Pasado, presente y futuro de la Edición...
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Pasado, presente y futuro de la Edición Genómica
Máster en Genética y Evolución (Especialidad Agroalimentaria)
Febrero de 2019
Aplicaciones de la Ingeniería Genética
Reprogramación Celular
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Transferencia nuclear
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Ratón Triple- 40% más longevo
Ratón SuperP53- Copia extra de P53
supresor de tumores (“resistente al cáncer”). - 15% más longevo
ACTIVIDAD TELOMERASA
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Embriogénesis humana
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Blastocisto humanoMasa celular interna
(Inner cell mass)
Mouse fibroblasts feeder layer
Células troncales humanas(ES cells)
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Terapia celular con células troncales
Blastocyst
Human Embryonic
Stem Cells
Neuronas
Lesiónmedular
Parkinson’s
Cardiomiocitos
Fallo
cardíaco
Células beta
Diabetes
Osteoblastos
Osteoporosis
Roturas de hueso
Condrocitos
Artritis
Hepatocitos
Fallo hepático
Drug discoveryCélulas dendríticas
Inducción de
tolerancia frente
a antígenos
Immunoterapia
contra el cáncer
Bancos de células genotipadas y
producidas bajo condiciones de Good
Manufacturing Practice ( cGMP)
Terapia celular
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Usos de la clonación terapéutica
Estudio de los mecanismos de enfermedades genéticas
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Usos de la clonación terapéutica
Terapia celular
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Reparación de la mutación por recombinación
homóloga
Introducción del material reparado en la médula ósea
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Usos de la clonación terapéutica
Generación de órganos
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People in the US affected by diseases that may be helped by stem cell research
Condition Number of Persons AffectedCardiovascular diseases 58 MillionAutoimmune diseases 30 MillionDiabetes 16 MillionOsteoporosis 10 MillionCancer 8.2 MillionAlzheimer's disease 4 MillionParkinson's disease 1.5 MillionBurns (severe) 0.3 MillionSpinal cord injuries 0.25 MillionBirth defects 150,000 (per year)Total 128.4 Million --------------------------------------------------------------------------------------Data from the Patients' Coalition for Urgent Research, Washington, DC
(according to Perry, Ref. 267).
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Enfermedades genéticas con células troncales disponibles obtenidas a partir de embriones
sobrantes de fecundación in Vitro (14 en total)
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Reprogramación celular
Potencia
Célula somática
Objetivo: manipular la totipotencia celular
• Totipotente
• Pluripotente
• Multipotente
• Oligopotente
• Unipotente
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24 factores de transcripción candidatos : Ecat1, Dpp5(Esg1), Fbx015, Nanog, ERas,
Dnmt3l, Ecat8, Gdf3, Sox15, Dppa4, Dppa2, Fthl17, Sall4, Oct4, Sox2, Rex1, Utf1, Tcl1, Dppa3,
Klf4, b-cat, cMyc, Stat3, Grb2
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Métodos de reprogramación y tipos celulares reprogramados
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Criterios para definir la calidad de una célula pluripotente inducida (iPS)
• Immunocitoquímica: células positivas para fosfatasa alcalina y factores detranscripción propios de estados pluripotentes (Oct4, Klf3, Sox2, NANOG, etc)
• Pérdida de metilación en los promotores endógenos de genes de pluripotencia(Oct4, Sox2, Nanog etc).
• Expresión de antígenos de expresión detectables por “sorting”: Tra-1-81(+),Tra-1-60(+), SSEA3(+) SSEA4(+)
• Habilidad de diferenciarse en las tres líneas germinales (ectodermo,mesodermo, endodermo) durante la formación de cuerpos embrionarios (invitro)
• Formación de quimeras y transmisión germinal
• Complementación tetraploide
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Formación de quimeras y transmisión germinal:
“Gene-targeting” en células troncales de ratón
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Complementación tetraploide
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Clonación terapéutica con
células iPS
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Método Características/Ventajas/DesventajasRetroviral Integración genómica, infección células en división, eficiencia generación iPS
media/alta
Lentiviral Integración genómica, infección de células en división y quiescentes, vectorespolicistrónicos disponibles, expresión inducible de transgenes, eliminacióntransgenes mediante CRE/loxP, eficiencia generación iPS alta
Transposon Integración genómica, vector policistrónico disponible, expresión inducible detransgenes, eliminación de transgenes mediante transposasa, potencial paraterapia génica, eficiencia generación iPS alta
Fago C31 integrasa Integración genómica, vector policistrónico, expresión inducible, potencial paraterapia génica, excisión de transgenes mediante Cre/loxP, eficiencia generacióniPS media
Adenovirus Baja posibilidad de integración genómica, vector policistrónico, potencial paraterapia génica, eficiencia de generación de iPS baja
Virus Sendai Sin integración genómica, eficiencia generación iPS media/alta
Plásmido Baja posibilidad de integración, eficiencia generación iPS muy baja
Plásmido Episomal Baja posibilidad de integración, eficiencia generación iPS muy baja
Proteína Sin integración genómica, múltiples transducciones, eficiencia generación iPSmuy baja
Minicírculo Baja posibilidad de integración genómica, múltiples transfecciones, muy bajaeficiencia
mRNA Sin integración genómica, múltiples transfecciones, alta eficiencia
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Reparación mediante “gene-targeting” del genoma humano en células iPS
Estrategia vector Delivery homología Pros Contras Innovaciones
eficiencia
Modificación de
La técnica original Plásmido
de gene targeting linearizado
en mES cells
Recombinación BAC
Homóloga con BACs linearizado
Mediado por virus HDAdv o AAV
Modificación del
Genoma mediante
zinc finger nucleasas
Electroporación
Transfección
nucleofección
Electroporación
Infección viral
Transfección
Nucleofección
Infección
5-13kb
1-14.6%
27-40%
82.5-195kb
21-27%
2-3kb AAV
(33-45%)
12-22kb
HDAdV
(19-90%)
1-4kb ZFN
(5-100%)
Plásmidos expresando
ZFN junto con
Plásmidos linearizados
con homología
Diseño
fácil
Simple de
adoptar
Fácil de
adoptar
Posibilidad
de reparar
ambos alelos
Delivery
eficiente con
poca
citotoxicidad
Alta
eficiencia de
targeting
Baja
eficiencia de
targeting
Difícil
encontrar
los eventos
de targeting
Las proteínas
virales pueden
inducir una
respuesta
inmune
Experiencia en
ingeniería de
proteínas
Mutagénesis
indeseada de
otros lugares e
el genoma
Desarrollo de
moléculas
químicas para la
mejora de
clonogenicidad
Desarrollo de la
tecnología de
recombineering
Desarrollo de
virus no
integrativos
Desarrollo de
la tecnología
de Zinc fingers
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Células iPS/Modelos animales/Secuenciación
tercera generación