores a partir de los endosomas implica que, además de los lugares de unión para sus ligandos y de los lugares de unión para las depresiones recubiertas, mu­chos tipos de receptores también tienen señales de clasificación que los guían hacia el tipo apropiado de vesícula que parte del endosoma y lo transporta hacia la membrana diana apropiada en la célula.

Una propiedad única de los endoso mas de reciclaje es que las células pueden regular la salida de las proteínas de membrana desde el compartimiento. De este modo. las células pueden ajustar a sus necesidades el llujo de proteínas a través de la ruta transcitótica. Aw1que los mecanismos son inciertos, esta regulación permite a los endosomas de reciclaje desempeñar un papel importante en el conrrol de la concentración de determinadas pro­teínas de membrana. Por ejemplo, las células grasas y las musculares contienen acumula­ciones intracelulares importantes de transportadores de glucosa que son responsables de la captación de glucosa a través de la membrana plasmática. Estas protefnas de transpone de membrana son almacenadas en endoso mas de reciclaje especializados hasra que la hormo­na insulina estimula que la céluJa incremente su captación de glucosa. En respuesta a la se­ñal de insulina. las vesfculas de transpone emergen con rapidez desde los endosornas de reciclaje y entregan un gran número de transportadores de glucosa a la membrana plas­málica, incrementando en gran medida la velocidad de captación de glucosa por la célula (Figura 1~1).

las células epiteliales tienen dos compartimientos endosómicos tempranos distintos pero un solo compartimiento endosómico tardío común

En células epiteliales polarizadas, la endocitosis ocurre tanto en el dominio basolateral de la membrana plasmática como en el dominio apical. El material endocitado en cada dominio entra primero en un compartimiento endosómico temprano único en cada uno de los do­minios específicos. Este fenómeno permite que los receptores endocitados sean reciclados a su dominio original de membrana, a menos que contengan señales de clasificación que les obliguen a transitar al otro dominio. Las moléculas endocitadas desde cada dominio que no son recuperadas en los endosomas tempranos son transportadas a un compartimiento en­dosómico tardío común, situado cerca del cen tro de la célula, y acaban siendo degradadas en los lisosomas (Figura 1~2).

Figura 13-61 Almacenamiento de protetn•·\ de la membrana plasmática en los endosomas de recídaje.los endosomas e reciclaje pueden actuar como un almacén intracelular de protefnas de membrana especializadas, permitiendo su rápida movilización cuando sean necesarias. En el ejemplo que se muestra, la unión d insulina al receptor de insulina activa una v de señalización que causa la rápida inserdón de los transportadores de glucosa, en la membrana plasm~tica de una célula ad1po o muscular, e incrementa en gran medida IU

captación de glucosa.

NSPORTE HACIA EL INTERIOR DE LA CÉLULA DESDE LA MEMBRANA PLASMÁTICA: ENDOCITOSIS 799

l. . .

dominio '<!> apical de la - r. membrana plasmática

endosoma temprano

' basolateral ® 1

,-~ -

dominio basolateral de

1 1a membrana plasmátiCa

lísosoma

núcleo

espacio extracelular

llt'cho de que las células tengan unos cuantos endoso mas rardfos conectados o mu­ck-;conectados parece depender del tipo celular y del estado fisiológico de la célula.

··n el caso de muchos otros orgánulos de membrana. Jos endosomas del mismo tipo ulusionarse unos con otros (en un ejemplo de la fusión homotípica descrita anterior­

' generar grandes endoso mas conectados.

lli·h ingieren fluidos. molecula.s y parcfculas por endocitosis: determinadas regmnes de la ·¡ ''"plasmática se imlflginan y se desprenden formando t1esfculas endocfticas. Por lo gene­Itas de las partfculas y moMculas endocitadttS acaban e11 los lisosomas. donde son de­', l.n endocitosis tiene lugar tamo constit111il'amente como en respuesta a se1iales extmce-1 ttf!ndocitosis es tan frecuente en muchas células que cada llora es imemalizada wwfrac­... rumte de la membrana p/(lsmática.. l.ns céluiltS mamienen su tammio porque la mayor! a 'llfJOnentes de la membrana plasmática (protefnas y lfpidos) son de11ueltos de forma con­'' wperjicie celular por exocitosis. Este gran ciclo endocítico-exocítico está mediado sobre> .!<'presiones y t'I!S(culttS re/lestidas de clmrina.

, lms receptores de la superficie celular que se unen a determinadas macromolécula..~ •lilres son marcadas con ubiqultina y son guiarlas llacialas depresiones reuestidas rie c/a­" lo tanto, estos receptores y sus ligandos son illlemaliuLdos de forma eftcieme en ,,eslcu­l•ll'rtas de clatrina. un proceso denominado endocitosis mediada por receptor. Las Tl'l'l!Stidas pierden rdpidameme su cubierta de clatrina y se fttSiOIWII con/os endoso mas

"''')'Orla de los ligandos se separan de SttS receptores en el ambieme dcido de los endosomas •·n los lisosomas, mientras que la mayor fa de receptores son reciclaiÚJs a la superficie celu­rt rPutiliuición mediallle vesfculo.s de rraasporte. Sin embargo, los complejos receptor-li­

.. vlen seguir otras rutas destú! el compartimiento endosómico. En algunos casos tamo el omo el ligando acaban degradándose en los /isosomas, dando lugar a la inhibición del re-

, •·stos casos, los receptores etiquetados con ubiquitino reclutan varios complejos ESCRT, '1'1/la invaginación y separación de veslculas endosómicas en la formación de los cuerpos , u lares. En otros casos, tanto el receptor como el ligando son trartSferidos a un dominio de

•-"''"•lllfl plasmática diferente de aquel en que se originó: es el proceso llamado transcitosis. La

rmnscitosis incluye endosomas de reciclaje, que almacenan las proteínas de membrana ,._...u,, ''hasta que sean necesarias.

Figura 1 3~2 Dos compartimientos endosómicos tempranos distintos en una célula epitelial. Los dominios basolateral y apiCal de la membrana plasmática se

comunican con distintos compartimientos endosómicos tempranos. Sin embargo, las moléculas endocitadas en ambos dominios que no tienen señales para su reciclaj e o transcitosis se encontrarán en un compartimiento endosómico tardfo común antes de ser digeridas en los lisosomas.

800 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

TRANSPORTE DESDE LA RED DEL TRANS GOLGI HASTA EL EXTERIOR CELULAR: EXOCITOSIS Después de considerar el sis tema digestivo interno de la célula y los diversos tipos de tráfico de membranas que convergen en los lisosomas, la descripción se centrará en el complejo de Golgi y las rutas secretoras que conducen al exterior celular. Normalmente, las vesfculas de transporte destinadas a la membrana plasmática abandonan la red del rrans Golgi (TGN: trans Go/gi network) manteniendo un nujo constante en fonna de túbulos de formas irregu­lares. Las proteínas de membrana y los lfpidos de estas vesículas aporran nuevos compo­nente a la membrana plasmática celular, mientras que las protefnas solubles de estas vesículas son secretadas al espacio extra celular. La fusión de las vesfculas con la membrana plasmática se llama exocltosis. lJe esta forma. por ejemplo, las células producen y secretan la mayorfa de los proteoglucanos y glucoprotefnas de la matriz extrncelular, como se descri­be en el Capírulo 19.

Todas las células necesitan esta ruta secretora constitutiva, que funciona constante­mente. No obstante, las células especializadas en la secreción disponen de una segunda ru­ta secretora en la que las proteínas solubles y otras sustancias se almacenan primero en vesfculas de secreción y más tarde son segregadas. Es la ruta secretora regulada, que se en­cuentra sobre todo en células especializadas en secretar rápidamente productos cuando son necesarios -como hormonas, neurotransmisores o enzimas digestivas (Figura 13-63). En esta sección, consideraremos el papel del complejo de Golgi en estas dos nnas de secreción y compararemos los mecanismos que intervienen en amba'i.

