Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays

Institut de RecercaHospital Universitari Vall d’Hebron

Tecnologies d’alt rendiment

a l’ucts. Conceptes i anàlisi de dades

28/11/12 – 05/12/12

Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

Ricardo Gonzalo Sanz

TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN la ucts.conceptos y análisis de datos

DIA 1. 28 de Noviembre. 10-14:00

Microarrays. Ricardo Gonzalo Sanz

Analisis de resultados de microarrays. Alex Sanchez

RTqPCR. Paqui Gallego

Análisis de resultados de RTqPCR. Jose Luis Mosquera

DIA 2. 5 de Diciembre. 10-14:00

Ultrasecuenciación. Paqui Gallego y Rosa Prieto

Analisis de resultados de Ultrasecuenciación. Alex Sanchez

Zeptosens. Paqui Gallego

Análisis de resultados de Zeptosens. Ferran Briansó

Hoja de asistencia. Certificado asistenciaEncuesta satisfacción.

MATERIAL DE PARTIDA: RNA

•Calidad (Bioanalyzer/RIN)•Cantidad (Kits amplificación)

ARRAYS AFFYMETRIX

•Tipos•¿cómo están hechos?

EXPERIMENTO DE MICROARRAYS

•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad

Esquema





Esquema

ARRAYS AFFYMETRIX


Tipos de microarrays

DNA ANALYSIS ARRAYS RNA ANALYSIS ARRAYS

•SNPs

•Resequencing

•Citogenética

•Chip on chip

•3’IVT

•Gene/Exon arrays

•miRNA

•FFPE

Según lo que interrogan:

Según el formato:

Cartucho individual

Placa de 16/24/96

•Genome-Wide SNP Analysis GW Human SNP array 6.0

? 1.8 M marcadores genéticos (900.000 SNP + 900.000 CNV)

•Resequencing Arrays Human Mitochondrial array

“Custom” resequencing arrays

•Citogenética CytoScan HD Array

Tipos de microarrays.DNA

DNA ANALYSIS ARRAYS

Dna copy number (ganancias/pérdidas), LOH, disomia uniparental, SNPs

DNA ANALYSIS ARRAYS

Tipos de microarrays. DNA

• ChiP-on-Chip: Estudio de interacciones entre DNA y proteínas y

modificaciones del DNA, ej.

Sitios de unión de factores de transcripción

Sitios de unión de histonas

Metilación del ADN

Tipos de microarrays. RNA

EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS

3’5’

•3’IVT

Human U133 Plus 2.0 Prime View Array

•Detección sesgada (buena cola polyA, buen extremo 3’)

•Muchas especies representadas

•Arrays más clásicos

(Unigene database 133) (Unigene database 219)

EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS

Gene Arrays Human, Mouse, Rat, CHO, Porcine, Canine … Gene 1.0 ST Array

Exon Arrays Human, Mouse, Rat Exon 1.0 ST Array

3’5’

Gene Arrays

Exon Arrays


Human/Mouse/Rat/CHO Gene 2.0 ST Array

•Librería actualizada (RefSeq 36 51)•Incluye sondas para detección long intergenic no-coding RNA transcripts (lincRNAs)

miRNA GeneChip miRNA 3.0 Array

•153 organisms in the array (human, mouse, rat, canine, ….)

•100% miRBase v17

•2.216 snoRNAs and scaRNAs (human small nuclear RNAs)

•Low inputs amounts (130 ng total RNA)

•2.999 probe sets unique to pre-miRNA hairpins

•Interroga de forma independiente pre-miRNAs y maduros

•También útil para muestras de FFPE



ALMAC XCEL ARRAY

•Tipo química 3’IVT

•Especialmente diseñado para muestras de FFPE. Muy problemáticas (calidad RNA baja, modif químicas,…)

•Diseño de kit “a medida” (Sensation Plus FFPE kit) 20 ngr

•Kits de extracción RNA (FormaPure BeckmanCoulter, RecoverAll LifeTech, Rneasy Qiagen,…)

•70% equivalente a HgU133 Plus 2.0

•8% información mejorada que no está en HgU133 plus2.0

•22% sondas derivadas de secuenciación de muestras de cáncer

•De momento es un servicio. En breve un array de catálogo.

•Especialmente diseñado para muestras de FFPE. Muy problemáticas (calidad RNA baja, modif químicas,…)

•75 ngr de DNA

•Información sobre cambios en número de copias, SNPs y LOH.

•Permite integración datos con expresión y miRNAs

OncoScan

Tipos de microarrays.

Human Transcriptome Array (HTA)

•Arrays todavía no en catálogo. Se pueden pedir a través de “core facilities”. Finales 2012.•Arrays todavía no en catálogo. Se pueden pedir a través de “core facilities”. Finales 2012.

