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A培�埽�︀ 픀㜀 ퟺ�뀀 㼀韀�韔�培�埮�뀀Pseudónimo de integrantes

    

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2723308Folio de Inscripción

 

© 2017 Escuela Nacional Colegio de Ciencias y Humanidades | Hecho en México | Dudas e información: feriadelasciencias@cch.unam.mx

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mailto:feriadelasciencias@cch.unam.mx

Introducción.- La producción de combustibles a partir de residuos fósiles, es un proceso

que se va tornando más complicado cada vez, debido al agotamiento del petróleo, por ello

se ha incrementado el interés de la industria en obtener combustibles de fuentes más

accesibles y más amigables con el ambiente. Los biocombustibles son energéticos

obtenidos a partir de materia orgánica, por digestión anaerobia, en el cual, levaduras y

bacterias realizan la degradación de azúcares en alcohol y CO2. El etanol es un compuesto

que puede utilizarse como biocombustible.

Objetivo.- Comparar la producción de etanol obtenida por fermentaciones de cultivos a

base de mandarina respecto a cultivos a base de uva

Justificación.- La gasolina se ha convertido en un problema más, debido a su costo y a su

alto nivel de contaminación en la ciudad. Derivado de esto, la Biotecnología representa una

alternativa viable, que ha apoyado en la obtención de biocombustibles como el etanol a

partir de sustancias orgánicas. Por otro lado, la central de abastos de la Ciudad de México

(CEDAM) genera alrededor de 780 toneladas de desechos orgánicos de frutas, siendo uno

de estos desechos la mandarina. Es por ello que en este trabajo se plantea utilizar

mandarina en fermentaciones semilíquidas incubadas con la levadura S. cerevisiae para

obtener etanol como producto final.

Metodología.- Se realizaron fermentaciones de 1) jugo y gabazo de mandarina, 2) jugo,

gabazo y cáscara de mandarina y 3) uva (utilizada como control) incubada con S.

cerevisiae. Los cultivos se mantuvieron en biorreactores a una temperatura de 25°C, con la

finalidad de obtener etanol como producto. Se realizaron diferentes tinciones para asegurar

la viabilidad de los cultivos y la propagación de la levadura, de igual forma se monitoreó la

producción de etanol mediante las pruebas de determinación de pH, medición de °Brix,

determinación colorimétrica y determinación por alcoholímetro. La obtención del producto

final se realizó por destilación simple de cada una de las fermentaciones.

Resultados.- Los resultados obtenidos muestran que ambas fermentaciones producen

etanol, al bajar su pH y los sólidos totales durante el desarrollo del experimento. En ambos

cultivos se obtuvo etanol, sin embargo, la fermentación de mandarina completa produce

etanol con una concentración de 6% para el jugo y gabazo de mandarina, 8% para la

mandarina completa y 6% para el fermentado de uva.

Conclusión.- Las fermentaciones de la mandarina completa producen una mayor cantidad

de etanol en comparación con la fermentación del jugo y gabazo, sin embargo la

concentración obtenida es menor al 10 %. Los desechos de frutas representan una

alternativa para obtener bioetanol, y utilizarlo como biocombustible.

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Título: Aprovechamiento de desechos de fruta para obtención de etanol

Introducción

La producción de combustibles a partir de residuos fósiles, es un proceso que se va tornando

más complicado cada vez, debido al agotamiento del petróleo, por ello se ha incrementado el

interés de la industria en obtener combustibles de fuentes más accesibles y más amigables con

el ambiente. Estos productos pueden ser biodiesel o etanol, representando este último el 90%

de la producción total de biocombustibles (Mielenz, 2001, Nguyen, Yang, & Bae, 2017, Vázquez

& Dacosta, 2007).

Los biocombustibles son energéticos obtenidos a partir de materia orgánica, por digestión

anaerobia, en el cual, levaduras y bacterias realizan la degradación de azúcares en alcohol y

CO2. Esta transformación es llevada a cabo principalmente por levaduras, siendo la principal

Saccharomyces cerevisiae. Este microorganismo puede utilizar la vía anaerobia para convertir

los azúcares complejos en glucosa mediante la vía Embden–Mereyhof–Parnas, donde la

fosforilación de los carbohidratos producen dos moles de etanol y 2 moles de dióxido de carbono

(Ecuación 1) (Nguyen, Yang, & Bae, 2017, Najafpour, Younesi, & Syahidah Ku Ismail, 2004).