Parece que muchas proteínas y lípidos son transportados automáticamente desde el ER y desde el complejo de Golgi hasta la superficie celular

Una célula capaz de realizar una secreción regulada tiene que separar al menos tres tipos de proteínas antes de abandonar en la red del trans Golgi las destinadas a los lisosomas (vía endoso mas), las destinadas a las vesfrulas de secreción y las destinadas a ser descargadas inmediatamente en la superficie celular (Figura 13-64). Ya se ha señalado que las protefnas destinadas a los lísosomas son seleccionadas para ser empaquetadas en vesículas de trans­porte espedficas (con manosa S-fosfato en el caso de las hidrolasas lisosómicas); parece que otras señales análogas a éstas dirigen a las protefnas de secreción al interior de las vesí­culas de secreción. La vía de secreción constitutiva no selectiva transporta la mayoría de

protelnas recién sintetizadas, para su secreción constitutiva

complejo de Golgi

CITOSOL\ ESPACIO EXTRACELULAR llpidos de membrana '\. plasmática recién '-

sintetizad';) ~ / 1 , . r~,,, / fUSIÓn de , ""'

~/. membranas \... \

proteínas de membrana plasmática

recién sintetizadas

--/ vi a de señalización

Intracelular

\ ___ •

VIA DE SECRECIÓN CONSTITUTIVA

membrana plasmAtica

señal de t1p0 hormonal o de neurotransmisor

VIA DE SECRECIÓN

REGULADA

l_ _ RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO

ENDOSOMA TARDIO

[l LISOSOMA

GOLGI

1 jll ENDOSOMA TEMPRANO

VESÍCULAS DE SECREC

EXTERIOR DE LA CELULA

Figura 1 3-63 l as vfas de secrec.ión regu y constitutiva . . ACAG. Las dos vías d111t!r en la red del crans Golgi. La vfa de secr constrtutiva estA presente en la totalidad las células. Muchas protefnas solubles son secretadas continuamente por la célula o través de esta via, que también nutre d 11

membrana plasmática con proteínas y 1 recién sintetizados. Las células especial en la secreción también disponen de uno de secreción regulada, mediante la cual determinadas proteínas de la red dellfo, Golgi son conducidas en vesículas se<H! en las que las protefnas son empaquet y concentradas hasta que una determlr señal extracelular estimula su secre<ión La secreción regulada de pequeñas molkulas, como la histamina, tiene lug~ de forma similar; estas moléculas son transportadas activamente desde el clt hasta vesículas de secreción ya form. da En esta área, a menudo forman complejO) con determinadas macromolkulas (proteoglucanos en el caso de la histan de manera que pueden ser almacenad~ grandes cantidades sin producir una pt

osmótica excesivamente elevada.

'tAN S PORTE DESDE LA RED DEL TRANS GOLGI HACIA EL EXTERIOR CELULAR: EXOCITOSIS 801

mezcla de protefnas clasificación

red del cis Golg1 cis

comple¡o de Golgi

1 DIRECCIONAMIENTO MEDIADO POR UNA SEÑAL HACIA LOS LISOSOMAS

(_,

• /,\¡ /

3 VIA DE SECRECIÓN CONSTITUTIVA

membrana plasmática

CITO SOL

DIRECCIONAMIENTO MEDIADO POR UNA SENAL HACIA LAS VES(CULAS DE SECRECIÓN (PARA LA SECRECIÓN REGULADA)

1:1. protefnas dirigidas a la membrana celular. Dado que la entrada en esta ruta no re­nmguna señal panicular, también se denomina vía por defecto. Asf. parece que en 110 polarizadas, taJes como las células de la serie blanca de la sangre o lo~ fibroblas­

'llquier protefna dellumen del complejo de Golgi es automáticamente arrastrada por un~titutiva a menos que sea devuelta de forma específica aJ ER, retenida como pro­.idente en el propio complejo de Golgi o seleccionada para las rutas que conducen

wrión regulada na los Jic;osomas. En células polarizadas, en las que se han de trans­tntos productos a diferentes dominios de la superficie celular, las opciones son más

·~.:t\.

vesículas secretoras emergen por gemación desde la red rtans Golgi

u la~ q ue están especiaJizadru; en secre1ar rápidameme algunos de sus productos en ta a una serial, concenlran y almacenan estos productos en vesículas secretoras (de­•. las gránulos de secreción o L'esfculas de nlic/eo denso porque se observan núcleos ' :~ando se miran al microscopio electrónico). Las vesfculas secretoras se forman a ··1;1 red del tmns Golgi y liberan su contenido al exterior celular en respuesta a una se­' • ilica. El producto secretado puede :.er tanto una molécula pequer1a (como la hista-

11110 una proteína (una hormona o una enzima <ligesdva). pro tema& destinadas a lal> vesículas de ~ecreción (a menudo denominadas proteí­

., rc>ción) son empaquetadas en ve~ículas adecuadas en la red deltrans Golgi. En es­¡larece que el mecanismo implica la agregación selectiva de las proteínas de

n• Estos agregados electrodensos pueden verse al microscopio electrónico en ellu­l.t red deltmns Golgi. Se desconoce cuál es la señ.aJ que dirige a las proteínas de se­

' .Jl'Stos agregados, pero parece que es una zona señal que se prc~cnta en muchas .,. de esta clase. Si un gen que codifica una protefna secretora es expresado artifi­IW en una célula secretora de otro tipo. que por lo general no fabrica esta protefna,

11.1 extraña se empaqueta de manera apropiada en vesículas de secreción. Esta ob­" demuestra que aunque las protc(nas que exprel>a y empaqueta una célula deter­·1111 diferentes, todas las pro tefnas contienen secuencias comtmes de clasificación

í.lll t.le forma correcta incluso cuando las proteínas se expresan en células que ha­ntr n o las producen.

n¡~<>Co se conoce cómo se segregan los agregados de las protefnas de secreción en las > ~l'cretoras. Las vesículas de secreción contienen proteínas de membrana especia-11•.ts de las cuales pueden actuar como receptores uniendo el material agregado en la !to~us Golh.¡· No obstante, los agregados son demasiado grandes para que cada molé-1,, protema secretada pueda unirse a su propio receptor, como se propone para el ,,. de enzimas lisosómicas. La captura de los agregados en las vesículas de secreción parecer más a la captación de partículas por fagocitosis en la superl'icie celular, membrana plasmática se cierra envolviendo grandes estructuras.

