aplicaciones dinamica aplicaciones dinamica aplicaciones dinamica
Aplicaciones de los Microarrays y Biochips en Salud … · APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y...
92
Aplicaciones de los Microarrays y Biochips en Salud Humana Informe de Vigilancia Tecnológica
Transcript of Aplicaciones de los Microarrays y Biochips en Salud … · APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y...
Aplicaciones de los Microarrays y Biochips en Salud HumanaInforme de Vigilancia Tecnológica
Aplicaciones de los Microarrays y Biochips en SaludHumana
Informe de VigilanciaTecnológica
4
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYSY BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
El presente informe de Vigilancia Tecnológica ha sido
realizado en el marco del convenio de colaboración
conjunta entre Genoma España y la Fundación General
de la Universidad Autónoma de Madrid (FGUAM), entidad
que gestiona el Círculo de Innovación en Biotecnología
(CIBT), perteneciente al Sistema de Promoción Regional
de la Innovación MADRID+D.
Genoma España y la Fundación General de la Universidad
Autónoma de Madrid (FGUAM) agradecen la colaboración
ofrecida a:
– Dr. Carlos Briones (CSIC-CAB-INTA)
– Dra. Ana Dopazo (CNIC)
La reproducción parcial de este informe está autorizada
bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando:
Aplicaciones de los Microarrays y Biochips en salud
humana. GENOMA ESPAÑA/CIBT-FGUAM.
Genoma España no se hace responsable del uso que se
realice de la información contenida en esta publicación.
Las opiniones que aparecen en este informe
corresponden a los expertos consultados y a los autores
del mismo.
© Copyright: Fundación Española para el Desarrollo
de la Investigación en Genómica y
Proteómica/Fundación General de la Universidad
Autónoma de Madrid.
Autores: Marta López (CIBT)
Paloma Mallorquín (CIBT)
Miguel Vega (Genoma España)
Edición: Silvia Enríquez Encinas (Genoma España)
Referencia: GEN-ES06001
Fecha: Noviembre 2005
Depósito Legal: M-10639-2006
ISBN: 84-609-9226-8
Diseño y realización: Spainfo, S.A.
Índice de contenido
• RESUMEN EJECUTIVO 7
• OBJETIVOS DEL INFORME 8
1. INTRODUCCIÓN 9
2. MICROARRAYS DE ADN 9
2.1. Diseño de un microarray de ADN 92.1.1. Tipos de sondas en microarrays de ADN 102.1.2. Tecnologías de inmovilización de las sondas y tipos de soporte
en microarrays de ADN 102.1.3. Tecnologías de fabricación de microarrays de ADN 122.1.4. Técnicas de detección de la hibridación en microarrays de ADN 152.1.5. Sistemas de amplificación de la señal de hibridación del ADN 16
2.2. Tipos de microarrays de ADN 192.2.1. Resecuenciación génica 202.2.2. Análisis de la expresión Génica 212.2.3. Genotipado de SNPs 232.2.4. Hibridación genómica comparada 23
3. MICROARRAYS DE PROTEÍNAS 24
3.1. Diseño de un microarray de proteínas 253.1.1. Tipos de soporte de microarrays de proteínas 263.1.2. Tipos de formato de microarrays de proteínas 283.1.3. Técnicas de detección de la señal en microarrays de proteínas 31
3.2. Tipos de microarrays de proteínas 333.2.1. Microarrays de identificación y cuantificación de proteínas 333.2.2. Microarrays de función e interacción de proteínas 363.2.3. Microarrays de screening inverso de proteínas 37
4. MICROARRAYS DE CARBOHIDRATOS 38
4.1. Diseño de un microarray de carbohidratos 394.1.1. Síntesis de oligosacáridos 394.1.2. Aislamiento de oligosacáridos de fuentes naturales 394.1.3. Inmovilización de los carbohidratos 40
4.2. Aplicaciones de los microarrays de carbohidratos 40
5. MICROARRAYS DE CÉLULAS 41
5
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
6. MICROARRAYS DE TEJIDOS 43
7. APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS EN SALUD HUMANA 46
7.1. Identificación de dianas terapéuticas 467.2. Descubrimiento y desarrollo de fármacos 477.3. Diagnóstico clínico 487.4. Farmacogenómica y farmacogenética 497.5. Investigación básica 50
8. BARRERAS EXISTENTES PARA LA IMPLANTACIÓN DE LOS MICROARRAYS 52
9. PERSPECTIVAS DE MERCADO DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPSEN SALUD HUMANA 54
10. SITUACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO EN ESPAÑAEN EL ÁREA DE MICROARRAYS APLICADOS A LA SALUD HUMANA 56
11. CONCLUSIONES 59
GLOSARIO 60
ANEXOS 62
ANEXO I. Principales aplicaciones de los microarrays disponibles comercialmente 62ANEXO II. Empresas españolas que operan en el área de microarrays 72ANEXO III. Empresas españolas que desarrollan productos de bioinformática aplicados
a microarrays 76ANEXO IV. Proyectos de investigación españoles relacionados con tecnologías de microarrays 78ANEXO V. Patentes recientes en Microarrays 89
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 90
6
Los microarrays de ADN surgen de la necesidad deanalizar la cantidad de información procedente de losgrandes proyectos de secuenciación de genomas1,2.Estas herramientas de estudio de la informacióngenética vienen empleándose en dos aplicacionesfundamentales, la secuenciación o genotipado delADN y el análisis de la expresión génica.
