Plataforma de Microscòpia

Conceptes de microscòpia Bàsica

Marta Valeri-Sala, MSc, Biòloga

Responsable de la Unitat de Microscòpia

UAT - VHIR

Microscòpia

La microscòpia és l’art de fer visibles detalls fins.

Les condicions prèvies per fer visibles detalls fins són: Ampliació, resolució i contrast.

L’òptica estudia la interacció de la llum amb la matèria i la formació de les imatges a

través de les lents.

Font Llúminica

Creació de la imatge

Detecció

Tractament de la imatge i

anàlisi de les dades

La llum Teories

Teoria corpuscular

La llum està composta per un flux de partícules invisibles o corpuscles (fotons) emeses

pels objectes i captades per l’ull. Es considerava que aquests corpuscles eren emesos

directament d’objectes lluminosos i que es reflexaven en l’ull a partir d’objectes no

lluminosos.

Teoria de les ones electromagnètiques

La llum és una ona electromagnètica.

La imatge es genera degut a la interaccció de les ones electromagnètiques amb el seu

entorn.

La llum Ona electromagnètica

La longitud d’ona és la distància que ha recorregut la llum en realitzar una vibració

completa.

La freqüència és el nombre de vibracions per segon d’una logitud d’ona determinada.

L’amplitud d’ona és el desplaçament màxim d’una partícula respecte del seu punt d’equilibri.

Velocitat llum en l’aire = 300.000 Km/sec

A

La llum Longitud d’ona

La longitud d’ona determina el color de la llum.

L’amplitud d’ona determina la intensitat de la llum.

La llum Refracció

Quan els feixos de llums paral·lels provinents d’una font llumínica canvien de medi canvien

la velocitat i la mantenen dins el medi on es troben.

La refracció es produeix en la superfície on canvia el medi i els feixos es mantenen

paral·lels tant abans com després d’aquesta.

El desviament de la llum depèn de l’angle d’incidència d’aquesta i de la diferència

d’índex de refracció dels dos medis.

L’índex de refracció és el quocient entre la velocitat de la llum en l’aire i la seva

velocitat en altres substàncies.

aire = 1

aigua = 1,33

Vidre de cobreobjetes = 1,51

Oli = 1,51

v 1 v 2

Glicerol = 1,47

La llum Difracció o dispersió

Detecció espectral

Prismes

La difracció es produeix quan les ones procedents d’una font quasi puntual troben un

obstacle o una petita obertura. Llavors deixen de propagar-se en línia recta i volten

l’objecte o s’obren després de passar l’obertura.

La llum Reflexió

Quan la superfície del vidre és un mirall, el feix llumínic no penetra a través d’ell sinó

que es reflexa.

És el mecanisme que coneixem en la generació comuna de les imatges en la vida

quotidiana.

La llum incideix sobre els objectes i es reflexa en ells en un angle que depèn del

propi angle d’incidència del feix llumínic.

i r

i = angle d’incidència

r = angle de reflexió

i = r

La llum Formació d’una imatge

Les ones de llum interaccionen d’una manera que pot ser destructiva ( pèrdua de llum ) o

constructiva ( increment de llum ). El resultat d’aquestes interaccions generalment és

parcialment destructiu i parcialment constructiu.

La formació d’una imatge en un microscopi òptic està directament relacionada amb la

interacció de la llum amb l’objecte:

Desviament dels feixos de llum quan aquests passen a través d’estructures molt

petites (difracció).

Desviament dels feixos de llum quan passen per les diferents lents del propi

microscopi (refracció).

Microscopi Formació de la imatge

La funció de l’objectiu és comparable a la lent d’un

projector.

Projecta la imatge a l’extrem superior del tub del

microscopi (imatge aèria).

Visualitzem la imatge a través de l’ocular que funciona

com una lupa.

La imatge real es forma a l’ull, però aquest la percep com

si es trobés en el pla de la imatge virtual.

Augment real de l’objecte

Augment de l’objectiu x augment de l’ocular = 100 x

10 = 1000

Augment de l’objectiu (ex:100X) = distància entre objecte

i imatge aèria (5000mm) / distància entre l’objecte i

objectiu (50mm).