Figura 13-64 los tres procesos mejor conocidos de clasificación de proteínas en la red del trans Golgi. {1) Las protelnas marcadas con manosa 6-fosfato (M6P) son dirigidas hacia los lisosomas (vla endosomas tardíos) mediante vesículas de transporte recubiertas de clatrina (véase Rgura 13-44). (2) las proteínas cuyas señales las dirigen hacia veskulas de secreción, son concentradas en estas vesículas como parte de una vla de secreción regulada que sólo está presente en estas células secretoras especializadas. (3) En las células no polarizadas, las protelnas que no presentan caracterlsticas especiales son transportadas hasta la membrana plasmática mediante una vfa de secreción constitutiva. Sin embargo, en las células polarizadas, las protefnas de secreción y las de membrana plasmática son dirigidas selectivamente hacia el dominio apical o hacia el dom1nio basolateral de la membrana plasmática, de forma que al menos una de estas dos rutas ha de estar mediada por una señal, como veremos más adelante

802 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

• •

··-•

Golgl

(A)

O cubierta / ..._o de el a trina

red del trans Golgi

- ' vesfcula

de secreción inmadura

- ~ vesfcula

de secreción madura

red del cis Golgi dictlosoma

(B)

CONCENTRACIÓN DE CARGA red del trans Golgl veslcula de secreción madura

Figura 13-65 Formación de las veslculas de secreción. (A) Las protefnas de secreción son clasificadas y concentradas en vesfculas de secreción mediante dos mecanismos. En primer lugar, se agregan en el ambiente iónico de la red del trons Golgl; con frecuencia los agregados aumentan su condensación a medida que la vesfcula de secreción va madurando y su lumen se acidifica. En segundo lugar, un exceso de contenido lumlnal y de membrana que está presente en las veslculas Inmaduras es recuperado mediante vesfculas recubiertas de clatrina a medida que la vesfcula de secreción va madurando. (8) E1UI electromicrograffa muestra algunas vesículas secretoras que se están formando a partir de la red del rrans Golg1 en una célula P del páncreas secretora de Insulina. Para localizar las moléculas de clatrlna, se ha utilizado un anticuerpo conjugado con esferas de oro coloidal (pvntas negros). Las vesfculas de secreción inmaduras (flecho vocfo). que contienen la protefna precursora de la Insulina (prolnsullna), contienen áreas de clatrlna. Las cubiertas de clatrina ya no se ven en las vesfculas de secreción maduras, que tienen un nucleo muy condensado (flecho relleno). (Cortesia de Lello Orcl.)

Inicialmente, la mayor parte de la membrana de las vesfculas de secreción que se han formado en la red del trans Golgi, rodean los grupos de agregados de proteínas de secreción. Estas vesículas de secreción inmaduras tienen el aspecto de cisternas de la red del trans Golgi dilatadas que se han separado del dictiosoma. A medida que la vesfculas van madu­rando. pueden fusionarse unas con otras y sus contenidos se concentran (Figuro 13-65A), probablemente como consecuencia tanto de la recuperación continua de la membrana que es reciclada hacia los endoso mas tard!os y el TGN como de la acidificación progresiva por el incremento de concentración en la membrana de la vesfcula de bombas de H' impulsadas por ATP. Es de destacar que son ATI'asas de úpo V las responsables de la acidificación de lodos los orgánulos endodticos y exocíricos (véase Figura 13-36). El grado de concentración de pro­teínas duramc la formación y la maduración de las vesículas de secreción es sólo una peque­ña pane del aumento total de concentración de entre 200 y 400 veces que presentan estas proteínas desde que abandonan el ER. Las proteínas de secreción y de membrana se concen­mm a medida que se desplazan desde el ER a través del complejo de Golgi debido al trans­porte de recuperación, retrógrado, mediado por vesículas recubiertas de COPI que las excluye (Figura 13-24).

El reciclaje de membrana es importante tanto para devolver componentes al complejo de Golgi como para concentrar el contenido de las vesfculas de secreción. Las vesículas im-

ANCLAJE FUSIÓN •

......-

Figura 13-66 Exocltosls de vesículas secretoras. La electromlcrografla muestra la liberací6n de insulina desde una ve secretora de una célula ~-pancreática. (Cortes fa de Lelio Orci, en L Orci, J-D. Vassali y A. Perrelet, Sci. A m. 256: 85-94 1988. Con permiso de Sclentífic AmeríClll\!

DESDE LA RED DEL TRANS GOLGI HACIA El EXTERIOR CELULAR: EXOCITOSIS 803

~~ptido sella!

pro-opiomelanocortina

s-au-~-t ;;- ?im&'l:? S "'§W fifl COOH

corticotropina

/ ~lípotropina

"" l (ACTH) l - t..: -a-MSH y-lipotropina fi·MSH 1}-endorfina

á~ en esta recuperación o;e forman como vesfculas recubiertas de da trina que emergen upl•rficie de las vesfculas de secreción inmaduras y pueden verse incluso sobre vesf­

dc ~ecreción que aún no se han separado del dictiosoma (véase Figura 13-658) _ Uthido a que las vesfculas madural> finales están tan densamente rellenas de compo­

la célula secretora puede descargar con rapidez grandes cantidades de material por osis en cuanto el> estimulada (Flgura l~l-

menudo las proteínas son procesadas proteolíticamente laa.ant~ la formación de las vesículas secretoras

:Kt•ntración no es el único proceso por el que se ven afectadas las protefnas secretoras tllldlda que las vesfculas secretoras maduran. Muchas hormonas polipepódicas y neum­

as! como muchas enzimas hidrol!ticas secretadas, se sinteti1.an como protefnas ..._.HI'"'~ inactivas. La proteolisis es necesaria para liberar las moléculas activas de los

Esta hidrólisis se Inicia en la red del trans Golgi y continúa en las vesfculas se-Y a veces en el fluido extracelular después de que haya ocurrido la secreción. Por muchos polipéptidos secretados tienen una prosecuencia N-termin al que es

-..nllda justo antes de la secreción, formándose la protefna madura. Asf, estas protefnas u.an como pre-proprotefnas, en las que el prepéptido consiste en el péptido señal del

f>t' elimina en el ER rugoso (Figura 12-38). En otros casos, las moléculas pepódicas ' intetizan como poliprotefnas que contienen muchas copias de una misma secuen-

amlnoácidos. En casos aún más complejos se sintetizan varias moléculas pepódicas omo partes de una sola poliprotcfn a que es la precursora de los diferentes productos los cuales son cortados de forma individual a partir de la cadena polipeptfdica !n i­misma poliprote!na puede ser procesada de formas diferentes produciendo diferen­

.. -.ldos en diferentes tipos celulares (Plgura 13-67). •r qué es tan común el procesamiento proteolftico en la ruta secretora? Algunos de los

producidos asf, como las encefalinas (neuropéptidos de cinco aminoácidos con tlvidad parecida a la morfina), son demasiado cortos en sus formas maduras para ser "'IXIrtados hacia ellumen del ERo para poder tener las señales necesarias para empa­

t•n las vesfculas secretoras. Además, en el caso de las enzimas hidrolrticas secreta­de· walqwer proteína cuya actividad pueda ser peligrosa en el interior de la célula- el

n la activación de la protefna hasta que llega a una ves!cula de secreción o hasta que secretada, proporciona una clara ventaja: evita que actúe antes de tiempo dentro

ula en la que ha sido sinteti.a~da.

vesículas de secreción esperan cerca de la membrana -.nátir~ hasta que una señal les haga liberar su contenido

cargadas, las vesículas secretoras tienen que ir al lugar de secreción, que en algunos ' encuentra alejado del complejo de Golgi. Las células nerviosas proporcionan el más extremo. Las proteínas secretoras, como los neurotransmisores (neuropépti­dt•ben ser liberados en las terminales nerviosas al final del axón, son sintelil-adas y

adas en vesfculas del cuerpo celular, donde se sitúan los ribosomas, el ER y el de Golgi. Así, han de viajar a lo largo del axón hasta alcanzar las terminales ner-

qut• pueden estar a más de un metro de distancia. Como se indicó en el Capftulo 16. lt•tnas motoras propulsan a las ves!culas a lo largo de los microtúbulos axonales,

Agur.~ 13~7 Las rutas alternativas de procesamiento de la prohonmona pro-opiomelanocortina. Los cortes iniciales son realizados por proteasas que cortan cerca de parejas de aminoácidos cargados positrvamente (Lys-Arg. Lys Lys, Arg-Lys o Arg-Arg). Mediante reacciones accesorias se obtienen los productos finales de secre<:ión. Diferentes t tpos celulares tienen diferentes tipos de enzimas. de maner.1 que el mismo precursor prohormonal puede ser utilizado para producir dtferentes hormonas peptldicas. Por ejemplo, en el lóbulo anterior de la pituitaria a partir de la pro-opiomelanocortma sólo se producen la corticotroptna (ACTH) y la ~-hpotropina, mientras que en el lóbulo intermedio se producen principalmente la honmona estimuladora de los a-melanocitos (a-MSH),

la y-lipotropina,la Ji-MSH y la Ji-endorfina

804 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

(A) L.___j 5¡¡m

(B)

cuya orientación unifonnc gufa a las vesículas en el sentido apropiado. Los microtúbulos también guian a las vesfculas hacia la ~uperficie celular en la exodtosis constitutiva.