La determinación de la variación en las secuenciasde ADN humano mediante microarrays permiteentre otras cosas identificar la huella genética dela predisposición a padecer diferentesenfermedades. Por otro lado, el empleo demicroarrays de ADN en estudios de la expresióngénica está permitiendo la identificación yvalidación de manera mucho más rápida de genescomo potenciales dianas terapéuticas. Lospatrones o perfiles de expresión génica se puedenestudiar desde dos puntos de vista: mediante elanálisis de la expresión específica de los genes enlos tejidos, o bien a través del estudio en lasalteraciones del nivel de expresión en unadeterminada situación fisiológica o patológica conel objetivo de identificar los genes implicados.
La combinación de los datos obtenidos a través dela secuenciación del ADN junto con la informaciónobtenida del estudio de perfiles de expresióngénica, permite establecer una correlación entreel genotipo y el fenotipo de un determinadoindividuo en una situación concreta. El resultadode esta combinación está resultando de enormeimportancia en estudios de farmacogenómica, asícomo en el desarrollo de la medicinapersonalizada.
A pesar de que los microarrays de ADN se hanconvertido en una herramienta esencial para elanálisis de expresión génica y la secuenciación delADN, la información que arrojan éstos no essuficiente para comprender los procesosrelacionados con los efectores últimos de unamultitud de mecanismos celulares: las proteínas.La estimación de la concentración de proteínas através del ARNm traducido no suministra unainformación precisa sobre las proteínassintetizadas correctamente ni sobre sufuncionalidad.
Los microarrays de proteínas permiten ladetección, caracterización y cuantificación de lasproteínas así como el estudio de su función y susinteracciones tanto entre diferentes proteínascomo con otras moléculas como ADN o lípidos. Espor ello que los microarrays de proteínas son unaherramienta fundamental de la Proteómica yposeen un enorme potencial en cuanto a suaplicación en diagnóstico molecular o desarrollode fármacos.
El estudio a gran escala de los carbohidratos ysus interacciones con proteínas juega un papeldestacable en biología celular y medicina, ya quelos carbohidratos están involucrados en lainteracción de los patógenos con su organismohospedador, procesos de desarrollo, transducciónde señales e inflamación. El empleo demicroarrays en el análisis de carbohidratos es otraposible expansión de estas herramientas alanálisis de alto rendimiento de moléculasdiversas.
7
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Resumen ejecutivo
1 http://www.sanger.ac.uk/HGP/2 http://www.tigr.org/tdb/
8
Objetivos del informe
El objetivo del presente informe consiste enrealizar una actualización de los últimosdesarrollos llevados a cabo en las tecnologíasrelacionadas con los microarrays y biochips, asícomo de sus aplicaciones en salud humana. Estedocumento pretende ser una revisión del informede Vigilancia Tecnológica en Microarrays yBiochips de ADN publicado por Genoma Españaen el año 2002, incluyéndose en esta ocasiónmicroarrays y biochips de otras biomoléculascomo proteínas y microarrays de células y tejidos.
Por otra parte, se ha realizado un estudio acercade las perspectivas de las tecnologías claverelacionadas con microarrays y biochips enEspaña, para lo cual se ha hecho una revisión delos grupos de investigación que en la actualidadestán trabajando en el desarrollo de estasherramientas de análisis. Por último, con elobjetivo de evaluar las limitaciones tecnológicas yprácticas del empleo de microarrays y biochips ensalud humana, se ha recurrido a la recopilaciónde información por medio de cuestionarios porparte de diversos expertos en la materia.