C6H12O6———>2CH3CH2OH + 2CO2 .Ecuación 1.-Obtención de etanol a partir de glucosa

El etanol es un compuesto con fórmula CH3-CH2-OH, cuyas características son incoloro e

inodoro. Posee un punto de ebullición de 78 °C, su pH es ácido y es una sustancia miscible en

agua. Su producción data desde tiempos remotos, a partir de la fermentación de azúcares por

acción de levaduras, siendo posteriormente destilado. El uso primordial de este ha sido como

bebida alcohólica, sin embargo, en la actualidad se utiliza como biocombustible. Diversos

estudios han resaltado las propiedades de este compuesto como combustible, aseguran que

las emisiones producidas por el uso de este en automóviles se reducen hasta en un 85%

respecto a la gasolina utilizada normalmente, ya que el octanaje obtenido es mejor, por lo que

contribuye a reducir los gases de tipo invernadero, Su combustión mejora las compresiones, lo

que representa una mayor fuente de energía en los motores, además de actuar como

anticongelante y representar una opción más económica tanto en producción como en

consumo.

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Objetivo general

● Comparar la producción de etanol obtenida por fermentaciones de cultivos a base de

mandarina respecto a cultivos a base de uva

Objetivos particulares

● Obtener etanol mediante la fermentación con S.cerevisiae en cultivos de mandarina y

uva

● Evaluar la producción de etanol a diferentes tiempos de cultivo

● Evaluar las condiciones óptimas de cultivo, mediante la medición de sólidos totales y pH

a diferentes tiempos de cultivo.

Justificación

La gasolina se ha convertido en un problema más, debido a su costo y a su alto nivel de

contaminación en la ciudad. Derivado de esto, la Biotecnología representa una alternativa

viable, que ha apoyado en la obtención de biocombustibles como el etanol a partir de sustancias

orgánicas, sin embargo, también presenta ciertas desventajas como son el requerir grandes

extensiones de tierra para cultivar la materia prima, además de que el uso constante de dichas

áreas conlleva problemas como la erosión de las mismas.

Por otro lado, la central de abastos de la Ciudad de México (CEDAM) genera alrededor de 780

toneladas de desechos orgánicos de frutas, estos residuos podrían ayudar a generar una

alternativa en el tema de la demanda de biocombustibles y la disminución del problema de

erosión en las tierras de cultivo. Uno de estos desechos es la mandarina, una fruta de

temporada que se desperdicia en mayor cantidad en los meses de diciembre-febrero en los

diferentes lugares de venta. Es por ello que en este trabajo se plantea utilizar mandarina en

fermentaciones semilíquidas incubadas con la levadura S. cerevisiae para obtener etanol como

producto final.

Hipótesis:

Si se mantienen las condiciones adecuadas en cultivos de con jugo y bagazo de mandarina y

mandarina completa con cáscara producirán la misma cantidad de bioetanol que el cultivo de

uva.

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Metodología

1) Propagación del inóculo

El primer paso del proceso consistió en la propagación de la levadura (Saccharomyces

cerevisiae). Para ello se inoculó un cultivo de levadura en 300 ml jugo de manzana estéril de la

marca Del Valle ®, en frascos de vidrio de 600 ml (Fig. 1). Los inóculos se mantuvieron a

temperatura de 25 °C y con agitación tres veces al día durante una semana para permitir la

salida de CO2 (Fig. 2). La propagación se realizó por triplicado.

Fig. 1.- Propagación del inóculo de la levadura

S. cerevisiaeFig. 2.- Incubación de los inóculos a 25°C

2) Preparación y pasteurización de los medios de cultivo para las

fermentaciones

Se acudió a la CACDMX para determinar qué fruta se desechaba en mayor cantidad y se

observó que la mandarina es la fruta de temporada de los meses de diciembre-febrero que se

desperdicia más, debido a ello se decidió utilizar esta fruta para realizar el proyecto. Los cultivos

experimentales se realizaron de la siguiente forma un cultivo con el jugo y el bagazo de la

mandarina y otro con la fruta completa (incluyendo la cascara), con la finalidad de determinar si

había diferencias en el producto obtenido. Como cultivo control se utilizó uva morada. Para la

preparación de los medios cultivos, se utilizaron 1000 g de cada una de las materias primas

(Fig. 3)PD

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Fig. 3.- Materia prima utilizada para la obtención de bioetanol

A cada cultivo se le agregó 1 L de agua y fueron esterilizados mediante pasteurización a una

temperatura de 70°C por 30 minutos, para eliminar posibles microorganismos presentes en los

cultivos (Fig. 4a y b). Una vez fríos se vertieron en los biorreactores.