Mientras que las vesfculas que contienen materiales para überación constitutiva se fu­sionan con la membrana plasmática en cuanto la alcanzan, las ve~fculas de secreción de la vfa regulada esperan cerca de la membrana hasta que la célula reciba una serial de secreción y entonces se fusionan. A menudo la señal es un mensajero químico, como w1a honnona, que se une a los receptores de la superficie celular. La activación de estos receptores genera seriales intracelulares, que a menudo incluyen un incremento transitorio de la concemra­ción de Ca2• libre en el citosol. En el ca<;o de las terminales nerviosas, nonnalmcnte la señal inicial para la exocitosis es una excitación eléctrica (un potencial de acción) que se ha produ­cido por la unión de un transmisor qufmico a los receptores de la superficie celular. Cuando el potencial de acción llega a las tcnninales nerviosas, provoca wm entrada de Ca2• en el ter­minal axónico a través de canales de ea2• dependientes de voltaje. La unión de iones Ca2+ a sensores especfflcos activa la fusión de las vesfculas secretoras (denominadas vesfculas si­nápticas) con la membrana y libera su contenido al espacio cxtracelular (véase figura 11 ·35).

La velocidad de liberación del transmisor (que sólo tarda milisegundos) indica que las proteínas que intervienen en la reacción de fusión no necesitan reorganizacione~ complejas ni muchas etapas. Después de que las vesfculas se han anclado a la membrana plasmática presináptica, son cebadas, lo que la!> deja preparadas para la fusión rápida. Las SNARI:. pue­den estar parcialmente aparcadas, pero sus hélices no están aún por completo enrolladas en la estructura de haz de cuatro hélices que se precisa para la fusión (véase Figura 13-18). Se cree que otras proteínas impiden que las S:"JARE completen la fusión hasta que el flujo de calcio elimine el bloqueo. En una sinopsis llpica, parece que sólo unas cuantas ve~fculas es­tán cebadas y listas para exocitosis. La utilización de unas cuantas vesículas a la vez permite a una sinapsis disparar una y otra vez en rápida sucesión. Con cada disparo, &on cebadas nuevas vesiculas sinápticas, que reemplazan a las que ya se han fusionado y han liberado su contenido.

La exocitosis regulada es una respuesta localizada de la membrana plasmática y del citoplasma subyacente

La histamina es una pequeiia molécula segregada por las células cebadas. Es liberada me­diante la ruta regulada en respuesta a ligandos espedficos que se unen a los receptores de superficie de la célula cebada (véase Figura 25-27). La histamina provoca muchos de los sín­tomas desagradables que acompañan a las reacciones alérgicas, tales como el prurito o los estornudos. Cuando las células cebadas se incuban en un medio que conúene un estimu­lante soluble, se observa una cxocitoc¡is masi\'a por toda la superficie celular {Figura 13-M).

Sin embargo, sí el ligando estimulante se une a un lecho sólido de forma que sólo pueda in­teractuar con una región localizada de la superficie de la célula cebada, la exocitosis queda restringida a la región en la que la célula está en contacto con el ligando {Flgura J 3-69).

Este experimento demuestra que respecto a la exocitosis regulada, algunas regiones in­dividuales de la membrana plasmática pueden responder de fonna independiente. Como resultado de ello la célula cebada, a diferencia de una célula nerviosa, no responde como un

Figura 1 3~ Electromlcrografías que muestran el proceso de exocitosls en las células cebadas de rata. (A) Célula cebada no estimulada. (B) Esta célula ha sido estimul"da por un l1gando extracelular soluble a secrt:tar la histamina que acumulaba. Las vesículas que contienen h1stamina aparecen oscur'ls, mientras que las que la han liberado son claras. El material que queda en las vesículas vacías consiste en una red de proteoglucanos a la que por lo general se halla unida la h1stamlna almacenada .. Cuando la vesícula secretora se ha fusionado con la membrana plasmática, la membrana de la veslcula secretora actúa normalmente como diana a la cual se unen otras vesiculas de secreción. As1, la célula de (B) presenta grandes cavidades delimitadas por las membranas fusionadas de muchas veslculas secretoras vaclas, que ahora se hallan en continuidad con la membrana plasmática. Esta continuidad no siempre es visible en el plano del corte realizado a través de la célula. (De D. Lawson, C. Fewtrell, B. Gomperts y M. Raff.J.Exp.Med.142:391-402,1975. Con el permiso de The Rockefeller Universlty Press.)

nucleo

..

superficie reg1ón de exocitosis

Figura 13-69 La exocitosis como resput localizada. Esta electromicrografla m una célula cebada estimulada a segrcg histamina por un estimulante acoplado • amplia esfera sólida. La exocitosis se N producido únicamente en la región de 11 célula que se halla en contacto con esta superficie. (De D. Lawson, C. Fewtmll y M J. Ce// Biol. 79:394-400, 1 978. Con el per de The Rockefeller University PressJ

DESDE LA RED DEL TRANS GOLGI HACIA EL EXTERIOR CELULAR: EXOCITOSIS

1Ddc1 cuando está estimulada; la activación de los receptores, las señales intracelular~ re­.. .atantes y la exocitosis posterior están localizadas en la región particular de la célula que

sido excitada. De manera similar, esta exocitosis localizada permite a un linfocito asesino :retar las protemas que inducen la muerte celular sobre una única célula infectada con

l~isión sin dañar a las células vecinas (véase Pigura 25-46).

componentes de membrana de las vesículas de secreción rápidamente recuperados desde la membrana plasmática

una vesícula secretora se fusiona con la membrana plasmática, su contenido se ~·arga desde la célula por exocitosis y su membrana pasa a formar parte de la membra­

plasmática. Este hecho podría incrementar notablememe el área de la superficie de la -.,hrana plasmátíca, pero sólo ocurre de forma transitoria ya que es constante la elirni­

de componentes de membrana de la superficie celular mediante endocitosis; este es por lo meno~ tan rápido como lo ha sido el de adición de componentes por exo­

un proceso reminiscente del ciclo de exocitosis-endocitosis descrito. La hipótesis probable es que después de su recuperación desde la membrana plasmática, las pro­

de membrana de la vesfcula secretora son o bien recicladas o bien dirigidas hacia los ._."'"S para su degradación. La cantidad de membrana vesicular que se añade te m po­

a la membrana plasmática puede ser enorme: cuando una célula acinar del pán­es estimulada a secretar sus enzimas digestivas, en la membrana plasmática apical

•rea de la cual es de sólo 30 pm2) se insertan alrededor de 900 pm2 de membrana vesi-

Así pues, el control del tráfico de membrana desempeña un papel importante en la -.nposición de las diferentes membranas celulares. Para mantener constante el tanmno de

uno de los compartimientos de membrana en las vías secretora y cndocitica, el equili­entre los flujos de membrana anterógrado y retrógrado debe estar controlado linamen-