9
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
1. Introducción
2. Microarrays de ADN
Puntos clave en la fabricación de un microarray
• Elección de la sonda.
• Elección del soporte.
• Tecnología de inmovilización de la sonda.
• Técnica de fabricación del array.
• Método de detección de la hibridación.
• Sistemas de amplificación de la señal/sonda.
• Sistemas de análisis e interpretación de la señal.
Como consecuencia de la disminución progresivadel coste de los microarrays en los últimos años,se ha producido una integración de estatecnología como herramienta fundamental de labiomedicina y del proceso de desarrollo defármacos. El empleo de microarrays en estudiosde genómica funcional tiene numerosasaplicaciones de entre las que se pueden destacarla determinación de perfiles de expresión génica,la selección de biomarcadores, lafarmacogenómica, la toxicogenómica, laidentificación de genes marcadores pronóstico deenfermedades y la clasificación de tumores.
Los microarrays de ADN son colecciones demoléculas de ADN inmovilizadas sobre un soporteen localizaciones conocidas, empleados para elestudio de la secuencia de genes conocidos, o bien para determinar los niveles de expresióngenética de un tipo celular o tejido.
2.1. Diseño de un microarrayde ADN
A la hora de fabricar un microarray, existendeterminados elementos que tendrán unaimportancia crucial en función de las aplicacionesdeseadas:
2.1.1. Tipos de sondas empleadasen los microarrays de ADN
“Sonda” es el término que se emplea comúnmentepara definir un fragmento de ADN o ARN desecuencia conocida, el cual se emplea en ensayos dehibridación para identificar secuencias idénticas osimilares en una mezcla compleja de ácidosnucleicos. Las sondas también pueden consistir enanticuerpos que son utilizados en las técnicas dedetección de proteínas específicas3. En el caso de losmicroarrays de ADN, el material biológico que seemplea como sonda puede consistir en moléculas deADN, ARN o PNA, que se inmovilizan sobre elsoporte del array e hibridan con la muestra de ADNa analizar denominada “diana”.
• Sondas de oligonucleótidos
Las sondas comúnmente empleadas en losmicroarrays de ADN consisten en oligonucleótidosde cadena sencilla de ADN, que puedensintetizarse in situ o bien depositarse sobre elsoporte mediante diferentes técnicas deinmovilización. Estas sondas suelen ser lineales ycon longitud comprendida entre los 11 y 50nucleótidos. Recientemente, el empleo dehorquillas de oligonucleótidos está empezando atomar relevancia debido a su mayor estabilidad,mejor índice de hibridación y mayor afinidad porlos agentes de captura, que se traduce en unaseñal de mayor intensidad.
• Sondas de PNAs
Los ácidos nucléicos peptídicos (PNAs) sonmoléculas artificiales con características híbridasde ácidos nucleicos y peptídicos, donde las bases
nucleotídicas están unidas a un esqueleto de tipo
peptídico en lugar del típico esqueleto de
fosforribosas del ADN. Estas sondas son de gran
utilidad en los microarrays de ADN ya que los
híbridos que se forman entre las sondas de PNA y
el ADN que se analiza poseen una estabilidad
térmica superior a los dúplex de ADN-ADN,
además de cierta insensibilidad a la fuerza iónica
debido a la carga neutra del PNA. Por otra parte,
los dúplex que presentan desapareamientos de
una sola base son menos estables que sus
correspondientes híbridos de ADN-ADN, lo que les
hace particularmente adecuados para detectar
mutaciones en una sola base nucleotídica o SNP
(Single Nucleotide Polymorphism)4.
• Sondas de ADNc
Además de oligonucleótidos de ADN o PNA,
también es posible emplear ARNm de genes
concretos como sonda de hibridación, aunque
debido a su baja estabilidad es necesario realizar
una transcripción inversa para obtener un ADN
copia (ADNc) de mayor estabilidad.
2.1.2. Tecnologías de inmovilizaciónde las sondas y tipos de soporte en microarrays de ADN
La deposición de las sondas es un paso
fundamental a la hora de diseñar un microarray
de ADN, y está directamente relacionado con la
elección del soporte y la técnica de fabricación del
array. Existen tres factores que han de tenerse en
cuenta en la inmovilización de las sondas:
10
3 Glosario de términos genéticos. Universidad de Murcia, Dpto. Bioquímica, Biología Molecular e Inmunología(http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Glosario/Glosario/index.htm).
