PARTICIPACIÓN DE LAS ACUAPORINAS Y CAVEOLINA -1 EN EL ...
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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES Facultad de Farmacia y Bioquímica Departamento de Ciencias Biológicas Laboratorio de Biología de la Reproducción PARTICIPACIÓN DE LAS ACUAPORINAS Y CAVEOLINA-1 EN EL DESARROLLO TEMPRANO DE LA PLACENTA HUMANA Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires Bioq. Alejandra Reca Directora de Tesis: Dra. Alicia E. Damiano Año 2018
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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Departamento de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Biología de la Reproducción
PARTICIPACIÓN DE LAS ACUAPORINAS Y CAVEOLINA-1 EN EL DESARROLLO TEMPRANO
DE LA PLACENTA HUMANA
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires
Bioq. Alejandra Reca
Directora de Tesis: Dra. Alicia E. Damiano
Año 2018
La presente tesis titulada “Participación de las Acuaporinas y Caveolina-1 en el desarrollo
temprano de la placenta humana” fue realizada por la estudiante de doctorado
Alejandra Reca en la Facultad de Farmacia y Bioquímica para optar al título de Doctora
de la Universidad de Buenos Aires, de acuerdo con la reglamentación pertinente.
Dicho trabajo fue realizado bajo la dirección de la Dra. Alicia Damiano.
Bioq. Alejandra Reca
Dra. Alicia Damiano
AGRADECIMIENTOS
A los Laboratorios de Biología de la Reproducción y Fisiopatogenia. Sin su guía y
colaboración esta tesis no se podría haber completado.
Al CONICET y a la Universidad de Buenos Aires que me formaron como
profesional y como persona.
A mis compañeros y amigos becarios que estuvieron siempre ahí, detrás de cada
acierto y cada fracaso, compartiendo el día a día.
A mis amigas de la vida y de la facultad por su apoyo incondicional todos estos
años, agradezco todos los días tenerlas en mi vida.
Y finalmente a mi familia, especialmente a mi mamá y a mi papá. Gracias por
acompañarme siempre y por transmitirme sus valores. A mis hermanas y cuñados por
el amor y la contención. A Nacho por alegrar cada uno de nuestros días. Ustedes son mi
orgullo.
Publicaciones que surgieron de resultados de este trabajo de tesis:
• Reca A, Szpilbarg N, Damiano AE. The blocking of aquaporin-3 (AQP3) impairs
extravillous trophoblast cell migration. Biochem Biophys Res Commun.
2018 May 5;499(2):227-232. doi: 10.1016/j.bbrc.2018.03.133. Epub 2018 Mar 23.
Publicaciones como co-autor durante el transcurso del doctorado:
• Castro-Parodi M, Szpilbarg N, Dietrich V, Sordelli M, Reca A, Abán C, Maskin B,
Farina MG, Damiano AE. Oxygen tension modulates AQP9 expression in human
placenta. Placenta. 2013 Aug;34(8):690-8. doi: 10.1016/j.placenta.2013.04.017.
Epub 2013 May 16.
ÍNDICE GENERAL
ABREVIATURAS 1
RESUMEN 3
INTRODUCCIÓN 7
1 FORMACIÓN DE LA PLACENTA HUMANA 7 2 ACUAPORINAS 15 3 CAVEOLAS Y CAVEOLINA-1 32 4 METALOPROTEASAS DE MATRIZ 42 5 DESÓRDENES GESTACIONALES 46 6 AQPS Y CAV-1 EN LA MIGRACIÓN E INVASIÓN CELULAR 57
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 61
MATERIALES Y MÉTODOS 63
1 CULTIVO DE LÍNEAS CELULARES 63 1.1 LÍNEAS CELULARES 63 1.2 MANTENIMIENTO Y SUBCULTIVO DE LAS CÉLULAS 64 1.3 CONSERVACIÓN DE LÍNEAS CELULARES 65 2 ENSAYOS DE VIABILIDAD Y PROLIFERACIÓN CELULAR 66 2.1 ENSAYO COLORIMÉTRICO DE MTT 66 2.2 EXCLUSIÓN DEL COLORANTE VITAL AZUL DE TRIPÁN 67 3 INHIBICIÓN DE LA FUNCIONALIDAD DE AQPS Y CAV-1 68 3.1 BLOQUEO FARMACOLÓGICO DE AQPS 68 3.2 SILENCIAMIENTO DE LA EXPRESIÓN DE AQP3 69 3.3 DISRUPCIÓN DE CAVEOLAS POR MEDIO DE METIL-Β-CICLODEXTRINA (MΒCD) 71 4 EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE ARNM 72 4.1 EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL Y OBTENCIÓN DE ADNC 72 4.2 RT-PCR SEMICUANTITATIVA 74 5 EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y SECRECIÓN DE PROTEÍNAS 76 5.1 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS 76 5.2 OBTENCIÓN Y PROCESAMIENTO DE LISADOS CELULARES 77 5.3 OBTENCIÓN Y PROCESAMIENTO DE MEDIOS CONDICIONADOS (MC) 78 5.4 ACONDICIONAMIENTO DE MUESTRAS PARA SDS-PAGE 79 5.5 SDS-PAGE 79 5.6 TÉCNICA DE WESTERN BLOT 80 6 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA 82 6.1 COLOCALIZACIÓN DE AQP3 Y CAV-1 83 7 INMUNOPRECIPITACIÓN 84 8 ENSAYOS DE MIGRACIÓN E INVASIÓN CELULAR 85 8.1 ENSAYO DE CICATRIZACIÓN DE HERIDA (WOUND HEALING) 85 8.2 ENSAYO DE INVASIÓN UTILIZANDO INSERTOS PRETRATADOS CON MEC 87 8.3 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE MMP (ZIMOGRAFÍA) 89 9 ENSAYO DE FORMACIÓN DE TUBOS SOBRE LA LÍNEA CELULAR SWAN 71 90
10 ENSAYOS DE FUNCIONALIDAD ENDOTELIAL 91 10.1 ENSAYO DE PROLIFERACIÓN CELULAR 91 10.2 ENSAYO DE CICATRIZACIÓN DE HERIDA (WOUND HEALING) 92 10.3 ENSAYO DE FORMACIÓN DE TUBOS (TUBULOGÉNESIS) 93 11 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS EXPERIMENTALES 94
RESULTADOS 95
1 EXPRESIÓN Y LOCALIZACIÓN DE AQPS Y CAV-1 EN CÉLULAS DE CITOTROFOBLASTO HUMANO 95 1.1 EXPRESIÓN DE AQP1, AQP3, AQP9 Y CAV-1 EN LA LÍNEA CELULAR SWAN 71 95 1.2 LOCALIZACIÓN DE AQP1, AQP3, AQP9 Y CAV-1 EN LA LÍNEA CELULAR SWAN 71 97 2 ROL DE LAS AQPS EN LA MIGRACIÓN DEL CITOTROFOBLASTO HUMANO 99 2.1 BLOQUEO FARMACOLÓGICO DE AQPS 99 2.2 ENSAYO DE CICATRIZACIÓN DE HERIDA 99 3 ROL DE AQP3 EN LA MIGRACIÓN DEL CITOTROFOBLASTO HUMANO 103 3.1 EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD DEL AGENTE CATIÓNICO DE TRANSFECCIÓN 103 3.2 DETERMINACIÓN DE LA EFICIENCIA DE TRANSFECCIÓN 105 3.3 SILENCIAMIENTO DE LA EXPRESIÓN DE AQP3 MEDIADA POR SIRNA 106 3.4 ENSAYO DE CICATRIZACIÓN DE HERIDA 107 4 ROL DE CAV-1 EN LA MIGRACIÓN DEL CITOTROFOBLASTO HUMANO 109 4.1 DISRUPCIÓN DE CAVEOLAS MEDIADA POR MΒCD 109 4.2 ENSAYO DE CICATRIZACIÓN DE HERIDA 111 5 PARTICIPACIÓN DE AQP3 Y CAV-1 EN LA INVASIÓN DEL CITOTROFOBLASTO HUMANO 114 5.1 ENSAYOS DE INVASIÓN 114 5.2 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE MMP POR ZIMOGRAFÍA 118 6 ESTUDIO DE LA ASOCIACIÓN ENTRE CAV-1 Y AQP3 123 6.1 COLOCALIZACIÓN DE CAV-1 Y AQP3 123 6.2 CO-INMUNOPRECIPITACIÓN DE CAV-1 Y AQP3 124 7 CAPACIDAD DE LA LÍNEA CELULAR SWAN 71 DE ADQUIRIR UN FENOTIPO ENDOVASCULAR 125 7.1 ENSAYO DE TUBULOGÉNESIS 125 8 ENSAYOS DE FUNCIONALIDAD ENDOTELIAL 127 8.1 EFECTO DE MC DE LA LÍNEA CELULAR SWAN 71 SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE EA.HY926 128 8.2 EFECTO DE MC DE LA LÍNEA CELULAR SWAN 71 SOBRE LA MIGRACIÓN DE EA.HY926 130 8.3 EFECTO DE MC DE LA LÍNEA CELULAR SWAN 71 SOBRE LA TUBULOGÉNESIS DE EA.HY926 132
DISCUSIÓN 134
CONCLUSIONES 161
PERSPECTIVAS 162
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 163
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ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
ADH Hormona antidiurética ADN Ácido desoxirribonucleico ADNc ADN copia AKT Proteína quinasa B (PKB) ANOVA Análisis de varianza AQPs Acuaporinas ARN Ácido ribonucleico ARNm ARN mensajero ATP Adenosina trifosfato BCA Ácido bicinconínico BSA Seroalbúmina bovina Cav-1 Caveolina-1 CD Ciclodextrina CEV Citotrofoblasto extravelloso hCG Gonadotrofina coriónica humana CV Citotrofoblasto velloso DAPI 4’,6-diamidino-2-fenilindol DMEM Medio esencial Dulbecco DMEM-F12 Medio esencial Dulbecco-Ham’s F12 DMSO Dimetilsulfóxido DRM Membranas resistentes a detergentes EDTA Ácido etilendiamino tetra-acético EGF Factor de crecimiento epidérmico EGFR Receptor de factor de crecimiento epidérmico EGTA Ácido etilenglicol tetra-acético EHS Engelbreth-Holm-Swarm FITC Isotiocianato de fluoresceína FGF Factor de crecimiento fibroblástico GPI Glicofosfatidilinositol GRB7 Growth factor receptor-bound protein 7 GTP Guanosina trifosfato HSP Heat shock proteins HUVEC Células endoteliales de vena umbilical humana ICAM-1 Intercellular adhesion molecule-1 LCR Líquido cefalorraquídeo LDL Lipoproteína de baja densidad LOX-1 Receptor de la forma oxidada de LDL sLOX-1 Fragmento soluble de LOX-1 MC Medio condicionado MβCD Metil-β-ciclodextrina MDCK Madin-Darby canine kidney β-ME β-mercaptoetanol MEC Matriz extracelular
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ABREVIATURAS
MMLV Virus de la leucemia murina de Moloney MMP Metaloproteasa de matriz MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difenil tetrazol PAI-1 Inhibidor del activador del plasminógeno-1 PBS Buffer de fosfatos salino PCR Reacción en cadena de la polimerasa PE Preeclampsia PI3K Fosfoinositol-3 quinasa PKA Proteína quinasa A PKC Proteína quinasa C hPL Lactógeno placentario humano PM Peso molecular PMSF Fluoruro de fenilmetil-sulfonilo PP2-A Proteína fosfatasa 2 PSA Persulfato de amonio RCIU Restricción del crecimiento intrauterino RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa SDS Dodecil sulfato de sodio SDS-PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes SEM Error estándar de la media SFB Suero fetal bovino siRNA ARN de interferencia SNC Sistema nervioso central STh Sinciciotrofoblasto SV-40 Virus del simio 40 TBE Buffer Tris Borato EDTA TBS Buffer Tris salino TEA Cloruro de tetraetilamonio TEM Transición epitelio-mesénquima TEMED Tetrametiletilendiamina TIMP Inhibidor tisular de metaloproteasas TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa TNF-R1 Receptor del factor de necrosis tumoral TRPV Receptor de potencial transitorio UV Ultravioleta VC Vellosidad coriónica VEGF Factor de crecimiento vascular endotelial VEGFR Receptor del factor de crecimiento vascular endotelial
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RESUMEN
RESUMEN
Los desórdenes gestacionales constituyen un problema de salud a nivel mundial.
Resulta evidente que entender los mecanismos fisiológicos que regulan los estadios iniciales de
formación de la placenta y establecer los factores que limitarían los mismos, nos ayudará a
dilucidar la fisiopatogenia de dichos desórdenes, con el fin de encontrar nuevas estrategias que
contribuyan a mejorar el funcionamiento placentario y lograr una gestación exitosa.
Múltiples reportes han permitido confirmar los siguientes antecedentes:
1. Las AQPs y Cav-1 modulan la migración e invasión de diversas líneas celulares y su
participación resulta crítica durante el desarrollo tumoral. Se propone que el flujo de agua
mediado por AQPs contribuiría en estos procesos de dos maneras: facilitando cambios en la
morfología e impulsando a la célula en la dirección del movimiento. La participación de Cav-
1/caveolas también ha sido estudiada ya que esta proteína puede modular vías de señalización
involucradas en la locomoción celular, cambios en su expresión modulan la migración celular y
se encuentra ligada al citoesqueleto.
2. La placenta humana es un tejido normal; sin embargo, las células del citotrofoblasto
extravelloso (CEV) comparten varias características con las células tumorales. La alta tasa de
proliferación, la falta de inhibición por contacto, la evasión del sistema inmune y la capacidad
de migración e invasión (particularmente durante el primer trimestre del embarazo) han llevado
a definir al trofoblasto como un tejido “pseudo-maligno” o una metástasis fisiológica.
3. Se observan alteraciones en la expresión o funcionalidad de estas proteínas en diversos
desórdenes gestacionales caracterizados por una remodelación superficial de las arterias
uteroplacentarias.
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RESUMEN
Bajo este escenario, la hipótesis planteada en este Trabajo de Tesis fue la siguiente:
“Las AQPs y la Cav-1 presentes en las células trofoblásticas participan en una etapa temprana
del desarrollo de la placenta, específicamente en el proceso de migración e invasión del
trofoblasto, y alteraciones en su funcionalidad conducen a desórdenes gestacionales
caracterizados por una placentación defectuosa”.
La línea celular de CEV humano Swan 71 fue sometida al bloqueo farmacológico de las
AQPs, al silenciamiento de AQP3 y a la disrupción de las caveolas. La migración celular se evaluó
por medio del ensayo de cicatrización de herida. La invasión celular se analizó realizando un
ensayo sobre insertos pretratados con matriz extracelular. La secreción de metaloproteasas
(MMP) se corroboró por medio de zimografía. Finalmente, se analizó la diferenciación
endovascular del CEV y su interacción con el endotelio de las arterias uterinas realizando un
ensayo de formación de tubos.
Nuestros resultados proporcionan evidencia de que la correcta expresión de AQP3 y la
presencia de estructuras caveolares intactas en el CEV son necesarias para la migración celular
durante la gestación temprana. Por otro lado, nuestros hallazgos confirmarían que la capacidad
invasiva de dicho tipo celular estaría mediada por AQPs, aunque sería un proceso independiente
de la isoforma. Dicha reducción en la capacidad invasiva podría atribuirse al menos parcialmente
a la reducción en la actividad de MMP-2, metaloproteasa crítica durante los estadios iniciales de
formación de la placenta.
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RESUMEN
Adicionalmente encontramos que AQP3 y Cav-1 co-localizan en la línea celular Swan 71.
Recientemente informamos que la expresión de AQP3 disminuye significativamente en
placentas complicadas por preeclampsia. Adicionalmente reportamos una disminución en la
expresión de Cav-1 y en el número de caveolas, lo que se atribuyó a alteraciones en la
composición lipídica necesaria para la formación de las mismas. Si bien las alteraciones en AQP3
y Cav-1 se evidenciaron al final de la gestación y en trofoblasto velloso, suponemos que una
expresión anómala de ambas proteínas podría tener lugar durante las primeras etapas de
diferenciación de las células madre del trofoblasto y persistir después de su diferenciación en
citotrofoblasto extravelloso y velloso afectando ambos linajes.
Finalmente demostramos por primera vez que la línea celular Swan 71 puede adquirir
un fenotipo endovascular in vitro y que la disrupción de caveolas modifica el proceso de
formación de tubos no sólo de las células endoteliales sino también de las células trofoblásticas
endovasculares. Una expresión anómala de AQPs, en particular de AQP3, y una reducción del
número de caveolas/Cav-1 originarían alteraciones durante la formación de la placenta y
podrían estar asociadas a distintas patologías, como la preeclampsia o la restricción del
crecimiento intrauterino. La preeclampsia es un síndrome caracterizado por una disminución
del flujo sanguíneo útero-placentario asociado a una invasión trofoblástica alterada que puede
conducir a hipoxia placentaria y disfunción endotelial, liberando materiales nocivos en la
circulación que originan daños en la función endotelial.
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RESUMEN
Tomando en consideración que previamente se determinó que la AQP3 y el número de
caveolas disminuye en placentas preeclámpticas y que en esta tesis demostramos que in vitro
tanto la AQP3 como Cav-1 son importantes para la correcta formación de la placenta, sería
interesante evaluar si estas proteínas están alteradas en mujeres que van a desarrollar esta
patología.
Recientemente se ha propuesto que microvesículas de trofoblasto (exosomas, cuerpos
apoptóticos) se encuentran en circulación materna desde la sexta semana de gestación. Por lo
tanto, futuros ensayos podrían orientarse a la caracterización de estas estructuras lo que
permitiría conocer “en tiempo real” qué está ocurriendo en la placenta en desarrollo.
Determinar la expresión de AQP3 y Cav-1 en microvesículas trofoblásticas durante las primeras
semanas de gestación nos permitiría corroborar si la desregulación de estas proteínas se
encuentra involucrada en la etiología de este síndrome.
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INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
1 Formación de la placenta humana
El embarazo es un proceso complejo que incluye una serie de eventos discretos
tales como la implantación, decidualización y placentación, permitiendo finalmente el
nacimiento de la descendencia por medio del parto (Figura 1.1). El éxito de cada evento
es esencial para avanzar a la siguiente etapa; sin embargo, los mecanismos celulares y
moleculares que orquestan el diálogo embrio-uterino no se conocen por completo.
La ventana de implantación constituye un tiempo limitado donde la competencia
del blastocisto debe superponerse con la receptividad del útero. La adquisición de un
estado receptivo por parte del útero se refleja en una serie de cambios celulares y
ultraestructurales: pérdida de la polaridad de las células epiteliales y formación de
microprotrusiones en la superficie apical llamadas uterodomos1. El útero está
compuesto por tres compartimentos principales: epitelio, estroma (endometrio) y
miometrio. Durante el desarrollo del embarazo, el endometrio sufre modificaciones
estructurales y funcionales dando origen a un nuevo tejido: la decidua.
La reacción de adhesión asegura la interacción entre el trofoectodermo y la luz del
epitelio, siendo este último uno de los principales reguladores de la receptividad uterina
transmitiendo señales al resto de los compartimentos. En el hombre los primeros
estadios de formación de la decidua no requieren de la presencia del blastocisto, si bien
el proceso se vuelve más robusto luego de la implantación.
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INTRODUCCIÓN
Para que la decidualización ocurra apropiadamente, se requiere de un estricto
control entre factores de transcripción, citoquinas, reguladores del ciclo celular y vías de
señalización. Si este fenómeno es aberrante, pueden originarse diversos fenotipos
adversos durante el embarazo, tales como anomalías en la placentación, restricción del
crecimiento intrauterino o preeclampsia2.
Figura 1.1| Eventos previos al desarrollo de la placenta.
Esquema representativo del útero que indica los procesos relacionados a la receptividad, implantación y decidualización. Alteraciones en estos procesos pueden provocar infertilidad. Si la implantación ocurre fuera de la ventana de receptividad, puede conducir a placenta previa, embarazo ectópico y/o preeclampsia. Esta última patología también puede ocasionarse por una invasión superficial de la decidua y/o vasos uterinos maternos. MCI: macizo celular interno. Adaptado de Cha et al. 20122.
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INTRODUCCIÓN
Puede considerarse que la placenta se forma como tal cuando las membranas
fetales entran en íntimo contacto con la pared uterina a fin de permitir el transporte de
gases, nutrientes y materiales de desecho. Sin embargo, cada especie ha desarrollado
su propia estrategia, lo que resulta en una gran divergencia en los tipos de placentación
en los mamíferos. Una diferencia principal se encuentra en el grado de invasión del
trofoblasto, que puede variar desde ausencia de invasión (placentación epiteliocorial)
hasta una invasión de alto nivel (placentación hemocorial) con remodelación exhaustiva
de los vasos uterinos, permitiendo el contacto directo con la sangre materna y
convirtiendo a la mucosa en un tejido ampliamente especializado: la decidua3.
Por lo tanto, los tipos de placentación en mamíferos pueden clasificarse en tres
grupos principales según el número de capas celulares que separan la circulación
materna de la fetal (Figura 1.2).
En la placentación epiteliocorial, las células del trofoblasto pueden adherirse
(e incluso fusionarse) con el epitelio uterino, pero no producen ningún grado de
invasión. La infiltración del útero por células trofoblásticas es característica de otros
tipos de placentación. Por ejemplo, pueden migrar hasta entrar en aposición con el
endotelio de los vasos uterinos (endoteliocorial) o bien infiltrar dichos vasos para entrar
en contacto directo con la sangre materna (hemocorial).
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INTRODUCCIÓN
Figura 1.2| Tipos de placentación.
Representación esquemática de los tres tipos principales de placentación. A| Epiteliocorial. El trofoblasto se encuentra sobre el epitelio uterino sin invadirlo. B| Endoteliocorial. El trofoblasto se encuentra en contacto directo con el endotelio de los vasos uterinos. C| Hemocorial. Los vasos uterinos son infiltrados por el citotrofoblasto y las vellosidades coriónicas son bañadas por la sangre materna en el espacio intervelloso. Adaptado de Moffett et al. 20063.
La placenta humana es de tipo hemocorial y su desarrollo depende de la
diferenciación del trofoblasto en dos tipos celulares característicos. El primero de ellos,
denominado citotrofoblasto velloso (CV), permanece en el compartimento fetal y se
fusiona dando origen al sinciciotrofoblasto (STh) que recubre a las vellosidades
coriónicas (VC). Estas vellosidades se encuentran en contacto directo con la sangre
materna en el espacio intervelloso y permiten el intercambio de nutrientes, gases y
productos de desecho entre la madre y el feto. El segundo tipo celular, denominado
citotrofoblasto extravelloso (CEV), es el responsable de la invasión del endometrio
decidualizado y el miometrio (CEV intersticial) y de la remodelación de las arterias
espiraladas (CEV endovascular) transformándolas en vasos de amplio diámetro y baja
resistencia4.
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INTRODUCCIÓN
Esta invasión se inicia inmediatamente luego de la implantación del embrión, y
se encuentra finamente regulada por una serie integrada de eventos de adhesión y
señalización. La invasión es controlada espacial y temporalmente, ocurre sólo durante
el primer trimestre de gestación e inicio del segundo y no suele superar la barrera del
miometrio. El control temporal tiene como consecuencia que el pico de penetración del
trofoblasto se produzca en la semana 12 de gestación, y el control espacial restringe la
profundidad de la invasión a la decidua y el tercio superior del miometrio.
De esta manera, queda claro que en humanos la decidua materna restringe el
acceso de las células trofoblásticas obteniendo el correcto balance entre exceso y déficit
de invasión. Una invasión desregulada puede desencadenar patologías con muerte
materna debido a hemorragia y, en el extremo opuesto, un bloqueo excesivo impide
una adecuada invasión del trofoblasto a las arterias uterinas maternas. En este caso, el
flujo sanguíneo hacia el feto es deficiente lo que puede ocasionar prematurez,
restricción del crecimiento intrauterino y preeclampsia (Figura 1.3).
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INTRODUCCIÓN
Figura 1.3| Placentación normal y patológica.
A| Embarazo normal. Las arterias espiraladas son transformadas en útero-placentarias por invasión exhaustiva del trofoblasto. La remodelación de la media y del endotelio permite obtener vasos de gran calibre que aseguran el flujo hacia el espacio intervelloso. B| Invasión superficial. Si la invasión es inadecuada las arterias no se remodelan, lo que altera el flujo sanguíneo y afecta el desarrollo fetal. CEV: citotrofoblasto extravelloso. VC: vellosidad coriónica. Adaptado de Moffett et al.20063.
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INTRODUCCIÓN
La transición epitelio-mesénquima (TEM) (Figura 1.4) es un proceso dinámico en
el cual las células epiteliales pierden su polaridad y adhesión célula-célula, sufren
múltiples cambios bioquímicos para adquirir una capacidad migratoria e invasiva, y
finalmente asumen un fenotipo mesenquimático5. Este fenómeno es central durante el
desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas y la reparación tisular pero también
ha sido reconocido como un evento crítico para la invasión tumoral. En diversas
patologías del embarazo, la invasión del lecho placentario es superficial, las arterias son
pobremente remodeladas y la placenta sufre un daño debido a isquemia-reperfusión.
Esto sugiere que la TEM que debe sufrir el CEV se encuentra desregulada causando
defectos en la migración e invasión previamente descriptos6.
Figura 1.4| Transición epitelio-mesénquima (TEM).
Durante la TEM, las células epiteliales pierden la polaridad apical-basal debido a la pérdida de las uniones adherentes, estrechas y comunicantes. Proteínas de la superficie celular como E-cadherina e integrinas epiteliales (verde) son reemplazadas por N-cadherina e integrinas mesenquimales (azul). El citoesqueleto de actina se remodela a fibras de estrés y los filamentos intermedios (citoqueratinas) son reemplazados por vimentina. La membrana basal es degradada y la célula libre de contactos intercelulares invade el estroma circundante. Adaptado de Micalizzi et al. 20107.
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INTRODUCCIÓN
Numerosos procesos fisiológicos dependen de una migración e invasión
apropiada: el desarrollo embrionario y placentario, la formación de nuevos vasos, la
cicatrización de heridas y el tráfico celular durante el desarrollo de la respuesta inmune.
De la misma manera, existen circunstancias patológicas en las que el movimiento celular
es exacerbado, siendo el cáncer el ejemplo clínico más relevante.