Para que las células crezcan, el flujo anterógrado tiene que ser mayor que el retrógrado, de que la membrana aumente de superficie. Para que las células mantengan un tamaño

._tan te. los flujos anterógrado} retrógrado han de ser iguales. Aún conocemos muy poco los mecanismos que controlan estos flujos.

os procesos de secreción regulada permiten aumentar membrana plasmática

de las funciones importantes de la exocitosis regulada es la de aportar más membrana aumentar la superficie de la membrana plasmática celular cuando sea necesario. Un

espectacular es la expansión de membrana que se produce en el proceso de cclula­del embrión de mosca, que inicialmente es una sola célula con cerca de 6000 nú­

rodeados por una tínica membrana plasmática. En pocas decenas de minutos el es convertido en el mismo numero de células que de núcleos. Este proceso de ce­

llrtzación reqtúere una enorme cantidad de nueva membrana plasmática, que es añadida una cuidada y ordenada fusión de vesfculas que de inmediato forma la membrana plas­

que rodea las células. Fenómenos de fusión similares a éste son necesarios para au­la membrana en los anillos de constricción de células de animales y plantas durante

lltocinesis, proceso por el cual las dos células hijas se separan después de la mitosis (des­, en el Capftulo 17). La mayoría de las células, sobre todo Las que se encuenrran sometidas a estrés mecáni­

con frecuencia a lo largo de su vida pequeñas roturas de su membrana plasmáti· En un proceso sorprendente, en el que se cree que ocurren fenómenos de fusión laOúpicas vesfcula-vesfcula como de exocitosis, se forma rápidamente un tapón en la su­

celular a partir de fuentes de membrana accesibles en las proximidades, como liso­Además de constituir una barrera de emergencia frente a los escapes, este tapón

ayuda a reducir la tensión de la membrana alrededor del área de la herida permi­a la bicapa lipfdica "normal" fluir de nuevo hasta recuperar la continuidad y sellar la En la reparación de heridas, la fusión y exocitosis de vesfculas está desencadenada

incremento súbito de Ca2+ que es abundante en el medio extracelular y penetra en el de la célula en cuanto la membrana se rompe. En la Figura 13-70 se muestran tres

en los que la exocitosis permite la expansión de la membrana plasmática.

"

805

806 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

(A) ANILLO DE CONSTRICCIÓN

(B) FAGOCITOSIS

HERIDA

(Q REPARACIÓN DE HERIDAS

Las células polarizadas dirigen las proteínas desde la red del trans Golgi hasta el dominio apropiado de la membrana plasmática

La mayorfa de las células de los tejidos están polariu1das y tienen dos (y a veces más) domi­nios de membrana que son las dianas de diferentes tipos de vesículas secretoras. Aparece, pues, el problema general de cómo se organiza la salida del complejo de Golgi para que se mantengan las diferencias entre un dominio de membrana y otro. Por ejemplo, una célula epitelial típica tiene un dominio apical. que da a una cavidad interna. o al mundo externo y que a menudo tiene estructuras especiali7.adas como los cilios o los microviUi; también tiene un dominio basolateral, que comprende el resto de la célula. Los dos dominio~ están sepa­rados por un anUlo de uniones estrechas (véase Figura 19-24) que impiden que las proteínas y los lfpidos (en la monocapa exterior de la bicapa lipfdica) se desplacen entre las regiones apical y basolateral, de manera que la composición de los dos dominios de membrana es

clifereme. Una célula nerviosa es otro ejemplo de célula polarizada. La membrana plasmática de

su axón y los terminales nerviosos esrán especializados en enviar ~eñales a otras células, mientras que la membrana plasmática de su soma celular y de sus dendritas está especiali­zada en recibir señales de otras células nerviosas. Los dos dominios tienen diferente com­posición proteica. Estudios del tráfico de proteínas en células nerviosas en cultivo sugieren que, en lo que respecta a transporte vesicular desde la red del trans Golgi a la e.uperficie celular. la membrana plasmática del soma celular nervioso y de las dendritas se parece a la membrana basolateral de una célula epitelial polarizada. mientras que la membrana plas­mática del axón y de los terminales nerviosos se parece a la membrana a pi cal de esta célula epitelial polarizada (Figura 13-71). Así, proteínas que están destinadas a un dominio espe­cífico en una célula epitelial, también se encuenrran dirigidas al dominio correspondjente

en una célula nerviosa.

Diferentes estrategias direccionan selectivamente a las proteínas de membrana y a los lípidos hacia el dominio de membrana plasmática correcto

En principio las diferencias entre los dominjos de la membrana plasmática no son por ne­cesidad las consecuencia de una entrega dirigida de los componentes de membrana apro­piados. Por el comrario, los componentes de membrana podrfan ser entregados a todas las regiones de la superficie celular por un igual, para después ser estables en algunas regiones

Figura 13-71 Comparad ón entre dos tipos de células polarizadas. Teniendo en cuenta sólo los mecanismos utilizados para dirigir las proteínas hacia los diferentes dominios de una célula, la membrana plasmática del soma celular nervioso y las dendritas se parecen al dominio basolateral de una célula epitelial polarizada, mientras que la membrana plasmática de un axón y los terminales nerviosos se parecen al dominio apical de una célula epitelial. Los diferentes dominios de membrana tanto de las células epiteliales como de las nerviosas se encuentran separados por una valla molecular formada por una red de proteínas de membrana estrechamente asociadas con el cltoesqueleto de actina subyacente; esta barrera -denominada unión estrecha en las células epiteliales y cono axonal en neuronas- evita la difusión de las proteínas de membrana entre los dos dominios.

Figura 13-70 Tres ejemplos de exocitosls regulada que aumentan la superficie de la membrana plasmática. (A, B) Parece que la vesfculas que se fusionan con la membrana plasmática durante la citocinesis y la fagocitosis proceden de los endosomas, mientras que (()las que se encuentran implicadas en la reparación de heridas podrían proceder de los lisosomas. La reparación de las heridas es un proceso esencial en aquellas células que, como las células musculares, están sometidas a estrés mecánico.

dominio apical de la membrana plasmatica

elle dominio baso lateral de la membrana plasmática

c~lulas

epiteliales

termmalr\ nerviosos

"barrera• molecular

axón

dendnta>

célu•a nerviosa

NSPORTE DESDE LA RED DEL TRANS GOLGI HACIA EL EXTERIOR CELULAR: EXOCITOSIS 807

vesicula de transporte basolatera 1

vesícula de transporte apical

" '-1--t--t- 1- t t

IFICACIÓN DIRECTA DE LAS PROTEINAS MEMBRANA EN LA RED DEL TRANS GOLGI

endosoma temprano basolateral

---~

G-t.ru1JU

nucleo- ) ¡ l-1--t --t-~

(B) CLASIFICACIÓN INDIRECTA VIA ENDOSOMAS

llllildos selectivamente en otras. Aunque esta estrategia de entrega al azar seguida de ~<in selectiva o eliminación parece ser la utilizada en algunas situaciones, por lo gene­··mregas son dirigidas específicamente a los dominios apropiados de membrana. Por In. las células epiteliales secretan con frecuencia una serie de producms -como enzi­it:l'stivas o mucus en el caso de las células del intestino- por su superficie apical. y orra

d(' productos -<:o m o componentes de la lámina basal- por su superficie baso lateral. Así lr1, células han de tener mecanismos para direccionar las vesículas que contienen de­Ir! das moléculas hacia diferentes dominios de membrana.

\1 l'\aminar células epiteliales en cultivo se ha observado que las proteínas que salen dl·~tinadas hacia diferentes dominios viajan juntas hasta que alcanzan al TGN. Allí se ''y son enviadns en vesículas de secreción o de transporte hacia el dominio de mem­l•propiado (Figura 13-72).