4 Campas, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analyticalChemistry. Vol. 23(1): 49-62.
Puntos clave en la inmovilización de sondas de ADN
• La química empleada en la inmovilización ha de ser estable durante las diferentes etapas delexperimento.
• Las sondas han de permanecer funcionales después de su inmovilización.
• Las sondas han de ser inmovilizadas con una orientación y configuración apropiada de manera queno se entorpezca el emparejamiento de bases.
Las tecnologías de inmovilización de sondas sobre la superficie de microarrays de ADN son muydiversas, como se muestra en la tabla 1. Las monocapas autoensambladas5 constituyen una de las técnicasque más aceptación ha tenido en los últimos años debido a su simplicidad, eficiencia y bajo coste. Lasprincipales tecnologías de inmovilización de sondas se recogen en la siguiente tabla:
11
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
MétodoOrientaciónde la sonda
Accesibilidad Ventajas
Retención enmatriz polimérica
Unión covalente
Al azar
Ordenada
Baja
Alta
Gran cantidadde sondas
Granestabilidad
Desventajas
Requiere tratamiento desuperficie.Bajos índices de hibridación
Requiere tratamiento desuperficie.Bajos índices deinmovilización
Silanización-unión covalente
Ordenada AltaPosible controlde la densidadde la sonda
Requiere tratamiento desuperficie.Posibles interaccionesinespecíficas.Bajos índices deinmovilización
Afinidad(biotina-estreptavidina)
Ordenada AltaGranestabilidad.Sencillez
Requiere tratamiento desuperficie.Bajos índices deinmovilización
Adsorción Al azar Baja Sencillez Bajos índices de hibridación
Inclusión en uncomposite6 Al azar Baja
Posible uniónordenada
Bajos índices de hibridación
SAMs directo7
(la propia sondase inmovilizaformando unamonocapa)
Ordenada Alta
Sencillez.Posible controlde la densidadde la muestra
Posibles interaccionesinespecíficas
SAMs indirecto (lasonda se une aSAM de otromaterialpreviamenteformado)
Ordenada AltaPosible controlde la densidadde la muestra
Requiere tratamiento desuperficie.Bajos índices deinmovilización
Tabla 1. Principales métodos de inmovilización de sondas.Fuente: Campàs, M. & Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analyticalchemistry. Vol. 23(1): 49-62 (SAM: Self-Assembled Monolayer o monocapa autoensambladas).
PRINCIPALES MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE SONDAS
5 Las monocapas autoensambladas (self-assembled monolayers o SAMs) se forman a partir de la organización espontáneade moléculas con ciertos grupos funcionales, principalmente grupos tiol, sobre la superficie de un metal. Estos grupos tiolse fijan al sustrato que se desea cubrir a través de un mecanismo de adsorción química y el resto de la molécula estableceuniones electrostáticas, de puente de H, o por fuerzas de Van der Waals, etc., con sus moléculas vecinas (Fuente:González Rumayor, V., et al. (2005). Informe de vigilancia tecnológica. Aplicaciones de biosensores en la industriaagroalimentaria. Fundación para el conocimiento madri+d; CEIM).
6 Composite: compuesto que une dos o más materiales, normalmente fibras introducidas en una resina polimérica (plásticos).7 Las sondas de PNAs han demostrado recientemente una capacidad para formar SAMs directos muy superior a la del ADN,
lo que abre una nueva línea de desarrolllo de biosensores. Fuente: Briones, C., et al. (2004). Ordered self-assembledmonolayers of peptide nucleic acids with Dna recognition capability. Physical Review Letters, vol. 93:208103 (1-4).
El tipo de soporte en el cual se inmovilizan lassondas puede ser de diferente naturaleza, siendolas membranas de nylon y los soportes rígidoscomo el plástico o el vidrio los más utilizados. Enla actualidad, debido a su adaptación al marcajefluorescente, alta sensibilidad, posibilidad derealizar distintas funcionalizaciones químicas yfácil manejo y resistencia, el vidrio ha suplantadoa las membranas como soporte para microarrayde ADN8.
2.1.3. Tecnologías de fabricaciónde microarrays de ADN
La fabricación de un microarray consiste en ladisposición de las sondas sobre la superficie delmismo en posiciones conocidas y ordenadas.Existen diferentes tecnologías para la producciónde microarrays que han de cumplir una serie derequisitos, lo que ha generado la aparición dediversas plataformas comerciales. Estosrequerimientos han motivado que los avancestecnológicos relacionados con la fabricación demicroarrays queden reflejados en los sistemas deproducción y las plataformas introducidas pordiferentes empresas.