Fig. 4.- Materias primas pasteurizadas a 70°C durante 30 min. a) Mandarina jugo y bagazo. b)

jugo, bagazo y cáscara de mandarina

a) b)

3) Inoculación

A cada uno de los cultivos se les agregaron 100 mL del inóculo y se incubaron a 25°C en un

bioreactor. Con un periodo de agitación de dos veces por día, a la misma hora, durante dos

semanas para favorecer la incorporación y mezcla de los componentes del medio de cultivo con

la levadura y la respectiva liberación de CO2 (Fig. 5).PDF C

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Fig. 5.- Biorreactores utilizados durante la incubación de los medios de cultivo con

la levadura S. cerevisiae

4) Tinción de Gram, preparación en fresco y tinción simple

Para observar el crecimiento Saccharomyces cerevisiae en las fermentaciones, se realizaron

tinciones de Gram, preparación en fresco y tinción simple en diferentes tiempos, además de

verificar que no estuvieran contaminados con otro tipo de microorganismos, como hongos o

bacterias.

5) Determinación de pH

Se realizó con un potenciómetro calibrado con solución amortiguadora de pH 7. Esta

determinación se realizó alícuotas tomadas durante todo el proceso (Fig. 6).

Fig. 6.- Potenciómetro utilizado para la medición de pH

6) Determinación de ºBrix

Los grados Brix son una unidad de cantidad (símbolo °Bx) y sirven para determinar el cociente

total de materia seca (generalmente azúcares) disuelta en un líquido. Una solución de 25°Bx

contiene 25 g de sólido disuelto por 100 g de líquido. Los grados Brix se cuantificaron con un

refractómetro de Aubbe, esta determinación se realizó en las muestras tomadas a lo largo de

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las fermentaciones (Fig. 7).

Fig. 7.- Refractómetro de Aubbe utilizado para la medición de °Brix

7) Determinación del contenido de etanol en las fermentaciones

Determinación colorimétrica

El método se fundamenta en la reacción, del etanol volátil en una cámara con dicromato de

potasio durante 24h (Fig. 8a) posteriormente se cuantifica el sulfato de cromo III (color azul),

por espectrofotometría visible a 580 nm (Fig. 8b). La reacción es la siguiente:

2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4 + 2 C2H5OH 2 Cr2(SO4)3 + 2 K2SO4 + 3 CH3COOH + 11 H2O

2Cr26+ 2Cr23+ Reducción CH3CH2OH CH3COOH Oxidación.

Para realizar esta cuantificación, se midió la transmitancia de los diferentes productos

obtenidos, utilizando como control una curva estándar con soluciones de etanol desde 1 hasta

8% de concentración. Estas mediciones se realizaron durante el tiempo de fermentación de los

cultivos. Para realizar los cálculos de absorbancia, se utilizó la ecuación de la recta, los valores

obtenidos de esta conversión, indican la concentración de etanol en las muestras analizadas.

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Fig. 8.- Procedimientos utilizados para medir la concentración de etanol por colorimetría. a)

Espectrofotómetro utilizado para determinar la concentración de etanol en las

fermentaciones, b) Pruebas de oxidación del cromo en presencia de etanol

a) b)

Determinación con alcoholímetro

La determinación de etanol mediante este método se realiza midiendo la densidad del

fermentado, al tomar la lectura en la parte inferior del menisco alcoholímetro, lo que indica una

lectura directa del porcentaje de la concentración de alcohol presente en el producto. Para este

procedimiento es importante utilizar una probeta adecuada al tamaño del alcoholímetro y a la

cantidad de la muestra destilada, verter el destilado enjuagando la probeta primero con un poco

de la misma muestra. Después introducir el alcoholímetro cuidando que flote libremente. Para

efectuar la lectura, se debe seguir la raya visual paralela a la superficie horizontal del líquido,

hasta donde se encuentre la escala, es decir, donde se encuentra la parte más baja del menisco.