La placenta humana es un tejido normal; sin embargo, las células del CEV
comparten varias características con las células tumorales. La alta tasa de proliferación,
la falta de inhibición por contacto, la evasión del sistema inmune y la capacidad de
migración e invasión (particularmente durante el primer trimestre del embarazo) han
llevado a definir al trofoblasto como un tejido “pseudo-maligno” o una metástasis
fisiológica8,9.
Se propone que el flujo de agua mediado por acuaporinas (AQPs) contribuiría a
la migración de dos maneras: facilitando cambios en la morfología e impulsando a la
célula en la dirección del movimiento10. La participación de Caveolina-1 (Cav-1)/caveolas
en la migración celular también ha sido estudiada, ya que esta proteína puede modular
vías de señalización involucradas en la locomoción celular, cambios en su expresión
modulan la migración celular y se encuentra ligada al citoesqueleto11.
Si bien es posible encontrar múltiples reportes que vinculan la expresión o
funcionalidad de estas proteínas con el desarrollo tumoral, poco ha sido estudiada la
participación de las mismas en los fenómenos de migración e invasión que caracterizan
a los estadios iniciales de formación de la placenta humana.
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INTRODUCCIÓN
2 Acuaporinas
Estructura
Las acuaporinas (AQPs) son una clase de proteínas de membrana cuya función
principal es facilitar el transporte pasivo de agua en respuesta a gradientes osmóticos
creados por el transporte activo de solutos. Estos canales selectivos al agua participan
de múltiples funciones biológicas, incluyendo el transporte transepitelial de fluido, la
migración y la proliferación celular.
Existe abundante información disponible en relación a la estructura molecular
de las AQPs12. Se encuentran formando tetrámeros en la membrana
plasmática (Figura 2.1 A|) y al menos una de las AQPs, la AQP4, puede formar
asociaciones supramoleculares estabilizadas por interacciones a nivel del N-terminal13.
Los monómeros de AQP tienen un PM ~30 kDa y consisten de 6 alfa hélices
transmembrana (M1, M2, M4-M6 y M8), dos hélices medias (M3 y M7) y cinco bucles
de conexión (loop a-e) (Figura 2.1 B,C|). Los dominios amino y carboxilo terminal se
encuentran orientados hacia el citoplasma. Si bien las AQPs facilitan el transporte de
agua (y de glicerol en el caso de las acuagliceroporinas), impiden el pasaje de protones,
lo cual es crucial para evitar la disipación de dicho gradiente en la célula.
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INTRODUCCIÓN
Cada monómero conecta el medio extracelular con el citoplasmático por medio
de un poro anfipático de 20-25 Å que contiene residuos hidrofílicos e hidrofóbicos
(Figura 2.1 D|)14. La superficie hidrofílica consiste de grupos α-carbonilo de la cadena
polipeptídica y los residuos hidrofóbicos previenen el pasaje de solutos de mayor
tamaño. Hay dos dominios conservados formados por Asn-Pro-Ala (NPA) en las medias
hélices M3 y M7 que forman parte de la superficie hidrofílica del poro e impiden la
conducción de protones. Junto con los restos carbonilo actúan como dadores y
aceptores de puentes de hidrógeno coordinando el transporte de agua (y glicerol) a
través del poro. El dominio extracelular presenta una región rica en residuos aromáticos
y arginina, conocida como ar/R o filtro de selectividad, que corresponde a la región más
angosta del poro con un diámetro de ~2,8 Å en AQP1 humana y ~ 3,4 Å en el caso de las
acuagliceroporinas menos selectivas14,15.
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INTRODUCCIÓN
Figura 2.1| Estructura de las acuaporinas.
A| Vista superior de la cara extracelular de un homotetrámero de AQP1 donde se indican los monómeros (1-4), basada en la estructura de rayos X de AQP1 bovina (Protein Data Bank (PDB): 1J4N). B| Esquema de los dominios de membrana de AQP. C| Estructura de un monómero de AQP1 donde se observan los dominios helicoidales (M1-M8) y los loops conectores (a-e). D| Vista del dominio extracelular de AQP1. El filtro de selectividad (en verde) está constituido por residuos aromáticos y arginina. Los dominios (NPA) (Asn194, Pro195 y Ala196) se observan en naranja, la cadena polipeptídica con grupos carbonilo aceptores de puente de hidrógeno (Ile192, Cys191, Gly190 y Gly189) se observa en violeta y los residuos hidrofóbicos en negro. Adaptado de Verkman et al. 201416.
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INTRODUCCIÓN
Clasificación de las acuaporinas
Hasta la fecha, se han descripto 13 isoformas en mamíferos, con una amplia
distribución en distintos tejidos en el hombre (Figura 2.2). Teniendo en cuenta sus
características estructurales y funcionales, se las clasifica en tres subgrupos:
1. Las “AQPs clásicas” que incluye a AQP0, 1, 2, 4, 5, 6 y 8, que sólo permiten el
pasaje de agua. Teniendo en cuenta sus secuencias, se incluye en este subgrupo a la
AQP6 (permeable a aniones, particularmente a nitrato) y a la AQP8 (permeable a
urea)17,18.
2. Las “acuagliceroporinas” que incluye a AQP3, 7, 9 y 10, permeables a agua, urea
y glicerol. AQP9 también facilita el flujo de solutos neutros como monocarboxilatos,
purinas y pirimidinas19,20.
3. Las “superacuaporinas” fueron recientemente descriptas y este subgrupo
incluye sólo a dos isoformas, AQP11 y AQP12, ambas localizadas en el citoplasma21.
En adipocitos, AQP11 es permeable a agua y glicerol y se localiza intracelularmente en
las cercanías de lipid droplets22. AQP12 se expresa en acinos pancreáticos donde se cree
participa en la secreción de enzimas digestivas23.
Si bien la función principal de las acuaporinas es el transporte de agua (y glicerol
en el caso de acuagliceroporinas), diversos reportes indicarían que estos canales serían
capaces de transportar gases, tales como CO2 y NO, al igual que solutos polares como
azúcares, H2O2 e incluso ciertos iones24,25.
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INTRODUCCIÓN
Figura 2.2| Distribución celular y tisular de AQPs en mamíferos.
Expresión de AQPs en múltiples células y tejidos del organismo humano. SNC: sistema nervioso central, LCR: líquido cefalorraquídeo. Adaptado de Verkman et al. 201416.
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INTRODUCCIÓN
Regulación de la permeabilidad
Se asume que la mayoría de las AQPs se expresan constitutivamente en la
membrana plasmática; sin embargo, estudios recientes describieron los mecanismos
moleculares que regulan la localización de AQP126, AQP327, AQP528 y AQP829 en la célula.
La fosforilación de residuos conservados de serina y treonina es un mecanismo
involucrado en la modulación del tráfico de las AQPs dentro de la célula. La hormona
antidiurética (ADH) estimula el tráfico de AQP2 desde vesículas intracelulares a la
membrana apical, luego de unirse a su receptor en la membrana basolateral de la célula
renal. La unión de la hormona a su receptor induce una cascada de señalización con
aumento del Ca2+ citosólico y activación de la proteína quinasa A (PKA) que en
consecuencia fosforila a AQP2 en el residuo Ser256 30,31. De manera análoga, cuando
células de riñón humano (línea celular HEK293) son sometidas a un medio hipotónico,
se activa el tráfico de AQP1 a la membrana en forma dependiente del sistema de
microtúbulos y de la proteína quinasa C (PKC)32.
Por medio de aproximaciones experimentales y computacionales fue posible
dilucidar que diversos factores, tales como la existencia de diferentes estados
conformacionales, la tensión de membrana y modificaciones en el pH, influyen en la
apertura y/o cierre de estos canales.
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INTRODUCCIÓN
Estudios moleculares sobre la AQP5 humana permitieron establecer que estos
canales pueden adoptar distintas conformaciones. Cambios en la orientación de la His67
en la región C-terminal determinan un estado abierto o cerrado del canal, bloqueándose
completamente el flujo de agua a través del poro en este último caso. De manera
equivalente, cuando el canal se encuentra en la conformación abierta, modificaciones
en la orientación de la His173 del filtro de selectividad determinan una conformación
amplia o angosta que influye en la tasa de flujo de agua33.
Al evaluar el comportamiento de AQP1 humana expresada en ovocitos de
Xenopus laevis se demostró que el canal se encuentra constitutivamente abierto, pero
que es capaz de cerrarse frente a incrementos en la tensión de membrana por medio de
una acción cooperativa entre monómeros34.
Cambios en el pH del medio también pueden influenciar la permeabilidad de
estos canales en distintos tipos celulares. Nuevamente trabajando en ovocitos de
Xenopus laevis, se evaluó la permeabilidad al agua de AQP0 bovina expresada en la
membrana. Tanto la reducción del pH como el aumento del Ca2+ extracelular
incrementaron la permeabilidad del canal al agua por medio de un mecanismo
cooperativo35.
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INTRODUCCIÓN
Funciones biológicas de las acuaporinas
Las AQPs se encuentran ampliamente expresadas en el hombre, particularmente
en tipos celulares involucrados en el transporte de fluidos, como las células epiteliales
presentes en distintos órganos. Su rol clásico facilitando el transporte transepitelial de
fluido, como en el mecanismo de concentración urinaria, ha sido estudiado
extensamente. Sin embargo, estudios recientes han revelado roles inesperados para
estos transportadores. Las AQPs facilitan la migración celular, la angiogénesis y la
diseminación tumoral al facilitar el transporte de agua en lamelipodios de células en
migración. Las acuagliceroporinas regulan el contenido de glicerol en la epidermis y el
tejido adiposo, y consecuentemente, la hidratación epitelial y el metabolismo adiposo36.
Dichas funciones serán descriptas a continuación:
Transporte transepitelial de fluido: las AQPs facilitan el transporte transepitelial
de agua en respuesta a gradientes osmóticos creados por el transporte de iones y
solutos neutros. AQP2, AQP3 y AQP4 se expresan en las células epiteliales del tubo
colector renal. La retención renal de fluido (antidiuresis) requiere una elevada
permeabilidad transepitelial al agua, posible gracias al tráfico inducido por la ADH de
AQP2 desde vesículas intracelulares a la membrana apical de la célula37. AQP3 y AQP4
se encuentran expresadas constitutivamente en la membrana basolateral
(Figura 2.3 A|).
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INTRODUCCIÓN
Posterior a la creación de un gradiente osmótico por la secreción activa de
solutos, las AQPs facilitan la secreción de agua hacia los acinos de distintas glándulas.
Los ratones knockout para AQP5 (que se expresa en las glándulas submucosas de vías
aéreas y salivales) son deficientes en la secreción de saliva y de mucus en las vías
aéreas38,39. Típicamente, las secreciones son hiperosmolares y de volumen reducido, ya
que la baja permeabilidad al agua del acino (en ausencia de AQP5) impide alcanzar el
equilibrio osmótico a través del epitelio. Adicionalmente, AQP1 facilita la secreción del
humor acuoso por el epitelio ciliar del ojo y de LCR en el plexo coroideo40,41
(Figura 2.3 B|).
Angiogénesis y diseminación tumoral: las AQPs se encuentran involucradas en
la angiogénesis, el crecimiento, la invasión y la metástasis tumoral. AQP1 se encuentra
sobreexpresada en las células endoteliales de la microvasculatura tumoral42 y múltiples
estudios indican que diferentes isoformas se encuentran sobreexpresadas en distintas
clases de tumores. Por ejemplo, AQP1, AQP4 y AQP9 se expresan en astrocitos y
permanecen expresadas en astrocitomas, correlacionándose el grado de expresión de
AQP4 con la severidad del tumor43. Los ratones knockout para AQP1 tienen un
crecimiento reducido de tumores espontáneos e implantados como consecuencia de
defectos en la angiogénesis tumoral44. De la misma manera, los tumores que expresan
AQP1 tienen mayor invasividad e inducen mayor número de metástasis que aquellos
que no expresan estos canales45.
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INTRODUCCIÓN
Uno de los mecanismos propuestos para explicar la participación de AQP1 en la
angiogénesis y metástasis tumoral es la migración celular dependiente de AQPs
(Figura 2.3 C|). Durante este proceso, las AQPs se polarizarían en la región de la
membrana en dirección del movimiento, facilitando el ingreso de agua en los
lamelipodios y la migración celular10. Adicionalmente, varios estudios demuestran que
estos canales facilitarían la proliferación de las células tumorales al provocar
alteraciones en vías de señalización intracelular46,47.
Funciones de las acuagliceroporinas: AQP3 se encuentra expresada en la lámina
basal de los queratinocitos epidérmicos y los ratones knockout para dicha proteína
presentan una reducción en la hidratación y elasticidad del estrato córneo. La deficiencia
de AQP3 reduce la permeabilidad de las células epidérmicas al glicerol, disminuyendo
su nivel en el estrato córneo y en la epidermis, donde esta isoforma actúa como un
humectante al retener agua48 (Figura 2.3 D|). Adicionalmente, la deficiencia de AQP3
afecta la cicatrización de heridas a nivel cutáneo49. Por otro lado, el aumento en la
expresión de AQP3 se correlaciona con el desarrollo de tumores en la piel y su
deficiencia reduce significativamente la formación de dichos tumores en ratones50.
La AQP3 es responsable del mantenimiento de niveles elevados de glicerol, permitiendo
la generación de ATP y la síntesis de lípidos necesaria para la proliferación celular
(Figura 2.3 E|).
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INTRODUCCIÓN
Las acuagliceroporinas AQP7 (adipocitos) y AQP9 (hepatocitos) participan en el
metabolismo adiposo. Los ratones knockout para AQP7 presentan un aumento
progresivo de masa adiposa e hipertrofia de adipocitos con acumulación de glicerol y
trigicéridos51. La deficiencia de AQP7 reduce la permeabilidad de la membrana
plasmática al glicerol, causando su acumulación intracelular, la producción de
triglicéridos y un aumento en la expresión de la enzima glicerol quinasa. En humanos, la
expresión de AQP7 en adipocitos se encuentra reducida en pacientes obesos52.
La gluconeogénesis hepática depende del ingreso de glicerol mediado por
AQP953 y tanto AQP7 como AQP9 actuarían como reguladores metabólicos en diabetes
y obesidad54 (Figura 2.3 F|).
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INTRODUCCIÓN
Figura 2.3| Principales funciones biológicas de las AQPs.
A| En el riñón, una elevada permeabilidad transepitelial al agua en el túbulo proximal, asa descendente de Henle, vasa recta y tubo colector es necesaria para concentrar la orina. B| En las células epiteliales, una elevada permeabilidad al agua facilita la secreción activa de fluido. C| La migración celular facilitada por AQPs involucra el ingreso de agua en lamelipodios de células en migración. D| AQP3 facilita la hidratación de la piel manteniendo niveles elevados de glicerol en el estrato córneo, el cual actúa como un humectante reteniendo agua. E| AQP3 mantiene elevados los niveles intracelulares de glicerol, permitiendo la generación de ATP y la síntesis de lípidos, necesarios para la proliferación celular. F| AQP7 facilita la salida del glicerol de los adipocitos previniendo su acumulación intracelular y la de triglicéridos. AGL: ácidos grasos libres, LCR: líquido cefalorraquídeo. Adaptado de Verkman et al. 201416.
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INTRODUCCIÓN
Acuaporinas en placenta humana
La función principal de la placenta es promover el transporte selectivo de
nutrientes y productos de desecho entre la madre y el feto. Esta función depende de la
formación y expansión del STh a partir de la fusión de células del CV, el cual actúa como
barrera fisiológica entre la sangre materna y fetal.
El STh controla el pasaje transcelular de agua y solutos, ayudando a mantener la
homeostasis y el crecimiento fetal normal. Durante el embarazo, los requerimientos
fetales de agua se incrementan marcadamente por el crecimiento exponencial en el
peso fetal. De hecho, en gestaciones cercanas a término, se transfieren ~400 mL/día
desde la cavidad amniótica hacia la circulación fetal a través de las membranas fetales55.
Dado que la placenta se comporta como una membrana con una permeabilidad
muy baja, la transferencia difusional a través de la misma no sería suficiente para
cumplir con los requisitos fetales56,57. Los datos fisiológicos indican que tanto una vía
transcelular como una paracelular son necesarias para la transferencia de agua a través
de la placenta humana, pero la correlación morfológica de la última es incierta58.
Investigaciones previas en vesículas de membrana de STh aisladas han sugerido que los
movimientos del agua a través de la placenta ocurren por una vía de difusión de
lípidos57,59,60 descartando la ruta transcelular y la participación de las proteínas
integrales de membrana como AQPs.
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INTRODUCCIÓN
Sin embargo, en el año 2001, nuestro laboratorio fue el primer grupo en
identificar la presencia de AQP3 y AQP9 en la membrana apical de STh de placenta
humana61, y utilizando el modelo de cultivo de explantos se estableció que ambas
isoformas son funcionales62. Recientemente, se ha resaltado la importancia del
citoesqueleto de actina en la regulación de proteínas canales y se ha establecido que su
reorganización es necesaria en la modulación de la actividad y tráfico intracelular de las
mismas63. Por lo tanto, una posible explicación de la discrepancia en los experimentos
funcionales es que, en aquellos realizados en vesículas aisladas, pueden excluirse
algunos de los componentes del citoesqueleto que serían importantes para la
funcionalidad de los AQP.
Múltiples autores han reportado la expresión de AQPs en membranas fetales y
placenta humana61,64–69 (Figura 2.4, Tabla 2.1). Hoy en día, se acepta que la transferencia
placentaria de agua ocurre a través de las rutas para y transcelular, y que dicha
transferencia es facilitada por las AQPs.
Por otro lado, la cavidad amniótica se encuentra delimitada por dos membranas:
el amnios, en contacto con el líquido amniótico, y el corion, en contacto íntimo con la
cara fetal de la placenta y con la decidua materna. Debido a la diferencia de presión
osmótica (Posm) entre el líquido amniótico (255 mOsm/kg) y la sangre fetal
(280 mOsm/kg), un gradiente osmótico impulsa el transporte de fluido desde el
compartimento amniótico hacia la circulación fetal70. Este fenómeno puede ocurrir para
o transcelularmente, siendo facilitado por AQPs en este último caso.
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INTRODUCCIÓN
Figura 2.4| Expresión de AQPs en placenta y membranas fetales.
Se indica la expresión de AQP1, AQP3, AQP8, AQP9 y AQP11 en corion y amnios. En placenta se encuentra adicionalmente AQP4. Adaptado de Moffett et al. 20063.
Tabla 2.1| Localización de AQPs en blastocisto, placenta humana y membranas fetales.
Localización Expresión Referencias Blastocisto AQP3, 7 71 Placenta 1° trimestre
Vellosidades coriónicas AQP1, 3, 4, 5, 8, 9 y 11 72,73
Membranas fetales AQP1, 3, 8, 9 y 11 64–66,72 Placenta a término
Vasos placentarios AQP1 64
Trofoblasto AQP3, 4, 8 y 9 61,66,67,73
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INTRODUCCIÓN
Se ha descripto la expresión de AQP3, 8 y 9 en blastocisto murino proponiendo
que estos transportadores participarían en el movimiento de agua durante la
cavitación74,75. En humanos, ARNm de AQP1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11 y 12 fue detectado en
embriones previo a la implantación, sin embargo, sólo la expresión de AQP3 y 7 se
mantiene en el blastocisto sugiriendo que ambas isoformas serían esenciales durante el
desarrollo embrionario temprano71. En experimentos posteriores, se reportó la
presencia de AQP1, 3, 8 y 9 en placenta humana, ovina y de ratón72.
En vellosidades coriónicas de primer trimestre se expresan AQP1, 3, 4, 5, 8, 9 y
1172,73. Teniendo en cuenta la localización intracelular de AQP11, se ha postulado que
su función sería mantener un ambiente apropiado en el retículo endoplasmático para la
traducción y el plegamiento proteico72,73. El aumento en la expresión de AQP11 durante
la embriogénesis podría relacionarse con el desarrollo de las glándulas salivales, el riñón
y con el pasaje de agua hacia el embrión76. Sin embargo, durante el desarrollo
embrionario la expresión de AQP11 se reduce progresivamente y hacia el final del
embarazo, una vez alcanzada la madurez de los órganos, otras isoformas son
responsables del flujo de agua.
En membranas fetales se describió la expresión de AQP1, 3, 8 y 9 y se sugirió la
participación de estos transportadores en la homeostasis del líquido amniótico.
Adicionalmente, se detectó la presencia de AQP1 en el endotelio de los vasos
placentarios64–66. Recientemente, se determinó la expresión de AQP11 en membranas
amnióticas72. Por otro lado, en placenta a término, se determinó la expresión de AQP3
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INTRODUCCIÓN
y 9 en membrana apical de STh61. AQP8 también se localizó en el trofoblasto, pero la
polaridad de esta proteína aún no ha sido determinada66. Finalmente, AQP4 reduce su
expresión en el trofoblasto a lo largo del embarazo67.
El estudio del rol de las AQPs en membranas fetales y placenta se ha centrado en
dos fenómenos: la homeostasis del líquido amniótico y el flujo materno-fetal de agua y
solutos. Recientemente, diversos estudios han correlacionado la expresión alterada de
estos canales con patologías que se caracterizan por un volumen anormal de líquido
amniótico. En comparación con embarazos normales, las membranas fetales
(particularmente el amnios) de pacientes con polihidramnios presentan un aumento en
la expresión de AQP1, lo que sugeriría que esta alteración actuaría como un mecanismo
compensatorio a fin de mantener la homeostasis del líquido amniótico77. De forma
análoga, se observa un aumento en la expresión de AQP8 y AQP9 en ambas membranas
fetales durante el curso de esta patología78.
Por el contrario, en casos de oligohidramnios se observa una reducción de la
expresión de AQP1 y AQP3 en membranas fetales, corroborando la hipótesis de que el
cambio en la expresión de estos canales sería un mecanismo compensatorio.
Sorprendentemente, se observó un aumento en la expresión de AQP3 en placentas de
pacientes con oligohidramnios. Por lo tanto, se postula que AQP3 cumpliría un rol
central en el flujo placentario de agua y que el aumento de su expresión en el curso de
oligohidramnios garantizaría un apropiado transporte de agua y solutos entre la madre
y el feto68.
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INTRODUCCIÓN
3 Caveolas y Caveolina-1
Estructura
La membrana plasmática se encuentra compartimentalizada en microdominios
funcionales necesarios para que procesos como la señalización y adhesión celular
ocurran eficientemente. Estos microdominios pueden representar desde agrupaciones
heterogéneas de lípidos y proteínas de corta duración, hasta dominios organizados y
estables de cientos de nanómetros de diámetro. Se denominan “balsas lipídicas” o lipid
rafts a los dominios de membrana enriquecidos en colesterol y lípidos saturados
(principalmente esfingolípidos), altamente empaquetados y con un nivel de
ordenamiento característico que los distingue del resto de la membrana79.
Este ordenamiento permite reclutar distintos lípidos y proteínas en función de su
capacidad para intercalarse en esta estructura altamente empaquetada. Las proteínas
de la monocapa externa ancladas por glicofosfatidilinositol (ancla-GPI), las proteínas
orientadas hacia el citoplasma ancladas por grupos palmitoílo y las proteínas de unión a
colesterol se consideran preferencialmente segregadas en lipid rafts80.
Es este empaquetamiento característico lo que convierte a los lipid rafts en
dominios insolubles en Tritón X-100 frío (membranas resistentes a detergentes, DRM)
en comparación con el resto de la membrana81. Por otro lado, el tratamiento con
agentes capaces de vaciar al microdominio de colesterol inhibe los procesos biológicos
mediados por estas plataformas, lo que demuestra que la estabilidad de la estructura es
crítica para la transducción de señales82.
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INTRODUCCIÓN
El análisis proteómico de estos dominios reveló que presentan un
enriquecimiento 10 veces mayor en proteínas de señalización que el resto de la
membrana83. Por su parte, el estudio de la composición lipídica determinó que además
de colesterol, esfingolípidos y fosfolípidos saturados, estos dominios se encuentran
específicamente enriquecidos en fosfatidilserina, fosfatidilinositol-4,5-bifosfato
(PI(4,5)P2) y ácido araquidónico84,85. La presencia de múltiples proteínas de señalización
y cofactores lipídicos sugiere una función como plataforma de señalización,
aumentando la eficiencia, especificidad y regulación de diversas vías de señalización86.
Las caveolas se consideran un subtipo especializado de lipid rafts, y se definen
como invaginaciones de 60-80 nm de la membrana plasmática que presentan a la
caveolina como proteína marcadora87. Su abundancia depende del tipo celular
estudiado: en neuronas y linfocitos están prácticamente ausentes, pero en endotelio,
músculo y adipocitos pueden representar hasta el 50% de la superficie de la membrana
plasmática88. En la mayoría de las células, se presentan como simples invaginaciones;
sin embargo, pueden formar redes extensas en células musculares en desarrollo.
Existen tres isoformas de caveolina (Cav): Cav-1 y Cav-2 se encuentran en casi
todas las células que presentan caveolas; en cambio, Cav-3 se encuentra restringida a
células de músculo89. Cav-1 es una proteína de 22 kDa, puede unirse a una o dos
moléculas de colesterol, se encuentra palmitoilada en C-terminal y tanto el dominio N
como C terminal se encuentran orientados hacia el citoplasma. Existen dos variantes de
Cav-1 (α y β) que derivan de dos sitios diferentes de inicio de la traducción
(Figura 3.1)90,91.
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INTRODUCCIÓN
Figura 3.1| Caveolas y Cav-1.
A| Representación esquemática de los dominios de Cav-1. Los números corresponden a la secuencia de aminoácidos en mamíferos. Se indican los sitios de palmitoilación (Palm) (en verde), el sitio de fosforilación de Tyr (en rojo) y el sitio de inicio de la traducción de Cav-1β (en negro). B| Cav-1 se inserta en la membrana de la caveola, con sus dominios N y C-terminal orientados al citosol. La región C-term se encuentra palmitoilada. Adaptado de Parton et al. 201391.
La formación de la caveola requiere de la oligomerización de Cav-1 (por medio
del dominio de oligomerización) y de la asociación a lipid rafts ricos en colesterol (por
medio del dominio intermembrana). El dominio scaffold se encuentra adyacente al
dominio intermembrana y es de vital importancia para la funcionalidad de la caveola.
Múltiples proteínas de señalización son capaces de unirse a Cav-1 gracias a este
dominio, lo que determinaría que la caveola actúe como una plataforma de complejos
preensamblados de señalización92.
