DIAGNOSTICO DE DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LAS LABORATORIO DE LAS

INFECCIONES POR INFECCIONES POR PLASMODIUMPLASMODIUM

13-2-09Óscar

IntroducciónIntroducción

Plasmodiosis = Malaria = Paludismo:

Parasitosis caracterizada por episodios febriles típicos, precedidos por escalofrío intenso que terminan con diaforesis, hepatoesplenomegalia y anemia que varia de leve a grave.

Enfermedad causada por parasitos del genero PlasmodiumPhyllum: Apicomplexa (una sola célula)Clase: Sporozoea (carece de organelos de locomocion)Subclase: CoccidiaFamilia: PlasmodiidaeGénero y especies que pueden parasitar al hombre:

Plasmodium vivaxP.malariaeP. falciparumP. ovale.

EpidemiologíaEpidemiología

Entre 500-900 millones de individuos sufrirán ataques clínicos de paludismo el próximo año

Las infecciones más frecuentes son las debidas a P.vivax y P.falciparum.

El P.falciparum predomina en África Tropical, sudeste de Asia, Oceanía, la ribera amazonica y la Republica Dominicana.

P.Vivax es más común en América Central y en la India.

El paludismo es una enfermedad endémica en unos 100 países.

Enfermedad reemergente tanto en países endémicos como en países no endémicos.

Este aumento obedece a:

-Aumento de la resistencia de los parásitos

-Aumento de la resistencia del vector

-Aumento de los viajes a zonas endémicas

• Transmisores del paludismo: hembras de los mosquitos del genero Anopheles.

Especies de Anopheles mas importantes: A.quadrimaculatus

A.pseudopunctipennisA.albimanus.

• Predomina en las regiones tropicales y subtropicales.

DISTRIBUCIDISTRIBUCIÓÓN DEL PALUDISMON DEL PALUDISMO

Epidemiología : Otras formas de Epidemiología : Otras formas de transmisióntransmisión

• Personas que anteceden de transfusión sanguínea procedente de donadores con paludismo, puede desarrollar la enfermedad.

• Paludismo congenito: Ha sido descrito con las 4 especies. Al parecer, para que exista este tipo de transmisión se necesita que la barrera placentaria haya sido dañada

Manifestaciones clínicas:Manifestaciones clínicas:Periodo de incubaciónPeriodo de incubación

Varia según la especie infectante y de acuerdo con la cepa.P. vivax y P. ovale tienen un periodo de incubación de 10 a 7 díasP. falciparum de 8 a 12 yP. malariae de 27 a 40 días.

Los últimos días del periodo de incubación pueden caracterizarse por signos y síntomas como dolores musculares, anorexia, naúseas e inclusive vómito.El paroxismo febril casi siempre es precedido por un escalofrío repentino, que estremece al enfermo, al principio dura 10 a 15 minutos y se alarga un poco a medida que el cuadro clínico se repite.La etapa febril sigue a la de escalofrío y se acompaña de cefalea y dolores de tronco y miembros.

Esta etapa dura de 2 a 6 horas y es seguida por una etapa de sudoración intensa, en la cual el paciente suele sentirse débil y agotado, quedando casi siempre dormido.En el paludismo causado por P. vivax y P. ovale el periodo de la crisis es de 48 horas.En P. falciparum es casi de 48 horas.Y en P. malariae de aproximadamente de 72 horas.

Los cuadros clínicos menos graves son causados por P. ovale y P. vivax Los moderadamente graves por P.malariae y los graves e incluso frecuentemente mortales por P. falciparum.

Manifestaciones clínicas:Manifestaciones clínicas:SíntomasSíntomas

Escalofríos intensoFiebre 40-41 º CSudoración.CefaleaNauseasTaquicardia

TratamientoTratamiento

Para destruir las formas eritrocitarias (tratamiento supresivo) se puede emplear principalmente:

AmodiaquinaCloroquina

• Debido al aumento de las resistencia a estos fármacos se están diseñando nuevos fármacos

• Estos tienen el inconveniente de ser unas 10 veces más caros

Ciclo biológicoCiclo biológico

1. Inoculación de esporozoito

2. Exporozoitos pasan del torrente sanguíneo al hepatocito

3. Esquizoogenesis

4. Esquizonte hepático

5. Merozoito

6. Merozoito penetra a los hematíes7. Trofozoito

8. Esquizonte hematico

9. Gametocitos

10. Gametocitos chupados por el mosquito

11. Fusión de los gametocitos y formación de los huevos

Diagnostico de laboratorio:Diagnostico de laboratorio:Examen de muestras de sangre Examen de muestras de sangre

perifericaperifericaMétodo de referenciaPreparación de las muestras:

Gota gruesa (sobre todo cuando hay menor presencia de parásitos)

Frotis (extensión en capa fina)

Tinciones– Giemsa (tinción de

referencia)– Field (tinción rapida y

sencilla)– Otras:

LeishmanNaranja de

Acridina

Plasmodium vivaxPlasmodium vivax

Los hematíes parasitados suelen tener tamaño aumentado y contienen gránulos de Schuffner (microtúbulos degradados de color rosado)

Las formas en anillo son de contorno fino y de tamaño considerable

Los Gametocitos tienen forma redonda u ovaladaLos Esquizontes contienen numerosos

merozoitos

Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum

Multiples formas en anillo en el interior de un hematie

Gametocitos en forma de bananaNo suelen verse esquizontesInclusiones de color parduzco en el

interior de los neutrofilos y monocitos (pigmento de Maurer = hemozoina)

Plasmodium ovalePlasmodium ovale

Hematies aumentadosAnillos de forma ovalada mas compactos

que en el P.vivax y el P.falciparumGametocitos redondeados

Plasmodium malariaeHematies ligeramente menores que los

normalesAnillos compactosGametocitos redondeados

TROFOZOITOSTROFOZOITOS

Plasmodium falciparum:  Los trofozoitos dentro del eritrocito

siempre están en forma de “anillo”, además de que sólo en P. falciparum se presentan múltiples trofozoitos en

una célula.

Plasmodium vivax:  Los eritrocitos infectados por P. vivax son a veces

más grandes que los eritrocitos normales. Aproximadamente cabría

1.5  eritrocitos normales en uno infectado..

Plasmodium malariae: La característica de los trofozoitos de P.

malariae muestran la forma de “anillo” y una ligera tendencia de que

los eritrocitos normales sean de tamaño normal o más pequeños.

Plasmodium falciparum:  El gametocito tiene forma de Platano.

Plasmodium ovale:  El gametocito es más grande que los eritrocitos normales.Tienen una apariencia granular parecidos a los puntos de Schuffner.Plasmodium malariae:  Los gametocitos de P. malariae tienen una apariencia redonda cercana a la de los eritrocitos. Tienen a demás una apariencia granular.

GAMETOCITOS

GAMETOCITOSGAMETOCITOS

Plasmodium malariae:  Un esquizonte tiene de 6 a 12 merozoitos, dándole una apariencia granular.

Plasmodium vivax: Un esquizonte muestra numerosos merozoitos (de 16 a 24), y un mayor tamaño en comparación con los eritrocitos normales

ESQUIZONTES

Características morfológicas de los parásitos Características morfológicas de los parásitos palúdicos en extensiones sanguíneas finas palúdicos en extensiones sanguíneas finas

(según OMS).(según OMS).P.Vivax P.Ovale P.Malariae P.falciparum

Hematie infectado AumentadoPuntos de Schuffner

Aumentado, ovalPuntos de Schuffner

Normal o menor NormalHendiduras de Maurer

Anillo GrandeUno o dos puntos de cromatinaPuede haber 2 anillos

CompactoRaro 2 anillos

CompactoRaro 2 anillos

Pequeño DelicadoA menudo dos puntos de cromatina y 2 o más anillos

Trofozoito GrandeAmeboidePigmento en bastones fino

PequeñoNo ameboidePigmento granuloso

PequeñoCompacto, a menudo en forma de bandaPigmento granuloso

Tamaño moderadoCompactoPigmento en gránulos

Esquizonte GrandeMerozoitos grande (12-24)Pigmento coalescente

Mas pequeño que P.vivax6-12 merozoitosPigmento más oscuro que P.vivax

Pequeño6-12 merozoitos grandesAspecto tipico de “Margarita”Pigmento granulosos

RaroMerozoitos pequeños (8-26)Masa única de pigmento

Gametozito EsfericosCompactosNucleo únicoPigmento difuso y granuloso

Parecido a P.vivax pero más pequeños

Parecidos a P.vivax pero más pequeñosMenos mumerososSin puntos de Schufner

Forma semilunarNucleo único

Otras pruebas diagnosticas:Otras pruebas diagnosticas:Microscopia de fluorescenciaMicroscopia de fluorescencia

Colorantes fluorescentes con afinidad por los ácidos nucleicos de los parasitos:

Naranja de acridina (NA)Benzotiocarboxipurina (BCP)

Aumentan la sensibilidad.Pueden ser útiles en caso de parasitemias muy

bajaNo permiten la diferenciación de las diferentes

especies de Plasmodium

Otras pruebas diagnosticas:Otras pruebas diagnosticas:Sistema QBCSistema QBC

Quantitative Buffy Coat SystemSe basa en la concentración por gradiente de

densidad de los eritrocitos parasitados mediante la centrifugación de un capilar impregnado de heparina y NA, al que se añade un flotador.

