Codi: Revisió: ITE-MICROSCOPI DE VHIR-UAT-ITE-003 ... · ITE-MICROSCOPI DE FLUORESCÈNCIA BX61...

ITE-MICROSCOPI DE FLUORESCÈNCIA BX61

Codi: VHIR-UAT-ITE-003

Revisió: 01

Data: 10/07/2013

Pàgina: 1 de 9

Nº Inventari: 1056466 (Nº del microscopi de fluorescència)

Nom Aparell: Microscopi de fluorescència

Model: BX61

Marca: Olympus

Nº Sèrie: 5M 14267

1. FUNCIONAMENT DE L’APARELL:

Per mirar qualsevol mostra al microscopi, la unitat d’alimentació d’aquest s’ha d’obrir (mòdul

adjacent que es troba al prestatge situat sobre el microscopi i a la dreta de la unitat d’alimentació

de fluorescència).

Unitat d’alimentació de fluorescència Mòdul d’encès del microscopi

Esquema del microscopi



Revisió: 01

Data: 10/07/2013

Pàgina: 2 de 9

1- Observació de les mostres amb llum transmesa

Encendre el microscopi. El botó d’encès-apagat de la llum transmesa està situat al lateral esquerra del microscopi, sota els oculars.

Per visualitzar mostres en Camp Clar (tenyides amb algun colorant):

Posar la roda de filtres de fluorescència en qualsevol de les posicions 5 ò 6, mitjançant el

controlador automàtic del microscopi.

Ajustar la intensitat de llum i l’obertura del diafragma. L’obertura del diafragma la trobem just a sota la platina.

Atenuar la intensitat de llum si és necessari amb els filtres neutres situats a la part

inferior del lateral dret del microscopi (ND6, ND25, LBD).

Ajustar el focus amb el macròmetre i el micròmetre (si l’observació de les mostres no és la desitjada, comprovar que l’òptica de Köhler estigui alineada correctament).

Els objectiu que necessiten oli d’immersió són els de 60 i 100 augments. Per tant després de fer-los servir s’haurà de netejar bé mullant una gasa amb alcohol-éter 50% (mai fer servir mocadors de paper que ratllaran la lent de l’objectiu).

Alineament de l’òptica de Köhler

Obertura del diafragma

Obrir el llum i enfocar la mostra.

Tancar el diafragma de camp fins que

veiem un hexàgon (a)

Enfocar l’hexàgon movent el condensador (b)

Centrar l’hexàgon amb els cargols (c)

Obrir el diafragma de camp i ajustar

l’obertura del diafragma.

a

b c



Revisió: 01

Data: 10/07/2013

Pàgina: 3 de 9

2- Observació de les mostres amb fluorescència

Si es vol observar fluorescència i la làmpada està apagada:

- Comprovar que el darrer usuari hagi apagat la làmpada al menys 20 minuts abans de tornar-la a encendre. Es pot posar la mà al portalàmpades i veure si està calent o no. En cas afirmatiu, deixar refredar.

- Encendre l’interruptor de la làmpada de fluorescència.

Seleccionar el cub de filtres de fluorescència específic per cada marcatge amb el controlador automàtic del microscopi. La roda de filtres es troba just per sota els oculars. A la part superior frontal hi ha una llegenda que ens indica quin filtre s’ha de fer servir per cada marcatge:

1----FarRed 4----FITC

2----TRITC 5 (*)

3----DAPI 6 (*)

(*) Per veure mostres amb llum transmesa (camp clar)

Donar pas a la llum de fluorescència a partir del controlador automàtic del microscopi.

Seleccionar la trajectòria de la detecció de llum fluorescent emesa amb la palanca situada a la part superior dreta del microscopi, al costat dels oculars:

- Totalment enfonsada (tota la llum va als oculars)

- A la meitat (50% als oculars i 50% a la càmera DP72)

- Totalment treta (tota la llum va a la càmera DP72)

Si la intensitat de fluorescència és massa forta, es poden fer servir els filtres neutres situats en el pas del feix de llum que va des de la làmpada de mercuri cap a la mostra. Així s’aconsegueix atenuar la seva il·luminació i preservar millor el marcatge (USND6 i US25ND25) .

Ajustar el focus amb el macròmetre i el micròmetre.



Revisió: 01

Data: 10/07/2013

Pàgina: 4 de 9

3- Adquisició amb DP72 i tractament de la imatge

Per captar imatges amb la càmera DP72, primer de tot s’ha de seleccionar que la llum emesa vagi cap a la càmera amb la palanca situada a la part superior dreta del microscopi (o bé que un 50% de la llum emesa incideix al xip CCD o bé tota). Obrir l’ordinador i encendre el programa CellSens. Aquest és el programa que controla els paràmetres de captació de la image.