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INTRODUCCIÓN
Las Cavinas son una familia de proteínas citoplasmáticas que trabajan
cooperativamente con las caveolinas en la formación y funcionalidad de las caveolas.
Se encuentran descriptas cuatro isoformas y forman complejos heteroméricos que son
reclutados a las caveolas en células que expresan caveolinas93. En modelos animales y
células en cultivo, la ausencia de Cavina-1 causa la pérdida de las caveolas. Esto tiene
como consecuencia la endocitosis y degradación intracelular de Cav-1, lo que reduce sus
niveles94.
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INTRODUCCIÓN
Regulación
Cav-1 es sintetizada en el retículo endoplasmático dando origen a oligómeros
que se asocian a lipid rafts en el complejo de Golgi. La incorporación de colesterol
acelera el abandono del Golgi; por el contrario, la disminución de glicoesfingolípidos la
inhibe95,96. Se ha propuesto que además de la formación de caveolas, existirían
mecanismos alternativos para el transporte de Cav-1 hacia la membrana plasmática.
Las caveolas suelen permanecer durante períodos prolongados en la membrana.
Su internalización puede ser estimulada por diversos agentes tales como virus que la
utilizan como mecanismo de invasión, esteroles y glicoesfingolípidos. La endocitosis de
estos microdominios es dependiente de la proteína dinamina, que oligomeriza a la
altura del cuello de la caveola mediando la hidrólisis de GTP y su liberación de la
membrana97,98. Adicionalmente, este mecanismo sería altamente dependiente de una
reorganización del citoesqueleto de actina99. Luego de la endocitosis, las caveolas
pueden fusionarse con endosomas tempranos o con caveosomas, organelas análogas al
endosoma, pero de pH neutro, que actuarían como vía de ingreso alternativa de los
componentes endocitados. Finalmente, la caveola puede ser reciclada a la membrana
manteniendo estabilizada su estructura gracias a la asociación de las moléculas de Cav-
1100.
P á g . 37 | 173
INTRODUCCIÓN
Como fue indicado previamente, la Tyr14 puede ser fosforilada por quinasas de
la familia Src, encargadas de modular la transducción de señales luego de la activación
de diversos receptores celulares101. Esta modificación ocurre en respuesta a la
estimulación hormonal, factores de crecimiento101,102 y al estrés celular,
particularmente de tipo oxidativo103. La fosforilación en Tyr14 cumple un rol central en
la endocitosis de las caveolas104.
Resulta de particular interés destacar el rol que se le ha atribuido a esta
modificación postraduccional en procesos de adhesión y migración celular.
La fosforilación en Tyr14 (Cav-1-Tyr14P) es requerida para la unión de Cav-1 a las
proteínas que modulan la motilidad celular como Grb7 (Growth factor receptor-bound
protein 7). Esta proteína fue inicialmente identificada por su capacidad de unión a Tyr
fosforiladas en el EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico). La unión de
Grb7 a Cav-1-Tyr14P potencia el crecimiento independiente de anclaje y la migración de
células 293T estimuladas con EGF (factor de crecimiento epidérmico)101.
Adicionalmente, estudios en células endoteliales demostraron que durante la invasión
celular Cav-1-Tyr14P se encuentra polarizada en la membrana plasmática en el sentido
de la migración105. Los fibroblastos obtenidos de ratones knockout para Cav-1 presentan
alteraciones severas en la arquitectura del citoesqueleto y en su capacidad para emitir
protrusiones. Finalmente, fue posible corroborar que en este tipo celular, Cav-1-Tyr14P
regula la polarización y migración al modular el perfil de activación de Src106.
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INTRODUCCIÓN
Funciones biológicas de las caveolas
Las funciones asociadas a las caveolas son diversas e incluyen endocitosis,
metabolismo de lípidos, compartimentalización de vías de señalización, regulación de la
composición de la matriz extracelular (MEC) y migración celular. Esta última función será
analizada en detalle en el capítulo correspondiente.
Metabolismo de lípidos: es importante recordar la estrecha relación que existe
entre Cav-1 y los lípidos de membrana, particularmente con el colesterol y los
esfingolípidos. Alteraciones en el nivel de colesterol pueden tener efectos dramáticos
en la expresión de Cav-1 y en la integridad estructural de la caveola. Como se indicó
previamente, las caveolas son especialmente abundantes en los adipocitos. Cav-1 puede
interaccionar con el colesterol de la membrana, unir ácidos grasos107 y asociarse a lipid
droplets108. Los lipid droplets son organelas cuya función es el almacenamiento de
lípidos, compuestas por un centro de triglicéridos o ésteres de colesterol rodeado por
una monocapa fosfolipídica. La expresión de Cav-1 facilita el ingreso de ácidos grasos en
la línea celular HEK293 (células embrionarias de riñón humano)109 e incrementa el eflujo
de colesterol desde células hepáticas110. En células deficientes en Cav-1 se acumula
colesterol en la mitocondria, lo que deriva en muerte celular inducida por especies
reactivas del O2111. Por otro lado, los ratones knockout para Cav-1 son insulino-
resistentes, resistentes a obesidad inducida por la dieta y presentan una menor
acumulación de tejido adiposo, demostrando la participación de esta proteína en la
homeostasis lipídica112.
P á g . 39 | 173
INTRODUCCIÓN
Organización y señalización en la membrana plasmática: las caveolas y Cav-1
han sido implicadas en numerosas vías de transducción de señales y pueden modularlas
a través de distintos mecanismos.
Por un lado, se ha propuesto que Cav-1 ejercería un efecto inhibitorio por medio
de su dominio scaffold, el cual interaccionaría con un motivo conservado presente en
proteínas señalizadoras como EGFR113 y PKC114. Sin embargo, en ciertas instancias la
interacción con Cav-1 resulta esencial para la activación, por ejemplo, del receptor de
insulina en adipocitos115.
En segundo lugar, la actividad de diversas proteínas señalizadoras puede
modificarse por cambios en su expresión en la membrana, lo cual puede depender de la
endocitosis/exocitosis mediada por caveolinas116. En adipocitos carentes de Cav-1, se
reduce la expresión y estabilidad del receptor de insulina en la membrana, ocasionando
una respuesta celular deficiente luego de la estimulación con dicha hormona117.
La endocitosis mediada por Cav-1 modula el nivel de E-cadherina en la membrana,
remodelando las uniones adherentes y facilitando la migración e invasión celular118.
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INTRODUCCIÓN
Finalmente, las caveolas podrían regular vías de señalización al segregar diversos
componentes en dominios funcionales específicos de la membrana plasmática.
La ceramida actúa como un regulador negativo de la señalización mediada por insulina,
al impedir la activación de la proteína quinasa B (PKB). Esta inhibición puede ocurrir por
dos mecanismos: uno involucra a la PKC zeta y el otro a la proteína fosfatasa 2 (PP2-A).
La elección de un mecanismo u otro depende de la abundancia de Cav-1 y de la
organización estructural de la membrana plasmática119.
Regulación de la composición de la matriz extracelular (MEC): la interacción
entre las células y la MEC circundante es central para el desarrollo embrionario, la
arquitectura de los tejidos y durante el crecimiento y progresión tumoral. Los tumores
sólidos suelen ser más rígidos que el tejido normal y la progresión tumoral está
favorecida por un reordenamiento de la MEC, una señalización mediada por integrinas
y una motilidad celular dependiente de actina y miosina120,121. Los fibroblastos presentes
en el estroma adyacente a distintos tipos de cáncer expresan altos niveles de Cav-1, la
cual regula las propiedades mecánicas del microambiente tisular. Al promover la
motilidad mediada por actina y miosina, Cav-1 induce la fibrilogénesis de la MEC y el
aumento de su rigidez. Estas modificaciones promueven, a su vez, la migración de
células tumorales permitiendo la invasión local y la metástasis a distancia122.
P á g . 41 | 173
INTRODUCCIÓN
Caveolas y Cav-1 en placenta humana
El endotelio de diversos tejidos se caracteriza por la presencia de caveolas; por lo
tanto, no resulta sorprendente que se detectara una abundante cantidad de estos
microdominios en el endotelio de vasos placentarios. Adicionalmente, Cav-1 se expresa
en fibroblastos del tejido conectivo presente en la placenta humana a término123.
Estudios inmunohistoquímicos de este tejido revelaron una débil marca para Cav-
1 en el STh, en contraste con la fuerte tinción observada en el endotelio de los vasos.
Sin embargo, células purificadas de citotrofoblasto presentan una elevada expresión de
la proteína y abundantes caveolas en la membrana. Estos resultados permiten concluir
que la fusión del citotrofoblasto para dar origen al STh provoca una reducción
significativa en la expresión de Cav-1 y en la consecuente formación de caveolas124.
Estudios posteriores sobre la línea celular Bewo (corioncarcinoma humano)
corroboraron la participación de Cav-1 en la diferenciación y fusión celular,
posiblemente al modular la actividad de PKB. La activación de esta quinasa requiere su
fosforilación en Thr308 y Ser473; y la disminución en la expresión de Cav-1 reduce
significativamente la fosforilación en el residuo de treonina. De esta forma, Cav-1 podría
inducir la fusión del citotrofoblasto al modular el nivel de fosforilación de PKB y los
eventos posteriores mediados por ésta125.
P á g . 42 | 173
INTRODUCCIÓN
4 Metaloproteasas de matriz
Los mecanismos moleculares precisos que regulan la invasión del CEV y su relación
con el desarrollo fetoplacentario siguen siendo ampliamente desconocidos.
Sin embargo, diversas proteasas, citoquinas y factores de crecimiento han sido
relacionados con este proceso.
Las metaloproteasas de matriz (MMP) son endopeptidasas dependientes de Zn2+
capaces de degradar la MEC. Se han descripto 23 isoformas en mamíferos, que
comparten una estructura conservada que consiste en un sitio catalítico y un pro-
dominio autoinhibitorio. El pro-dominio contiene una Cys en coordinación con el Zn2+
del sitio activo inhibiendo la catálisis; cuando este pro-dominio es removido, el sitio
activo se encuentra disponible para el clivaje de sustratos126. Adicionalmente, la mayoría
de las MMP presenta un dominio hemopexina en la región C-terminal. Este dominio
contribuye en el reconocimiento de sustratos, la activación enzimática, la localización,
la internalización y la degradación de estas endopeptidasas127. MMP-2 y MMP-9 se
caracterizan por presentar tres repeticiones ricas en Cys en el sitio catalítico.
Estos residuos son análogos a los que presenta la fibronectina, y son necesarios para el
clivaje eficiente del colágeno y la elastina128,129. La mayoría de las MMP son secretadas,
aunque también existen isoformas ancladas a la membrana plasmática.
P á g . 43 | 173
INTRODUCCIÓN
La regulación de la actividad de las MMP es compleja y puede realizarse a nivel
transcripcional, traduccional, modulando su localización y activación enzimática; y por
medio de inhibidores de su actividad126. Las MMP y sus reguladores, incluyendo a los
inhibidores tisulares de las metaloproteasas (TIMP), jugarían un rol central en múltiples
procesos biológicos. Los diversos miembros de la familia de MMP son capaces de
degradar distintos componentes de la MEC, incluyendo a las colagenasas (MMP-1,
MMP-4, MMP-8), estromalisinas (MMP-3, MMP-10, MMP-11) y las gelatinasas (MMP-2,
MMP-9).
La proteólisis mediada por MMP puede favorecer la migración e invasión celular
por medio de distintos mecanismos: creando espacios para que las células puedan
migrar, generando fragmentos con actividad biológica independiente, regulando la
arquitectura celular a través de su acción sobre la MEC y las uniones intercelulares, y al
activar, desactivar o modificar la actividad de moléculas de señalización directa o
indirectamente130 (Figura 4.1).
P á g . 44 | 173
INTRODUCCIÓN
Figura 4.1| Posibles modos de acción de las MMP.
Al clivar componentes de la MEC, estas proteasas pueden aumentar el espacio para la migración de células o tejidos (A|), generar moléculas de señalización que actúen autócrina o parácrinamente (B|) modificar la arquitectura epitelial degradando las uniones intercelulares y la membrana basal (C|) y modular la actividad de moléculas de señalización latentes o activas con efectos sobre la diferenciación, proliferación, muerte y motilidad celular (D, E|). Adaptado de McCaw et al. 2007126.
P á g . 45 | 173
INTRODUCCIÓN
Por ejemplo, el clivaje de laminina-5 y colágeno tipo IV expone sitios crípticos que
promueven la migración131,132, y la degradación de colágeno tipo I mediada por MMP-1
es necesaria para la migración de células epiteliales en modelos en cultivo133.
Adicionalmente, el clivaje de E-cadherina dependiente de MMP-3 y MMP-7 origina
fragmentos biológicos activos que inducen un aumento de la invasividad de la línea
celular MDCK (Madin-Darby Canine Kidney)134.
La regulación de la actividad de estas proteasas en la interfase materno-fetal sería
crítica para lograr una implantación y placentación exitosa. Las células del trofoblasto
secretan MMP de manera constitutiva y por lo tanto son invasivas por naturaleza.
Las gelatinasas (Gelatinasa A: MMP-2: 72 kDa y Gelatinasa B: MMP-9: 92 kDa) que
degradan colágeno tipo IV (componente principal de la membrana basal) se expresan
en el trofoblasto y se consideran enzimas centrales para la invasión135. Diversos estudios
han demostrado que la síntesis y activación de MMP-2 y MMP-9 son necesarias para la
invasión del trofoblasto135–138, si bien los reportes difieren acerca de cuál sería la
predominante durante los estadios iniciales de formación de la placenta.
Recientemente se ha descubierto que el trofoblasto presenta una secreción diferencial
de estas enzimas según la semana gestacional evaluada. En células JAR (línea celular
derivada de corioncarcinoma) y citotrofoblasto de entre 6-8 semanas de gestación,
MMP-2 sería la gelatinasa principal que regularía la invasión, con colaboración de MMP-
9 en este proceso recién a partir de la semana 9 de gestación139,140.
P á g . 46 | 173
INTRODUCCIÓN
5 Desórdenes gestacionales
La preeclampsia y la restricción del crecimiento intrauterino
De acuerdo con datos provistos por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en
el año 2015, la razón de mortalidad materna (RMM) – definida como el número de
muertes maternas por cada 100.000 nacidos vivos – se estimó globalmente en 216.
Este valor se traduce en la muerte diaria de aproximadamente 830 mujeres debido a
complicaciones durante el embarazo y/o parto. Las causas principales de muerte
materna incluyen condiciones médicas exacerbadas durante el embarazo (diabetes,
malaria, HIV), hemorragia severa (principalmente luego del parto), trastornos
hipertensivos del embarazo (preeclampsia y eclampsia) y sepsis o infecciones.
En el año 2012, fallecieron en Argentina 258 mujeres durante o dentro de los 42
días siguientes a la terminación del embarazo, por causas relacionadas o agravadas por
el mismo. Con 738.318 nacidos vivos en el mismo año, representa una RMM de 35.
Las causas obstétricas directas son responsables del 57% de las defunciones maternas,
30,2% son debidas a causas indirectas y 12,8% son producto de abortos. Al desagregar
las causas de defunciones maternas directas, aparecen en primer lugar los trastornos
hipertensivos representando el 18,2% de las mismas141.
P á g . 47 | 173
INTRODUCCIÓN
La preeclampsia (PE) se caracteriza por el desarrollo de hipertensión y proteinuria
a partir de la semana 20 de gestación en una mujer previamente normotensa142.
La PE complica al 3-14% de todos los embarazos, al 30% de las gestaciones múltiples, al
30% de los embarazos en mujeres diabéticas y al 20% de las gestaciones en mujeres con
hipertensión crónica. Sin embargo, dos tercios de todos los casos ocurren en
embarazadas que fuera de este desorden, son nulíparas sin otra complicación aparente.
La preeclampsia-eclampsia es una de las principales causas de morbimortalidad materna
y perinatal mundial; aún sigue siendo responsable de 200.000 muertes maternas por
año en el mundo y se asocia con un aumento de 20 veces de la mortalidad perinatal143.
En el año 2012, la tasa de mortalidad infantil en Argentina (que comprende la
mortalidad de niños menores de 1 año) fue del 1,11%. Las afecciones originadas en el
período perinatal son responsables del 49,4% de las defunciones en el primer año de
vida. Al desagregar este grupo en causas más específicas, se observa que los trastornos
relacionados con la duración de la gestación y el crecimiento fetal son la principal causa,
representando el 27,1% de los casos analizados141. La restricción del crecimiento
intrauterino (RCIU) se define como la incapacidad del feto para alcanzar su máximo
potencial de desarrollo. La frecuencia de esta alteración es del 8-14% en embarazos
normotensos, pero resulta interesante destacar que el 30% de los casos reportados se
asocian a PE144.
P á g . 48 | 173
INTRODUCCIÓN
La PE puede presentarse en forma temprana (antes de la semana 34) o en forma
tardía (luego de la semana 34) y las diferencias en la presentación clínica sugieren una
diferencia etiológica en ambos casos.
La PE tardía constituye el 80% de los casos, se caracteriza por una remodelación
apropiada – o sólo ligeramente alterada – de las arterias espiraladas y no se encuentra
asociada con RCIU. Por el contrario, la PE temprana constituye entre el 5-20% de los
casos reportados, pero representa los casos más severos, caracterizados por una
invasión deficiente del CEV y claros signos de retraso en el crecimiento fetal.
La presentación simultanea de ambos síndromes (PE y RCIU) puede haber contribuido a
la noción de que las alteraciones que dan origen a la RCIU son las mismas que originan
PE temprana145.
P á g . 49 | 173
INTRODUCCIÓN
Alteraciones del citotrofoblasto observadas en PE y RCIU
La diferenciación del citotrofoblasto hacia la vía invasiva es un proceso complejo
que conlleva múltiples cambios en la expresión de distintos marcadores. A medida que
invade la pared del útero, el CEV aumenta la expresión de MMP-9135 y HLA-G, una
molécula no clásica del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I que sería
importante para impedir el rechazo inmunológico materno. De la misma manera, se
originan cambios en el perfil metabólico, incrementando la secreción de hormonas
específicas, incluyendo al lactógeno placentario humano (hPL).
También se ve afectada la interacción del trofoblasto con la MEC y con otros tipos
celulares. Por ejemplo, la expresión de ligandos de la MEC y sus receptores de tipo
integrinas esta finamente regulada por el trofoblasto. Antes de diferenciarse el
trofoblasto expresa el receptor de laminina α6β4, pero al diferenciarse al fenotipo
invasivo reduce la expresión de esta integrina y aumenta, en cambio, la expresión del
receptor de laminina y colágeno α1β1146,147. De hecho, se ha demostrado que la
interacción del receptor α1β1 con colágeno tipo IV promueve la invasión del trofoblasto
y el balance apropiado entre la promoción y la restricción de este proceso regularía la
profundidad de invasión del trofoblasto sobre la pared uterina148.
P á g . 50 | 173
INTRODUCCIÓN
Este programa de diferenciación sería crítico para una adecuada placentación ya
que durante la PE y/o RCIU, en donde la invasión intersticial y endovascular es
deficiente, el trofoblasto presenta severos defectos en su fenotipo invasivo.
Por ejemplo, los niveles de MMP-9, hPL y HLA-G149 en trofoblasto proveniente de
placentas preeclámpticas son anormalmente bajos. De forma análoga, el perfil de
integrinas no sufre el cambio previamente descripto, por lo tanto el trofoblasto
parecería encontrarse arrestado en su programa de diferenciación, expresando
receptores de ligandos de MEC que no contribuirían a la invasión150,151.
Sin embargo, resulta poco convincente que las alteraciones en el fenotipo del
trofoblasto sean la única causa de estas patologías. De hecho, existen factores de riesgo
para el desarrollo de PE y/o RCIU (enfermedad renal, diabetes, obesidad) que indicarían
la presencia de un factor materno dominante. Se ha postulado que la pérdida del
inmunoprivilegio que caracteriza al trofoblasto contribuiría al desarrollo de estas
alteraciones. Los macrófagos residen normalmente en la decidua y son capaces de
modular el grado de invasión del trofoblasto152. Los macrófagos activados secretan
niveles elevados del factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), el cual induce la apoptosis del
trofoblasto al unirse a su receptor (TNF-R1)153. Durante embarazos normales, las
paredes de las arterias uterinas carecen de macrófagos y son invadidas por el CEV. Por el
contrario, en PE se observan restos apoptóticos del trofoblasto rodeados de macrófagos
maternos154.
P á g . 51 | 173
INTRODUCCIÓN
Por lo tanto, la invasión deficiente de las arterias espiraladas y el desarrollo
placentario reducido que caracterizan a la PE y/o RCIU serían el resultado de:
1. Factores intrínsecos, fundamentalmente defectos en la capacidad invasiva
del CEV, objeto de estudio de esta tesis, y
2. Factores extrínsecos de origen materno, operando en las inmediaciones de
las arterias uterinas, tales como remodelación insuficiente de la decidua y
mecanismos de defensa mediados por macrófagos4.
P á g . 52 | 173
INTRODUCCIÓN
El rol de las AQPs y la Cav-1 en la preeclampsia
El rol de las AQPs durante la gestación humana y su posible desregulación en la PE
ha sido objeto de estudio de nuestro grupo de investigación desde el año 2001.
Como previamente se describió, AQP3 y AQP9 se encuentran expresadas en trofoblasto
y se ha postulado que estas acuagliceroporinas no sólo participarían en el transporte de
agua entre madre y feto, sino también en el movimiento rápido de solutos a través de
la membrana plasmática con mínima perturbación osmótica61.
En placentas preeclámpticas se corroboró un aumento en la expresión de AQP9
junto con una modificación en su localización intracelular. La AQP9 no sólo se localizaba
en la membrana apical, sino también en la basolateral y en el citoplasma del STh en estas
muestras patológicas62. Estas diferencias en la expresión y localización fueron la base
para orientar el estudio a la funcionalidad de estos transportadores en condiciones
normales y patológicas. En explantos provenientes de placentas normales se detectó un
flujo significativo de agua, urea y manitol sensible a HgCl2 (bloqueante general de las
AQPs) y floretina (bloqueante selectivo de AQP9), lo que indica que la AQP9 permanece
funcional en la placenta a término.
P á g . 53 | 173
INTRODUCCIÓN
Contrario a lo esperado, el aumento en la expresión de AQP9 en explantos
provenientes de placentas preeclámpticas no se correlacionó con un aumento en el flujo
de agua; de hecho, el flujo de agua y manitol fue menor al obtenido en condiciones
normales y no resultó sensible a la acción del HgCl2. Estos resultados sugieren una falta
de funcionalidad de AQP9 para el transporte de agua y manitol en placentas
preeclámpticas e indicarían que la permeabilidad de AQP9 a sus solutos puede
modificarse bajo condiciones patológicas62.
Tomando estos resultados en consideración y el escaso conocimiento de los
mecanismos que regulan a las AQPs en placenta humana, se evaluó el efecto de la
hormona gonadotrofina coriónica humana (hCG)155, el canal regulador de la
conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR)156, la insulina157, la tensión
de O2158 y el pH159 sobre la expresión y funcionalidad de estos transportadores.
La selección de estos factores se fundamentó en la observación de diferencias y/o
alteraciones de los mismos al comparar placentas normales y preeclámpticas.
La expresión y funcionalidad anómala de las AQPs en placentas preeclámpticas, y
la falta de evidencia que vincule a la PE con alteraciones en el flujo de agua en la interfase
materno-fetal, sugieren que las AQPs estarían involucradas en otros procesos.
P á g . 54 | 173
INTRODUCCIÓN
El rol clásico de transporte transepitelial de agua ha sido ampliamente estudiado;
sin embargo, análisis recientes en sistemas celulares y/o ratones knockout han revelado
funciones inesperadas para estos transportadores, participando de fenómenos tan
diversos como la señalización neuronal, la migración celular, la metástasis tumoral y la
regulación del volumen celular durante la apoptosis36. Son estas funciones no clásicas
las que podrían verse afectadas durante el desarrollo de la PE y/o RCIU.
La apoptosis es un mecanismo de muerte celular necesario para el desarrollo
normal de la placenta160. El grado de apoptosis que sufren las vellosidades placentarias
se modifica a lo largo de la gestación y se encuentra considerablemente incrementado
en placentas preeclámpticas161. La exacerbación de los eventos apoptóticos podría
alterar la funcionalidad del STh y la expresión de diversos transportadores, incluyendo
a las AQPs. De hecho, en un modelo de isquemia/reperfusión placentaria (tal como el
propuesto en PE), se observó un incremento de la apoptosis del STh debido a un
aumento en el estrés oxidativo del sistema162.
P á g . 55 | 173
INTRODUCCIÓN
Múltiples reportes sugieren que las AQPs participarían en el movimiento de agua
a través de la membrana plasmática durante la apoptosis163. Morfológicamente, uno de
los eventos más tempranos y conservados de la muerte celular programada es la pérdida
de agua y la reducción del volumen celular. Estudios posteriores demostraron que dicha
pérdida es mediada por AQPs y crítica para la progresión de la apoptosis164.
Adicionalmente, en otros tejidos, se observó que la inhibición de estos transportadores
impide el desarrollo de la apoptosis y en forma coincidente, el aumento de su expresión
incrementa la tasa de la misma165. En explantos de placentas normales sometidos a
hipoxia/reoxigenación (imitando las condiciones de la PE), el bloqueo general de las
AQPs, y de AQP3 en particular, reduce de manera drástica la apoptosis del trofoblasto162.
Teniendo en cuenta estos resultados, se postuló que en placentas preeclámpticas,
la AQP3 debería encontrarse incrementada para desencadenar dicha apoptosis
exacerbada. Contrario a lo esperado, la expresión de AQP3 (a nivel transcripcional y
proteico) en placentas preeclámpticas se encuentra reducida con respecto a placentas
normales. Si bien se especula que esta disminución pueda deberse a una respuesta
adaptativa del sistema166, la participación de AQP3 en la apoptosis del trofoblasto
velloso en PE no es clara aún.
P á g . 56 | 173
INTRODUCCIÓN
Los antecedentes en materia de expresión y/o regulación de Cav-1 durante la
gestación aún son escasos. La disrupción y la pérdida progresiva de Cav-1 ha sido
asociada con hipertensión pulmonar fuera del embarazo167, pero aún se desconoce su
regulación durante el embarazo normal o patológico.
