“Plasmodium vivax: avances en la

identificación y caracterización de antígenos

de potencial utilidad en el desarrollo de una

vacuna antimalárica”

Darwin Andrés Moreno Pérez MSc., cPhD Investigador Asociado Grupo Funcional Biología Molecular

Fundación Instituto de Inmunología de Colombia

1

2

Metodología para el Desarrollo de Vacunas

Parásitos

Virus

Bacterias

Hongos

3

Metodología para el Desarrollo de Vacunas

Enfermedad aguda

Fácil diagnóstico

Malaria

Cinchona officinalis

Aotus spp.

OMS, 1988

4

Malaria – Biología Molecular

Malaria atlas project

132 a 391 millones de casos nuevos

Price R et al. Am J Trop Med Hyg 2007,77:79-87

Plasmodium vivax

MPAC de la OMS

Mosquiteros

impregnados con

insecticidas

Fumigación

residual

de interiores

Sedes entomológicas

para estudiar y

controlar el vector

Quimioprevención

Diagnóstico y

tratamiento

oportuno

Organización Mundial de la Salud, 2015

5

1. Etapa pre-

eritrocítica

2. Etapa

eritrocítica

3. Etapa sexual

Ciclo de vida de Plasmodium

Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:555-66

6

1. Genera

hipnozoitos

Ciclo de vida de Plasmodium

Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:555-66

7

1. Genera

hipnozoitos

2. Infecta

reticulocitos

Ciclo de vida de Plasmodium

Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:555-66

8

1. Genera

hipnozoitos

3. Genera gametos

tempranamente

2. Infecta

reticulocitos

Ciclo de vida de Plasmodium

Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:555-66

9

Ciclo de vida de Plasmodium

Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:555-66

10

Proceso de Invasión a eritrocitos

Contacto

Inicial Reorientación Unión

Fuerte

Invasión

Gavin J. et al. Plos Pat 2014,10: e1003943

11

Metodología para el diseño de una vacuna

para P. vivax

1. Identificar y caracterizar antígenos parasitarios

2. Estudiar el rol en el proceso de adhesión celular

3. Determinar las regiones de interacción proteína-

célula

4. Evaluar la utilidad como vacuna

12

Metodología para el diseño de una vacuna

para P. vivax

1. Identificar y caracterizar antígenos parasitarios

2. Estudiar el rol en el proceso de adhesión celular

3. Determinar las regiones de interacción proteína-

célula

4. Evaluar la utilidad como vacuna

13

Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax?

Miller L. et al. J Exp Med 1979,149:172-184

Fya-b-

Fya+b+

Duffy-null

Duffy

Merozoitos de

P. knowlesi y P. vivax

African population

Du

ffy-n

ull

D

uff

y-p

osit

ive

14

Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax?

Horuk R. et al. Science 1993,261:1182-1184

Reticulocitos

DARC

DBP

P. vivax

Infección

15

Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax?

Horuk R. et al. Science 1993,261:1182-1184

Reticulocitos

DARC

DBP

P. vivax

Infección

Eritrocitos Maduros

DARC

DBP

P. vivax

No hay infección

?

16

Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax?

Horuk R. et al. Science 1993,261:1182-1184

Infección No hay infección

Reticulocitos

DARC

DBP

P. vivax

DARC

DBP

P. vivax

Eritrocitos Maduros

17

Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax?

Del Portillo H. et al. PNA 1991,88:4030-4034

MSA1(MSP1)

Regiones Conservadas

Regiones Semi-conservadas

Cheng Q. et al. Mol Bio Par 1994,65:183-187

AMA1

Galinsky M. et al. Cell 1992,69:1213-1226

RBPs

18

P. vivax

Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax?

Micronemas

Micronemas

DBP AMA

Roptrias

RBP1, 2

Superficie MSP1

Reticulocitos

DARC

19

Micronemas

P. vivax

Micronemas

DBP AMA

Roptrias

RBP1, 2

Superficie MSP1

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

20

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

Enfoque Bioinformático

Micronemas

Micronemas

DBP AMA

Roptrias

RBP1, 2

Superficie MSP1

Comparación por homología

21

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

Enfoque Bioinformático

Datos in silico

Bozdech Z et al. PNAS 2008, 105:16290-16295

Transcripción >35h

Secuencia de Secreción

RT, GPI, Dominios

Función en Plasmodium

Proteínas de invasión

en P. vivax

22

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

Validación Experimental

Galinsky M. et al. Adv Par 2013,81:1-26

Galinsky M. et al. Adv Par 2013,81:1-26 23

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

Validación Experimental

Aotus spp.