12
Requisitos de las tecnologías de producción de microarrays
• Robustez
• Consistencia
• Automatización
• Velocidad de fabricación
• Versatilidad
Principales tecnologías empleadas en la fabricación de microarrays
• Ink Jetting: impresión de sondas sin contacto.
• Pin deposition: impresión de sondas por contacto.
• Fotolitografía: síntesis in situ mediante métodos químicos.
• Polipirrolización: inmovilización electroquímica de sondas modificadas por pirroles.
• Electrodeposición: inmovilización de sondas de ADN sobre nanopartículas de biorreconocimiento enelectrodos.
• Unión con direccionamiento electrónico.
• Reproducibilidad
• Uniformidad
• Alta precisión
• Alta resolución
• Coste-efectividad
Las principales tecnologías empleadas en la fabricación de microarrays de ADN se pueden clasificar enfunción de la metodología empleada para disponer sondas de forma ordenada.
8 Meloni, R., et al. (2004). DNA microarrays and pharmacogenomics. Pharmacological Research. Vol. 49: 303-308.
La técnica de Ink jetting emplea inyectores
piezoeléctricos. Junto al capilar de vidrio que
contiene la muestra se localizan cristales
piezoeléctricos que se deforman al aplicar voltaje.
Esta deformación presiona el capilar y expulsa
una pequeña cantidad de fluido por el extremo
del capilar, que se deposita en un punto concreto
de la superficie.
La técnica Pin deposition emplea agujas o pins que
se empapan en la solución que contiene la muestra
y se transfiere una pequeña cantidad al extremo de
la aguja. Al hacer contacto el extremo con la
superficie del chip, se imprime una gota en una
posición determinada de la superficie. Una variante
de este método utiliza en vez de agujas, cabezales
similares a la punta de una pluma estilográfica.
Respecto a la Fotolitografía, la técnica se basa
en la unión de los nucleótidos protegidos por un
agente químico fotodegradable sobre un soporte
de vidrio que posee determinados grupos
reactivos. Mediante una máscara que se sitúa
sobre el chip se logra enfocar un haz de luz hacia
unas posiciones determinadas, degradando al
agente químico protector en dichas zonas y
dejándolo intacto en las zonas protegidas por la
máscara. Posteriormente se añade un medio que
contiene uno de los cuatro nucleótidos que se
unirá, mediante enlace covalente, al soporte con
los grupos reactivos que hayan quedado
desprotegidos. Cada grupo añadido lleva una
molécula receptora fotodegradable. Este proceso
se va repitiendo con los diferentes nucleótidos y
máscaras hasta generar unos oligonucleótidos con
las secuencias de interés. La pionera en el empleo
de esta técnica fue Affymetrix y en el primer chip
que construyó alcanzó una densidad de 106
sondas por cm2. En la actualidad, el Genechip®
comercializado por esta compañía consigue una
densidad de más de 9.000 sondas de una longitud
de 30 bases en 1,6 cm2.
La técnica de Polipirrolización está basada en la
copolimerización de un grupo pirrol y los
oligonucleótidos que portan parte del pirrol en su
extremo 5’. Las secuencias de oligonucleótidos
modificados con pirrol se inmovilizan
electroquímicamente en lugares específicos
mediante el encendido secuencial de los
diferentes electrodos9.
La electrodeposición selectiva se basa en lainmovilización de sondas de ADN sobrenanopartículas de biorreconocimiento enelectrodos de resolución fotolitográfica. Estasnanopartículas consisten en pequeñas esferas deoro modificadas con oligonucleótidos.
El posicionamiento electrónico, técnicadesarrollada por Nanogen, está basada en laconcentración electroforética de oligonucleótidosbiotilinizados sobre un gel de agarosa modificadocon estreptavidina. Este gel puede direccionarseelectrónicamente sobre un array con propiedadesde electrodo. La incorporación de camposeléctricos permite controlar la deposición de lassondas, así como incrementar la concentración delas muestras sobre estas últimas, aumentandopor tanto la efectividad de la hibridación. Existendiversos métodos basados en este tipo de técnica,que combinan los avances producidos en lainvestigación con microarrays con los derivadosde la microfluídica.