Al estudiar la composición lipídica de placentas preeclámpticas, se observan
diferencias con respecto a embarazos normales. Las membranas apicales del STh de
placentas preeclámpticas son más rígidas y se encuentran enriquecidas en
esfingomielina. Una composición lipídica alterada puede alterar la capacidad de la
esfingomielina y el colesterol para ensamblarse en lipid rafts, provocando un aumento
del grado de empaquetamiento que desestabilizaría la formación de las caveolas y
afectaría la expresión de la proteína y la señalización celular. Por lo tanto, el daño
potencial en las membranas de STh debido a la hipoxia intermitente y el estrés oxidativo
como consecuencia de ésta, contribuirían a crear un entorno desfavorable para la
inserción de Cav-1 en la membrana plasmática, aumentando su degradación.
Esto explicaría la reducida expresión de Cav-1 en membranas apicales del STh de
placentas preeclámpticas168.
Dado que la PE es un síndrome de la placentación temprana, no podemos
descartar que las alteraciones en la expresión de AQPs y de Cav-1 observada al final de
la gestación no sean consecuencia de una falla en la diferenciación de la célula madre
del trofoblasto que afecta tanto el linaje velloso como al extravelloso.
P á g . 57 | 173
INTRODUCCIÓN
6 AQPs y Cav-1 en la migración e invasión celular
La migración celular es un proceso que involucra múltiples pasos integrados,
orquestando la morfogénesis embrionaria, contribuyendo a la reparación y
regeneración tisular y determinando la progresión de procesos patológicos como el
cáncer, la ateroesclerosis y la artritis. La respuesta inicial de una célula a un agente
promotor de la migración es polarizarse y extender protrusiones en la dirección del
estímulo. Estas protrusiones pueden ser extensos lamelipodios o agudos filopodios,
cuya formación depende de la polarización del citoesqueleto de actina y que se
estabilizan por adhesión a la MEC vía integrinas. Estas adhesiones actúan como sitios de
tracción para la migración y son desensambladas en el polo distal de la célula
permitiendo que se retraiga y libere de su entorno169.
Por la descripción anterior, resulta evidente que al migrar las células sufren
rápidos cambios en su morfología, los cuales probablemente se encuentren
acompañados por cambios en el volumen celular a expensas del flujo de agua.
Los cambios en el volumen celular no solo facilitarían los cambios de morfología, sino
que también impulsarían a la célula hacia adelante contribuyendo con el movimiento
mediado por la polarización del citoesqueleto de actina. Teniendo en consideración
estos factores, se propone que el flujo de agua mediado por AQPs contribuiría a la
migración de dos maneras: facilitando cambios en la morfología e impulsando a la célula
en la dirección del movimiento10.
P á g . 58 | 173
INTRODUCCIÓN
Luego de la inyección de células de melanoma en ratones knockout para AQP1, el
crecimiento de tumores se encuentra reducido. De hecho, células endoteliales aórticas
provenientes de dichos ratones migran significativamente menos frente a un estímulo
quimioatractante en comparación con células provenientes de ratones normales44.
Desde esta observación inicial, múltiples estudios han corroborado la participación de
las AQPs en la migración celular. En la piel, la expresión de AQP3 aumenta la
proliferación y migración de los queratinocitos, en tanto que los ratones knockout para
dicha isoforma presentan una reducción considerable en su capacidad de cicatrización
de heridas49. De la misma manera, el silenciamiento de AQP3 en fibroblastos reduce su
capacidad migratoria170. La transfección de diversas líneas celulares con AQP9 induce la
formación de filopodios en la membrana plasmática171. Estos hallazgos apoyan la noción
de que la migración mediada por AQPs sería un fenómeno generalizado, independiente
de la isoforma y del tipo celular involucrado.
Varios reportes han aportado evidencias que sugieren un rol para Cav-1/caveolas
en la migración celular. Cav-1 puede influenciar la migración celular modulando la
actividad de múltiples vías de señalización.
Como ya se indicó anteriormente, la acción scaffold ejercida por Cav-1 contribuiría
a compartimentalizar vías de señalización involucradas en la migración celular172.
Dentro de las proteínas importantes para la motilidad celular asociadas a las caveolas se
incluyen receptores de factores de crecimiento, moduladores de los niveles de Ca2+
(como la Ca2+ ATPasa) y miembros de la familia de GTPasas Rho173,174.
P á g . 59 | 173
INTRODUCCIÓN
La participación de Cav-1 durante este fenómeno se encuentra avalada por su
asociación con fibras de estrés por medio de la proteína entrecruzadora filamina175.
Se cree que esta proteína cumple un rol central en la locomoción celular actuando como
una proteína comunicadora entre el citoesqueleto y proteínas transmembrana como las
integrinas176.
Resulta particularmente interesante recordar las características “pseudo-
malignas” del CEV y evaluar la correlación entre AQPs y Cav-1 con el desarrollo tumoral.
La migración es un fenómeno central en la diseminación tumoral, tanto en la infiltración
del tejido circundante como en la aparición de metástasis a distancia. Las AQPs se
encuentran sobreexpresadas en una variedad de tumores43,177–180, y donde fue
estudiada, su expresión correlaciona con un mayor grado tumoral. La participación de
AQP1 en la migración de células de cáncer de colon y en el crecimiento de tumores
mamarios181,182, de AQP3 en la migración e invasión de cáncer de próstata183 y de AQP5
en la proliferación y migración de células de cáncer de mama46 representan sólo algunos
ejemplos de los numerosos estudios que demuestran la relación entre la expresión de
las AQPs y el desarrollo tumoral.
P á g . 60 | 173
INTRODUCCIÓN
Cav-1 regula múltiples procesos asociados al cáncer, incluyendo la transformación
celular, el crecimiento tumoral, la migración celular, la angiogénesis y la metástasis.
Se ha reportado que puede impactar positiva y negativamente sobre diversos aspectos
de la progresión tumoral, y si bien se ha descripto su acción como supresora de tumores,
también ha sido identificada como un factor de mal pronóstico en varios cánceres
humanos184.
La expresión de Cav-1 en biopsias y líneas celulares tumorales fue documentada
en numerosos estudios y estaría condicionada por el tipo y estadio tumoral. El aumento
en la expresión de Cav-1 se considera un factor de mal pronóstico en tumores del tracto
gastrointestinal, próstata, mama y pulmón185. La capacidad de Cav-1 de inducir
metástasis se atribuye a su acción sobre la motilidad celular, actuando como una
proteína que comunica al citoesqueleto con moléculas de adhesión y de la MEC.
Recientemente, en células de cáncer de próstata, se corroboró su participación en la
TEM, además de facilitar la migración celular y la resistencia a apoptosis inducida por
taxol186. Se ha observado que el silenciamiento de Cav-1 impide la formación de
protrusiones de membrana necesarias para la degradación de la MEC en células de
cáncer de mama187. Adicionalmente, las caveolas son necesarias para la localización y
funcionalidad de MT1-MMP (activador de la MMP-2) en la migración de las células
endoteliales durante la angiogénesis188.
P á g . 61 | 173
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Los desórdenes gestacionales constituyen un problema de salud a nivel mundial.
Resulta evidente que entender los mecanismos fisiológicos que regulan los estadios
iniciales de formación de la placenta y establecer los factores que limitarían los mismos,
nos ayudará a dilucidar la fisiopatogenia de dichos desórdenes, con el fin de encontrar
nuevas estrategias que contribuyan a mejorar el funcionamiento placentario y lograr
una gestación exitosa.
Tomando en consideración el conjunto de antecedentes desarrollados
previamente, podemos establecer que:
1. Las AQPs y Cav-1 modulan la migración e invasión de diversas líneas celulares y
su participación resulta crítica durante el desarrollo tumoral;
2. Existen similitudes entre las células tumorales y el CEV que nos permiten
considerar a la placenta como un tejido “pseudo-tumoral” o una “metástasis
fisiológica”;
3. Se observan alteraciones en la expresión o funcionalidad de dichas proteínas en
diversos desórdenes gestacionales caracterizados por una remodelación
superficial de las arterias uteroplacentarias.
Bajo este escenario, la hipótesis planteada en este Trabajo de Tesis fue la siguiente:
“Las AQPs y la Cav-1 presentes en las células trofoblásticas participan en una etapa
temprana del desarrollo de la placenta, específicamente en el proceso de migración e
invasión del trofoblasto, y alteraciones en su funcionalidad conducen a desórdenes
gestacionales caracterizados por una placentación defectuosa”
P á g . 62 | 173
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
El objetivo general propuesto fue:
Estudiar el papel de AQPs y Cav-1 en el microambiente placentario, investigando su
participación en la migración, invasión y diferenciación endovascular del CEV y su
interacción con el endotelio de las arterias uterinas.
Mediante la utilización de la línea celular de CEV humano Swan 71 y de la línea celular
endotelial EA.hy926, se plantearon los siguientes objetivos específicos:
I. Estudiar la expresión y localización de AQPs y Cav-1 en la línea celular Swan 71.
II. Evaluar la participación de AQPs y Cav-1 en la migración de dicha línea celular.
III. Evaluar la participación de AQPs y Cav-1 y su interacción con MMP en la
invasión de dicha línea celular.
IV. Evaluar la interacción de AQP3 y Cav-1 en la línea celular Swan 71.
V. Evaluar la capacidad de la línea celular Swan 71 de adquirir un fenotipo
endovascular. Analizar el efecto de medios condicionados (MC) provenientes de dicha
línea celular sobre la proliferación, migración y formación de túbulos de la línea
endotelial EA.hy926.
P á g . 63 | 173
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS 1 Cultivo de líneas celulares
1.1 Líneas celulares
Para realizar los experimentos de este trabajo se empleó una línea celular de CEV
humano denominada Swan 71, y la línea celular de endotelio EA.hy926; las cuales se
describen a continuación:
Swan 71: La línea celular Swan 71 se estableció a partir de células de trofoblasto humano
de 7 semanas de gestación mediante transfección con el gen de la telomerasa.
Su caracterización permitió determinar que presenta las características del CEV189.
Las células se utilizaron hasta el Pasaje 10.
Las líneas celulares HTR-8/SVneo190 (trofoblasto extravelloso de primer trimestre;
ATCC® CRL-3271™) y Bewo191 (corioncarcinoma humano; ATCC® CCL-98TM) y
vellosidades coriónicas humanas (de 12-14 semanas de gestación obtenidas por punción
abdominal) se utilizaron como controles en los ensayos necesarios.
EA.hy926: La línea celular EA.hy926 se estableció a partir de células endoteliales aisladas
de vena umbilical humana (HUVEC) por fusión con un clon resistente a la tioguanina de
la línea celular A549 (ATCC® CRL-2922)192. Su caracterización permitió determinar que
conserva funciones de células endoteliales diferenciadas tales como las relacionadas a
angiogénesis, homeostasis/trombosis e inflamación193.
P á g . 64 | 173
MATERIALES Y MÉTODOS
1.2 Mantenimiento y subcultivo de las células
Las líneas celulares Swan 71 y EA.hy926 se cultivaron en botellas de 25 cm2 con
5 mL de medio esencial Dulbecco modificado con medio Ham F12 (DMEM-F12;
Laboratorio Microvet, Argentina) suplementado con 10% suero fetal bovino inactivado
por calor (SFB; Laboratorio Natocor, Córdoba, Argentina), conteniendo 5 mM L-
Glutamina (L-Glu; Laboratorio Microvet, Argentina), 100 U/mL penicilina,
100 µg/mL estreptomicina y 0,25 µg/mL anfotericina B (ATB-APS; Laboratorio Microvet,
Argentina). Para el subcultivo de las líneas celulares, luego de alcanzar un 80-90% de
confluencia las células se lavaron con 5 mL de un buffer de fosfatos salino
(PBS; 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl [pH 7,4]) y
posteriormente, para la cosecha, se incubaron con 500 µL de una solución de tripsina al
0,25% (p/v) (Laboratorio Microvet, Argentina) durante 1-5 min en estufa. Para detener
el efecto proteolítico de la tripsina, ésta se diluyó mediante la incorporación de 2 mL de
medio completo. El análisis del número de células viables se realizó mediante el ensayo
de exclusión del colorante vital Azul de Tripán (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados
Unidos) al 0,4% (p/v). La viabilidad celular de cada una de las líneas utilizadas fue mayor
al 95%. Finalmente se realizaron diluciones de las suspensiones celulares con medio
completo, de manera de sembrar el número apropiado de células para alcanzar una
confluencia del 80-90% luego de 2 o 3 días.
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MATERIALES Y MÉTODOS
1.3 Conservación de líneas celulares
Las líneas celulares se conservaron mediante criopreservación. Para ello, se partió
de cultivos en fase exponencial de crecimiento (50-60% de confluencia). Las células se
cosecharon como se indicó previamente y se resuspendieron en 90% SFB y
10% dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos).
Luego, las suspensiones celulares (1 x 106 células/mL) se dividieron en alícuotas de 1 mL
y se colocaron en criotubos, los cuales se ubicaron en un recipiente conteniendo
isopropanol (Mr. Frosty Freezing Container, Thermo Fisher, Waltham, MA, Estados
Unidos) para permitir un descenso gradual de la temperatura y evitar la formación de
cristales de agua intracelulares. Dicho recipiente se almacenó a -70°C durante 24 h y
luego los criotubos se transfirieron a un termo conteniendo nitrógeno líquido (-180°C).
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MATERIALES Y MÉTODOS
2 Ensayos de viabilidad y proliferación celular
2.1 Ensayo colorimétrico de MTT
El ensayo de MTT es un método colorimétrico que se utiliza para evaluar el número
de células viables. Este ensayo se basa en la reducción del compuesto MTT (3-(4,5-
dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difenil tetrazol) por las deshidrogenasas presentes en células que
se encuentran metabólicamente activas. El producto generado se denomina formazán,
es coloreado y soluble en etanol, facilitando la lectura de su absorbancia a una longitud
de onda de 540 nm. Por lo tanto, es un método útil y confiable para determinar el
número de células viables en proliferación, por ejemplo, en presencia de SFB. Además,
este método permite determinar el efecto de un agente citotóxico o condición de cultivo
que pudiera restringir la viabilidad celular.
Para este ensayo se sembraron 7 x 103 células/pocillo (sobre placas de 96 pocillos),
en 100 µL de medio basal suplementado con 10% SFB. Al día siguiente, las células se
cultivaron en medio basal suplementado con SFB (0,5% para Swan 71 y 2% para
EA.hy926) durante 24 h para la sincronización del ciclo celular. Posteriormente, las
células se sometieron al tratamiento correspondiente y una vez finalizado el mismo se
realizó el ensayo. Se reemplazó el medio de cultivo por 100 µL de MTT (0,5 mg/mL en
medio basal, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos). La densidad óptica debida a
la formación de cristales de formazán se evaluó a 540 nm en un lector de placas (RT-
6000 Microplate Reader, Rayto, Shenzhen, China) y los resultados se expresaron como
relaciones porcentuales de viabilidad celular respecto a los controles de cada caso.
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MATERIALES Y MÉTODOS
2.2 Exclusión del colorante vital Azul de Tripán
Luego de la cosecha, la viabilidad de las células se analizó mediante el recuento
por exclusión del colorante vital Azul de Tripán al 0,4% (p/v). La viabilidad celular
obtenida para cada una de las líneas utilizadas fue mayor al 95%. Previamente a la
criopreservación cada muestra se analizó por cuadruplicado.
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MATERIALES Y MÉTODOS
3 Inhibición de la funcionalidad de AQPs y Cav-1
3.1 Bloqueo farmacológico de AQPs
Para evaluar la contribución de las AQPs en los diferentes experimentos realizados
se procedió a su bloqueo farmacológico por medio de los siguientes tratamientos:
a) 50 µM HgCl2 durante 30 min (bloqueo no selectivo de AQPs). Los compuestos
mercuriales son capaces de inhibir a la mayoría de las AQPs debido a la elevada afinidad
del Hg2+ a la Cys189 presente en el poro del canal, generando un bloqueo estérico del
mismo194,195.
b) 100 µM Cloruro de Tetraetilamonio (TEA) durante 24 h (bloqueo selectivo de
AQP1). Previamente descripto como un agente bloqueante de los canales de K+,
presenta un efecto inhibitorio sobre AQP1 (y adicionalmente sobre AQP2 y AQP4) por
unión a la Tyr186 presente en el bucle-E del canal196.
c) 100 µM CuSO4 durante 24 h (bloqueo selectivo de AQP3). La inhibición de AQP3
mediada por Cu2+ se atribuye a su unión a los residuos Trp128, Ser152 y His154 previamente
reportados como los responsables del bloqueo del canal mediado por Ni2+. El Cu2+
bloquea la permeabilidad del canal al agua y al glicerol197.
d) 100 µM floretina durante 24 h (bloqueo selectivo de AQP9). El tratamiento con
floretina inhibe la permeabilidad de AQP9 al agua y al resto de sus sustratos, e inhibe
sólo parcialmente la permeabilidad de AQP3 al agua y urea19,198.
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MATERIALES Y MÉTODOS
3.2 Silenciamiento de la expresión de AQP3
Con el fin de obtener cultivos de células Swan 71 con 60-70% de confluencia se
sembraron 2,5 x 105, 5 x 104 y 1 x 104 células en placas de 6, 24 y 96 pocillos
respectivamente, y se incubaron durante 24 h en medio DMEM-F12 suplementado con
10% SFB en ausencia de antibióticos. A fin de determinar la eficiencia de la transfección
se utilizó un ARN de interferencia inespecífico conjugado a isotiocianato de fluoresceína
(siCTRL-FITC; Santa Cruz Biotechnology, CA, Estados Unidos) el cual consiste en una
secuencia control que no conduce a la degradación específica de ningún ARNm celular
conocido. Una vez establecidas las condiciones óptimas de transfección, las células se
transfectaron con un ARN de interferencia anti-AQP3 humana (siRNA-AQP3; Santa Cruz
Biotechnology, CA, Estados Unidos), el cual consiste en 3 secuencias de ARN de 19-25
nucleótidos diseñados específicamente para silenciar la expresión de AQP3.
Como control se utilizó un ARN de interferencia inespecífico (siRNA-CTRL; Santa Cruz
Biotechnology, CA, Estados Unidos), el cual consiste en una secuencia control que no
conduce a la degradación específica de ningún ARNm celular conocido.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Cada 1 x 104 células, se preparó una solución que requirió 1,6 µL del
correspondiente ARN de interferencia (10 µM) diluido en 20 µL de medio de transfección
(Santa Cruz Biotechnology, CA, Estados Unidos) y otra solución, con 1,2 µL de reactivo
de transfección (Santa Cruz Biotechnology, CA, Estados Unidos) diluido en 20 µL de
medio de transfección. Luego de 5 min de incubación a temperatura ambiente, se
mezcló el contenido de ambas soluciones y se incubó 20 min adicionales para favorecer
la formación de los complejos. Finalmente se realizó una dilución al 1/5 con medio de
transfección, cada 40 µL de los complejos se agregaron 160 µL de medio. Por pocillo, se
agregaron 40 µL de la solución con los complejos cada 1 x 104 células. Luego de 5 h de
transfección los complejos remanentes se retiraron, y las células se mantuvieron en
medio de crecimiento por 72 h para evaluar el silenciamiento máximo de AQP3.
Por motivos operacionales, los experimentos de migración e invasión se realizaron luego
de 24 h de finalizada la transfección. La recuperación de medios condicionados se realizó
24, 48 y 72 h posteriores a la transfección.
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MATERIALES Y MÉTODOS
3.3 Disrupción de caveolas por medio de metil-β-ciclodextrina (MβCD)
A fin de evaluar la participación de Cav-1 en los distintos experimentos, se realizó
una disrupción de las caveolas (por depleción del contenido de colesterol) en presencia
de 5 mM metil-β-ciclodextrina (MβCD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos)
durante 30 min a 37°C. Este agente actúa estrictamente a nivel superficial, es capaz de
remover rápida y selectivamente colesterol de la membrana plasmática y ha sido
ampliamente utilizado para lograr la disrupción de lipid rafts199.
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MATERIALES Y MÉTODOS
4 Evaluación de la expresión de ARNm
4.1 Extracción de ARN total y obtención de ADNc
La obtención de ARN total se realizó utilizando un sistema comercial (SV Total RNA
Isolation System, Promega, Madison, WI, Estados Unidos) siguiendo las indicaciones del
fabricante. Brevemente, 1 x 106 células se resuspendieron en 175 µL de buffer de lisis.
Las muestras se incubaron a 70°C durante 3 min y fueron centrifugadas a 10 000g en
una microcentrífuga (Z-216MK Refrigerated Centrifuge, Hermle Labortechnik,
Wehingen, Alemania) durante 10 min a temperatura ambiente. Luego de recuperar el
sobrenadante, la precipitación del material genético se logró por agregado de etanol 95°
y el ADN presente se eliminó por incubación con DNasa I durante 15 min a temperatura
ambiente. El ARN remanente se sometió a sucesivos lavados y finalmente se recuperó
en 100 µL de agua libre de RNasas. En el caso de muestras de vellosidades coriónicas, se
tomaron 175 µL de buffer de lisis por cada 60 mg de tejido y las muestras se lisaron
utilizando un homogeneizador manual. El rendimiento obtenido en muestras de tejido
fue del orden de 240 ng ARN/mg, y en líneas celulares de 8 µg ARN/1 x 106 células.
La pureza fue estimada por espectrofotometría a partir de las absorbancias relativas a
260 y 280 nm. El radio A260/A280 fue del orden de 2,0. El ARN se conservó a -70°C hasta
ser utilizado.
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MATERIALES Y MÉTODOS
La obtención del ADNc se realizó a partir de 5 µg de ARN total utilizando una
secuencia sintética de ADN compuesta por 15 nucleótidos con base timina (Oligo dT;
Biodynamics, Buenos Aires, Argentina) que actúa como primer universal para la
transcriptasa reversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV; Thermo
Fisher, Waltham, MA, Estados Unidos). El apareamiento del Oligo dT se realizó a 70°C
durante 10 min y la reacción de transcripción reversa a 42°C durante 1 h, utilizando un
termociclador (Px2 Thermal Cycler, Thermo Fisher, Waltham, MA, Estados Unidos).
El ADNc obtenido se conservó a -20°C hasta ser utilizado.
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MATERIALES Y MÉTODOS
4.2 RT-PCR Semicuantitativa
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevó a cabo durante 30 ciclos
utilizando un termociclador (Px2 Thermal Cycler, Thermo Fisher, Waltham, MA, Estados
Unidos) y mediante el uso de primers específicos para cada secuencia de interés
(Tabla 4.2.1). Primers para β-actina se utilizaron para corroborar la integridad del ADNc
y como control de carga. Los productos de PCR se corrieron en geles de agarosa al
1,5% (p/v) en buffer Tris-Borato EDTA (TBE; 89 mM Tris, 89 mM Ácido Bórico,
2 mM EDTA [pH 7,6]) utilizando el mismo buffer para la corrida. La visualización de los
productos de amplificación se logró por agregado de un compuesto fluorescente capaz
de unirse a los ácidos nucleicos (Gel Red 10 000x, Biotium, CA, Estados Unidos) y
posterior análisis bajo exposición a luz UV (GBox Chemi, Syngene, Cambridge, Reino
Unido). Como control positivo se utilizaron muestras de vellosidades coriónicas
humanas provistas por el Instituto GENOS. Las VC se obtuvieron entre las semanas 12 a
14 de gestación y se seleccionaron aquellas de cariotipo normal y edad materna
avanzada o ansiedad parental como únicas indicaciones para el estudio; en forma
anonimizada, después de que las pacientes aceptaran participar en este estudio y
firmaran un consentimiento informado por escrito.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Tabla 4.2.1| Secuencias de primers específicos utilizados para la PCR.
Secuencia (5´-3´) Ta (°C) Tamaño (pb) AQP1 Forw: 5’-AGATCAGCATCTTCCGTG-3’
Rev: 5’-AGTTGTGTGTGATCACCG-3’ 54 354
AQP3 Forw: 5’-CCTGAACCCTGCGGTGACC-3’ Rev: 5’-GGCATAGCCGGAGTTGAAGC-3’
61 397
AQP9 Forw: 5’-CATCAACCCAGCTGTGTCT-3’ Rev: 5’-CAGCCACTGTTCAGTCCCA-3’
57 393
Cav-1 Forw: 5’-GTCCACTTCTGGGCTTCATC-3’ Rev: 5’-TCCTCCCCCATCTTCTTTCT-3’
57 468
β-actina Forw: 5’-CGGAACCGCTCATTGCC-3’ Rev: 5’-ACCCACACTGTGCCCATCTA-3’
58 290
Ta: temperatura de apareamiento. pb: pares de bases.
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MATERIALES Y MÉTODOS
5 Evaluación de la expresión y secreción de proteínas
5.1 Determinación de la concentración de proteínas
La concentración de proteínas totales se determinó según el método del ácido
bicinconínico (BCA) utilizando un sistema comercial (Pierce BCA Protein Assay Kit,
Thermo Fisher, Waltham, MA, Estados Unidos). En placas de 96 pocillos con fondo plano,
se sembraron 25 µL de la muestra en la dilución correspondiente. Luego se incubó con
200 µL de reactivo de trabajo, se mezcló por agitación durante 30 seg y se incubó a 37°C
durante 30 min. La absorbancia a 540 nm se determinó en un lector de placas (RT-6000
Microplate Reader, Rayto, Shenzhen, China). La curva de calibración se realizó con una
solución de seroalbúmina bovina (BSA) provista por el fabricante, en un rango de
concentraciones de 20-2000 µg/mL.
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MATERIALES Y MÉTODOS
5.2 Obtención y procesamiento de lisados celulares
Para evaluar la expresión de las AQPs y Cav-1, monocapas subconfluentes de
células Swan 71 se lavaron con PBS frío y luego se lisaron en Buffer RIPA (150 mM NaCl,
2 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Tritón X-100, 50 mM Tris-Cl [pH 7,4]) conteniendo
0,2 mM fluoruro de fenilmetil-sulfonilo (PMSF; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados
Unidos) y una mezcla de inhibidores de proteasas (0,5 mM AEBSF, 0,4 µM aprotinina,
25 µM bestatina, 7,5 µM E-64, 10 µM leupeptina, 5 µM pepstatina A; Protease Inhibitor
Cocktail Set III, Calbiochem, Millipore, Darmstadt, Alemania). El lisado obtenido se
centrifugó durante 5 min a 10 000g a 4°C en una microcentrífuga (Z-216MK Refrigerated
Centrifuge, Hermle Labortechnik, Wehingen, Alemania). Se recolectaron los
sobrenadantes y el contenido de proteínas totales se determinó mediante el método de
BCA. Como control positivo, se utilizaron muestras de VC humanas obtenidas por
punción abdominal entre las semanas 12-14 de gestación.