8) Obtención del bioetanol por destilación simple

En este método se separa una mezcla líquida en sus componentes, con base en el punto de

ebullición de los mismos. Al calentar la mezcla, el componente más volátil, es decir el del punto

de ebullición más bajo se separa del resto de la mezcla en forma de vapor, el cual

posteriormente es condensado y obtenido de forma individual al resto de los componentes. Para

separar el etanol del resto de la mezcla de fermentación, se manejó una temperatura de 78°C,

momento en el cual el etanol llega a su punto de ebullición y se evapora (Fig. 9).

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Fig. 9.- Equipo de destilación utilizado para la obtención

Resultados

1) Tinciones de Gram y simple de las fermentaciones en los biorreactores

Se tomó una alícuota diaria de cada biorreactor y se les realizó tinción de Gram y tinciones

simples. En las muestras analizadas, se pudo observar el incremento en la gemación de las

levaduras a medida que incrementa el tiempo del experimento. (Fig. 10 a, b y c). Ninguno de

los cultivos se contaminó con bacterias u otro tipo de microorganismos ajenos al cultivo.

Fig. 10.- Tinciones de los cultivos fermentados en los biorreactores

a)

Fecha: 25 de enero del 2017.

Muestra: Fermentación de jugo y bagazo de mandarina.

Preparación: Tinción de Gram

Objetivo: 100 x

Descripción: Se observa un cultivo joven de levaduras en

gemación, por lo que está puroPDF C

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b)

Fecha: 30 de enero del 2017.

Muestra: Fermentación de mandarina (cáscara).

Preparación: En fresco

Objetivo: 100 x

Descripción: Se encuentra un cultivo joven de levaduras,

algunas están gemando y en movimiento

c)

Fecha: 30 de enero del 2017.

Muestra: Fermentación de una con hollejo.

Preparación: Tinción simple.

Objetivo: 100 x

Descripción: Se observa un cultivo joven de levaduras en

gemación, por lo que está puro.

2) Determinación de pH de en las diferentes fermentaciones

Se determinó el pH en cada una de las fermentaciones durante el periodo experimental. Se

puede observar que en cada uno de los cultivos hubo descenso de pH, lo que indica el

incremento en la producción de etanol.

tiempo

(h)

Jugo

mandarina

Mandarina

completa

Uv

a

244.10 4.20

3.9

0

483.96 4.20

3.8

0

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10

724.12 3.72

3.9

3

1443.93 3.90

3.6

5

1683.80 4.00

3.7

0

1923.80 4.00

3.7

6

2163.70 3.80

3.5

0

3603.20 3.20

3.3

2

3) Determinación de ºBrix

Se realizó la cuantificación de °Brix en cada una de las fermentaciones a lo largo de la etapa

experimental, con la finalidad de obtener la cantidad de sólidos en los cultivos. Se puede

observar que durante el periodo de incubación la cantidad de sólidos fue disminuyendo durante

el periodo de incubación, desde valores iniciales alrededor de 5 para los tres cultivos hasta un

valor de 2, siendo la fermentación de la mandarina completa, la que más tardó para disminuir

la cantidad de sólidos.

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Tiempo

(h)

Mandarina

(jugo y

bagazo)

Mandarina

completa

Uv

a

24 5 4.8 5.2

48 4.6 4.8 5.2

72 2 5 4

144 2.2 5 2.4

168 2 5 2

192 2 3 2

216 2 2 2

360 2 2 2

4) Determinación colorimétrica de etanol

Determinación colorimétrica

Mediciones obtenidas de la curva patrón

Para realizar las mediciones de transmitancia en cada una de las fermentaciones, se preparó

una curva de calibración con soluciones de etanol en concentraciones del 1 al 8%. Los valores

de absorbancia se representan gráficamente.

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Tub Transmitancia % Etanol Absorbancia

B 100% 0 0

1 99% 1 0,04

2 97% 2 0,13 Pendiente:

0,04571429

3 96% 3 0,17 Ordenada: 0.02

4 95% 4 0,22 Coef. relación: 0,962

5 93% 5 0,3

6 94% 6 0,29

7 94% 7 0,29

Cuantificación de etanol durante la fermentación

Durante la etapa experimental, se midió el contenido de etanol en los diferentes cultivos. Los

resultados se muestran en la tabla 2. Acorde a los resultados obtenidos en el gráfico, la cantidad

de etanol obtenida de la mandarina completa, es mayor que en el cultivo de jugo y gabazo.