1

a. Clicar el botó Live (1) per poder veure la mostra en viu a l’ordinador.

b. Ajustar els paràmetres d’adquisició (temps d’exposició, guany de la càmera, format, etc…).

c. Fer una adquisició de la imatge seleccionant Snap (2).

d. Guardar les imatges.

Passes a seguir:

2

b. Ajustar els paràmetres d’adquisició (temps d’exposició, guany de la càmera, format, etc…).

b.1. Exposició:

Automàtica Manual



Revisió: 01

Data: 10/07/2013

Pàgina: 5 de 9

És important tenir en compte que quan es carreguen els paràmetres d’adquisició d’imatges anteriors, el programa no sap com estan situats els filtres i els diferents dispositius del microscopi. És a dir, el programa carregarà el mateix temps d’exposició que el de la imatge de referència, però no sabrà si s’ha posat al pas de la llum algun filtre atenuador del senyal, la qual cosa, si fos així, faria que el senyal detectat fos més lleu. Per això s’ha de tenir en compte com estaven disposats el diferents dispositius del microscopi.

b.2. Format d’adquisició:

Manual:

Clicar el botó Manual.

Modificar el temps d’exposició o bé per o

bé per

Sensibilitat: Incrementa la intensitat del senyal

emès per la mostra. A diferència del temps

d’exposició, aquest increment es dóna sobre el

senyal que detecta el CCD. És per això que

incrementa tant el señal específic com el

background. Sensibilitat més baixa = ISO 200.

Automàtica:

si es mira fluorescència seleccionar el botó SFL.

Clicar el botó Automatic.

Region: es tracta d’una regió de la imatge que el

programa fa servir per calcular el temps

d’exposició necessari. Aquesta pot ser un 30% o

menys i pot estar centrada o no.

Si es vol canviar de zona de la mostra i que no variï

el temps d’exposició, s’ha de seleccionar la icona

del candau.

Sensibilitat: Incrementa la intensitat del senyal

emès per la mostra. A diferència del temps

d’exposició, aquest increment es dóna sobre el

senyal que detecta el CCD. És per això que

incrementa tant el señal específic com el

background. Sensibilitat més baixa = ISO 200.

Si la selección automática no acaba de convèncer

(imatge massa lleu o massa forta), es pot fer una

compensació positiva (si la imatge és lleu) o

negativa (si la imatge és forta). Es selecciona la

comepensació adequada al despelegable Exposure

Compensation.

1



Revisió: 01

Data: 10/07/2013

Pàgina: 6 de 9

Es pot escollir el mateix o diferent format d’adquisició (nº de píxels) per la imatge adquirida (snap) que per veure la imatge al monitor en viu (live/mode). En la imatge adquirida hi ha disponibles dos formats més que en la imatge en viu. Aquests contenen més número de píxels. Crop: es pot fer crop (1) de la imatge. El crop consisteix en guardar només la informació d’una part de la imatge que s’adquireix. Es guardarà només l’àrea prèviament seleccionada de la imatge en viu i s’obtindrà un arxiu que ocupa menys espai (menys nombre de píxels). Encara que la imatge tingui menys nombre de píxels, la resolució d’aquesta (mida del píxel), serà la mateixa que la de qualsevol imatge que s’hagi triat el mateix format, independentment que se li hagi aplicat l’opció crop. Si es clica el requadre Apply to live, es podrà veure el crop (únicament l’àrea seleccionada) en viu.

b.3. Image Averaging:

L’average el que fa és fer la mitja en cada píxel dels valors obtinguts en diferents exposicions, obtenint-se imatges més nítides. Es pot fer tant quan visualitzem la imatge en viu (enlantiment del procés), com en la imatge adquirida. Es modifica el nombre d’exposicions o adquisicions mitjançant les sagetes.

b.4. White and black balance:

2 .Black balance

Es fa servir per imatges de fluorescència. Funciona igual que el balanç de blanc i serveix per posar

un llindar pel soroll de fons (en aquest cas negre).

3. La icona nº 3 informa sobre diferents paràmetres de la Imatge. Tant el white balance com el black balance s’aconsegueixen movent les barres que es veuen en la imatge. A voltes amb les dues opcions anteriors (1 i 2), no s’arriba a obtenir la coloració adequada. En aquestes situacions es pot obrir aquesta finestra i moure els percentatges manualment. Sempre es pot recórrer a l’opció default.

1. White balance

Es fa servir per imatges de camp clar. Es selecciona la icona i es delimita una regió de soroll de fons de la mostra a partir de la qual es calcularà el percentatge de les tres franjes cromàtiques (RGB).

1 2

3

. Informa sobre l’enfocament de la imatge en una zona determinada. . Mostra un perfil d’intensitats d’una línea concreta de la imatge. . Converteix la imatge en color a una imatge a nivells de grisos i a l’inversa. .Mostra l’histograma.