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MATERIALES Y MÉTODOS
5.3 Obtención y procesamiento de medios condicionados (MC)
Para la obtención de MC, la línea celular Swan 71 se cultivó en DMEM-F12
suplementado con 10% SFB. Luego de la sincronización, monocapas subconfluentes se
lavaron con PBS y se realizaron los siguientes tratamientos, cada uno de ellos con su
correspondiente control:
a) Bloqueo farmacológico no selectivo de AQPs (mediado por HgCl2),
b) Bloqueo farmacológico selectivo de AQP3 (mediado por CuSO4),
c) Silenciamiento de la expresión de AQP3 (mediado por siRNA),
d) Disrupción de caveolas (mediado por MβCD)
Finalizado el tratamiento correspondiente, las monocapas se lavaron con PBS y se
incubaron durante 24, 48 o 72 h en DMEM-F12 en ausencia de SFB. A continuación, se
colectaron los MC de los cultivos, los cuales se centrifugaron a 10 000g durante 10 min
(Z-216MK Refrigerated Centrifuge, Hermle Labortechnik, Wehingen, Alemania), con el
objetivo de precipitar posibles células muertas y/o detritos celulares. A continuación, el
sobrenadante se recuperó y se conservó a -20°C para la realización de las zimografías y
de los ensayos de funcionalidad endotelial. Se obtuvieron tres muestras independientes
para cada uno de los tratamientos analizados.
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MATERIALES Y MÉTODOS
5.4 Acondicionamiento de muestras para SDS-PAGE
Alícuotas de cada muestra conteniendo 25-100 µg de proteínas totales se
diluyeron al medio con buffer de siembra 2x (SDS 4% (p/v), glicerol 20% (v/v), β-ME
10% (v/v), azul de bromofenol 0,005% (p/v), 125 mM Tris-Cl [pH 6,8]) y se
desnaturalizaron mediante incubación a 90°C durante 5 min. Las muestras se
centrifugaron a 10 000g durante 1 min (Z-216MK Refrigerated Centrifuge, Hermle
Labortechnik, Wehingen, Alemania) y se conservaron a -20°C hasta su uso.
5.5 SDS-PAGE
Las proteínas se resolvieron mediante la técnica de electroforesis en geles de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (presencia de SDS). Los geles se
polimerizaron sobre placas de vidrio de 10 x 10 cm con separadores de 2 mm.
El gel separador consistió en: acrilamida/bisacrilamida 12,5% (p/v), SDS 0,1% (p/v),
persulfato de amonio (PSA) 0,1% (p/v) y tetrametiletilendiamina (TEMED) 0,1% v/v,
1,5 M Tris-Cl [pH 8,8]. El gel concentrador consistió en: acrilamida/bisacrilamida
4% (p/v), SDS 0,1% (p/v), PSA 0,15% (p/v) y TEMED 0,13% (v/v), 0,5 M Tris-Cl [pH 6,8].
El buffer de corrida utilizado fue: 192 mM Glicina, 0,1% SDS (p/v), 25 mM Tris-Cl
[pH 8,3]. En cada corrida se adicionó una muestra de proteínas marcadoras de peso
molecular (Full Range Amersham Rainbow Marker, GE Life Sciences, Little Chalfont,
Reino Unido). La corrida electroforética se desarrolló a temperatura ambiente,
aplicando un voltaje constante de 80 Volts (V) durante aproximadamente 30 min, hasta
que las proteínas alcanzaran el gel separador. Luego se incrementó el voltaje a 120 V
para el resto de la corrida.
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MATERIALES Y MÉTODOS
5.6 Técnica de Western blot
Luego de las corridas electroforéticas, las proteínas se electrotransfirieron a una
membrana de nitrocelulosa (Amersham, GE Life Sciences, Little Chalfont, Reino Unido).
La transferencia se realizó utilizando un buffer de transferencia (192 mM Glicina,
metanol 20% (v/v), 25 mM Tris-Cl [pH 8,3]) aplicando un amperaje constante de 200 mA
durante 1 h. Para visualizar las proteínas transferidas, las membranas se tiñeron con una
solución de Rojo Ponceau-S 0,5% (p/v) en ácido acético 1% (v/v), durante 1 min a
temperatura ambiente. Luego del lavado, las membranas se incubaron con una solución
de leche en polvo descremada al 5% (p/v) en buffer PBS durante 1 h a temperatura
ambiente en agitación, para bloquear los sitios de unión inespecíficos. Las membranas
se incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes (Tabla 5.6.1) diluídos en la
solución de bloqueo durante toda la noche a 4°C. Finalizada la incubación las
membranas se lavaron con PBS conteniendo Tween 0,1% (v/v), y luego se incubaron con
el correspondiente anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa durante 2 h a
temperatura ambiente en agitación (Tabla 5.6.1).
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MATERIALES Y MÉTODOS
La presencia de las proteínas de interés se evidenció a través del revelado
mediante quimioluminiscencia empleando un sistema comercial (ECL plus, Amersham,
GE Life Sciences, Little Chalfont, Reino Unido) y las imágenes se capturaron utilizando
un lector de geles (GBox Chemi, Syngene, Cambridge, Reino Unido). La evaluación de la
expresión de las proteínas se realizó mediante el análisis densitométrico respecto a la
proteína utilizada como control de carga, el software empleado fue ImageJ®
(U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MD, Estados Unidos;
https://imagej.nih.gov/ij/).
Tabla 5.6.1| Anticuerpos utilizados en este trabajo.
Antígeno Tipo Proveedor Dilución
AQP1 Conejo AcP Alpha Diagnostic 1/500 AQP3 Conejo AcP Alpha Diagnostic 1/1000 AQP9 Conejo AcP Alpha Diagnostic 1/1000 Cav-1 Conejo AcP Santa Cruz 1/1000
β-actina Conejo AcP Santa Cruz 1/1000 IgG conejo Cabra-HRP Jackson 1/10000
AcP: anticuerpo policlonal. HRP: enzima peroxidasa de rabanito.
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MATERIALES Y MÉTODOS
6 Inmunofluorescencia indirecta
Las células se cultivaron sobre cubreobjetos circulares (12 cm2) dispuestos en
placas de 24 pocillos. Una vez alcanzada una confluencia del 80% las células se lavaron
con PBS. A continuación, se fijaron con una solución de para-formaldehido 4% (p/v) en
PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Luego de tres lavados con PBS durante 10
min cada uno, las células se permeabilizaron mediante la incubación con Tritón X-100
0,5% (v/v) en PBS durante 10 min. Luego, los sitios de unión inespecíficos se bloquearon
con solución de bloqueo (leche en polvo descremada al 5% (p/v) en buffer PBS) durante
1 h. En los casos donde se evaluó la localización de proteínas asociadas a membrana las
células no fueron permeabilizadas. Luego del bloqueo, se incubó con una dilución 1/50
del anticuerpo primario en solución de bloqueo durante toda la noche a 4°C.
A continuación, se realizaron tres lavados con PBS de 5 min cada uno y se incubó con el
anticuerpo secundario (1/100 anti-IgG de conejo conjugado a Texas Red, Santa Cruz
Biotechnology, CA, Estados Unidos) durante 2 h a temperatura ambiente y en oscuridad.
Luego de tres lavados con PBS de 5 min cada uno, se realizó el montaje de los
cubreobjetos en medio de montaje con 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para el teñido
de los núcleos celulares (Fluoroshield Mounting Medium with DAPI, Abcam, Cambridge,
MA, Estados Unidos). Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio
epifluorescente (Nikon Eclipse E200, Nikon Instruments Inc., Estados Unidos).
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MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Colocalización de AQP3 y Cav-1
Las células se cultivaron sobre cubreobjetos circulares (12 cm2) dispuestos en
placas de 24 pocillos. Una vez alcanzada una confluencia del 80% las células se lavaron
con PBS. A continuación, se fijaron con una solución de para-formaldehido 4% (p/v) en
PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Posteriormente se realizaros tres lavados
con PBS durante 10 min cada uno. Luego, los sitios de unión inespecíficos se bloquearon
con solución de bloqueo (leche en polvo descremada al 5% (p/v) en buffer PBS) durante
1 h. Luego del bloqueo se incubó con una mezcla de Ac monoclonal anti-Cav-1 (1/50 en
solución de bloqueo, Santa Cruz Biotechnology, CA, Estados Unidos) y Ac anti-AQP3
(1/50 en solución de bloqueo, Alpha Diagnostic, San Antonio, TX, Estados Unidos)
durante toda la noche a 4°C. A continuación, se realizaron tres lavados con PBS de 5 min
cada uno, y se incubó con una mezcla de Acs secundarios (anti-IgG de conejo conjugado
a Texas Red y anti-IgG de ratón conjugado a fluoresceína, Santa Cruz Biotechnology, CA,
Estados Unidos) durante 2 h a temperatura ambiente y en oscuridad. Luego de tres
lavados con PBS de 5 min cada uno, se realizó el montaje de los cubreobjetos en medio
de montaje con 4´-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para el teñido de los núcleos celulares
(Fluoroshield Mounting Medium with DAPI, Abcam, Cambridge, MA, Estados Unidos).
Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio epifluorescente (Nikon Eclipse
E200, Nikon Instruments Inc., Estados Unidos).
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MATERIALES Y MÉTODOS
7 Inmunoprecipitación
La inmunoprecipitación se realizó utilizando un sistema comercial (Pierce Crosslink
Immunoprecipitation Kit, Promega, Madison, WI, Estados Unidos) siguiendo las
indicaciones del fabricante. Monocapas subconfluentes de células Swan 71 se lavaron
con PBS frío y luego se lisaron en un buffer Tris en presencia de inhibidores de proteasas
(1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 200 mM Ortovanadato de Sodio, 0,5% Nonidet P-40, 0,5%
Tritón X-100, 20 mM NaF, 0,15 M NaCl, 20 mM Tris [pH 7,5]).
Los lisados se incubaron a 4°C durante 1 h en una resina de proteína–A-sefarosa
previamente tratada con un anticuerpo anti-Cav-1. Luego de sucesivos lavados, se
procedió a la elución del antígeno de interés unido a la resina. Para corroborar la
interacción entre Cav-1 y AQP3, el eluato obtenido fue sometido a la técnica de Western
Blot utilizando un anticuerpo anti-AQP3 para el revelado de la membrana.
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MATERIALES Y MÉTODOS
8 Ensayos de migración e invasión celular
8.1 Ensayo de cicatrización de herida (Wound Healing)
Monocapas confluentes de Swan 71 se arrestaron durante 24 h en medio basal
suplementado con 0,5% SFB para la sincronización del ciclo celular. Las células se
sometieron a los siguientes tratamientos:
a) Bloqueo farmacológico no selectivo de AQPs (mediado por HgCl2),
b) Bloqueo farmacológico selectivo de AQP1 (TEA), AQP3 (CuSO4) y AQP9
(floretina). En este caso las células fueron expuestas al reactivo durante la migración
debido a la reversibilidad de su efecto,
c) Silenciamiento de la expresión de AQP3 (mediado por siRNA). Luego de la
transfección las células se mantuvieron 24 h en medio de crecimiento, previamente a la
realización de la herida,
d) Disrupción de caveolas (mediado por MβCD)
Finalizado cada tratamiento, se realizó manualmente la herida con un tip de
200 µL, lavándose posteriormente con PBS para remover las células no adheridas181,200.
Durante la migración, las células se mantuvieron en medio basal suplementado con
0,5% SFB. El cierre de la herida se evaluó durante 24 h a distintos tiempos (8, 18 y 24 h)
por medio de imágenes obtenidas con un microscopio invertido equipado con una
cámara fotográfica (Nikon TMS Inverted Microscope, Nikon Instruments Inc., Estados
Unidos). La cuantificación de la herida se realizó utilizando el programa TScratch®201.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Para analizar el cierre de la herida, se tomaron fotografías de cada monocapa a
tiempo cero (t0h) y a los distintos tiempos de incubación (txh). Para cuantificar el cierre
de la herida se empleó la siguiente fórmula: Cierre de la herida (%) = 100 x [(área t0h –
área txh)/área t0h]. Para cada uno de los tratamientos, se analizaron las heridas
correspondientes a tres monocapas y se realizaron tres ensayos independientes en cada
caso.
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MATERIALES Y MÉTODOS
8.2 Ensayo de invasión utilizando insertos pretratados con MEC
Con el objetivo de evaluar la capacidad invasiva de la línea celular Swan 71 se
realizaron los siguientes tratamientos:
a) Bloqueo farmacológico no selectivo de AQPs (mediado por HgCl2),
b) Bloqueo farmacológico selectivo de AQP3 (mediado por CuSO4). En este caso las
células fueron expuestas al reactivo durante la invasión debido a la reversibilidad de
su efecto,
c) Silenciamiento de la expresión de AQP3 (mediado por siRNA). Luego de la
transfección las células se mantuvieron 24 h en medio de crecimiento, previamente
a la siembra en los insertos,
d) Disrupción de caveolas (mediado por MβCD)
Finalizado el tratamiento, 5 x 104 células se sembraron sobre insertos de
policarbonato (Millicell Cell Culture Inserts, Merck Millipore, Billerica, MA, Estados
Unidos) de 6,5 mm de diámetro y 8 µm de poro albergados sobre placas de 24 pocillos.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Previamente a su uso, los insertos se trataron con 50 µL de MEC 0,3 mg/mL
(ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
Estados Unidos) en DMEM-F12. Se los dejó secar durante 1-2 días bajo flujo laminar
(con ocasional UV) y antes de sembrar las células, se rehidrataron por incubación con
75 µL de DMEM-F12 durante 2 h a 37°C. La suspensión celular se sembró sobre los
insertos en DMEM-F12 suplementado con 0,5% SFB, y sobre los pocillos de la placa se
adicionaron 300 µL de DMEM-F12 suplementado con 10% SFB a fin de ejercer una acción
quimioatractante. La capacidad invasiva se evaluó luego de 24 h de incubación.
Para eliminar las células no invasivas, se realizó un raspado con un hisopo estéril
sobre la cara superior del inserto y sucesivos lavados con DMEM-F12. Las células
localizadas en el lado inferior del inserto se fijaron con metanol frío durante 30 min y se
tiñeron con Hematoxilina-Eosina. Los insertos se deshidrataron por pasajes sucesivos en
etanol de graduación creciente y finalmente en xilol. Utilizando pinza y bisturí, se retiró
la membrana de la base del inserto y se procedió al montaje en Glicerol: PBS (1:1).
El número de células por membrana se cuantificó utilizando el software ImageJ® a partir
de imágenes representativas obtenidas mediante microscopía de campo claro.
Para cada uno de los tratamientos se analizaron las imágenes correspondientes a tres
insertos y se realizaron tres ensayos independientes.
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MATERIALES Y MÉTODOS
8.3 Evaluación de la actividad de MMP (Zimografía)
Con el objetivo de evaluar la actividad gelatinolítica de las MMP se realizó una
zimografía con los MC obtenidos. Se sembraron 60 µL del MC con 20 µL de buffer de
siembra 4x (SDS 8% (p/v), glicerol 40% (v/v), azul de bromofenol 0,4% (p/v),
200 mM Tris-Cl [pH 6,8]) en un SDS-PAGE al 10% conteniendo 1 mg/mL de gelatina
(Bovina tipo B, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos). Las muestras se evaluaron
en ausencia de condiciones reductoras o calor. Las condiciones de corrida utilizadas
fueron idénticas a las indicadas para la técnica de Western Blot.
Para remover el SDS los geles se lavaron tres veces en buffer TBS (150 mM NaCl,
50 mM Tris-Cl [pH 7,2]) en presencia de Tritón X-100 2,5% a temperatura ambiente
durante 30 min. Para remover el Tritón X-100, los geles se lavaron nuevamente tres
veces en buffer TBS a temperatura ambiente durante 15 min. Finalmente, se incubó
durante 48 h a 37°C en buffer Colagenasa (5 mM CaCl2, 120 mM NaCl, 5 µM ZnCl2,
50 mM Tris-Cl [pH 7,5]). Con el objetivo de visualizar las bandas los geles se tiñeron con
Coomasie Blue R-250 0,25% en metanol: ácido acético: agua (4:1:5) durante 30-60 min,
y a fin de obtener bandas más nítidas, se los incubó en agua antes de realizar la
densitometría.
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MATERIALES Y MÉTODOS
9 Ensayo de formación de tubos sobre la línea celular Swan 71
La línea celular Swan 71 se cultivó en DMEM-F12 suplementado con 10% SFB.
Luego de la sincronización, monocapas subconfluentes se lavaron con PBS y se
realizaron los siguientes tratamientos,
a) Bloqueo farmacológico no selectivo de AQPs (mediado por HgCl2),
b) Bloqueo farmacológico selectivo de AQP3 (mediado por CuSO4)
c) Disrupción de caveolas (mediado por MβCD)
Finalizado el tratamiento correspondiente, se resuspendieron en 100 µL de
DMEM-F12 suplementado con 3% SFB. Cada suspensión se cargó por triplicado en placas
de 96 pocillos previamente tratadas con 50 µL de MEC en DMEM-F12 (9,3 mg/mL, ECM
Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
Estados Unidos). Luego de 6 h se obtuvieron 5 imágenes representativas por pocillo
utilizando un microscopio invertido equipado con una cámara fotográfica (Nikon TMS
Inverted Microscope, Nikon Instruments Inc., Estados Unidos). Las imágenes se
procesaron utilizando el Angiogenesis Analyzer del software ImageJ®. Se realizaron tres
ensayos independientes.
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MATERIALES Y MÉTODOS
10 Ensayos de funcionalidad endotelial
10.1 Ensayo de proliferación celular
Se realizó un ensayo de MTT para evaluar el efecto de los MC de Swan 71 sobre la
proliferación de las células endoteliales. Sobre placas de 96 pocillos se sembraron
células EA.hy926 (7 x 103 células/pocillo) en DMEM-F12 conteniendo 10% SFB durante
24 h. Para la sincronización del ciclo celular se removió el medio y se lo reemplazó por
DMEM-F12 suplementado con 2% SFB durante 24 h. Posteriormente, el medio de
arresto se reemplazó por 100 µL de MC suplementado con 3% SFB. Se evaluó el efecto
de los MC de Swan 71 obtenidos 24, 48 y 72 h posteriores a los tratamientos
correspondientes. Como control, las células se incubaron en DMEM-F12 suplementado
con 3% SFB. Se evaluó la proliferación de las células luego de 48 h de incubación y los
resultados se expresaron como porcentaje en relación con los correspondientes
controles. Cada MC se evaluó por triplicado y se realizaron tres ensayos independientes.
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MATERIALES Y MÉTODOS
10.2 Ensayo de cicatrización de herida (Wound Healing)
Se realizó un ensayo de cicatrización de herida para evaluar el efecto de los MC de
Swan 71 sobre la migración de las células endoteliales. Monocapas confluentes de la
línea celular EA.hy926 se arrestaron durante 24 h en DMEM-F12 suplementado con
2% SFB. La herida se realizó manualmente con un tip de 200 µL, lavándose con PBS para
remover las células no adheridas. Posteriormente, el medio de arresto se reemplazó por
100 µL de MC suplementado con 3% SFB. Se evaluó el efecto de los MC de Swan 71
obtenidos luego de 72 h de los tratamientos correspondientes. Como control, las células
se incubaron en DMEM-F12 suplementado con 3% SFB. El cierre de la herida se evaluó
durante 24 h a distintos tiempos (8, 18 y 24 h) y la cuantificación se realizó como se
indicó previamente. Para cada uno de los MC, se analizaron las heridas correspondientes
a dos monocapas y se realizaron tres ensayos independientes.
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MATERIALES Y MÉTODOS
10.3 Ensayo de formación de tubos (tubulogénesis)
Luego de un arresto durante 24 h en DMEM-F12 suplementado con 2% SFB,
4 x 104 células EA.hy926 se resuspendieron en 100 µL de los MC de Swan 71 obtenidos
luego de 72 h de los tratamientos correspondientes suplementados con 3% SFB.
Como control, las células fueron incubadas en presencia de DMEM-F12 suplementado
con 3% SFB. Cada suspensión se cargó por triplicado en placas de 96 pocillos
previamente tratadas con 50 µL de MEC en DMEM-F12 (9,3 mg/mL, ECM Gel from
Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados
Unidos). Luego de 6 h se obtuvieron 5 imágenes representativas por pocillo utilizando
un microscopio invertido equipado con una cámara fotográfica (Nikon TMS Inverted
Microscope, Nikon Instruments Inc., Estados Unidos). Las imágenes se procesaron
utilizando el Angiogenesis Analyzer del software ImageJ®. Cada MC se evaluó por
triplicado y se realizaron tres ensayos independientes.
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MATERIALES Y MÉTODOS
11 Análisis estadístico de los resultados experimentales
Los resultados experimentales se analizaron con el programa estadístico
“GraphPad Prism” para Windows. En todos los casos, se realizaron como mínimo tres
ensayos independientes. Para el análisis estadístico se realizó el test de ANOVA y el test
t de Student, según correspondiera. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente
significativo.
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RESULTADOS
RESULTADOS
1 Expresión y localización de AQPs y Cav-1 en células de citotrofoblasto humano
1.1 Expresión de AQP1, AQP3, AQP9 y Cav-1 en la línea celular Swan 71
La línea celular Swan 71 se estableció a partir de una muestra de placenta humana
de 7 semanas de gestación obtenida luego de un aborto electivo y constituye un modelo
representativo del CEV humano para estudios in vitro189.
Figura 1.1.1| Morfología de la línea celular Swan 71.
Microfotografías de campo claro de células Swan 71 cultivadas en DMEM-F12 suplementado con 10% SFB. Imágenes representativas de cultivos en baja (A|) y alta (B|) densidad (Magnitud 40X).
La expresión de AQPs y Cav-1, se analizó a nivel transcripcional (ARNm) por
medio de RT-PCR semicuantitativa (Figura 1.1.2) y a nivel proteico por medio de la
técnica de Western Blot (Figura 1.1.3) evaluando la presencia de las isoformas indicadas.
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RESULTADOS
Figura 1.1.2| Expresión de ARNm de AQP1, AQP3, AQP9 y Cav-1.
La reacción de RT-PCR se llevó a cabo durante 30 ciclos utilizando primers específicos para AQP1, AQP3, AQP9 y Cav-1. En todos los casos se amplificó un solo producto cuyo peso fue el esperado. Primers específicos para β-actina fueron utilizados para corroborar la integridad del ADNc. Luego de la separación por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (p/v) los productos se visualizaron por exposición a luz UV. Como control positivo, se utilizaron muestras de vellosidades coriónicas humanas obtenidas por punción abdominal entre las semanas 12-14 de gestación.
Figura 1.1.3| Expresión proteica de AQP1, AQP3, AQP9 y Cav-1.
Lisados de Swan 71 fueron sometidos a la técnica de Western Blot para detectar la expresión de las proteínas de interés. Se utilizó un anticuerpo primario anti-AQP1 (1:500), anti-AQP3 (1:1000), anti-AQP9 (1:1000) o anti-Cav-1 (1:1000) y un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado a peroxidasa (1:10000). Como control positivo, se utilizaron muestras de vellosidades coriónicas humanas obtenidas por punción abdominal entre las semanas 12-14 de gestación.
Al analizar la expresión a nivel transcripcional se obtuvo un sólo producto de
peso esperado de acuerdo con los primers diseñados específicamente para cada una de
las secuencias. Con respecto a la expresión a nivel proteico se observaron bandas
coincidentes con el PM de las AQPs (28 kDa para las formas no glicosiladas y 35 kDa para
las formas glicosiladas) y Cav-1 (22 kDa).
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RESULTADOS
1.2 Localización de AQP1, AQP3, AQP9 y Cav-1 en la línea celular Swan 71
Posteriormente, nos propusimos evaluar la distribución subcelular de las AQPs y
Cav-1 en la línea celular Swan 71. Mediante inmunofluorescencia indirecta se observó
una intensa localización citoplasmática y en la membrana celular para cada una de las
isoformas de AQP estudiadas. Por el contrario, en el caso de Cav-1 la marca observada
se localizó exclusivamente en la membrana plasmática siendo prácticamente
indetectable en el citoplasma celular (Figura 1.2.1).
De esta forma, se confirmó la expresión y localización de AQP1, AQP3, AQP9 y
Cav-1 por primera vez en la línea celular Swan 71. Estos resultados nos permiten
afirmar que dicha línea celular no solo es adecuada para estudiar el rol de AQPs y Cav-1
en los fenómenos de migración e invasión del citotrofoblasto, sino que además
constituye un modelo representativo de la participación de estas moléculas en el
desarrollo temprano de la placenta humana.
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RESULTADOS
Figura 1.2.1| Localización intracelular de AQP1, AQP3, AQP9 y Cav-1.
Las células se cultivaron en cubreobjetos en presencia de SFB y al cabo de 48 h se analizó la localización subcelular de las proteínas de interés mediante inmunofluorescencia indirecta. Se utilizó un anticuerpo primario anti-AQP1 (1:50), anti-AQP3 (1:50), anti-AQP9 (1:50) y anti-Cav-1 (1:50) y un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado a Texas Red (1:100). Controles negativos se realizaron omitiendo el anticuerpo primario. Los núcleos se muestran en azul (DAPI). Se muestran fotografías representativas de tres ensayos independientes (Magnificación 1000X).
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RESULTADOS
2 Rol de las AQPs en la migración del citotrofoblasto humano
2.1 Bloqueo farmacológico de AQPs
Con el fin de evaluar la participación de las distintas isoformas de las AQPs sobre
la migración, monocapas confluentes de Swan 71 se sometieron al bloqueo
farmacológico de las AQPs previamente al ensayo de cicatrización de herida. Si bien se
recomienda trabajar en ausencia de SFB dado que el estímulo migratorio de sus
componentes puede enmascarar el efecto a analizar, previamente se ha reportado el
efecto pro-apoptótico de la deprivación absoluta de SFB sobre la línea Swan 71202.
Considerando estos antecedentes se decidió trabajar en presencia de 0,5% SFB para
evitar apoptosis celular durante el ensayo y en un registro de 24 h para evitar la
replicación celular.