5000mm

50mm

Microscopi Objectius

Són les peces més precises del microscopi, ja que la seva

funció és augmentar la mostra i resoldre els detalls amb tota

nitidesa i fidelitat.

Augment

És el producte matemàtic entre l’augment de l’objectiu i

el de l’ocular.

El límit de l’augment ve determinat pel poder de

resolució de l’objectiu.

Obertura numèrica

És la variable que defineix el poder de resolució de

l’objectiu.

Aberració

És el defecte òptic inherent al disseny d’una lent que li

impedeix concentrar tots els raigs de llum en un focus

exacte.

Microscopi Objectius

Obertura numèrica

A major obertrura numèrica d’un objectiu, major serà el seu poder de resolució.

Microscopi

aire

Oli

Objectius

Obertura numèrica

Mostres fixades Mostres vives

Objectius d’immersió

Medis de muntatge

Objectius d’aigua

Objectius que es

submergeixen

al medi de cultiu

n = índex de refracció del medi

. Aire n = 1

. Aigua n = 1.33

. Oli n = 1.515

Microscopi

Resolució òptica

Una imatge d’un objecte puntiforme no és un punt sinó que, degut al fenomen de

difracció de la llum, és una petita taca de llum envoltada d’anells llumínics.

Criteri de Rayleigh

La resolució lateral mínima es dóna quan el centre màxim del primer disc d’Airy del

punt 1 cau en el primer mínim del punt 2.

Objectius

RL = 1,22 l /2NA ( NAobjectiu + NA condensador)

Microscopi

Crear la imatge d’un punt com un disc

redueix 1,22 vegades la resolució del

microscopi.

RL = 1,22 l /2NA

Raxial = 2 n lem / NA2

El poder de resolució incrementa amb la llum

monocromàtica i el màxim de resolució es troba en

les longituds d’ona més petites de l’espectre.

Profunditat de camp Propietat que tenen els objetius de presentar

detalls a una mateixa posició de focus en el

gruix d’una mostra.

f = 1/ NA

Objectius

Resolució òptica

Microscopi

Aberracions

Els raigs de llum que passen per la perifèria de la

lent no arriben al mateix punt que aquells que

passen pròxims al centre. La imatge queda més o

menys borrosa i no pot enfocar-se (pèrdua de

contrast).

Esfèriques

Les lents estan formades per un conjunt de prismes més inclinats com més es

trobin a la perifèria.

Cromàtiques

Es detecta en un sistema de lents quan

els raigs de colors que composen la llum

blanca no es condueixen a un focus

simultàniament. Aquest fet provoca

l’aparició de franges cromàtiques no

desitjades en la imatge.

Objectius

Curvatura de camp

Produïda per la pròpia curvatura de la lent.

Microscopi

Correccions

Lent acromàtica

Confeccionades amb cristall de crown i cristall de flint.

Correcció de l’aberració cromàtica de manera que té la

mateixa distància focal per dos colors (roig i blau). Aquesta lent

també està corregida per l’aberració esfèrica per un color.

Lent fluorita (semiapocromàtica)

Combina cristall de quarç i fluorita. Gràcies a la seva baixa

dispersió produeix una qualitat d’imatge propera a la dels

objectius apocromàtics. Té correcció cromàtica per 3 colors (roig,

blau i verd) i correcció esfèrica per dos.

Lent apocromàtica

Corregeixen les aberracions cromàtiques i esfèriques pels tres

colors (roig, blau i verd).

Correcció plana

Corregeix la pròpia curvatura de la lent.

Objectius

Microscopi Objectius

1 2 3

4

5

6 6. Codi de colors pel líquid d’immersió

nergre oli, blanc aigua, taronja glicerina

4. Codi de color per l’Augment

Negre 1.25X, cafè 2,5X, roig 4X i 5X,

taronja 6.3X, groc 10X, verd 20X, 25X

32X, blau clar 40X, 50X, blau fosc 63X,

blanc 100X

1.Categories dels objectius /Color del mèt. contrast

roig POL I DIC,

verd Ph

2. Augment / Obertura Numèrica

3. Longitud del tub / Gruix del cobreobjectes

5. Anell mecànic de correcció

Microscopi Parts del microscopi

Microscopi invertit

Microscopi recte

Microscopi Òptica de Köhler

Il·luminació òptima i homogènia de la preparació a través del condensador i del

diafragma de camp.