Sistema caro: necesita de centrifuga, capilares especiales, un acoplador de microscopio con un sistema de epifluorescencia, lentes especiales,…

No aporta mucho al frotis y a la gota gruesa, ni permite diferenciar diferentes especies

• Utilizan principios de inmunocromatografía incorporados a formatos de cintas reactivas o de tarjetas de prueba

• Pretenden tipificar a la especie de Plasmodium conforme a la detección de antígenos específicos producidos por el parásito.

•Las PRDM pretenden ser :sencillas (manejo a temperatura ambiente sin

instrumentos) rápidas (diagnóstico en sólo 10 a 15 minutos)

PRUEBAS RAPIDAS PARA EL DIAGNOSTICO DEL PALUDISMO (PRDM)

PRDMDetección de HRP-2

• Proteína 2 rica en histidina especifica de P. falciparum (PfHRP-2)

• Detección mediante la captura antigénica con anticuerpos especificos y técnicas de inmunocromatografía

• Tienen falsos negativos y no son cuantitativas• Tienen falsos positivos: especialmente con el FR• Faciles de utilizar en laboratorios sin experiencia en

diagnostico microscopico

• Los kit comerciales utilizan anticuerpos contra HPR-2 especifica de P.falciparum, y anticuerpos contra antigenos panmalaricos, o sea, presentes en las cuatro especies de Plasmodium (Lactato Deshidrogenasa parasitaria y Aldolasa de Plasmodium).

• Detección mediante la captura antigénica con anticuerpos especificos y técnicas de inmunocromatografía

• Metodo barato• No ofrece mejor sensibilidad que la microscopia, tienen falsos

negativos ,no son cuantitativas y no permite distinguir entre especies diferentes a P.falciparum.

• Tienen falsos positivos• Faciles de utilizar en laboratorios sin experiencia en diagnostico

microscopico

PRDMKit comerciales de detección conjunta de

HPR-2 y pLDH o Aldolasa de plasmodium

OPTIMAL: Diagnóstico de malariacon anticuerpos monoclonales contrala enzima pLDH

Técnicas molecularesTécnicas molecularesPCR a tiempo real PCR a tiempo real

• Se amplifica el gen de la subunidad 18S del RNA ribosomalEste gen presenta secuencias de bases comunes y

especificas de cada especie.• Se utilizan varios pares de primers en un unico tubo (PCR

multiplex) que permite la amplificación simultanea de varios fragmentos de DNA.

• El producto amplificado se detecta por fluorescencia• La detección de las intensidades de fluorescencia mientras se

produce la PCR, hace posible la detección y cuantificación del producto amplificado.

• Permite la detección incluso de 0.7-4 parásitos/uL• Al ser cuantitativa: sirve para controlar tratamientos• Altisima sensibilidad y especificidad

• MUY CARA. Solo posible en países desarrollados

- - Diagnostico molecular de malaria en sangre de pacientesDiagnostico molecular de malaria en sangre de pacientes

ssDNA Plasmodium

ssrDNA Humano

P. vivax (499 pb)

P. falciparum (395 pb)

P. malariae (269 pb)

Serología Serología

• Derección de anticuerpos anti P.falciparum en el suero

• Baja sensibilidad.• Solo se utiliza en determinados casos en donde

la microscopia es negativo debido a la medicación

• Existe una técnica de inmunofluorescencia (Falciparum-spot IF. Bio-Merieux).

• Mas recientementew se ha introducido un enzimoinmunoensayo (Malaria IgG Celisa. BMD).

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

LA OBSERVACIÓN MICROSCOPICA ES EL METODO DE REFERENCIA

cuantitativo ,diferencia especies y barato

LAS TECNICAS INMUNOCROMATOGRAFICAS SON FACILES Y BARATAS PERO PEORES

menos sensibilidad y con falsos positivos y falsos negativos

LA PCR ES LA MAS SENSIBLE PERO LA MAS CARAdetecta parasitemias bajas. Util para control de

ttos.