2.2 Ensayo de cicatrización de herida
A fin de corroborar que los efectos observados no se debieran a citotoxicidad
inducida sobre la línea celular, se realizó un ensayo de MTT para evaluar la viabilidad
luego del bloqueo farmacológico respectivo (Figura 2.2.1 A|). Ninguno de los
tratamientos generó un efecto citotóxico sobre la línea celular. El cierre de la herida en
cada una de las condiciones se comparó con el observado en ausencia del tratamiento
correspondiente (Control) en presencia de DMEM-F12 suplementado con 0,5% SFB
luego de 8, 18 y 24 h (Figura 2.2.1 B|).
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RESULTADOS
Figura 2.2.1| Efecto del bloqueo farmacológico de las AQPs en la migración de células Swan 71.
A| Viabilidad de la línea celular Swan 71 evaluada por medio del ensayo de MTT. B| Imágenes representativas de tres ensayos independientes (40X). Monocapas de células Swan 71 se cultivaron en DMEM-F12 suplementado con 0,5% SFB. La migración celular se determinó mediante el ensayo de cicatrización de herida. C, D, E, F| Análisis del % de cierre de la herida luego del bloqueo no selectivo de las AQPs y del bloqueo selectivo de AQP1, AQP3 y AQP9. Los resultados se muestran como el porcentaje de cierre del área de la herida respecto al tiempo 0 (cero). Los resultados se expresan como la media ± SEM de tres ensayos independientes. *p < 0,05; ***p < 0,001.
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RESULTADOS
Observamos que el bloqueo no selectivo de AQPs (mediado por HgCl2) redujo la
migración celular en todos los tiempos evaluados (Figura 2.2.1 C|, Tabla 2.2.1).
Considerando la situación Control como 100% de cierre de la herida en cada tiempo
analizado, podemos evidenciar una reducción en la capacidad migratoria del orden del
40-50% luego del tratamiento con este compuesto (Figura 2.2.2).
Tabla 2.2.1| Efecto del bloqueo farmacológico de las AQPs en la migración de células Swan 71.
Bloqueo 8 h 18 h 24 h
Control 20,77 ± 1,234 47,50 ± 1,824 56,34 ± 1,220
AQPs 10,36 ± 1,496* 25,64 ± 2,865* 33,00 ± 2,459*
AQP1 17,69 ± 2,179 52,65 ± 1,224 57,14 ± 3,130
AQP3 14,44 ± 1,205# 39,65 ± 2,464# 49,75 ± 2,380#
AQP9 23,21 ± 3,032 42,13 ± 2,408 51,73 ± 2,332
La migración celular se determinó mediante el ensayo de cicatrización de herida. Los resultados se expresan como el porcentaje de cierre del área de la herida respecto al tiempo 0 (cero). #p < 0,05; *p < 0,001.
El bloqueo de AQP1 mediado por TEA (Figura 2.2.1 D|, Tabla 2.2.1) al igual que el
bloqueo de AQP9 mediado por floretina (Figura 2.2.1 F|, Tabla 2.2.1) no generó una
modificación significativa en la capacidad migratoria de la línea celular. Sin embargo, el
bloqueo de AQP3 mediado por CuSO4 redujo la migración de las células Swan 71 en
todos los tiempos evaluados (Figura 2.2.1 E|, Tabla 2.2.1), aunque este efecto fue menor
al obtenido frente al bloqueo no selectivo de todas las isoformas. En este caso, si
consideramos la situación Control como 100% de cierre de la herida en cada tiempo
analizado, podemos evidenciar una reducción en la capacidad migratoria del orden del
20-30% luego del tratamiento con CuSO4 (Figura 2.2.2).
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RESULTADOS
Figura 2.2.2| Efecto del bloqueo farmacológico de las AQPs en la migración de células Swan 71.
La migración celular se determinó mediante el ensayo de cicatrización de herida. Los resultados se expresan como el porcentaje de cierre del área de la herida considerando la situación Control como 100% de cierre en cada tiempo analizado. Se observa una reducción en la capacidad migratoria del orden de 40-50% luego del bloqueo no selectivo y del orden de 20-30% luego del bloqueo de AQP3. *p < 0,05; ***p < 0,001.
Estos resultados demuestran que el bloqueo farmacológico de las AQPs, y en
particular de la AQP3 reduce la migración del citotrofoblasto extravelloso.
Teniendo en cuenta estos hallazgos decidimos confirmar la participación de AQP3
en la migración celular. Para ello, se procedió a realizar un silenciamiento de AQP3
mediado por ARN de interferencia (siRNA).
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RESULTADOS
3 Rol de AQP3 en la migración del citotrofoblasto humano
3.1 Evaluación de la citotoxicidad del agente catiónico de transfección
Los ensayos de transfección deben alcanzar un equilibrio entre el ingreso eficiente
del siRNA y la minimización de la citotoxicidad debida al agente de transfección.
Este compuesto lipídico catiónico forma complejos con los ácidos nucleicos cargados
negativamente, permitiendo su ingreso a la célula vía endocitosis. La capacidad de
interacción del reactivo de transfección con la membrana plasmática es imprescindible
para el ingreso del complejo, pero usualmente ocurre a expensas de una respuesta
citotóxica.
Se evaluó la citotoxicidad del agente de transfección dentro del rango de
concentraciones de uso recomendadas por el fabricante (0,4 – 1,6 µL de reactivo de
transfección por cada 5 x 104 células). Luego de 5 horas de incubación con el reactivo,
las células fueron lavadas e incubadas durante 24 horas en DMEM-F12 suplementado
con 0,5% o 10% SFB. Finalizada la incubación se evaluó la viabilidad celular por medio
del ensayo de MTT (Figura 3.1.1).
P á g . 104 | 173
RESULTADOS
Figura 3.1.1| Efecto citotóxico del reactivo de transfección sobre la línea celular Swan 71.
La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT. Los resultados se expresan considerando como 100% de viabilidad a las células incubadas en medio de transfección en ausencia del reactivo de transfección. Los resultados se expresan como la media ± SEM de tres ensayos independientes. *p < 0,05.
Como era esperable, se observa que la incubación en presencia de 10% SFB indujo
una mayor proliferación con respecto al 0,5% dentro de cada grupo evaluado.
Finalmente, se evaluó la citotoxicidad considerando como viabilidad del 100% a la
obtenida en ausencia del reactivo de transfección en ambos grupos analizados.
La exposición a 1,6 µL de reactivo de transfección presentó un efecto citotóxico en
ambos grupos cuando fueron comparados con sus respectivos controles
(0,5% SFB: 100 vs. 79,20 ± 6,86; 10% SFB: 100 vs. 81,40 ± 6,69).
Por este motivo se decidió evaluar la eficiencia de la transfección dentro del
siguiente rango de concentraciones: 0,4 a 1,2 µL reactivo de transfección por cada
5 x 104 células.
P á g . 105 | 173
RESULTADOS
3.2 Determinación de la eficiencia de transfección
Con el objetivo de determinar la eficiencia de transfección se utilizó un siRNA
control conjugado con isotiocianato de fluoresceína (siCTRL-FITC). Se evaluaron distintas
relaciones de siRNA-reactivo de transfección a fin de determinar la relación óptima.
Para ello se formaron complejos por unión de 1,6 µL siRNA con 0,4; 0,8 y 1,2 µL de
reactivo de transfección (por cada 5 x 104 células), respectivamente. Se decidió
seleccionar la relación 1,6 µL siRNA/1,2 µL reactivo de transfección ya que se evidenció
claramente la incorporación de los complejos fluorescentes a la línea celular Swan 71
(Figura 3.2.1).
Figura 3.2.1| Eficiencia de transfección en la línea celular Swan 71.
Las células se cultivaron en cubreobjetos y finalizada la transfección se analizó la incorporación de los complejos mediante inmunofluorescencia directa. Las células transfectadas presentan una marca verde en el citoplasma. Se muestran fotografías representativas de tres ensayos independientes (Magnificación 200X).
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RESULTADOS
3.3 Silenciamiento de la expresión de AQP3 mediada por siRNA
Una vez establecidas las condiciones óptimas para la transfección, las células se
transfectaron con un ARN de interferencia anti-AQP3 humana (siRNA-AQP3).
Como control se utilizó un ARN de interferencia inespecífico, el cual consiste en una
secuencia control que no conduce a la degradación específica de ningún ARNm celular
(siRNA-CTRL) y se evaluó la expresión de AQP3 a las 24, 48 y 72 h posteriores a la
transfección (Figura 3.3.1).
Figura 3.3.1| Silenciamiento de la expresión de AQP3 mediada por siRNA.
A| Imagen representativa de la expresión de AQP3. +: siRNA-CTRL, -: siRNA-AQP3. B| Semicuantificación de la expresión de AQP3 total. *p < 0,05; ***p < 0,001.
Al evaluar los niveles de AQP3 total se observó una reducción en la expresión en
todos los tiempos analizados, siendo máxima luego de 72 h (24 h: 100 vs. 81,25 ± 10,66;
48 h: 100 vs. 68,40 ± 5,27; 72 h: 100 vs. 33,10 ± 11,37). Por motivos operacionales los
experimentos de migración e invasión se realizaron luego de 24 h de finalizada la
transfección. La recuperación de medios condicionados se realizó a las 24, 48 y 72 h
posteriores a la transfección.
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RESULTADOS
3.4 Ensayo de cicatrización de herida
Con el fin de evaluar el efecto del silenciamiento de AQP3 sobre la migración,
monocapas confluentes de Swan 71 fueron transfectadas utilizando un siRNA específico
para AQP3 (siRNA-AQP3) o bien un siRNA secuencia control (siRNA-CTRL). Luego de 24 h,
se realizó la herida y se evaluó el cierre de la misma a las 8, 18 y 24 h siguientes
(Figura 3.4.1). En forma análoga a lo obtenido mediante el bloqueo farmacológico, el
silenciamiento de AQP3 redujo significativamente la capacidad migratoria de la línea
celular en todos los tiempos evaluados.
Figura 3.4.1| Efecto del silenciamiento de AQP3 en la migración de células Swan 71.
La migración celular se determinó mediante el ensayo de cicatrización de herida. Los resultados se expresan como el porcentaje de cierre del área de la herida respecto al tiempo 0 (cero). Los resultados se expresan como la media ± SEM de tres ensayos independientes. *p < 0,05; **p < 0,01.
De igual manera que en los experimentos previos si consideramos la situación
Control como 100% de cierre de la herida en cada tiempo analizado, podemos evidenciar
una reducción en la capacidad migratoria del orden del 20-30% luego del silenciamiento
de AQP3 (Figura 3.4.2).
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RESULTADOS
Figura 3.4.2| Efecto del silenciamiento de AQP3 en la migración de células Swan 71.
La migración celular se determinó mediante el ensayo de cicatrización de herida. Los resultados se expresan como el porcentaje de cierre del área de la herida considerando el cierre en la situación Control como 100% en cada tiempo analizado. Los resultados se expresan como la media ± SEM de tres ensayos independientes. *p < 0,05; **p < 0,01.
Estos resultados confirman que la AQP3 participa en la migración del
citotrofoblasto extravelloso humano.
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RESULTADOS
4 Rol de Cav-1 en la migración del citotrofoblasto humano 4.1 Disrupción de caveolas mediada por MβCD
El colesterol es el lípido mayoritario en la membrana plasmática regulando su
fluidez y permeabilidad. Por este motivo es el componente principal en lipid rafts y
caveolas, dominios con múltiples funciones biológicas tales como el tráfico de
membrana y la señalización celular.
La depleción de colesterol mediada por MβCD es el método más ampliamente
utilizado para la disrupción de estos dominios de membrana y para el estudio de su
participación en diversos procesos celulares.
Para corroborar la eficiencia del tratamiento con MβCD se analizó la expresión y
localización subcelular de Cav-1. En la situación Control se observa una marca intensa
en la membrana citoplasmática la cual es prácticamente indetectable luego de la
depleción del colesterol, obteniéndose una imagen similar a la observada en el control
negativo. Adicionalmente se evaluó la expresión de Cav-1 luego del tratamiento,
detectándose una reducción del orden del 40% (100 vs. 63,99 ± 8,22) (Figura 4.1.1)
P á g . 110 | 173
RESULTADOS
Figura 4.1.1| Localización y expresión de Cav-1 en células Swan 71.
A| Localización de Cav-1. Las células se cultivaron en cubreobjetos en presencia de SFB y al cabo de 48 h fueron incubadas durante 30 min en presencia de 5 mM MβCD (derecha). Se analizó la localización celular de Cav-1 mediante inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo primario anti-Cav-1 (1:50) y un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado a Texas Red (1:100). La marca roja corresponde a Cav-1, en azul se ven los núcleos. El control negativo se realizó omitiendo el anticuerpo primario (Magnificación 1000X). B| Expresión de Cav-1. Lisados de Swan 71 fueron sometidos a la técnica de Western Blot para evaluar la expresión de Cav-1 luego del tratamiento con 5 mM MβCD. El análisis densimétrico se realizó después de la normalización con β-actina, los valores de abundancia relativa de la proteína se representaron como relación relativa de Cav-1/ β-actina.
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RESULTADOS
4.2 Ensayo de cicatrización de herida
Con el fin de evaluar el efecto de la disrupción de caveolas sobre la migración
monocapas confluentes de Swan 71 fueron sometidas a los siguientes tratamientos:
a) 5 mM MβCD en DMEM-F12 durante 30 min previo a la realización de la herida.
Realización de la herida y posterior seguimiento del cierre durante 24 h en DMEM-F12
suplementado con 0,5% SFB.
b) Realización de la herida y posterior seguimiento del cierre durante 24 h en
DMEM-F12 suplementado con 0,5% SFB (Control).
A fin de corroborar que el efecto obtenido no se debía a citotoxicidad del
tratamiento sobre la línea celular se realizó un ensayo de MTT para evaluar la viabilidad
luego de la disrupción de las caveolas (Figura 4.2.1 A|). El cierre de la herida en cada una
de las condiciones se comparó con el observado al cultivar las monocapas en presencia
de DMEM-F12 0,5% SFB (Control) (Figura 4.2.1 B,C|)
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RESULTADOS
Figura 4.2.1| Efecto de la disrupción de caveolas en la migración de células Swan 71.
A| Viabilidad de la línea celular Swan 71 luego de la incubación con 5 mM MβCD durante 30 min evaluada por medio del ensayo de MTT. B, C| Monocapas de células Swan 71 se cultivaron con DMEM-F12 suplementado con 0,5% SFB y se evaluó el efecto de la disrupción de las caveolas. La migración celular se determinó mediante el ensayo de cicatrización de herida. Los resultados se expresan como el porcentaje de cierre del área de la herida respecto al tiempo 0 (cero). Los resultados se expresan como la media ± SEM de tres ensayos independientes. ***p < 0,001.
Observamos que la disrupción de las caveolas mediada por MβCD redujo la
migración de las células Swan 71 en todos los tiempos evaluados. Si consideramos el
cierre de la herida en la situación Control como 100% en cada tiempo analizado,
podemos evidenciar una reducción en la capacidad migratoria del orden del 30-50%
luego del tratamiento con este compuesto (Figura 4.2.2)
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RESULTADOS
Figura 4.2.2| Efecto de la disrupción de caveolas en la migración de células Swan 71.
La migración celular se determinó mediante el ensayo de cicatrización de herida. Los resultados se expresan como el porcentaje de cierre del área de la herida considerando el cierre en la situación Control como 100% en cada tiempo analizado. Los resultados se expresan como la media ± SEM de tres ensayos independientes. ***p < 0,001.
Es interesante destacar que en este caso se observa una recuperación de la
capacidad migratoria de la línea celular a medida que transcurre el tiempo de análisis.
Por lo tanto, nuestros resultados demuestran que el mantenimiento de una estructura
caveolar intacta es necesaria para la migración del citotrofoblasto extravelloso
humano.
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RESULTADOS
5 Participación de AQP3 y Cav-1 en la invasión del citotrofoblasto humano
5.1 Ensayos de invasión
La capacidad invasiva de la línea celular Swan 71 fue evaluada por medio del
ensayo de invasión sobre insertos previamente tratados con matriz extracelular.
La detección de las células se realizó por tinción con Hematoxilina-Eosina y recuento
sobre imágenes obtenidas con microscopio de campo claro.
Las células fueron sometidas a los tratamientos descriptos previamente con el
objetivo de evaluar la participación de AQP3 y Cav-1 en la invasión del CEV humano.
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RESULTADOS
Bloqueo farmacológico de AQPs
Al analizar el efecto del bloqueo farmacológico de las AQPs sobre la capacidad
invasiva de la línea celular Swan 71 se observó una reducción significativa luego del
bloqueo no selectivo (100 vs. 30,3 ± 6,3) mediado por HgCl2 (Figura 5.1.1). Sin embargo,
cuando la línea celular fue sometida al bloqueo farmacológico selectivo de AQP3 no se
observaron cambios en la capacidad invasiva (100 vs. 107,1 ± 9,7).
Figura 5.1.1| Efecto del bloqueo farmacológico de las AQPs en la invasión de células Swan 71.
A| Imágenes representativas de tres ensayos independientes luego del tratamiento de las células con HgCl2 o CuSO4 (Magnificación 400X). B| La invasión celular se determinó mediante el ensayo de invasión sobre insertos previamente tratados con MEC luego de 24 h. Los resultados se expresan como el número de células que invadieron por campo (izquierda) o bien como el porcentaje de invasión considerando la situación Control como 100% (derecha). Se tomaron como mínimo 10 imágenes representativas en cada condición y se realizaron tres ensayos independientes. *** p < 0,001.
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RESULTADOS
Silenciamiento de AQP3
Con el objetivo de confirmar la participación de AQP3 en la invasión del
citotrofoblasto humano, las células se recuperaron 24 h luego de la transfección para
realizar el ensayo de invasión (Figura 5.1.2). En forma coincidente con los resultados
obtenidos luego del bloqueo farmacológico, no se observó una diferencia en la
capacidad invasiva luego del silenciamiento de AQP3 (100 vs. 97,9 ± 19,4).
Figura 5.1.2| Efecto del silenciamiento de AQP3 en la invasión de células Swan 71.
A| Imágenes representativas de tres ensayos independientes luego del tratamiento de las células con una secuencia control (siRNA-CTRL) o específica para AQP3 (siRNA-AQP3) (Magnificación 400X). B| La invasión celular se determinó mediante el ensayo de invasión sobre insertos previamente tratados con MEC luego de 24 h. Los resultados se expresan como el número de células que invadieron por campo (izquierda) o bien como el porcentaje de invasión considerando la situación Control como 100% (derecha). Se tomaron como mínimo 10 imágenes representativas en cada condición y se realizaron tres ensayos independientes.
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RESULTADOS
Disrupción de caveolas
La línea celular Swan 71 fue sometida al ensayo de invasión luego de la disrupción
de las caveolas mediada por MβCD. No se observó una diferencia significativa en la
capacidad invasiva luego del tratamiento (100 vs. 92,7 ± 11,1) (Figura 5.1.3).
Figura 5.1.3| Efecto de la disrupción de caveolas en la invasión de células Swan 71.
A| Imágenes representativas de tres ensayos independientes luego del tratamiento de las células con MβCD (Magnificación 400X). B| La invasión celular se determinó mediante el ensayo de invasión sobre insertos previamente tratados con MEC luego de 24 h. Los resultados se expresan como el número de células que invadieron por campo (izquierda) o bien como el porcentaje de invasión considerando la situación Control como 100% (derecha). Se tomaron como mínimo 10 imágenes representativas en cada condición y se realizaron tres ensayos independientes.
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RESULTADOS
5.2 Evaluación de la actividad de MMP por zimografía
La expresión de MMP-2 y MMP-9 a nivel del CEV es central para una invasión
exitosa durante el primer trimestre de gestacion203. Sin embargo, estudios previos sobre
la línea celular Swan 71 sólo detectaron la expresión de MMP-2204. Por lo tanto,
decidimos estudiar el efecto que los tratamientos previamente mencionados ejercían
sobre la actividad de MMP-2. Finalizados los correspondientes tratamientos,
monocapas de Swan 71 se mantuvieron en DMEM-F12 en ausencia de SFB, a fin de
recuperar medios condicionados (MC) para el estudio de las MMP secretadas luego de
24, 48 y 72 h.
Como controles positivos de la actividad enzimática se utilizaron las líneas
celulares Bewo (MMP-2) y HTR-8 (MMP-2 y MMP-9).
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RESULTADOS
Bloqueo farmacológico de AQPs
De forma coincidente a los resultados obtenidos en el ensayo de invasión
observamos una reducción en la actividad de MMP-2 luego del bloqueo no selectivo de
AQPs (Figura 5.2.1) y una actividad conservada de esta endopeptidasa a las 24, 48 y 72 h
en el caso del bloqueo de AQP3 mediado por CuSO4 (Figura 5.2.2).
Figura 5.2.1| Efecto del bloqueo farmacológico de las AQPs sobre la actividad de MMP-2.
Células Swan 71 fueron incubadas durante 30 min en presencia de 50 µM HgCl2 en DMEM-F12 (Bloqueo no selectivo). Luego del tratamiento, se incubaron en DMEM-F12 sin SFB durante 24, 48 y 72 h para recuperar los medios condicionados. La actividad de MMP-2 fue determinada por medio de zimografía sobre geles conteniendo 1 mg/mL de gelatina. A| Zimografía representativa de los MC obtenidos. B| Cuantificación de la actividad de MMP-2 por análisis densitométrico. Los resultados se expresan relativizados a la actividad de MMP-2 en el medio Control a las 24 h. Se realizaron tres ensayos independientes. ***p < 0,001.
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RESULTADOS
Figura 5.2.2| Efecto del bloqueo farmacológico de AQP3 sobre la actividad de MMP-2.
Células Swan 71 fueron incubadas durante 24 h en presencia de 100 µM CuSO4 en DMEM-F12 (Bloqueo de AQP3). Luego del tratamiento, se incubaron en DMEM-F12 sin SFB durante 24, 48 y 72 h para recuperar los medios condicionados. La actividad de MMP-2 fue determinada por medio de zimografía sobre geles conteniendo 1 mg/mL de gelatina. A| Zimografía representativa de los MC obtenidos. B| Cuantificación de la actividad de MMP-2 por análisis densitométrico. Los resultados se expresan relativizados a la actividad de MMP-2 en el medio Control a las 24 h. Se realizaron tres ensayos independientes.
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RESULTADOS
Silenciamiento de AQP3
De igual manera que luego del bloqueo farmacológico, no se observó una
diferencia significativa en la actividad de MMP-2 en ninguno de los tiempos evaluados
(Figura 5.2.3) luego del silenciamiento de AQP3.
Figura 5.2.3| Efecto del silenciamiento de AQP3 sobre la actividad de MMP-2.
Finalizada la transfección, las células se incubaron en DMEM-F12 sin SFB durante 24, 48 y 72 h para recuperar los medios condicionados. La actividad de MMP-2 fue determinada por medio de zimografía sobre geles conteniendo 1 mg/mL de gelatina. A| Zimografía representativa de los MC obtenidos. B| Cuantificación de la actividad de MMP-2 por análisis densitométrico. Los resultados se expresan relativizados a la actividad de MMP-2 en el medio Control a las 24 h. Se realizaron tres ensayos independientes.
Estos resultados confirman la participación de las AQPs de manera isoforma
independiente en la invasión del citotrofoblasto extravelloso humano.
Esta modulación podría explicarse al menos parcialmente por la reducción en la
actividad de MMP-2, metaloproteasa crítica para una invasión exitosa durante el
primer trimestre de gestación.
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RESULTADOS
Disrupción de caveolas
Luego de la disrupción de las caveolas mediada por MβCD las células se
mantuvieron en DMEM-F12 sin SFB durante 24, 48 y 72 h para recuperar los MC.
No se observó una diferencia significativa en la actividad de MMP-2 en ninguno de los
tiempos evaluados (Figura 5.2.4).
Figura 5.2.4| Efecto de la disrupción de caveolas sobre la actividad de MMP-2.
Células Swan 71 fueron incubadas durante 30 min en presencia de 5 mM MβCD en DMEM-F12. Luego del tratamiento, se incubaron en DMEM-F12 sin SFB durante 24, 48 y 72 h para recuperar los medios condicionados. La actividad de MMP-2 fue determinada por medio de zimografía sobre geles conteniendo 1 mg/mL de gelatina. A| Zimografía representativa de los MC obtenidos. B| Cuantificación de la actividad de MMP-2 por análisis densitométrico. Los resultados se expresan relativizados a la actividad de MMP-2 en el medio Control a las 24 h. Se realizaron tres ensayos independientes.
Estos resultados confirman que la disrupción de las caveolas, al menos en las
condiciones evaluadas, no modifica la capacidad invasiva del citotrofoblasto
extravelloso humano.
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RESULTADOS
6 Estudio de la asociación entre Cav-1 y AQP3
6.1 Colocalización de Cav-1 y AQP3
Por medio de una doble inmunofluorescencia indirecta fue posible corroborar la
colocalización de AQP3 y Cav-1 en la membrana plasmática de la línea celular Swan 71
(Figura 6.1.1).
Figura 6.1.1| Colocalización de AQP3 y Cav-1.
Las células se cultivaron en cubreobjetos en presencia de SFB y al cabo de 48 h se analizó la colocalización de las proteínas de interés mediante inmunofluorescencia indirecta. Se utilizó un anticuerpo primario anti-AQP3 (1:50) y un anticuerpo monoclonal anti-Cav-1 (1:50). Como anticuerpos secundarios se utilizó una mezcla de anti-IgG de conejo conjugado a Texas Red y anti-IgG de ratón conjugado a fluoresceína. La marca roja corresponde a AQP3, la verde a Cav-1, en azul se ven los núcleos. Se muestran fotografías representativas de tres ensayos independientes (Magnificación 400X).
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RESULTADOS
6.2 Co-inmunoprecipitación de Cav-1 y AQP3
Para confirmar los resultados obtenidos previamente realizamos una
inmunoprecipitación de Cav-1 utilizando AQP3 para el revelado. Observamos que ambas
proteínas co-inmunoprecipitan en la línea celular Swan 71 (Figura 6.2.1).
Figura 6.2.1| Co-inmunoprecipitación de AQP3 y Cav-1.
Lisados de células Swan 71 se incubaron con proteína–A-Sefarosa unida a un anticuerpo anti-Cav-1. Los inmunoprecipitados se resolvieron por Western blot usando un anticuerpo anti-AQP3. A| Fracción no unida. B| Fracción unida.
