Pcr y Electroforesis Biociencias 2011

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) YELECTROFORESIS

ADRIANA MARIA GIL ZAPATAMscMsc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS

BIOCIENCIAS II

ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN LA SINTESIS DEL DNA POR PCR

•••• Hebra Templado

• Iniciador (cebador, primer) : secuencia corta denucleótidos complementaria a la hebra templado. La enzima DNA polimerasa sólo puede iniciar la síntesisde una cadena de DNA a partir de un 3’OH libre.

•••• dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados

•••• DNA Polimerasa

PCRMelting

94 oC

Tem

peratura

100

0

50

Tiempo

5’3’

3’5’DNA de cadena doble

PCRMelting

94 oC

Tem

peratura

100

0

50

Tiempo

3’5’

5’3’

CalorDNA de cadena simple

PCRMelting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC

Tem

peratura

100

0

50

Tiempo

3’5’

5’3’

5’

5’

Melting

94 oC

Hibridaciónde primers

PCRMelting

94 oC

Melting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC

Tem

peratura

100

0

50

Tiempo

30 ciclos

3’5’

5’3’

Calor

Calor

5’

5’

5’

PCRMelting

94 oC

Melting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC

Tem

peratura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3’5’

5’3’5’

5’

5’

5’

5’

5’

PCRMelting

94 oC

Melting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC

Tem

peratura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3’5’

5’3’5’

5’

5’

5’

5’

5’

Calor

Calor

PCRMelting

94 oC

Melting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC

Tem

peratura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3’5’

5’3’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

Fragmentos de

tamaño definido

PCRMelting

94 oC

Melting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC

Tem

peratura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3’5’

5’3’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR.

0

# ciclos

Numero de copias

1

3

8

2

4

1

2

4

16

5

32

6

64

VENTAJAS DE PCR SOBRE

OTRAS TECNICAS

�� ALTA SENSIBILIDAD

�� ALTA ESPECIFICIDAD

�� RAPIDEZ

DESVENTAJA:

PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA

templado específico o productos amplificados previamente)

PCRProceso que semeja “in vitro” la replicación del ADN y que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento de ADN, después de realizar 30 o más ciclos.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

CICLO

1. DENATURACIÓN90 a 95 ° c

2. ANILLAMIENTO55 a 65 ° c

3. EXTENSIÓN72 ° c

DENATURACION

• El ADN sirve de molde para ser copiado.

• Un aumento de la temperatura o un pH

alcalino permite que la cadena se separe.

• Es reversible

HIBRIDACION

• Los primers se unen a los extremos 3 prima

de la cadena.

• La nueva hebra tiene la direccion de 5 a 3

prima.

• Le dan la especificidad a la PCR.

EXTENSION

• Actua la Taq (Termophilus aquaticus)

polimerasa.

• Polimerisa los dNTP‘s.

PCR MIX• Buffer • Primers •ADN molde

• dNTP’s (dATP, dGTP, dTTP y dCTP)

•ADN Polimerasa (Taq polimerasa)

• Cloruro de Magnesio (MgCl2) cofactor de la Taq.

Usos de la PCR

• Pruebas de identificación (STRs)• Detección de enfermedades hereditarias

• Detección de enfermedad viral• Clonación de genes• Mutagénesis dirigida• Genotipificación de mutaciones especificas (SNPs)

CLASES DE PCR

• PCR MISMATCH• RT PCR• PCR TIEMPO REAL• PCR MULTIPLEX• PCR NESTED

mRNA

cDNA (simple cadena)

cDNA (doble cadena)

PCR

RT-PCR

Consiste en dos pasos:

• Transcripción reversa

• PCR

OBJETIVO:

Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA

Transcripción Reversa1. Purificación de RNA mensajero

2. Transcripción reversa a cDNA (DNA copia)

REAL TIME PCR - PCR EN TIEMPO REAL

•Cuantificación del número de copias de DNA presentesen la muestra (diagnóstico, monitoreo de carga viral, comparación entre número de copias en diferentessubespecies, etc.)