1 membrana plasmática apicaJ de la mayoría de las células epiteliales está muy enri­d., m glucoesfingolfpidos, que contribuyen a la protección frente a la agresión de esta

l1 ll' expuesta, por ejemplo, por las enzimas cJigeslivas y el pH bajo en sitios como el in­' el estómago. respectivamente. De manera similar, las proteínas de la membrana

illla que están unidas a la bicapa lipfdica mediante un anclaje glucosilfosfaridilino-1'1 glucosy/phosphmidylinosito[) (descritas en el Capítulo 12) también se encuentran

to.to en la membrana plasmática apical. Si se utilizan técnicas de DNA recombiname tli un anclaje GPJ a una prote(na que normalmente sería transportada a la superficie lt'lal, por lo general la proteína es transportada a la superficie apical. Se cree que las t:t~ unidas a GPI son dirigidas hacia la membmna apical porque están asociadas con ocsfingolfpidos en balsas lipídicas de membrana que se fom1an en la membrana del

Como se describe en el Capftulo lO, las balsas lipídicas se forman en el TGN y en la tilna plasmática cuando los glucoesfingolípidos y el colesterol se agrupan en microa-¡, (véase Figura 10-14). Una vez han seleccionado un solo tipo de moléculas a trans­o arga), las balsas lipídicas emergen de la red del rrans Golgi en vesículas de 1tc destinadas a la membrana plasmática apicaJ. Las balsas lipídicas pueden partid­

l.• dasificación de protefnas en el TGN, de una manera similar a como ocurre con la '' ión selectiva de algunas proteínas de membrana en las balsas lipfdicas especializa-' .1\ eolas en la membrana plasmática.

proteínas de membrana destinadas a la membrana basolateral contienen seiiales ,l.t citoplasmática. Cuando se encuentran en un contexto estructural adecuado, estas 5<111 reconocidas por protcfnas adaptadoras de la cubierta que las empaquetan en 'eJe transporte adecuadas en el TGN. Las mismas sciiales basolaterales que son re­.t~ en el TGN también ftmcionan en los endoso mas reciclando las proteínas hacia la

basolateral después de haber sido endocitadas.

Figura 13-72 Dos vías de clasificación de las proteínas de la membrana plasmática en una célula epitelial polarizada. Las proteínas que están recién sintetizadas alcanzan su dominio de la membrana plasmática apropiado mediante (A) una vía directa o (Bl una vía indirecta. En la vía Indirecta una protelna es recuperada del dominio inapropiado de la membrana plasmática por endocitosis y luego es transportada al dominio correcto vía endosomas tempranos, es decir, por transcitosis. Se sabe que la vla Indirecta es la que se utiliza en los hepatocitos del hígado para entregar proteínas hacia el dominio apical, que delimita los conductos biliares. Sin embargo, en otros casos, como en las células epiteliales del intestino, se utíliza la vía directa, como se describe en el texto.

808 Capítulo 13: Tráfico vesicular intracelular

Las vesículas sinápticas pueden formarse directamente a partir de vesículas endocíticas

• • • •

• • .

Las células nerviosas (y también algunas células endocrinas) contienen dos tipos de vesfcu­las de secreción. Como en todas las célula& secretoras, estas células empaquetan protefnas y péptidos en vesfculas de secreción de contenido denso por la ruta que se utiliza habitual­mente y son liberadas mediante la vfa secretora regulada para el caso. No obstante, estas cé­lulas utilizan además otra clase especializada de pequeñas vesículas de secreción (unos 50 nm de diámetro) , denominadas vesículas slnápticas, y que se forman de manera dife· rente. En las células nerviosas. estas vesículas almacenan neurotransmisores pequeños, co­mo la acetilcolina. el glutamatO y el ácido y-aminobutfrico (GASA: gamma-nminobutiric acid), que participan en las sinapsis químicas comunicando rápidamente dos células entre sí. Como se ha descrito, cuando un potencial de acción alcanza un terminal nervioso, de­sencadena la liberación del contenido de las vesículas en una fracción de milisegundo. Algunas neuronas disparan más de 1000 veces por segundo y liberan neurotransmisores ca­da vez. Esta rápida liberación es posible porque algunas de las vesfculas están ancladas y ce­badas para la fusión, que sólo ocurrirá cuando el potencial de acción induzca el O u jo de Ca2

+

en la terminal. Sólo una pequeña proporción de las vesículas sinápticas en el terminal nervioso se fu.

sionan con la membrana plasmática en respuesta a cada potencial de acción. Pero para que el terminal nervioso responda con rapidez y de manera repetida, las vesículas han de ser re­U en a das muy rápido después de su descarga. Así pues, muchas vesículas sinápticas no se generan a partir de la membrana del complejo de Golgi en el cuerpo celular sino a partir del reciclaje local desde la membrana plasmática en los tennjnales nerviosos. Se cree que los componentes de membrana de las vesfculas sinápticas son transportados a la membrana plasmática por la vfa secretora constitutiva y después son recuperados por endocitosis. Pero en lugar de fusionarse con los endoso mas, la mayoría de las vesículas endocfticas se reUenan de inmeiliato con neurotransmisores convirtiéndose en vesfculas sinápticas.

Los componentes de membrana de las vesículas sinápticas incluyen transportadores especializados en la captación de neurotransmisores desde el citosol, donde son sintetizadas las pequeñas moléculas de neurotransmisores que intervienen en la señalización sináptica rápida. Una vez llenas del neurotransrrnsor, las vesículas vuelven a la membrana plasmática, donde esperan hasta que la célula sea estimulada. Después de que hayan liberado su con te· nido, los componentes de membrana son recuperados de la rrusma manera y son reutiliza· dos de nuevo (Figura 13-73).

Debido a que las vesfculas sinápticas son abundantes y tienen un tamaño bastante u ni· forme, es posible purificarlas en gran número, lo que las ha convertido en el orgánulo mejor caracteri7..ado de la célula. Mediante cuidadosos estudios de proteórruca cuantitativa se han identificado todos los componentes de la vesícula sináptica (Figura 13-74).

1 LIBERACIÓN DE LOS COMPONENTES DE LA VESICULA SINÁPTICA EN LA MEMBRANA PLASMÁTICA

2 ENDOCITOSIS DE LOS COMPONENTES DE LA VESICULA SINÁPTICA QUE DIREGAMENTE FORMA VESICULAS

3 ENDOCITOSIS DE COMPONENTES DE LA VESICULA SINAPTtCA Y ENTREGA AL ENDOSOMA

4 GEMACIÓN DE LA VESICULA SINÁPTICA DESDE EL ENDOSOMA

5 CARGA DEL NEUROTRANSMISOR A LA VESICULA SINÁPTICA

6 SECRECIÓN DEL NEUROTRANSMISOR POR EXOCITOSIS EN RESPUESTA A LA AGIVACIÓN CELULAR

Figura 13-73 Formación de veskulas sinápticas. Estas vesfculas, diminutas y

uniformes, se encuentran sólo en células nerviosas y en algunas células endocrinas, donde almacenan y secretan pequeñas moléculas de neurotransmisor. La Importación de neurotransmisores directamente en las pequeñas vesículas endoclticas que se forman a partir de la membrana plasmática está mediada por proteinas transportadoras de membran.1 que actúan como antiportadores, impul por un gradiente de W que mantienen t. bombas de protones de la membrana de la vesfcula.