•Más adecuado que Exon arrays (solamente 20% de la información está basada en datos bien

contrastados). Falsos positivos

Tipos de microarrays.

¿Cómo están hechos? (I). Fotolitografía

¿Cómo están hechos?

ARRAYS AFFYMETRIX






TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA

MATERIAL DE PARTIDA RNA TOTAL

Poli A mRNA

EXTRACCIÓN

Células eucariótas QIAGEN

Tejido TRIZOL

CALIDAD CANTIDADBIOANALYZER


CALIDAD RNA (I): BIOANALYZER


CALIDAD RNA (II): BIOANALYZER

CALIDAD RNA (III): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración

RNA Area: 192.0 RNA Concentration: 150 ng/µlResult Flagging Color: 255 Result Flagging Label: Bad RNA quality

RNA Area: 155.7 RNA Concentration: 122 ng/µlrRNA Ratio [28s / 18s]: 1.6 RNA Integrity Number (RIN): 8.5 (B.02.08) Result Flagging Color: 65280 Result Flagging Label


Not all expected ladder peaks have been found. You should try to modify peak find settings or add peaks using manual integration.

Issue with ladder peak detection. Please check ladder.

RNA Area: 1,653.2 RNA Concentration: 50,101 pg/µlrRNA Ratio [28s / 18s]: 1.3 RNA Integrity Number (RIN): 7.7 (B.02.08) Result Flagging Color: 65280 Result Flagging Label: Good RNA quality

CALIDAD RNA (IV): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración



BIOANALYZER

Chips disponibles:

RNA

PROTEINAS

DNA

CÉLULAS

Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent 2100 Small RNA Kit

Agilent DNA 1000 Kit Agilent DNA 7500 Kit Agilent DNA 12000 Kit Agilent High Sensitivity DNA Kit

Agilent Protein 80 Kit Agilent Protein 230 Kit High Sensitivity Protein 250 Kit

Agilent Cell Kit


CALIDAD RNA (III): RNA INTEGRITY NUMBER

0 ≤ RIN ≤ 10


CALIDAD RNA (IV): RNA INTEGRITY NUMBER


CALIDAD RNA (V): RNA INTEGRITY NUMBER

? ¿qué RIN es el más adecuado?

RIN 5.0 RIN 8.0

¿hasta que RIN se puede utilizar?

¿se pueden mezclar diferentes RIN?


CALIDAD RNA (VI): TIPO DE MUESTRA

• kits especiales extracción RNA

• extracción “genes globina”

• no trabajar con sangre total

• HABLAR CON NOSOTROS ANTES


CANTIDAD RNA

• 3’ IVT ARRAYS 200 ng / 3 µL

• Exon/Gene ARRAYS 200 ng / 3 µL

• NUGEN 500 pg / 5 µL

• miRNA 130ng / 8 µL



ARRAYS AFFYMETRIX




RNA (150 ng)


3’IVT EXPRESS

AAAAAAAAAAAA

TTTTTTT

TTTTT

RNA (150 ng) RNA-cDNA dscDNA cRNA (≈ 40 µg)

IVT

O/N

PROCEDIMIENTO (I)

EXON/GENE

NNNNN

RNA-cDNA dscDNA

IVT

O/NcRNA

NNNNN

ssDNA (7 µg)


NUGEN

PROCEDIMIENTO (II)

NNNNN

RNA (500 pg) RNA-cDNA dscDNA

SPIA

ssDNA (8 µg)TTTTT

miRNA

ATPAAAAAA

RNA (130 ng) AAAAAA

Biotin-labeled 3DNA

Biotin-labeled RNA


PROCEDIMIENTO (III)

Fragmentación

O/N

3’IVT EXPRESS EXON/GENE NUGEN miRNA Resequencing


Y ESTO SOLO ACABA DE EMPEZAR…

.CEL

UEB


DIFERENCIAS ENTRE LOS KITS

3’ IVT Exon/Gene NUGEN

O oligo dT NNN oligo dT + NNN

cRNA ssDNA ssDNA

15 µg 5.5 µg 5 µg

NO MEZCLAR DIFERENTES PROTOCOLOS DE AMPLIFICACIÓN

EN UN MISMO PROYECTO…


GENETITAN (I)


GENETITAN(II)

• Formato placa: 16, 24, 96 arrays


GENETITAN(III)

• Formato placa: 16, 24, 96 arrays

mayor high throughtput

reducción del tiempo de procesado

disminución de costes

mayor reproducibilidad (disminución de efecto batch)

Formato cerrado (16, 24, 96)

No todos los tipos de especies, tipo de array representados


CONTROL DE CALIDAD (I)


CONTROL DE CALIDAD (II)

CONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Puricado


CONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Fragmentado


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