Estos resultados confirman que AQP3 se encuentra preferentemente localizada
en caveolas en células del citotrofoblasto extravelloso humano.
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RESULTADOS
7 Capacidad de la línea celular Swan 71 de adquirir un fenotipo endovascular
7.1 Ensayo de tubulogénesis
Como se describió previamente, el CEV es responsable de la invasión del
endometrio decidualizado y el miometrio (CEV intersticial) y de la remodelación de las
arterias espiraladas (CEV endovascular) transformándolas en vasos de amplio diámetro
y baja resistencia4.
Con el objetivo de determinar si la línea celular Swan 71 podía asumir un fenotipo
endovascular se realizó un ensayo de tubulogénesis luego de los siguientes
tratamientos:
a) Bloqueo farmacológico no selectivo de AQPs (mediado por HgCl2)
b) Bloqueo farmacológico selectivo de AQP3 (mediado por CuSO4)
c) Disrupción de caveolas (mediado por MβCD)
Como control del ensayo se utilizó DMEM-F12 suplementado con 3% SFB y se
evaluó la formación de túbulos a las 6 h. Se evaluaron tres parámetros de angiogénesis
obtenidos a partir del Angiogenesis Analyzer; nodos (puntos de conexión en la red de
túbulos), segmentos (extensión de túbulos que aún no han formado una red) y
formación de la red propiamente dicha (Figura 7.1.1).
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RESULTADOS
Figura 7.1.1| Efecto del bloqueo de AQPs y disrupción de caveolas sobre la formación de túbulos de la línea celular Swan 71.
A, B y C| Los resultados se expresan como formación de nodos, segmentos y red de túbulos considerando como 100% al Control a las 6 h. Los resultados se expresan como la media ± SEM de tres ensayos independientes. *p < 0,05; ***p < 0,001.
Estos resultados demuestran que la línea celular Swan 71 es capaz de adquirir un
fenotipo endovascular con formación de una red de túbulos. Adicionalmente podemos
concluir que la disrupción de las caveolas modula la formación de una red tubular en
las células del citotrofoblasto extravelloso humano.
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RESULTADOS
8 Ensayos de funcionalidad endotelial
Como previamente fue descripto, la remodelación de las arterias espiraladas del
útero materno es crucial para el crecimiento y desarrollo normal del feto. Los cambios
iniciales involucran una modificación generalizada de estas arterias debido a la
activación del sistema renina-angiotensina de la decidua205. Luego de estos cambios, las
células del CEV intersticial localizadas perivascularmente inducen una mayor
remodelación de las arterias. Finalmente son las células del CEV endovascular las que
invaden y reemplazan a las células endoteliales, alcanzando incluso la capa media
muscular de la arteria4.
Las células endoteliales en el adulto se encuentran en estado quiescente a menos
que sean activadas por factores angiogénicos tales como el factor de crecimiento
vascular endotelial (VEGF) o la interleuquina-8 (IL-8). Esta activación origina un aumento
en la proliferación, la migración hacia tejidos adyacentes y finalmente la formación de
túbulos con la consecuente diferenciación en nuevos vasos. La angiogénesis puede ser
inhibida potencialmente en múltiples niveles ya sea por bloqueo en la producción o
secuestro de factores angiogénicos, inhibición de la unión a sus receptores o bien por
alteración de sus vías de señalización.
Por lo tanto, se evaluó el efecto de MC de la línea celular Swan 71 sobre la
proliferación, migración y formación de túbulos de la línea endotelial EA.hy926.
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RESULTADOS
8.1 Efecto de MC de la línea celular Swan 71 sobre la proliferación de EA.hy926
La proliferación es el primer paso requerido para la angiogénesis ya que provee
las células necesarias para la formación de nuevos vasos. Luego de los tratamientos
correspondientes las células Swan 71 se mantuvieron en DMEM-F12 durante 24, 48 y
72 h para recuperar los MC. Se evaluó el efecto de dichos medios sobre la proliferación
de las células endoteliales por medio de un ensayo de MTT luego de 48 horas de
incubación (Figura 8.1.1).
En primer lugar, se evaluó la proliferación obtenida con los MC Control de cada
tratamiento específico (obtenidos luego de 24 h) considerando como 100% la
proliferación obtenida en presencia de DMEM-F12 fresco (Figura 8.1.1 A|). Se observa
que los MC control inducen una proliferación del orden del 80-100%. Esta reducción
puede explicarse en parte por el agotamiento de ciertos nutrientes en los MC.
Por último, cada tratamiento se evaluó individualmente. Se consideró como 100%
de proliferación a la obtenida en presencia del MC Control recuperado luego de 24
horas. Ninguno de los MC obtenidos post-tratamiento provocó diferencias significativas
con respecto a su control (Figura 8.1.1 B-F|) en ninguno de los tiempos analizados.
Debido a que no se observaron diferencias en el efecto de los MC en función del
tiempo de recuperación y a fin de simplificar los ensayos posteriores, se decidió trabajar
solo con MC recuperados luego de 72 h de incubación.
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RESULTADOS
Figura 8.1.1| Efecto de MC de Swan 71 sobre la proliferación de la línea endotelial EA.hy926.
A| Proliferación obtenida con los MC Control de cada tratamiento específico considerando como 100% la obtenida en presencia de DMEM-F12 fresco. B| Análisis de la proliferación en presencia de MC obtenidos 24, 48 y 72 horas luego de los tratamientos. Se analizó la proliferación en presencia de MC obtenidos luego del bloqueo no selectivo de AQPs (C|), bloqueo farmacológico de AQP3 (D|), silenciamiento de AQP3 (E|) y disrupción de caveolas (F|). La proliferación se evaluó por medio de un ensayo de MTT luego de 48 horas, considerando como 100% la proliferación obtenida en el MC Control recuperado a las 24 h. Los resultados se expresan como la media ± SEM de tres ensayos independientes.
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RESULTADOS
8.2 Efecto de MC de la línea celular Swan 71 sobre la migración de EA.hy926
Distintos factores de crecimiento pueden contribuir a la migración endotelial al
activar diversas vías de transducción de señales. Se evaluó la capacidad migratoria
mediante el ensayo de cicatrización de herida en presencia de MC recuperados luego de
72 h de incubación. Las condiciones del ensayo fueron idénticas a las descriptas con la
línea celular Swan 71 (Figura 8.2.1). De manera coincidente con los resultados de
proliferación, no se observaron diferencias en la migración de la línea EA.hy926 frente a
ninguno de los MC obtenidos luego del tratamiento de la línea celular Swan 71.
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RESULTADOS
Figura 8.2.1| Efecto de MC de Swan 71 sobre la migración de la línea endotelial EA.hy926.
Monocapas confluentes de células EA.hy926 se incubaron con MC provenientes de Swan 71 luego de 72 h del bloqueo no selectivo de AQPs (A|), bloqueo farmacológico de AQP3 (B|), silenciamiento de AQP3 (C|) y disrupción de caveolas (D|). La migración celular se determinó mediante el ensayo de cicatrización de herida. Los resultados se muestran como el porcentaje de cierre del área de la herida respecto al tiempo 0 (cero). Los resultados se expresan como la media ± SEM de tres ensayos independientes.
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RESULTADOS
8.3 Efecto de MC de la línea celular Swan 71 sobre la tubulogénesis de EA.hy926
La angiogénesis es la formación de nuevos vasos a partir de una red vascular
preexistente. Este proceso es responsable de la vascularización en tejidos embrionarios
y en crecimiento, en el ciclo ovárico-uterino, durante la reparación de tejidos y en
patologías como el cáncer y la artritis reumatoidea. La angiogénesis involucra una serie
de eventos coordinados, incluyendo la degradación de la MEC adyacente y finalmente
la proliferación y migración de las células endoteliales para formar nuevos vasos206.
La formación in vitro de túbulos a partir de células endoteliales sobre una matriz
extracelular es un método versátil para evaluar factores pro y anti-angiogénicos. Por lo
tanto, decidimos evaluar la formación de túbulos de la línea endotelial EA.hy926 en
presencia de MC de Swan 71 recuperados luego de 72 h de los tratamientos
correspondientes. Como control del ensayo se utilizó DMEM-F12 suplementado con
3% SFB y se evaluó la formación de túbulos a las 6 h. De la misma manera que con la
línea celular Swan 71 se evaluaron tres parámetros de angiogénesis obtenidos a partir
del Angiogenesis Analyzer; nodos (puntos de conexión en la red de túbulos,
representados como círculos blancos), segmentos (extensión de túbulos que aún no han
formado una red, representados como líneas discontinuas) y formación de la red
propiamente dicha (representada como líneas continuas) (Figura 8.3.1).
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RESULTADOS
Figura 8.3.1| Efecto de MC de Swan 71 sobre la tubulogénesis de la línea endotelial EA.hy926.
A| Imágenes representativas de tres ensayos independientes mostrando la formación de túbulos luego de la incubación en DMEM-F12 3% SFB (Control) o MC provenientes de Swan 71 luego de 72 h del tratamiento con MβCD (Magnificación 100X). A-D| Los resultados se expresan como formación de nodos, segmentos y red de túbulos considerando como 100% al Control a las 6 h. Los resultados se expresan como la media ± SEM de tres ensayos independientes. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.
Estos resultados demuestran que sólo los MC obtenidos luego de la disrupción de
caveolas en la línea celular Swan 71 modulan la actividad de la línea celular endotelial
EA.hy926. A pesar de la ausencia de cambios en la proliferación o migración celular,
dicho MC incrementó significativamente la formación de nuevos vasos en las células
endoteliales.
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DISCUSIÓN
DISCUSIÓN
Se sabe que una diferenciación, proliferación e invasión trofoblásticas
perfectamente sincronizadas son necesarias para lograr un embarazo exitoso. Hoy en
día, los mecanismos moleculares que regulan estos complejos procesos siguen siendo
desconocidos. En el ser humano, las células de citotrofoblasto se diferencian a
citotrofoblasto velloso y extravelloso. Las células del CEV proliferan, migran e invaden la
decidua materna y el miometrio uterino, remodelando las arterias espiraladas maternas
mediante la adopción de un "fenotipo endovascular" y reemplazando el revestimiento
endotelial de las mismas207.
De este modo, las células del CEV pierden su fenotipo epitelial organizado y
experimentan una transición a un fenotipo mesenquimal migratorio e invasivo.
Estos eventos se asemejan al proceso de transición epitelio-mesénquima (TEM) y
permiten a las células del CEV migrar e infiltrarse en la decidua y los vasos
maternos208,209. Aunque los mecanismos celulares subyacentes a la TEM en las células
trofoblásticas aún se desconocen, ha sido demostrado que estas células usan la misma
maquinaria molecular que las células tumorales malignas para su crecimiento, migración
e invasión. Sin embargo a diferencia de las células tumorales, el comportamiento del
trofoblasto está estrictamente controlado por el entorno uterino de forma espacio-
temporal, por lo que estas células “trofoblásticas pseudomalignas” presentan
mecanismos para regular estos eventos210.
P á g . 135 | 173
DISCUSIÓN
Por otro lado, el CEV recubre las vellosidades coriónicas y está en contacto directo
con la sangre materna siendo responsable del intercambio feto-placentario. Fallas en el
proceso de placentación desencadenan hipoperfusión, daño tisular e hipoxia del
trofoblasto y sus consecuencias incluyen muerte fetal, restricción del crecimiento
intrauterino y preeclampsia144,211.
Por ende, determinar los mecanismos fisiológicos que regulan los estadios iniciales
de formación de la placenta y establecer los factores que limitarían los mismos, nos
ayudará a dilucidar la fisiopatogenia de dichos desórdenes, con el fin de encontrar
nuevas estrategias que contribuyan a mejorar el funcionamiento placentario y lograr
una gestación exitosa.
La migración es un fenómeno central en la diseminación tumoral tanto en la
infiltración del tejido circundante como en la aparición de metástasis a distancia.
Las AQPs se encuentran sobreexpresadas en una variedad de tumores43,177–180 y su
expresión se correlaciona con un mayor grado tumoral. Por su parte Cav-1 regula
múltiples procesos asociados al cáncer incluyendo la migración celular, el crecimiento
tumoral, la angiogénesis y la metástasis184. Si bien hace más de una década se determinó
la similitud entre el citotrofoblasto extravelloso y las células tumorales8, el rol de las
AQPs y Cav-1 en los estadios iniciales de formación de la placenta humana aún se
desconoce.
P á g . 136 | 173
DISCUSIÓN
En este contexto, en este trabajo de tesis estudiamos el papel de AQPs y Cav-1
en el microambiente placentario e investigamos su participación en la migración,
invasión y diferenciación endovascular del CEV y su interacción con el endotelio de las
arterias uterinas.
Los estudios que requieren citotrofoblasto de primer trimestre pueden
encontrarse limitados por la falta de acceso a las muestras y/o al número de células
requerido para desarrollar los ensayos. Adicionalmente los cultivos primarios de células
trofoblásticas presentan una duración limitada212. Si bien se han establecido líneas
celulares por transformación mediada por el virus SV-40, se demostró que esta
estrategia suele inducir anomalías fenotípicas y/o cariotípicas213,214. En forma
alternativa han sido ampliamente utilizadas líneas celulares derivadas de
corioncarcinoma, sin embargo, estas células se encuentran transformadas y son
tumorigénicas215. Con el objetivo de superar estas limitaciones se decidió utilizar a la
recientemente establecida línea celular Swan 71189, como un modelo representativo del
CEV durante el primer trimestre de gestación.
Nuestro primer objetivo fue estudiar la expresión y localización de AQPs y Cav-1
en la línea celular Swan 71.
La expresión de las AQPs placentarias ha sido ampliamente estudiada a lo largo
del embarazo. Después de la fecundación, el cigoto se diferencia a blastocisto que
consiste en una masa celular interna (embrioblasto) y una cavidad llena de líquido
(blastocele) rodeada de un epitelio: el trofoectodermo, que dará lugar a la placenta y al
P á g . 137 | 173
DISCUSIÓN
corion. En humanos, se detectó la expresión de ARNm de AQP1, AQP2, AQP3, AQP4,
AQP5, AQP7, AQP9, AQP11 y AQP12 en embriones preimplantación71. Sin embargo, se
encontró que solo la expresión de AQP3 y AQP7 persiste desde las etapas de cigoto a
blastocisto, y al igual que en blastocistos de ratón se cree que estas AQPs pueden
desempeñar un papel en el movimiento de agua a través del trofoectodermo durante el
proceso de cavitación74,75. En estudios posteriores, se observó que las AQP1, AQP3,
AQP4, AQP5, AQP8, AQP9 y AQP11 se expresan en vellosidades coriónicas de 10-14
semanas de gestación y se observó una expresión mayoritaria de las isoformas 1, 3 y 973.
De forma coincidente a lo observado en muestras de vellosidades coriónicas
humanas de primer trimestre, demostramos la expresión de AQP1, AQP3 y AQP9 por
primera vez en la línea celular Swan 71.
Si bien se ha propuesto que el rol principal de estas AQPs es mediar el intercambio
materno-fetal de agua, evidencias indican que alteraciones en su expresión no
afectarían dicho intercambio216. Recientemente se informaron roles celulares
inesperados de las AQPs como la proliferación, la apoptosis y la migración celular217,218.
Todos estos procesos requieren cambios transitorios en el volumen celular y en la
actividad de ciertos transportadores iónicos. Posiblemente la presencia de AQPs en
etapas tempranas del desarrollo placentario esté relacionada con estos eventos.
P á g . 138 | 173
DISCUSIÓN
En lo que respecta a Cav-1 también encontramos que se expresa en esta línea
celular. Poco se sabe de su expresión en trofoblasto de primer trimestre, aunque en
placentas a término se la ha encontrado en citotrofoblasto y en menor medida en STh.
Estudios de sincialización en la línea celular Bewo permiten inferir que la diferenciación
a STh resulta en una reducción de la expresión de esta proteína y consecuentemente,
en una reducción considerable en la presencia de caveolas en la membrana
plasmatica124. Esto nos sugiere que Cav-1 estaría cumpliendo un papel importante
durante la formación inicial de la placenta.
Los resultados obtenidos nos permiten concluir que la línea celular Swan 71
expresa AQP1, AQP3, AQP9 y Cav-1 al igual que las vellosidades coriónicas de primer
trimestre constituyendo un modelo representativo para el estudio de los mecanismos
involucrados en la placentación durante dicho estadio.
Nuestro segundo objetivo fue evaluar la participación de AQPs y Cav-1 en la
migración del citotrofoblasto extravelloso.
Como previamente fue descripto la migración de las células del CEV constituye un
fenómeno crucial en el desarrollo temprano de la placenta, permitiendo una
remodelación exhaustiva de las arterias espiraladas maternas y asegurando un correcto
flujo útero-placentario. El flujo de agua mediado por AQPs facilitaría la migración celular
por medio de dos mecanismos: inducir cambios en la morfología de la célula y colaborar
en la propulsión de la misma en la dirección del movimiento10.
P á g . 139 | 173
DISCUSIÓN
Los cambios característicos que sufre una célula en migración se han descripto con
anterioridad. Estas células presentan polarización en la dirección del movimiento y
motilidad dependiente del citoesqueleto de actina y miosina219. Las células pueden
presentar dos clases de movimiento: el ameboide y el mesenquimático. El primero se
caracteriza por una débil adhesión al sustrato sin participación de adhesiones focales en
el mecanismo del movimiento. El movimiento mesenquimático en cambio, es
característico de tipos celulares que han sufrido una TEM e involucra fuertes adhesiones
focales con la MEC, la contracción del citoesqueleto y la adquisición de una morfología
celular ahusada220. La transformación del citotrofoblasto al CEV es consistente con una
TEM208, por lo tanto, la línea celular Swan 71 presentaría este tipo de movimiento.
Existen múltiples reportes acerca de la participación de AQP144,181,221,222 y
AQP349,170,223 en la migración de distintas líneas celulares. Por otra parte las
caveolas/Cav-1 también han sido relacionadas con la migración celular187,224,225 ya que
estos dominios actúan como plataformas de señalización capaces de modular este
proceso. La Cav-1 presenta una distribución polarizada en células en migración, se
encuentra asociada al citoesqueleto y su expresión se correlaciona con la capacidad
migratoria celular11. Sin embargo, se desconoce si alguna de estas proteínas modula la
migración del CEV humano.
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DISCUSIÓN
En este trabajo, evaluamos la migración celular mediante el ensayo de
cicatrización de herida sobre monocapas confluentes de células Swan 71. Este ensayo
ha sido ampliamente utilizado debido a su bajo costo y complejidad. El tratamiento
previo de la superficie permite evaluar la migración sobre diversos sustratos como el
colágeno, la fibronectina o la MEC. Se lo considera particularmente apropiado para
evaluar la migración en un entorno donde las interacciones célula-célula y célula-matriz
se encuentran conservadas. En la cámara de Boyden, otro método de amplia difusión,
la preparación de una suspensión celular previamente al ensayo disrumpe estas
interacciones. El método de cicatrización de herida presenta como ventaja adicional la
posibilidad de estudiar este proceso a distintos tiempos, permitiendo analizar la cinética
de la migración, a diferencia de la cámara de Boyden donde sólo se evalúa un tiempo
final. Sin embargo, presenta desventajas ya que no permite estudiar estímulos
quimioatractantes al no establecerse un gradiente, y deben controlarse rigurosamente
el área de la herida realizada, el lavado de las células para evitar su readhesión y la
aparición de lesiones sobre la superficie que puedan generar artefactos en los
resultados226,227. Si bien se recomienda trabajar en ausencia de SFB dado que el estímulo
migratorio de sus componentes puede enmascarar el efecto a analizar; previamente se
ha reportado el efecto pro-apoptótico de la deprivación absoluta de SFB sobre la línea
Swan 71202. Considerando estos antecedentes se decidió trabajar en presencia de 0,5%
SFB para evitar apoptosis celular durante el ensayo y en un registro de 24 h para evitar
la replicación celular.
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DISCUSIÓN
Con el fin de evaluar la participación de las distintas isoformas de las AQPs y Cav-
1 sobre la migración del CEV monocapas confluentes de Swan 71 se sometieron a
distintas estrategias metodológicas.
Para el caso de las AQPs se recurrió en primer lugar al bloqueo farmacológico de
las distintas isoformas. Si bien la estrategia del bloqueo farmacológico ha sido
ampliamente superada por otras metodologías, aún continúa siendo aplicada.
Dicho bloqueo se realizó mediante compuestos mercuriales, CuSO4, floretina y cloruro
de tetraetilamonio (TEA).
Los compuestos mercuriales fueron los primeros en ser descriptos como
bloqueantes no selectivos de las AQPs, al corroborarse que el flujo de agua mediado por
AQP1 en ovocitos de Xenopus laevis era sensible a HgCl2195. Al incubar los ovocitos en
presencia de 0,3 mM HgCl2, se observaba una reducción del 60% en la permeabilidad al
agua. Posteriormente se comprobó que la inhibición se debía a la elevada afinidad del
Hg2+ a la Cys189 presente en el poro del canal, generando un bloqueo estérico del
mismo228.
Estudios posteriores permitieron determinar la existencia de bloqueantes
relativamente selectivos sobre las distintas isoformas. El TEA previamente descripto
como un agente bloqueante de los canales de K+, presenta un efecto inhibitorio sobre
AQP1 (y adicionalmente sobre AQP2 y AQP4) por unión a la Tyr186 presente en el bucle-
E del canal. La incubación de ovocitos de Xenopus con 100 µM TEA reduce la
permeabilidad de AQP1 al agua entre un 20-40%, un bloqueo similar al obtenido por
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DISCUSIÓN
incubación con 100 µM HgCl2196. Posteriormente se comprobó que el TEA bloquea el
flujo de agua mediado por AQP1 tanto en su forma nativa en riñón como luego de su
expresión en la línea celular MDCK229.
La inhibición de AQP3 mediada por Cu2+ se atribuye a su unión a los residuos
Trp128, Ser152 y His154 previamente reportados como los responsables del bloqueo del
canal mediado por Ni2+. Ensayos sobre una línea celular humana transfectada con AQP3
revelaron que el Cu2+ es un potente inhibidor de la permeabilidad del canal al agua y al
glicerol. Al incubar las células en presencia de 500 µM CuSO4 la permeabilidad a ambos
solutos se reducía aproximadamente un 50%197.
La floretina es un derivado flavonoide con actividad inhibitoria sobre un amplio
grupo de canales iónicos230. El tratamiento de ovocitos de Xenopus con 100 µM floretina
reduce la permeabilidad de AQP9 al agua (aproximadamente un 80%) y al resto de sus
sustratos, e inhibe sólo parcialmente la permeabilidad de AQP3 al agua y urea19,198.
En nuestros ensayos los resultados obtenidos luego del bloqueo no selectivo
(mediado por HgCl2) permitieron corroborar la participación de las AQPs en la migración
del CEV, observándose una reducción en la capacidad migratoria del orden del 40%
luego del tratamiento con este compuesto. El bloqueo de AQP1 (mediado por TEA) y el
de AQP9 (mediado por floretina) no generó una modificación significativa en la
capacidad migratoria de la línea celular.
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DISCUSIÓN
Sin embargo, el bloqueo de AQP3 (mediado por CuSO4) redujo la migración de las
células Swan 71 en todos los tiempos evaluados, aunque este efecto fue menor al
obtenido frente al bloqueo no selectivo de todas las isoformas. En este caso, si
consideramos la situación control como 100% de cierre de la herida en cada tiempo
analizado, podemos evidenciar una reducción en la capacidad migratoria del orden del
30%. Debido a que el bloqueo con HgCl2 o CuSO4 en las condiciones utilizadas no afectó
la viabilidad de las células Swan 71, el efecto observado no parece ser atribuible a la
citotoxicidad de estos compuestos.
Los agentes previamente descriptos (metales iónicos, TEA, floretina) son
herramientas valiosas para el bloqueo farmacológico de las AQPs, pero carecen de la
eficacia y especificidad necesaria para corroborar con certeza su participación en
distintos fenómenos biológicos. En este trabajo se utilizaron como estrategia preliminar
para evaluar la participación de todas las AQPs expresadas en las células Swan 71 en la
migración celular. Los resultados obtenidos permitieron orientar los ensayos posteriores
al silenciamiento de AQP3.
En base a estos datos silenciamos específicamente la expresión de AQP3 y
corroboramos que dicho tratamiento reduce significativamente la migración del CEV en
un 20%. Este hallazgo confirma que la AQP3 interviene en el proceso de migración
celular del citotrofoblasto extravelloso humano.
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DISCUSIÓN
Diversos grupos de investigación evaluaron el rol de las AQPs en la migración
celular en otros tejidos, corroborando que la participación en este fenómeno es
independiente de la isoforma y del tipo celular evaluado10.
Cao et al. evaluaron la participación de AQP3 en la migración de fibroblastos
humanos luego de la estimulación con el factor de crecimiento epidérmico (EGF).
Cuando los fibroblastos eran incubados durante 24 h en presencia de EGF y CuSO4, la
migración celular inducida por este factor de crecimiento se inhibía significativamente.
La capacidad inhibitoria de CuSO4 ya era detectable en una concentración 10 µM si bien
alcanzaba su efecto máximo en 500 µM. Finalmente corroboraron la participación de
AQP3 por medio de su silenciamiento, detectando una reducción del 60% en la
migración inducida por EGF170. Tomando en consideración estos resultados, utilizaron la
misma estrategia experimental para evaluar la participación de AQP3 en la migración de
células de carcinoma de ovario. El tratamiento con 100 µM CuSO4 y el silenciamiento de
AQP3 inhibían significativamente la migración celular inducida por EGF231.
Asimismo, Verkman et al. demostraron una capacidad reducida para la
cicatrización de heridas cutáneas en ratones knockout para AQP3 y en una línea celular
de queratinocitos luego del silenciamiento de dicha isoforma49. Recientemente, Zhang
et al. analizaron la participación de AQP3 en la migración de células de cáncer de mama
luego de la estimulación con el factor de crecimiento fibroblástico (FGF). El tratamiento
con CuSO4 en el intervalo 10-500 µM y el silenciamiento de AQP3, reducían
significativamente la migración de ambas líneas celulares evaluadas223.
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DISCUSIÓN
Resulta interesante destacar que la misma estrategia experimental fue utilizada
para evaluar la participación de otras isoformas de AQP en la migración celular.