24

Gen Transcrito Proteína

http://www.ciencia-activa.org/

DivergenAlfabetoGenes.htm

Genoma

http://www.unprofesor.com/ciencias-

naturales/diferencia-entre-adn-y-arn-503.html

ARN DBP

http://humanbetaglobin.weebly.com/be

ta-globin-protein-structure.html

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

25

Gen Transcrito Proteína

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

AND genómico

ARN

Aotus spp.

PCR

26

PvRAP1 PvRhopH1

Gen Transcrito Proteína

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

27

Pv48 PvGAMA PvARP Pv12 PvRON4

PvRON1 Pv34 PvRAP1 PvRhopH1

Gen Transcrito Proteína

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

28

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

Gen Transcrito Proteína

Día 0

ACF

Día 20

AIF

Día 40

AIF

Día 60

Obtención

de sueros PIII Obtención

de sueros PI

29

PvRAP2 PvRhopH3

Gen Transcrito Proteína

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

30

Pv48 PvGAMA PvARP PvRON5 PvRON4 Pv12 PvRhopH1

PvRON1 PvRON2 PvTRAMP Pv38 Pv41 PvRhopH3 PvRAP2

Gen Transcrito Proteína

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

31

Pv41

Gen Transcrito Proteína

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

32

Pv48 Pv12 PvARP Pv41 PvMSP10 PvTRAMP

Gen Transcrito Proteína

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

33

Pv48

PvRhopH1

Pv12

PvRON5

PvARP

Pv38

Pv41 PvMSP10

PvGAMA

PvTRAMP

PvRON4 Pv34

Gen Transcrito Proteína

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

35

PvGAMA

PvARP Pv12

PvRhopH1 PvRON5

Pv48

Gen Transcrito Proteína

1. Identificación y Caracterización

de Nuevos Antígenos

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

2. Estudio del proteóma de P. vivax

Lasonder E et al. Nature 2002, 419:537-42

Florens L et al. Nature 2002, 419:520-6

P. falciparum P. vivax

1289 proteínas 457 proteínas

Acharya P et al. Prot Clin Appl 2011, 6:e26623

Roobsoong W et al. J Proteomics 2011,74:1701-10

55

2. Estudio del proteóma de P. vivax

Procesamiento de

la muestra

Aislamiento de

estadios sanguíneos

Propagación de la

cepa VCG-1 de P. vivax

Análisis LC-MS/MS

Identificación de

proteínas

Predicción de candidatos a

vacuna

56

2. Estudio del proteóma de P. vivax

P. vivax

Primates del Nuevo mundo

Contaminantes

ORF DE REFERENCIA

Procesamiento de

la muestra

Aislamiento de

estadios sanguíneos

Propagación de la

cepa VCG-1 de P. vivax

Análisis LC-MS/MS

Identificación de

proteínas

Predicción de candidatos a

vacuna

57

2. Estudio del proteóma de P. vivax

734 moléculas

1.309 moléculas

Proteínas esenciales para establecer la

infección por Plasmodium o

desarrollarse dentro de la célula

58

2. Estudio del proteóma de P. vivax

734 moléculas

1.309 moléculas

Contacto

Inicial Reorientación Unión

Fuerte

Invasión

Gavin J. et al. Plos Pat 2014,10: e1003943

27%

59

2. Estudio del proteóma de P. vivax

734 moléculas

1.309 moléculas

Contacto

Inicial Reorientación Unión

Fuerte

Invasión

Gavin J. et al. Plos Pat 2014,10: e1003943

27%

Pv41, Pv12, MSP-1,

MSP7, SERA, TRAgs

and Pv-fam (a and d)

RON5, RALP1,

RON2, RhopH1

RON3

60

2. Estudio del proteóma de P. vivax

61

Antígenos Descritos a la Fecha

P. vivax

62

Metodología para el diseño de una vacuna

para P. vivax

1. Identificar y caracterizar antígenos parasitarios

2. Estudiar el rol en el proceso de adhesión celular

3. Determinar las regiones de interacción proteína-

célula

4. Evaluar la utilidad como vacuna

63

2. Actividad de Unión de Antígenos Identificación de Péptidos de Alta Capacidad de Unión

Ocampo M. et al. Peptides

2002,23:13-22

DBP Receptor-Ligando

+

125I-péptido Reticulocitos

=

Unión

64

2. Actividad de Unión de Antígenos Identificación de Péptidos de Alta Capacidad de Unión

RBP1

Urquiza M. et al. Peptides

2002,23:2265-2277

Ocampo M. et al. Peptides

2002,23:13-22

DBP MSP1

Rodríguez L. et al. Vaccine

2002,20:1331-1339

65

3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por ELISA

y Aglutinación

+ =

Eritrocitos Proteína Unión

Anti-His (Proteína)