BLEMAS

v-SNARE (sínaptobrevina)

D

u m en

·utas pueden secretar prorefnas ramo de manera constitutiva como de manera regulada. ~>que las rutas reguúulas sólo actúan en células secretoras especializadas, en todas las célu­fl· una rnta secretora constitutim que se caracteriza por un transporte uesiculnr continuo 1 J'GN a In membrana plasmática. En In u/a regulnda,las moléculas son almacenadas en ve-11' secreción o en uesfculas sindpricas, que no se fusicnan con/a membrana plasmática pam 11 contenido ltasta que reciben una señal apropiada. Las uesfculas de secreción contienen

'Id. para secreción que /tan sido rransponadas desde el TGN. Las protefnas de secreción se con­.turanre la formación y la maduración de las veslculas de secreción. Las vesfculas sindpticas, • ,,. encuentran en los terminales nerviosos y en algunas células endocrinas, se fomtan tanto

• t/e uesfculas de endocitosis como de endosomas, y permiten la secreción de moléculas pe­lt• neurotransmisores.

1• proteínas son automdticamente transferidas desde el TGN hasta la membrana plasmdtica ,fp In ruta constitutiva, a menos que sean captadas por otras rutas o sean retenidas en el 'de Golgi. En las células polarizadas, las rutas de transporte desde el TGN llasta la mem­

·lmmdtica actúan selectivamente asegurando que sean transferidos diferemes tipos de pro­¡,. membrana y de lfpidos a los diferentes dominios de la tnembrana plasmática.

809

Figura 13-74 Modelo a escala de la vesfcula sináptica. La ilustración muestra una sección a través de la vesícula sin~ptica en la que las proteínas y los lfpidos han sido representados a escala en función de su estequiometrfa y de sus estructuras conocidas o aproximadas. Sólo se han representado alrededor del70% de las proteínas presentes en la membrana; un modelo completo mostraría una membrana aún m~s densamente ocupada que el mostrado. Cada una de las membranas contiene 7000 moléculas de fosfolfpido y 5700 moléculas de colesterol. En la membrana de cada veslcula sin~ptlca se encuentran cerca de 50 tipos de proteínas Integrales de membrana diferentes que varían mucho en su abundancia relativa y que en conjunto tienen aproximadamente 600 hélices-a transmembrana. La v-SNARE slnaptobrevlna es la proteína más abundante en la vesfcula (-70 coplas/vesícula). Su naturaleza filamentosa le permite destacar y extenderse más allá de la densa capa que forman los dominios citosóllcos de las protefnas. Por el contrario, la V-ATPasa que utiliza ATP para bombear H+ hacia ellumen de la vesfcula, sólo se encuentran en 1 o 2 copias por vesícula. El gradiente de W aporta la energía para el transporte del neurotransmisor, mediante un transportador H+/neurotransmisor, que permite cargar cada vesfcula con 1800 moléculas de neurotransmisor como elglutamato, uno de los que se muestran a escala. (Adaptado de S. Takamori et al., Ce//, 127:831-846, 2006. Con permiso de Elsevier.) . ACCA

cía la cara luminal; aqueUas que se encuentran en la membrana plasmática apuntan hacia el exterior celular.

afirmaciones son ciertas? Explicar por qué si o por qué no

1 n Lodos los procesos que implican fusión de una vesfcu­membrana diana, siempre se fusionan entre sf las capas <1~ de las bicapas de la vesícula y de la membrana, como

11 las capas que no están en contacto con el citosol.

'-ólo existe un requisito indispensable para la salida de •tdna del ER: debe estar correctamente plegada.

ludas las glucoprotefnas yglucolfpidos de las membranas lt•lares tienen sus cadenas de oligosacáridos dirigidas ha-

13-4 Durante la transcitosis, las vesículas que se forman a par­tir de depresiones recubiertas en la superficie apical se fusionan con la membrana de la superficie basolateral y de este modo transportan moléculas a través del epitelío.

Resolver los siguientes problemas

13- 5 En una célula que no se divide, como la célula hepática, ¿por qué el flujo de membrana entre compartimientos debe estar equilibrado de manera que el flujo de reciclaje equilibre el flujo de salida? ¿También se producirá esta situación de equilibrio en

81 O Capftulo t 3: Tráfico vesicular intracelular

una célula que, como la célula del epitelio intestinal, se encuentra en constante división?

13-6 Las levaduras y muchos otros organismos producen un único tipo de cadena pesada de clatrina y un único tipo de cade­na ligera; así pues sólo producen un único tipo de cubierta de da­trina. ¿Cómo es posible que una única cubierta de clatrina pueda participar en tres ruras de transporte diferentes -de Golgi a en do­somas tardíos. de membrana plasmática a endosomas tempranos y de vesículas de secreción inmaduras a Colgi- en las que se transportan de forma especffica diferentes proteínas?

13-7 ¿Cómo es posible que sea cierto que las cadenas comple­mentarias de SNARE específicas sólo marquen vesículas y sus co­rrespondientes membranas diana? Después de la fusión de vesículas la membrana djana contiene una mezcla de t-SNARE y v-SNARE. Al principio, estas SNARE están íntimamente unidas. pero NSF puede separarlas, reactivándolas. ¿Qué evita que las membranas diana acwnulen una población de v-SNARE igual o superior que la de sus propias t-SNARE?

13-8 Los virus son Jos últimos "carroñeros" -una consecuencia directa de sus pequeños genomas. Siempre que es posible utili­zaJl la maquinaria celular para realizar las diferenres etapas nece­sarias para su reproducción. Muchos virus diferentes tienen cubiertas de membrana. Estos virus, denorrunados recubiertos, acceden al citosol fusionándose con una membrana celular. ¿Por qué cada uno de estos virus codifica su propia proteína de fusión en vez de aprovecharse de las S N ARE celulares?

1 3· 9 Para que se produzca la fusión de una vesícula con su membrana diana, las membranas tienen que aproximarse a me­nos de 1,5 nm de distancia, de manera que Las bicapas puedan unirse (Figura PI3-J). Asumiendo que las porciones significati­vas de las dos membranas en el sitio de fusión tienen 1,5 nm de diámetro, calcular el número de moléculas de agua que se encon­trarían emre las dos membranas. (El agua es 55,5 M y el volumen de un cilindro es nr21!.) Oado que un fosfoHpido ocupa una su­perficie de 0,2 nm2, ¿cuántos fosfoHpidos estarían presemes en cada una de las dos monocapas opuestas en el sitio de u nión? ¿1 lay suficientes moléculas de agua para unir las cabezas polares de ese número de fosfolípidos? (Se estima que hay de 10 a 12 mo­léculas de agua asociadas con la cabeza polar de cada fosfoHpido de la superficie expuesta de la membrana.)

membrana diana

membrana de la veslcula

Figura P13-1 Aproximación Intima de una veslcula y su membrana diana en preparación para la fusión (Problema 13-9).

13-10 Las proteínas SNARE existen como parejas complemen­tarias que reali.zan la fusión de membranas entre vesículas apro­piadas y sus membranas ruana. De esta forma una vesícula con

una variedad particular de v-SNARE sólo se fusionará con la membrana que contenga la t-SNARE complementaria. Sin em bargo, en algunas situaciones se producen fusiones de membra nas idénticas (fusiones homoúpicas). Por ejemplo, cuando una célula de levadura forma una yema. las vesículas que proceden dl la vacuola de la célula madre se desphv.an a la yema donde se fu sionan unas con otras formando una nueva vacuola. Estas vesf culas llevan tanto v-como t-SNARE. ¿Son ambos tipos de SNARl esenciales para estas fusiones homotfpicas?