Hayashi et al. evaluaron la participación de AQP1 en la migración de células del epitelio
gástrico durante la cicatrización de heridas. El tratamiento con HgCl2 y el silenciamiento
de AQP1 reducían significativamente la migración celular. Adicionalmente,
Pelagalli et al. evaluaron el efecto de stem cells de médula ósea en el microambiente
tumoral del osteosarcoma y del hepatocarcinoma celular. Corroboraron que medios
condicionados provenientes de las stem cells incrementaban la expresión de AQP1 y la
migración e invasión de las células tumorales. El tratamiento con 100 µM TEA reducía
significativamente la migración e invasión celular, evaluadas por el ensayo de
cicatrización de herida y la cámara de Boyden respectivamente232.
Dado que la expresión de AQP3 persiste de cigoto a las etapas de blastocisto y que
se trata de la isoforma más abundantemente expresada en vellosidades coriónicas de
primer trimestre73, creemos que esta proteína puede ser esencial para el desarrollo
temprano de la placenta y el feto. Sin embargo, teniendo en cuenta la diversidad de
AQPs que expresa el trofoblasto lo que implica una redundancia de información y que
la mayor reducción de la migración se obtuvo con el bloqueo general de las AQPs, no
podemos descartar que todas las isoformas estén involucradas en este proceso, y que
la mayor participación de la AQP3 en el mismo sea simplemente el resultado de su
mayor expresión en el sistema en estudio.
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DISCUSIÓN
En lo concerniente a Cav-1, para evaluar su participación en la migración celular
se recurrió a una estrategia indirecta. Las ciclodextrinas (CD) son oligosacáridos solubles
en agua con una cavidad hidrofóbica central. Estas moléculas están constituidas por D-
glucopiranosas unidas por enlaces α-(1-4) y pueden formar hexámeros (α-CD),
heptámetros (β-CD) u octámeros (γ-CD). El número de moléculas de glucopiranosa y el
grado de polimerización determina el tamaño de la cavidad hidrofóbica y,
consecuentemente, la afinidad especifica frente a distintos compuestos.
Adicionalmente, la metilación incrementa la solubilidad en agua de estos compuestos.
La metil-β-ciclodextrina (MβCD) tiene una capacidad elevada de unión al colesterol (2:1)
y elevada solubilidad en agua, lo que la convierte en el compuesto más ampliamente
utilizado para modular los niveles de colesterol en líneas celulares233.
La manipulación de los niveles celulares de colesterol por medio de MβCD es una
estrategia ampliamente utilizada para evaluar lipid rafts y caveolas. Es por ello que,
siendo estrictos, los resultados obtenidos luego del tratamiento de la línea celular
Swan 71 con este compuesto deben atribuirse a la presencia de lipid rafts/caveolas en
general, en lugar de a Cav-1 en particular.
Los estudios de participación de Cav-1 en la migración celular se han centrado en
las células endoteliales y tumorales. En células HUVEC y de cáncer de próstata,
Tahir et al. demostraron que Cav-1 controla la fosforilación de VEGFR2 modulando vías
de señalización angiogénicas. El silenciamiento de Cav-1 en células HUVEC – estimuladas
o no previamente con VEGF – reducía significativamente la migración celular y la
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DISCUSIÓN
formación de túbulos225. Asimismo, Raghu et al. demostraron que la localización de
MMP-9 en lipid rafts es crítica para la migración, invasión y angiogénesis de células de
cáncer de mama. Trabajando sobre esferoides de células tumorales se observó una
inhibición de la migración celular posterior al tratamiento con MβCD224. Recientemente,
Liu et al. corroboraron la participación de Cav-1 en la migración e invasión del carcinoma
esofágico. La línea celular EC109 fue sometida a un ensayo de cicatrización de herida
luego de 14 h del silenciamiento de Cav-1. Se observó una reducción del 60% de la
capacidad migratoria en comparación con las células control234.
En concordancia con estos resultados, nosotros encontramos que la línea celular
Swan 71, una línea epitelial no tumoral, sufrió una reducción de aproximadamente el
30% en su capacidad migratoria luego de la disrupción de las caveolas corroborando la
necesidad de una estructura caveolar intacta para una migración exitosa.
Luego de corroborar la participación de AQP3 y Cav-1 en la migración del CEV
nuestro siguiente objetivo fue evaluar la participación de dichas proteínas y su
interacción con MMP durante la invasión del citotrofoblasto extravelloso.
El ensayo de invasión sobre insertos pretratados con MEC es un ensayo
ampliamente difundido y ha sido utilizado para evaluar esta capacidad en células de
citotrofoblasto humano235, melanoma236 y cáncer de colon237. Los poros del inserto se
ocluyen con una delgada capa de MEC – usualmente obtenida a partir del sarcoma
murino EHS – y aquellas células capaces de degradarlo quedan adheridas a la zona
inferior del inserto. Este método presenta como ventajas un diseño experimental
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DISCUSIÓN
sencillo, la disponibilidad de insertos de diferentes tamaños de poro y que un gradiente
de SFB es suficiente para inducir la invasión celular. Se trata de un método de punto final
y debe prestarse especial atención a la remoción de las células en la zona superior del
inserto para evitar artefactos en los resultados226.
Al analizar el efecto del bloqueo farmacológico de las AQPs sobre la capacidad
invasiva de la línea celular Swan 71 se observó una reducción significativa luego del
bloqueo no selectivo (100 vs. 30,3 ± 6,3) mediado por HgCl2. Esto implica que, frente al
bloqueo simultáneo de todas las isoformas presentes en el sistema, la invasión se
encuentra significativamente reducida.
A diferencia de lo ocurrido con la migración, no pudimos establecer una
correlación entre la capacidad invasiva de la línea celular Swan 71 y AQP3. Si bien
Shaeffer et al. reportaron una falta de correlación entre migración e invasión al analizar
células murinas de cáncer prostático238 – antes y después de una TEM – no consideramos
que este sea el motivo en nuestro sistema de análisis.
Si bien es cierto que en el caso de la migración fue posible establecer una
participación predominante de AQP3, la reducción fue considerablemente inferior a la
obtenida en el caso del bloqueo mediado por HgCl2 (~50 vs. 30%). Estos resultados son
coincidentes con el concepto de que tanto la migración como la invasión no son
fenómenos característicos de una isoforma, por lo tanto, es posible que frente al
bloqueo de especifico de AQP3 las isoformas remanentes actúen en forma
compensatoria.
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DISCUSIÓN
Por otro lado, es importante destacar que los trabajos que evalúan el rol de las
AQPs en la migración o invasión suelen valerse de sistemas experimentales donde se
exacerba la expresión de la isoforma de interés por medio de tecnologías de ADN
recombinante, o bien, de ratones knockout donde la expresión se encuentra abolida
completamente. Células endoteliales aórticas de ratones knockout para AQP1 presentan
una migración deficiente, con formación anómala de vasos in vitro. Adicionalmente, la
transfección de líneas celulares con AQP1 o AQP4 incrementa la migración celular y la
capacidad de cicatrización de heridas44. Verkman et al. reportaron un aumento en la
permeabilidad de la membrana, migración y capacidad de generar metástasis en células
tumorales murinas luego de la transfección con AQP145. Si bien la ventaja de esta
estrategia es que el rol de la molécula de interés puede observarse con mayor facilidad,
su desventaja principal radica en que se aleja de su comportamiento en el
microambiente en estudio y, por lo tanto, la relevancia biológica de los resultados
obtenidos puede ser cuestionable.
Por otro lado, las metaloproteasas de matriz (MMP) son una familia de
endopeptidasas dependientes de Zn2+ capaces de degradar la mayoría de los
componentes de la MEC. Estas proteínas juegan un rol central en la degradación
fisiológica de dichos componentes durante fenómenos de angiogénesis y de reparación
de tejidos, al igual que en procesos patológicos como la invasión y metástasis tumoral.
Existen más de 23 isoformas organizadas en subfamilias en base a su homología y
especificidad de sustrato. MMP-2 y MMP-9 presentan acción selectiva sobre matriz
extracelular rica en colágeno y por lo tanto se las conoce como gelatinasas.
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DISCUSIÓN
Mediante el uso de la zimografía es posible separar enzimas hidrolíticas en función
de su peso molecular y detectarlas por medio de su habilidad para degradar un sustrato
especifico. En el método convencional el sustrato copolimeriza con la acrilamida del gel
y las zonas proteolíticas se evidencian luego de la tinción. Con la incorporación de
gelatina, enzimas como MMP-2 (gelatinasa A) y MMP-9 (gelatinasa B) pueden ser
detectadas, además de evaluar su regulación, inhibición y procesamiento239.
Es importante destacar que debido a la separación electroforética es posible discriminar
formas latentes y activas y adicionalmente, disociar complejos entre las MMP y sus
inhibidores (TIMP).
Múltiples autores han relacionado la expresión/actividad de AQP3 con la
funcionalidad de las MMP. Xia et al. demostraron que el silenciamiento de AQP3 reduce
la actividad de MMP-2 y MMP-9 y la invasividad de células de cáncer de pulmón240.
Adicionalmente, Xu et al. corroboraron que en células de carcinoma gástrico AQP3
regula positivamente la actividad de ambas metaloproteasas por medio de la vía de
señalización PI3K/Akt241. Recientemente, Chen et al. reportaron en células de cáncer de
próstata que AQP3 promueve la secreción de MMP-3 vía ERK1/2183.
Como fue indicado previamente, diversos estudios han demostrado que la síntesis
y activación de MMP-2 y MMP-9 son necesarias para la invasión del trofoblasto135–138.
Bajo las condiciones experimentales analizadas solo fue posible distinguir la forma
activa de MMP-2 sin detectarse la forma latente de MMP-2 ni la forma latente/activa de
MMP-9. Estos resultados son coincidentes con lo reportado previamente para la línea
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DISCUSIÓN
celular Swan 71204. No observamos cambios en la actividad de metaloproteasas cuando
inhibimos selectivamente a la AQP3, aunque sí vimos que el bloqueo general de todas
las AQPs reducía la actividad gelatinolítica de MMP-2.
Estos resultados demuestran que la reducción en la capacidad invasiva en el
tratamiento con HgCl2 puede atribuirse a una disminución en la actividad de MMP-2
luego del bloqueo simultaneo de todas las isoformas de AQPs, confirmando nuevamente
que la invasión mediada por AQPs sería un proceso independiente de la isoforma.
Por otro lado, si bien la migración de las células Swan 71 disminuyó
significativamente luego de la disrupción de las caveolas, no se encontraron diferencias
significativas en el número de células con capacidad invasiva ni en la actividad de las
MMP luego de dicho tratamiento.
La migración y la invasión constituyen campos separados dentro de la biología
celular. Definimos como migración al movimiento celular direccionado sobre sustratos
tales como la membrana basal, MEC o superficies plásticas. De esta forma, la migración
ocurre sobre superficies bidimensionales carentes de cualquier clase de matriz fibrosa.
La invasión en cambio se define como el movimiento sobre una matriz tridimensional
por medio de una reestructuración de la misma. Por lo tanto, la invasión no sólo requiere
de la adhesión y migración de las células, también resulta indispensable la degradación
de componentes de la MEC para que el fenómeno sea exitoso.
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DISCUSIÓN
Si bien en muchos tipos celulares ambos procesos están asociados,
particularmente en células endoteliales, es posible que en el CEV el mantenimiento de
la estructura caveolar intacta sea indispensable como una plataforma de señalización
mediando únicamente procesos de migración, sin afectar al proceso de invasión.
Recientemente se ha demostrado que las caveolas pueden agrupar canales iónicos que
participan en la señalización de Ca2+, lo que sugiere que estos dominios tienen un papel
importante en la modulación de dicha señalización. Se sabe que las proteínas de
señalización dependientes de Ca2+ son reguladores importantes de las proteínas del
citoesqueleto que coordinan la migración celular242. En otros tejidos se ha determinado
que cambios en la expresión de los canales tipo TRPV (Receptores de potencial
transitorio), un canal de iones altamente selectivo de Ca2+, modifica la migración y
proliferación de células tumorales243. Estos canales han sido asociados con las
caveolas244. En experimentos previos en placenta de gestantes preeclámpticas,
observamos que el TRPV-1 disminuye245, coincidentemente con la reducción del número
de caveolas168. Por lo tanto, suponemos que una alteración en las caveolas desde las
etapas tempranas del desarrollo placentario afectaría directamente los procesos de
migración porque altera la señalización de Ca2+ (mediada por canales tipo TRP), sin
alterar significativamente la capacidad de las células para degradar la MEC e invadir.
Nuestro siguiente objetivo fue evaluar la posible interacción de AQP3 y Cav-1 en
el citotrofoblasto extravelloso humano.
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DISCUSIÓN
La interacción entre AQPs y Cav-1 ha sido evaluada en diversos trabajos. En células
MDCK, AQP2 colocaliza con Cav-1 en la membrana apical luego de una estimulación con
forskolina (que induce el aumento del AMPc intracelular), lo que sugiere que la
internalización de AQP2 sería dependiente de Cav-1246. En astrocitos, la fosforilación de
Cav-1 inducida por estrés oxidativo modula la distribución subcelular de AQP4 y, por lo
tanto, podría modular indirectamente el transporte de agua de esta isoforma247.
Durante la apoptosis, la asociación Cav-1/AQP1 aumenta significativamente en
timocitos, sugiriendo un potencial rol de Cav-1 en la inhibición de las AQPs durante el
AVD (apoptotic volumen decrease)248. Adicionalmente en queratinocitos, AQP3
colocaliza con fosfolipasa D2 en microdominios de membrana ricos en Cav-1249.
La mayoría de las proteínas que están asociadas con caveolina o caveolas
contienen secuencias que interaccionan con el dominio scaffold de Cav. Los motivos de
unión a Cav se caracterizan por la presencia de una secuencia consenso - φχφχχχχφ o
φχχφχχχχφ - donde φ es Phe, Tyr o Trp y χ es cualquier resto de aminoácido250.
El análisis de la estructura primaria de AQP1 reveló una coincidencia muy estrecha
(W210-IFWVGPF217), identificando esta secuencia como un sitio putativo de unión a
Caveolina. Si bien no se ha identificado este motivo en la AQP3, varios autores han
encontrado que esta proteína se localiza en dominios de membrana ricos en Cav y por
experimentos de co-precipitación han demostrado que ambas proteínas
interaccionan249.
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DISCUSIÓN
En este trabajo se comprobó la colocalización de AQP3 y Cav-1 y que ambas
proteínas co-precipitan. Posiblemente al igual que AQP1, la AQP3 expresada en CEV
presente un motivo de unión a caveolas. De esta manera, la correcta expresión de AQP3
en estructuras caveolares intactas y su interacción con Cav-1 pueden ser necesarias para
la migración celular durante la gestación temprana.
En este contexto, recientemente informamos que la expresión de AQP3 disminuye
significativamente en placentas complicadas por preeclampsia166.
Adicionalmente reportamos una disminución en la expresión de Cav-1 y en el número
de caveolas en placentas de gestantes con preeclampsia, lo que se asoció a alteraciones
en la composición lipídica necesaria para la formación de caveolas168. Si bien las
alteraciones en AQP3 y Cav-1 se evidenciaron al final de la gestación y en trofoblasto
velloso, suponemos que una expresión anormal de ambas proteínas podría tener lugar
durante las primeras etapas de diferenciación de las células madre del trofoblasto y
persistir después de su diferenciación en citotrofoblasto extravelloso y velloso
afectando ambos linajes.
Finalmente, en estas condiciones experimentales evaluamos la interacción de las
células trofoblásticas con el endotelio materno.
Como describimos previamente, un embarazo exitoso requiere de una formación
adecuada de la placenta. En este proceso es crucial el desarrollo de una compleja red
vascular materno-fetal que permita abastecer la creciente demanda de oxígeno y
nutrientes al feto.
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DISCUSIÓN
Existen tres estadios en el desarrollo vascular placentario: inicialmente un
proceso de vasculogénesis (formación de novo de nuevos vasos), posteriormente la
angiogénesis no ramificada (formación de nuevos lechos vasculares a partir de otros
preexistentes) y finalmente la angiogénesis ramificada251. Para ello al final del primer
trimestre del embarazo, el CEV migra hacia el endometrio de la decidua materna
invadiendo hasta un tercio del miometrio252, sustituyendo el músculo liso vascular y el
tejido elástico, convirtiendo así a las arterias espiraladas uterinas en arterias de gran
capacidad de conducción y baja resistencia. Esta remodelación de las arterias es esencial
para dotar a la placenta de una adecuada perfusión que garantice el crecimiento fetal253.
Fallas en este proceso conducen a varias complicaciones del embarazo como restricción
del crecimiento intrauterino y preeclampsia.
Podemos decir entonces que la migración e invasión del CEV durante el
embarazo temprano es un factor clave para la remodelación de las arterias
espiraladas144. Por otro lado, el CEV adquiere un fenotipo endovascular y es este
trofoblasto endovascular el que orquesta las adaptaciones de los vasos maternos
convirtiéndose en parte de las capas endoteliales. Ambos procesos son cruciales para la
remodelación de los vasos maternos. En primer lugar, nuestros experimentos
demostraron que el bloqueo de las AQPs y/o la reducción del número de
caveolas/caveolina-1 afectan la migración e invasión del CEV. Sin embargo, el
mecanismo de interacción entre el CEV y las células endoteliales maternas se desconoce.
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DISCUSIÓN
En una primera instancia evaluamos si la línea celular Swan 71 podía asumir un
fenotipo angiogénico, diferenciándose a trofoblasto endovascular por medio del ensayo
de formación de túbulos. La formación de túbulos sobre una MEC es un método
ampliamente difundido para el estudio in vitro de factores que promueven o inhiben la
angiogénesis. Típicamente células endoteliales como las HUVEC son utilizadas para este
ensayo. Las células se adhieren al sustrato, migran y finalmente originan las estructuras
tubulares relativamente rápido (entre 2-6 horas) dependiendo de la clase y
concentración del estímulo involucrado254.
Estudios previos demostraron que las células HTR8/SVneo (también de CEV)
adquirían espontáneamente un fenotipo endovascular formando estructuras similares
a túbulos cuando se las cultivaba sobre matrigel255,256. Al repetir estos experimentos con
la línea celular Swan 71 demostramos por primera vez que estas células son capaces de
formar dichas estructuras tubulares. Cuando analizamos el efecto del bloqueo de AQP3
o de la disrupción de caveolas, observamos que sólo este último tratamiento aumentaba
la formación de túbulos.
En una segunda instancia decidimos analizar el efecto de MC provenientes de la
línea celular Swan 71 sometida a los distintos tratamientos, sobre la proliferación,
migración y formación de túbulos de la línea endotelial EA.hy926.
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DISCUSIÓN
Cuando cultivamos dicha línea endotelial en presencia de MC provenientes de
Swan 71 a la que se le había bloqueado la AQP3 no observamos cambios ni en la
proliferación ni en la migración celular. Coincidentemente, cuando evaluamos el
proceso de formación in vitro de túbulos cultivando células endoteliales con estos MC
sobre una matriz extracelular tampoco encontramos modificaciones.
Cuando repetimos estos experimentos utilizando MC provenientes de Swan 71 a
las que se había tratado con MβCD tampoco hallamos cambios en la proliferación y
migración de estas células. Sin embargo, contrario a lo esperado, la formación de nodos,
de segmentos y de la red de túbulos se encontraba incrementada en la línea endotelial
EA.hy926.
Recientemente se ha puesto considerable atención en componentes vesiculares
de tamaño nanométrico liberados por una variedad de tipos celulares, que exhiben
actividades inmunoreguladoras y de señalización257–260. Estas vesículas membranosas
llamadas "exosomas" estarían implicadas en una variedad de funciones fisiológicas y
patológicas261,262. Los exosomas generalmente se consideran vesículas endocíticas que
se originan en la membrana limitante de cuerpos multivesiculares por un mecanismo de
gemación hacia adentro. Estas estructuras presentan proteínas ubicuas – involucradas
en la biogénesis del exosoma – y especificas del tipo celular del que se originan.
Dentro del grupo de proteínas ubicuas se incluyen proteínas del citoesqueleto (tubulina,
actina), anexinas y GTPasas de la familia Rab (ambas involucradas en la fusión y
transporte de membranas intracelulares). Chaperonas HSP (Heat shock proteins)
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DISCUSIÓN
involucradas en el transporte de proteínas plegadas incorrectamente para ser
degradadas y tetraspaninas involucradas en la organización de los complejos
multivesiculares, también se encuentran abundantemente expresadas en los
exosomas263. Se ha descripto que durante la gestación el citotrofoblasto libera
exosomas, y se los ha detectado en niveles elevados en circulación periférica de mujeres
embarazadas264. Sin embargo, el papel de dichas estructuras en el embarazo aún está
bajo investigación. Algunos autores han postulado que tendrían un papel importante en
la tolerancia fetal265–267. Abrahams et al. han propuesto que el trofoblasto libera
constitutivamente exosomas cargados de FasL que permiten mantener el
inmunoprivilegio placentario por medio de la apoptosis vía FasL/Fas de linfocitos T que
reconocen antígenos paternos265.
Atay et al. demostraron que las células Swan 71 son capaces de liberar exosomas
y que estas microvesículas serían capaces de inducir la migración de monocitos y
"educar" a estas células para producir un perfil de citoquinas proinflamatorias, incluida
interleuqina-1β (IL-1β)268. De esta forma, los exosomas reclutarían a los monocitos de
manera independiente al contacto célula-célula, promoviendo su diferenciación a
macrófagos cuya secreción de citoquinas contribuya al crecimiento y supervivencia del
trofoblasto. La composición del exosoma sería importante para determinar el tipo de
señal que puede modular. En el caso de las células trofoblásticas se esperaría que
dependiendo de la edad gestacional la composición sea diferente y pueda inducir
resultados distintos.
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DISCUSIÓN
En este sentido, Atay et al. han identificado 282 proteínas asociadas con
exosomas derivados de Swan 71 que incluyen una amplia gama de proteínas secretorias
y proteínas celulares269. Adicionalmente a las proteínas marcadoras previamente
detalladas (proteínas del citoesqueleto, GTPasas de la familia Rab, anexinas,
chaperonas HSP y tetraspaninas) los exosomas provenientes de Swan 71 se caracterizan
por la presencia de ICAM-1 (Intercellular adhesion molecule-1), fibronectina y PAI-1
(Inhibidor del activador del plasminógeno-1). El estudio proteómico de estas estructuras
reveló que las redes/vías principalmente expresadas corresponden a la regulación de la
presentación antigénica, a la reorganización del citoesqueleto y a la interacción célula-
MEC.
Si bien los reportes que relacionan la liberación exosomal con la depleción de
colesterol son conflictivos, varios de ellos indican que luego del tratamiento con MβCD
se incrementa la liberación de exosomas de la célula. La enfermedad de Niemann-Pick
se caracteriza por la acumulación anómala de lípidos en los compartimentos
endosomales y lisosomales, lo que resulta en un proceso neurodegenerativo progresivo.
Strauss et al. demostraron que oligodendrocitos tratados con MβCD eran capaces de
liberarse del colesterol almacenado intracelularmente por medio de exosomas con
flotilina-2 como proteína marcadora270. De manera análoga, recientemente se reportó
en células transfectadas con LOX-1 (receptor de la forma oxidada de LDL) la liberación
masiva en exosomas de LOX-1 y sLOX-1 (fragmento soluble de LOX-1) luego del
tratamiento con MβCD271.
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DISCUSIÓN
En este contexto y teniendo en cuenta que la composición exosomal refleja la
célula de donde fueron liberados, y que las caveolas son plataformas de señalización, es
posible que la disrupción de caveolas induzca la liberación de exosomas “cargados de
proteínas” capaces de activar diversas vías de transducción de señales y facilitar la
formación de estructuras tubulares en las células endoteliales o en el trofoblasto
endovascular.
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CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
Nuestros resultados proporcionan evidencia de que la correcta expresión de
AQP3 y la presencia de estructuras caveolares intactas en células de citotrofoblasto
extravelloso son necesarias para la migración celular durante la gestación temprana.
Por otro lado, nuestros hallazgos confirmarían que la capacidad invasiva del
citotrofoblasto extravelloso estaría mediada por AQPs, aunque sería un proceso
independiente de la isoforma. Dicha reducción en la capacidad invasiva podría atribuirse
al menos parcialmente, a la reducción en la actividad de MMP-2.
Adicionalmente encontramos que AQP3 y Cav-1 co-localizan en la línea celular
Swan 71, siendo por lo tanto fundamentales durante la placentación.
Además, demostramos por primera vez que las células Swan 71 pueden adquirir
un fenotipo endovascular in vitro. Finalmente, encontramos que la disrupción de
caveolas modifica el proceso de formación de túbulos in vitro no sólo de las células
endoteliales sino también de las células trofoblásticas endovasculares.
Una expresión anómala de AQPs, en particular de AQP3 y una reducción del
número de caveolas/Cav-1 llevarían a alteraciones en estos procesos durante la
formación de la placenta y podrían estar asociadas a distintas patologías, como la
preeclampsia o la restricción del crecimiento intrauterino.
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PERSPECTIVAS
PERSPECTIVAS
El éxito del embarazo se asocia con una correcta placentación, esencial para el
crecimiento y desarrollo del feto. La preeclampsia es un síndrome caracterizado por una
disminución del flujo sanguíneo útero-placentario asociado a una invasión trofoblástica
alterada que puede conducir a hipoxia placentaria y disfunción endotelial, liberando
materiales nocivos en la circulación, lo que ocasiona daños en la función endotelial.
Tomando en consideración que previamente se determinó que la AQP3 y el
número de caveolas disminuye en placentas preeclámpticas de tercer trimestre y en
esta tesis demostramos que in vitro tanto la AQP3 como Cav-1 son importantes para la
correcta formación de la placenta, sería interesante evaluar si estas proteínas están
alteradas desde las primeras semanas de gestación en mujeres que van a desarrollar
preeclampsia. Recientemente se ha propuesto que microvesículas de trofoblasto
(exosomas, cuerpos apoptóticos) se encuentran en circulación materna desde la sexta
semana de gestación. Por lo tanto, la caracterización de estas estructuras permitiría
conocer “en tiempo real” qué está ocurriendo en la placenta en desarrollo.
Determinar la expresión de AQP3 y Cav-1 en microvesículas trofoblásticas durante las
primeras semanas de gestación nos permitiría corroborar si la desregulación de estas
proteínas se encuentra involucrada en la etiología de este síndrome.
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