Cantor E. et al. Mol & Bio Par 2001,117:229/234

66

3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por ELISA

y Aglutinación

+ =

Eritrocitos Proteína Unión

Anti-His (Proteína)

Cantor E. et al. Mol & Bio Par 2001,117:229/234

67

3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por ELISA

y Aglutinación

+ =

Eritrocitos Perla+Proteína Unión

68

3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por ELISA

y Aglutinación

+ =

Eritrocitos Perla+Proteína Unión

Cantor E. et al. Mol & Bio Par 2001,117:229/234

69

3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por Microscopia

+ =

Eritrocitos Proteína

Unión

Anti-CD71 Rodamina (Ret)

Anti-His FitC (Proteína) +

Arévalo-Pinzón G. et al. Mal J 2015,14:106

70

3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría

Anti-CD45 APC (Linfocitos)

Anti-CD71 APC-H7 (Ret)

Anti-His PE (Proteína)

Eritrocitos Maduros

Eritrocitos Inmaduros

+ =

Eritrocitos Proteína

Unión

+

71

3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría

PvGAMA

Mayor porcentaje de unión a reticulocitos

GR Reticulocitos

72

3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría

PvGAMA

Mayor porcentaje de unión a reticulocitos Preferencia por células CD71hi

GR Reticulocitos

73

3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría

PvGAMA

Pv48

GR Reticulocitos

74

3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría

75

P. vivax Reticulocitos

Ligandos Descritos a la Fecha

DARC

76

Metodología para el diseño de una vacuna

para P. vivax

1. Identificar y caracterizar antígenos parasitarios

2. Estudiar el rol en el proceso de adhesión celular

3. Determinar las regiones de interacción proteína-

célula

4. Evaluar la utilidad como vacuna

77

4. Inmunogenicidad de Moléculas

+ +

Primates

Proteína+ACF Reto

% Parasitemia

=

78

4. Inmunogenicidad de Moléculas

+ +

Primates

Proteína+ACF Reto

% Parasitemia

=

MSP1

Rodríguez L. et al. Vaccine

2002,20:1331-1339

20 kDa

14 kDa

79

4. Inmunogenicidad de Moléculas

80% de los primates controlaron la infección

+ +

Primates

Proteína+ACF Reto

% Parasitemia

=

80

Conclusiones

La predicción bioinformática es una herramienta útil para identificar proteínas parasitarias con rol en adhesión celular.

La adaptación de la cepa VCG-1 de P. vivax en primates Aotus permitió caracterizar a nivel de biología molecular antígenos con potencial para desarrollar una vacuna contra la especie.

Se estudio por primera vez en Colombia el proteoma de una cepa de P. vivax adaptada en primates.

81

Conclusiones

Hemos utilizado distintas técnicas de interacción proteína-célula para determinar las moléculas o regiones de estas que se unen a los reticulocitos humanos (PvRON5, PvGAMA y Pv48).

Contamos con una fuente de información útil para continuar con

estudios de caracterización de proteínas candidatas a vacuna.

Se demostró el papel inmunogénico y de protección para distintos

fragmentos de una molécula considerada como buen candidato a

vacun (MSP-1).

82

Agradecimientos

Profesor Manuel Elkin Patarroyo MD (Director FIDIC)

Manuel Alfonso Patarroyo MD., DrSc (Jefe del GF Biología Molecular e Inmunología)

Diego Edison Garzón Ospina MS., cPhD (Investigador Asociado GF Biología Molecular)

Luis Alfredo Baquero Suarez BSc (Investigador Junior GF Biología Molecular)

Hernando Curtidor M.S., PhD (Jefe del GF Receptor-Ligando)

Gabriela Arévalo Pinzón MS., cPhD (Investigador Asociado GF Receptor Ligando)

Maritza Alejandra Bermúdez Díaz BSc (Investigador Junior GF Receptor Ligando)

Otros investigadores:

Yago Pico de Coaña (GF Biología Molecular)

Oscar Pérez Leal (GF Biología Molecular)

Álvaro Monguí (GF Biología Molecular)

Diana Ángel (GF Biología Molecular)

83

Ente Financiador

Entidades Internacionales