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Transmitancias Absorbancias

Tiempo

(h)Uva

Mandarina

(jugo y bagazo)

Mandarina

completaUva

Mandarina

(jugo y bagazo)

Mandarina

completa

00,03

10,031 0,031

0,2406

250,240625 0,240625

24 0,04 0,05 0,1 0,4375 0,65625 1,75

48 0,08 0,05 0,1 1,3125 0,65625 1,75

120 0,09 0,05 0,11,5312

50,65625 1,75

144 0,1 0,05 0,15 1,75 0,65625 2,84375

168 0,2 0,1 0,15 3,9375 1,75 2,84375

192 0,2 0,1 0,15 3,9375 1,75 2,84375

216 0,2 0,3 3,93750 6,125

360 0,23 0,35 4,59375 7,21875

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Determinación de etanol con alcoholímetro

Con este método no fue posible obtener la cuantificación de la concentración de etanol en

ninguno de las fermentaciones, debido a que el dispositivo tiene una sensibilidad mínima del

10% (Fig. 11 a, b y c).

Fig. 11.- Medición de la concentración de etanol utilizando alcoholímetro

a) b) c)

5) Obtención de etanol por destilación simple

Se destiló cada uno de los cultivos fermentados para separar el etanol del resto de los

componentes (Fig. 12 a y b), obteniéndose las siguientes concentraciones de etanol: jugo y

bagazo de mandarina: 6%, mandarina completa: 8% y uva: 8%; siendo esta equiparable al

producto obtenido del jugo de uva. (Fig. 12c)

Fig. 12.- Etanol obtenido de las destilaciones de los cultivos fermentados. a) y b)

destilaciones de los cultivos de uva y mandarina completa respectivamente, c) Etanol

total obtenido de las fermentaciones

a) b) c)PDF C

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Análisis de resultados

Uno de los factores primordiales para la obtención del bioetanol, es la temperatura de

propagación de la levadura, antes de ser utilizada en los biorreactores, durante la propagación

fue importante mantener una temperatura constante de 25°C dentro de la incubadora, además

de ser agitada tres veces al día; de lo contrario no habría sido posible ya que anteriormente se

descubrió que la levadura no se propagaba sin estas condiciones exactas. Entonces como

resultado se obtuvo un cultivo rico en levaduras que continuaron propagándose y trabajando en

la generación del bioetanol. Las tinciones de Gram ayudaron a mantener un control cualitativo

de la proliferación de la levadura, y gracias a que es un método diferencial permitió observar

que los cultivos no fueran contaminados por algún microorganismo (bacteria u hongo

filamentoso).

A medida que la fermentación avanzaba y el bioetanol se generaba, tanto el pH como los

grados brix descendían; esto debido a que las levaduras utilizaban la glucosa para la

fermentación anaerobia y se tornaba un medio más ácido, siendo la fermentación de la

mandarina completa la que más tardó para disminuir la cantidad de sólidos. Esto se debe a

que en la cáscara encontramos hemicelulosa. Las hemicelulosas están constituidas por

polímeros de unidades de anhidroazúcares unidas por enlaces glucosídicos, formadas por más

de un tipo de azúcar (hexosas y pentosas).(José Miguel Oliva Domínguez, 2003 )

Por lo tanto, el cultivo de jugo y bagazo no podía producir la misma cantidad de de etanol ya

que al quitar la cáscara quitamos glucosa y al quitar esta reducimos la cantidad de producción

de etanol.

Cada método utilizado para cuantificar la producción de etanol (colorimétrica, destilación simple

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y alcoholímetro) dieron como resultado un porcentaje de alcohol menor al 10%. Primero el

método colorimétrico para determinar la presencia de alcohol en cada muestra tomada, seguido

por el método de destilación simple que dio como resultado los porcentajes (jugo y bagazo de

mandarina: 6%, mandarina completa: 8% y uva: 8%) y terminando con la determinación con un

alcoholímetro, que confirmó la producción al 10% ya mencionado.

Acorde a los resultados obtenidos, la cantidad de etanol obtenida de la mandarina completa, es

mayor que en el cultivo de jugo y bagazo, además del cultivo de uva.

Conclusiones

Se puede observar que en cada uno de los cultivos hubo descenso de pH, lo que indica el

incremento en la producción de etanol.

Las fermentaciones de la mandarina completa producen una mayor cantidad de etanol en

comparación con la fermentación del jugo y bagazo, sin embargo la concentración obtenida en

todos los casos es menor al 10 %.

Los desechos de frutas representan una alternativa para obtener bioetanol.

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