•Cuantificación del mRNA por RT-PCR en tiempo real (análisis de la expresión de genes en diferentes tejidos o en diferentes condiciones normales vs patológicas, efecto de drogas, etc)

•Análisis de la cinética de la reacción

PCR en tiempo real

• Detección y cuantificación de reporteros fluorescentes.

• La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de

producto formado en cada ciclo de PCR.

• Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons moleculares,

SYBR Green

TaqMan PCRSonda específica

CYCLE NUMBER DNA copy number0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 512

10 1,02411 2,04812 4,09613 8,19214 16,38415 32,76816 65,53617 131,07218 262,14419 524,28820 1,048,57621 2,097,15222 4,194,30423 8,388,60824 16,777,21625 33,554,43226 67,108,86427 134,217,72828 268,435,45629 536,870,91230 1,073,741,82431 1,400,000,00032 1,500,000,00033 1,550,000,00034 1,580,000,000

PCR reagent is the limiting factor!!

Copies of DNA=2N

0.0E+00

2.0E+08

4.0E+08

6.0E+08

8.0E+08

1.0E+09

1.2E+09

1.4E+09

1.6E+09

1.8E+09

0 5 10 15 20 25 30 35

PCR cycle

DN

A c

opy

num

ber

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 5 10 15 20 25 30 35

PCR cycle

DN

A c

opy

num

ber

(log)

CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS

Se observa diferencias en los ciclos iniciales. Relación como línea recta al utilizar logaritmos, porque la amplificación por PCR es una reacción logarítmica.

Real Time PCR

ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:

• Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los

primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en

el DNA o cDNAs de la muestra

• Dímeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando

productos pequeños

PROBLEMAS

PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que

pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida

durante la reacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza

SYBR-green.

Ventajas del PCR en tiempo real• Simple y rápida (semi-automatizada).

• No hay manipulación post-PCR.

• Eliminación de contaminación por amplicones.

• Cuantificación del DNA o RNA molde inicial.

• Muy sensible.

• Detección de productos inespecíficos con la opción “curva de desnaturalización” (Melt-Curve).

• Detección de más de un producto específico en una misma reacción.

• Extraordinariamente específico.

SHORT TANDEM REPEATSSHORT TANDEM REPEATS

STRsSTRs LocalizaciLocalizacióón Secuencia Taman Secuencia Tamaññoocromoscromosóómica ( mica ( pbpb ))

D3S1358 3p (D3S1358 3p (TCTA)nTCTA)n 114 114 -- 142142

vWAvWA 12p (TCTG)n 152 12p (TCTG)n 152 -- 197197

FGA 4p (CTTT)n 219 FGA 4p (CTTT)n 219 -- 167167

DYS 391 Y (GCGT)n 210 DYS 391 Y (GCGT)n 210 -- 264264

METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN

ELECTROFORESIS CAPILAR:

Cromosoma Y: DYS19, DYS385, DYS389 I, DYS389 II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393.

ABI PRISM 310

PCRSTR’s

EXTRACCION DE ADN: Salting Out, Chelex

Autosómicos: D3S1358, VWA, FGA,THO1, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317,D7S820, D8S1179, D21S11, D18S51,D16S539.

Cromosoma X: DXS8378, DXS9898,DXS8377DXS8378, DXS9898,DXS8377HPRTBHPRTB

TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 4Alelo 4

TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 5Alelo 5

TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 6Alelo 6

TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TATA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TATA …… n n Alelo nAlelo n

POLIMORFISMO:POLIMORFISMO: MMúúltiples alelos posibles en la poblaciltiples alelos posibles en la poblacióónn

D3S1358

KIT COFILER

ELECTROFORESIS

METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN

ELECTROFORESIS CAPILAR

EQUIPO ABI PRISM 310

ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL

CAMARA DE ELECTROFORESISGEL DE AGAROSA

ELECTROFORESIS

Técnica en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un campo eléctrico.

La velocidad de migración es función de la densidad de carga y ésta a su vez es función de una serie de parámetros que marcan las condiciones experimentales como: pH, fuerza iónica, voltaje, interacciones con el soporte.

MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICO

Catión ( carga + ) Migra al polo negativo. CATODOAnión ( carga - ) Migra al polo positivo. ANODO

La fuerza que ejerce el campo eléctrico sobre la partícula cargada, es proporcional a la carga de la partícula y al voltaje del campo eléctrico aplicado.

F = Q X V

MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICO

Otra fuerza se opone al movimiento de la partícula y es proporcional al tamaño y la forma de ella y a la viscosidad del buffer.

Fr = F X VEstas dos fuerzas se equilibran cuando la partícula empieza a migrar y hace que alcance una velocidad constante.

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS

Carga neta de la partícula: Efecto del pH del tampón.Cuando las partículas se colocan en un campo eléctrico, estas migrarán hacia el ánodo o el cátodo en función de la carga neta que posean y ésta depende del pH de la solución en que se encuentran.


Tamaño y Forma de la partícula:Según el tipo de electroforesis, el tamaño y la forma de la partícula pueden tener mayor o menor importancia.Cuando se emplean soportes que permiten el paso selectivo de moléculas, según el tamaño, retienen las grandes y dejan pasar las más pequeñas.


Fuerza iónica del tampón:En la electroforesis, la corriente es llevada por los iones presentes, tanto del tampón como de las partículas en solución, por tanto cuanto más concentrado es el tampón, mayor la proporción de corriente que transportan, menor la migración de las partículas y peor la separación.


Potencial del campo eléctrico:A mayor potencial del campo eléctrico mayor velocidad de la partícula.Según el método electroforético se elige trabajar manteniendo constante el V o A.Si aumenta el voltaje, aumenta velocidad de separación, pero también la temperatura aparecen efectos indeseables como:desnaturalización de pr, evaporación del buffer, aumento de la fuerza iónica.

TIPOS DE SOPORTES

El procedimiento electroforético se lleva a cabo sobre dos soportes::

1. Soportes No Restrictivos:Las partículas colocadas sobre ellos, se separan únicamente en función de su carga eléctrica. Los principales soportes son:Papel – Acetato de Celulosa – Agarosa

TIPOS DE SOPORTES

2. Soportes Restrictivos:El soporte ejerce algún tipo de resistencia al desplazamiento de las moléculas de la muestra. La resistencia estará dada por el tamaño del poro del soporte y por el tamaño y características de las moléculas que deben desplazarse sobre el soporte. Los principales tipos de soportes son:Geles de Almidón – Geles de Poliacrilamida


AGAROSA:Es uno de los componentes del agar. Se prepara como un gel de concentración entre 0.5 – 2 gr %. El tamaño del poro es grande y permite el paso de moléculas de peso molecular relativamente alto, por lo cual migran tan solo en función de su carga. Su aspecto claro y transparente facilita la cuantificación por densitometría.


POLIACRILAMIDASe forman por polimerización de la acrilamida con un agente enlazante. El tamaño del poro varía, según la concentración de la acrilamida y las moléculas puedan ser separadas por diferencias en sus cargas y tamaños. Soporte ideal para obtener mayor y mejor número de separaciones electroforéticas. Se puede leer por densitometría.Permite introducir al gel: SDS, urea y etc.

ELECTROFORESIS CAPILAR

POLIMERO POP 4Soporte restrictivo que permite la separación de moléculas de ADN desde un par de bases en adelante.Se deposita en un capilar de 1 mm de diámetro y este se introduce en un equipo automatizado que posee una placa de calentamiento y un laser que detecta la señal de los fluorocromos.

ABI PRISM 310

FLUOROCROMOS

REALIZACION DE LA ELECTROFORESIS

Obtención de la Montaje de laMuestra jeringa

Montaje de la muestra

Electroforesis capilar

Detección por el laser

Lectura de electroferogramas

ELECTROFEROGRAMA

MARCADOR DE PESO MOLECULAR

LADDER ALÉLICO

PERFIL GENÉTICO

Pcr y Electroforesis Biociencias 2011

Documents

Transcript of Pcr y Electroforesis Biociencias 2011