Ajust òptim de contrast i resolució a través del condensador i l’obertura de diafragma.

Feix de llum per formar la imatge

(plans de camp conjugats)

Feix de llum d’il·luminació

( plans d’obertura conjugats)

Microscopi Òptica de Köhler

Condensador

Obertura de

camp

Obertura de

diafragma

Centratge

Treure un ocular:

Tancar obertura del

diafragma fins a 3/4

Tipus d’imatge Imatges de camp clar

La font d’ones electromagnètiques genera un raig de llum que penetra en la mostra

que es troba al seu pas. Aquesta interacció provoca l’absorció i refracció de la llum que

es desviarà del seu recorregut inicial de manera diferent segons el material biològic

que travessi. Aquests canvis produiran una imatge amb regions de llum i ombres.

Aquest fenomen es pot incrementar amb l’addició de colorants segons l’afinitat pel

material. Això fa que es produeixi l’absorció de determinades bandes de l’espectre i

s’observin parts de la mostra amb diferents coloracions contrastades.

Es necessita al menys una

diferència d’intensitat d’un

20% per veure les mostres

contrastades.

Objectes de fase

Objectes d’amplitud

Llum transmesa

DICT

n2

n1

El feix llumínic en passar per un

objecte de fase rep un desplaçament

que depèn del seu índex de refracció.

El feix llumínic 1, en passar per un

objecte de fase amb diferent índex

de refracció que el feix llumínic2,

rebrà un desplaçament de fase

diferent.

El desplaçament de fase entre

diferents estructures de la mostra fa

que veiem les imatges amb

profunditat la qual cosa ens permet

diferenciar millor els detalls.

V1 > V2

l1 < l2

f1 = f2

Tipus d’imatge

Llum transmesa

Contrast de Fases

S’aprofita el fenomen de difracció de la llum per incrementar el contrast entre

estructures.

Objectiu Aire

S’incrementa la diferència de fase entre

llum difractada i no difractada d’1/4 a 1/2.

S’incrementa la influència de la llum

difractada en la imatge intermitja

reduint la intensitat de la llum no

difractada.

Tipus d’imatge

Llum transmesa

Obertura del diafragma pràcticament tancada Obertura del diafragma totalment oberta

Contrast de Fases

Posar el filtre de contrast de fases específic per

cada objectiu.

L’obertura del diafragma ha d’estar totalment

oberta.

DICT

Tipus d’imatge

Llum reflexada i emesa

A més de les característiques pròpies de l’objecte que fan que s’absorbeixi

una determinada quantitat de llum d’una franja de l’espectre determinat, la

disposició relativa de la font de llum i la mostra fa que s’obtinguin ombres

que confereixen una sensació de profunditat.

i r És el mecanisme que coneixem en la generació comuna de les imatges en

la vida quotidiana.

La llum incideix sobre els objectes i es reflexa en ells en un angle que depèn

del propi angle d’incidència del feix llumínic.

Lupes estereoscòpiques

Llum emesa El propi objecte és el que emet la llum quan és excitat.

Fluorescència: determinades substàncies són capaces d’absorbir fotons molt

energètics al ser estimulades amb llum d’una determinada longitud d’ona i

alliberar part de l’energia absorbida en forma de fotons de menor energia.

Tipus d’imatge

Upright Microscope

Inverted Microscopes

Olympus BX61

Microscopi

Olympus IX71

Nikon Eclipse TE-2000-S

FSX100

Microscopi Programes

Temps d’exposició

Mida de la imatge (nombre de píxels)

Sensibilitat de la càmera

Olympus IX71 Olympus BX61

Nikon Eclipse TE-2000-S

Microscopi Programes

Correcció de soroll de fons

Microscopi Límits de Resolució

MO

MLC

STORM

STED

SIM

PALM

Lupa