Para evaluar este punto se desarrolla un ingenioso ensayo paru la fusión de las vesículas vacuolares. Se preparan vesículas de do\ cepas mutantes de levadura: la cepa B contiene un gen defectun so de la fosfatasa alcalina (Pase: phosp/wtase) vacuo lar; la cepa A es defectuosa en la proteasa que transfomla el precursor de lafos fatasa alcalina (pro-Pasa} en su forma activa (Pasa) (Figur• Pl3-2A). Ninguna de las dos cepas tiene fosfatasa alcalina. pt.'rll cuando los ex1:ractos de las dos cepas se mezclan, La fusión V{. . • 1

cular produce fosfatasa alcalina activa que puede ser meruda f.l cilmente (Figura Pl3-2)

Ahora se eliminan los genes de las v-o las t-SNARE vacuolafl o ambos en cada una de las dos cepas de levadura, se preparm vesfculas vacuolares de ambas y se evalúa su capacidad para ht sionarse mediante el ensayo de fosfatasa alcalina (Figuril P\3-28).

(Al cepa A e:

(B) 100

"'~ 75 e o := e ~ ·x -¡;..., ., E 50 rQ-¡¡ 10-o ~~ ....

25

o combinaciones cepa A

S N ARE cepa B vt vt

experimento 1

t t

2

V ~

ANCLAJE

FUSIÓN

t vt V V vt t vt t V vt V V t 3 4 5 6 7 B 9

Figura P13-2 Requerimientos de SNARE para la fusión de las vesfculas (Problema 13 1 O). (A) Esquema para medir la fusión de las vesículas vacuo lares. (B) Resultado de la fusión de vesículas con diferentes combinaciones de v-SNARE y t-SNARE. Las SNARE presentes en las vesfculas están marcadas como v (v-SNARE) y t (t-SNARE).

.,. puede deducir del papel de las v-y t-SNARE vacuolares flot eso de fusión de las vesfculas vacuo lares? ¿Tiene impor­

ltipo de SNARE que se encuentre en cada vesícula?

~~ '>e elimina La señal de recuperación al EH de la proteína o asomerasa (POI: protein disul.fide isomerase), que habi­ltt' es una proteína soluble residente en el. EH, ¿dónde es­

pr•ltcína POI modificada?

1~ receptor KDEL, para realizar su función de asegurar la ncn ellumen del ER de las proteínas solubles residentes

lt. tiene que desplazarse adelante y atrás entre el ER y el in de Golgi. ¿En qué compartimiento tiene que unir el re­~~ ll ·La su ligando con más intensidad? ¿En que comparti­(,, hará más débilmente? ¿Cuál es la razón que podría

r la~ diferencias de afinidad que se observan en los dos 11111ientos? Si se diseñara el sistema ¿en qué comparti­•tuarfamos la máxima concentración de receptor KDEL?

lltUs predecir que el propio receptor KDEL, que es una , transmembrana, presentaría una señal KDEL?

1 le qué forma el pll bajo de los lisosomas puede suponer I•'ITión para el resto de la célula frente a las enzimas liso-1'11 caso de una rotura del orgánulo?

l.u-. melanosomas son lisosomas especializados que al­" ptgmentos para su liberación ocasional mediante exo­

\ .uios tipos celulares como las células de la piel y las del 1ptan el pigmento, lo cual les da su coloración caracte­

. lltl'nudo, los ratones mutan tes que tienen melanosomas "os presentan colores suaves o in usuales. Uno de estos mutantes. el raton Mocltn (Figura Pl3-3l. tiene un defec­:;··n de una de las subunidades del complejo de proteínas !>t<\S AP3 que está relacionado con la formación de vesf­uhienas de clatrina en la red del trans Golgi. ¿De qué for­·•dtda de función AP3 puede provocar un defecto en los

ratón normal ratón Mocha

Pll 3 Un ratón normal y el ratón Mocho (Problema 13 14). •·· su color claro, el ratón Mocha tiene disminuido su sentido t>rio. (Cortesla de Marglt Burmeister.)

1 '.1dentes con el síndrome de 1 lunter o con el síndrome de . n<~mente superan la adolescencia. Estos pacientes acu­lucosaminoglucanos en los lisosomas pues son incapa­mtelizar las enzimas lisosómicas necesarias para su

• u~n. Cuando se fusionan las células de los pacientes de 111dromes los glucosarninoglucanos son correctamente , los, lo que indica que las células carecen de enzimas de­

diferentes. Si las células son cultivadas de forma con­'" t:apaces de corregir sus defectos. Aún más sorprendente :hu de que el medio de cultivo procedente de un cultivo h de Hurler es capaz de corregir el defecto en las células

11·1 (y viceversa). Los factores correctores presentes en el .on inactivados por acción de proteasas, por tratamiento

81 1

cun periodato que destruye los carbohidratos y por tratamiento con fosfatasa alcalina que elimina los grupos fosfato.

A. ¿Cuáles son los factores correctores? EmpCY.ando por las cé­lulas del paciente dador describir la ruta que siguen los factores hasta alcanzar el medio de cultivo y posteriormente cmrar en las células diana para corregir los defectos lisosómicos.

B. ¿Cuál es la razón que explicaría que los tratamientos con pro­teasas. periodato y fosfatasa alcalina inactiven los factores correc­tores?

C. ¿Se producirá un tipo de efecto de corrección similar si se tra­tara de enzimas citosólicas mutan tes?

13- 16 Un macrófago ingiere mediante endocitosis cada media hora el equivalente aJ 100% de su membrana plasmática. ¿Cuál es la tasa de retorno de membrana por exocitosis?

13 17 Las células ingieren moléculas extracelulares mediante endocitosis mediada por receptor y endocitosis de fase fluida. Un trabajo clásico comparaba las eficiencias de las dos vías incuban­do células humanas durante varios periodos de tiempo con un factor de crecimiento epidérmico (EGF: epidemial growthfactor) marcado con I25J, para medir la endocitosis mediada por recep­tor, o mediante peroxidasa de rábano (1 ffiP: llorseradis/1 peroxi­dase), para medir la endocitosis de fase fluida. Tanto el EGF como la 1 IRP se localizan en pequeñas vesfculas cuyo radio interno es de 20 nm. A concentraciones crecientes, la entrada de 1 IRP en las células fue lineal (Figura Pl3-4A), mientras que la de EGF fue li­neal al principio pero alcanzó un valor máximo que ya no fue su­perado a concentraciones superiores (Figura P 13-4B).

A. Explicar por qué la forma de las curvas de la Figura Pl3-4 son diferentes para 1-IRP y para EGF.

B. A partir de las curvas de la Figura Pl3-4 estimar la diferencia en las tasas de entrada entre HRP y EGF cuando ambas se en­cuentran a 40 nM. ¿Cuál sería la diferencia si ambas se encontra­ran a 40 j.!M?

C. Calcular el número medio de moléculas HHP que son incor­poradas a cada una de las vesfculas de endocitosis (radio 20 nm) cuando el medio contiene 40 !JM 1-IRP. [El volumen de una esfera es (4/3)nr·i.]

D. Los científicos que hicieron estos experimentos dijeron en su momento: "Estos cálculos demuestran claramente cómo las célu­las internalizan EGF medjante endocitosjs, excluyendo todo el medio e>.'tracelular, excepto quizás pequeñas cantidades". ¿Qué significa esta afirmación?

:a ... :; ~ ~2 tll.o "00

c::¡¡j -o~ üo ~51 a. o ~ E

E:

(A) CAPTACIÓN DE HRP

10 20 30 40

HRP en el medio ~M)

(8) CAPTACIÓN DE EGF

20

u.."" ~316 t~ ~ '& 12 "0-

:§ ~ B ~s ~ o ~E 4 vE:

o~

. . " .

20 40 60 80

EGF en el medio (nM)

Figura P1 3-4 lngesta de HRP y EGF en función de su concentración en el medio (Problema 13 17).

812 Capítulo 13:Tráfico vesicular intracelular

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