Revisió: 01

Data: 10/07/2013

Pàgina: 7 de 9

Si tot i així no s’aconsegueix, s’haurà de modificar el temps d’exposició o la sensibilitat de la càmera.

Altres aspectes d’interès:

. Scalebar: per posar una barra d’escala, primer s’ha de verificar que l’objectiu amb què es mira la

mostra és el mateix que el que està seleccionat al programa (1). Seguidament s’ha de seleccionar

tools del menú principal___ option ___menú de la barra d’escala. Aquí es pot modificar la mida,

el color, la lletra, etc...

Anar a View___Scalebar, per visualitzar la barra d’escala a la imatge. Anar a View___Infostamp, per visualitzar l’augment. Capturar la imatge (quedarà la barra d’escala estampada). . Properties: La finestra amb el metadata (dades de la imatge i de l’adquisició) generalment està amagada. Per veure-la, s’ha de clicar amb el botó dret del ratolí sobre la imatge i seleccionar properties.

. Guardar les imatges: es pot fer amb save o save as. Hi ha els formats típics d’anàlisi d’imatges. Per unir diferents imatges i combinar-les, s’ha de seleccionar Image del menú principal i després Combine colors. Afegir al menú de la finestra les diferents imatges que es volen combinar. Si no es fa res més, guardarà les diferents imatges en un arxiu multipàgina, però no guardarà el solapament (merge) d’aquestes. Per guardar la imatge solapada, s’ha de seleccionar el botó merge layers que està indicat amb una fletxa vermella en la imatge.

1



Revisió: 01

Data: 10/07/2013

Pàgina: 8 de 9

.Visualització: Es pot veure una única imatge o diferents imatges que s’hagin carregat. Les diferents opcions de visualització es troben a la barra senyalada amb la fletxa vermella. En la imatge de sota, hi ha dues imatges obertes. Quan les imatges encara no s’han guardat, apareixen amb un asterisc al costat del nom. Aquestes són les instruccions bàsiques. Es poden fer altres aplicacions més avançades, tant en l’adquisició com en el tractament (mesures, etc...). L’explicació d’aquestes es troben al manual del mateix programa que s’obra al iniciar-lo. 4- Per acabar

Netejar tant els objectius bruts d’oli com la platina.

Quan la caixa de la bombeta de mercuri s’hagi refredat, tapar el microscopi amb la seva funda.

És preferible guardar les imatges a la carpeta Aparells Comuns de la partició “Q” i recuperar-les directament accedint a ella directament des del vostre ordinador. Aquesta carpeta s’esborra cada diumenge. A més, cada tres mesos (començant l’1 de juliol del 2013) s’esborra tot el contingut d’imatges de l’ordinador del microscopi.

2. ACCESSORIS: no

3. PRECAUCIONS: Evitar l’exposició directa al feix lluminós provinent de la bombeta de mercuri.

4. INTERVENCIÓ REQUERIDA

INTERVENCIÓ REQUERIDA :

MANTENIMENT x VERIFICACIÓ CALIBRATGE

REALITZADA PER:

Intern VHIR (preventiu) x

Manteniment HUVH

Electromedicina HUVH

Extern x

Intern VHIR

Manteniment HUVH


Extern

Intern VHIR

Manteniment HUVH


Extern

*



Revisió: 01

Data: 10/07/2013

Pàgina: 9 de 9

Manteniment intern VHIR:

1. Neteja d’ objectius i lents. Si s’han fet servir objectius d’oli d’immersió, netejar amb etanol/èter 50% o bé paper òptic especial per lents. La resta de lents amb etanol n’hi ha prou. À càrrec de l’usuari quan es facin servir aquests objectius. Revisió per part del tècnic un cop al mes.

2. Canvi de bombeta de mercuri i centratge d’aquesta cada 300 hores de funcionament.

3. Alineament òptica de Köhler quan es miri amb llum transmesa i estigui desajustada. L’usuari ho ha de fer si detecta l’anomalia. Revisió per part del tècnic un cop al mes.

Les operacions de manteniment realitzades s’han d'anotar a la Fitxa de l'Equip del programa de gestió HACTEC, a l'apartat “Registre d'actuacions”.

5. APROVACIÓ

REDACTAT PER REVISAT PER APROVAT PER

Nom: Marta Valeri

Càrrec: Tècnic Microscòpia

Nom: Rosa Prieto

Càrrec: Responsable UAT

Nom: Monica Anglada

Càrrec: Responsable Calidad

Nom: Rosa Prieto

Càrrec: Responsable UAT

Signatura:

Signatura: Signatura:

Codi: Revisió: ITE-MICROSCOPI DE VHIR-UAT-ITE-003 ... · ITE-MICROSCOPI DE FLUORESCÈNCIA BX61...

Documents

Transcript of Codi: Revisió: ITE-MICROSCOPI DE VHIR-UAT-ITE-003 ... · ITE-MICROSCOPI DE FLUORESCÈNCIA BX61...