Algunas de las técnicas anteriormente descritasestán confinadas para su uso en laboratorio pordiferentes motivos. Tal es el caso de lapolipirrolización, que si bien presenta ciertasventajas como su bajo coste, existen una serie defactores que hacen inviable su empleo a escalaindustrial, como son su escasa reproducibilidad dela deposición de sondas, así como el tiemponecesario para fabricar un array.
Las tecnologías líderes en el mercado son laimpresión por chorro de tinta o ink-jetting, lafotolitografía, pin deposition y el posicionamientoelectrónico. Además, en los últimos años se hadesarrollado toda una serie de variantes de estastecnologías orientadas a mejorar el control sobreel tamaño y la morfología de la muestra de ADNdepositada sobre el array. Este es el caso de latecnología Bubble Jet Printing Technology deCanon10 que es capaz de crear un array de altadensidad con unos puntos de tamaño uniforme yforma regular.
La siguiente tabla recoge las principalestecnologías líderes en el mercado en fabricaciónde microarrays, sus principales características,ventajas y desventajas, así como las aplicacionesa las que van dirigidas.
13
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
9 Càmpas, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analyticalchemistry Vol. 23 (1): 49-62.
10 Bubble Jet Technologies Applied to DNA Chips, Canon (http://www.canon.com/technology/detail/bj/dna_chips).
14
Em
pre
saTécn
ica
So
nd
aD
en
sid
ad
Syn
teni/
Incy
tePh
arm
aceu
tica
ls
Hys
eq
Ink-
jett
ing e
nvi
drio
Dep
osi
ción d
epin
s en
mem
bra
na
Mues
tras
de
AD
N d
e 500 n
tFr
agm
ento
s de
PCR
Olig
os
de
5nt
Mues
tras
de
AD
N d
e 500-
2.0
00 n
t
2.7
80 p
unto
s/cm
2
1.0
24 p
unto
sen
1,1
5 c
m2
64 p
unto
s en
0,6
cm
2
Ap
lica
ció
n
Perf
iles
de
expre
sión,
iden
tifica
ción g
énic
a, d
iagnóst
ico,
anál
isis
de
polim
orf
ism
os
Perf
iles
de
expre
sión,
iden
tifica
ción g
énic
a, d
iagnóst
ico,
anál
isis
de
polim
orf
ism
os,
secu
enci
ació
n
Affym
etrix
Foto
litogra
fía
con
nucl
eótidos
activa
dos
Olig
os
de
25 n
t9.0
00 p
unto
sen
1,6
cm
2
Perf
iles
de
expre
sión,
dia
gnóst
ico,
anál
isis
de
polim
orf
ism
os
Clin
ical
Mic
roSen
sors
Dep
osic
ión d
epi
nes
en
elec
trod
os o
foto
litog
rafía
con o
ligos
activa
dos
Pequ
eños
frag
men
tos
de
AD
N/A
RN
36 d
ianas
en
un c
hip
Perf
iles
de
expre
sión,
iden
tifica
ción g
énic
a, d
iagnóst
ico,
secu
enci
ació
n,
anál
isis
de
polim
orf
ism
os
Nan
ogen
Posi
cion
amie
nto
elec
trón
ico
Olig
os d
e 20 n
t99 p
unto
sen
2 m
m2
Perf
iles
de
expre
sión,
iden
tifica
ción g
énic
a, d
iagnóst
ico,
iden
tifica
ción d
e STR (
short
tandem
rep
eat)
Dete
cció
n
Fluore
scen
cia
Rad
iois
otó
pic
a
Fluore
scen
cia
Rad
iois
otó
pic
a
Fluore
scen
cia
Imped
anci
a
Fluore
scen
cia
Ven
taja
s
Baj
o c
ost
e
Baj
o c
ost
e
Alta
den
sidad
Baj
o c
ost
e
Alta
den
sidad
Desv
en
taja
s
Baj
a den
sidad
Baj
a den
sidad
Alto c
ost
eSín
tesi
s in
situ
Baj
a den
sidad
Alto c
ost
e
Alto c
ost
e
Tabla
2.
Prin
cipal
es t
ecnolo
gía
s de
fabrica
ción d
e m
icro
arra
ys.
Fuen
te:
Cam
pàs
, M
.; K
atak
is,
I. (
2004).
DN
A b
ioch
ip a
rray
ing,
det
ection a
nd a
mplif
icat
ion s
trat
egie
s.
Tren
ds
in A
nal
ytic
al C
hem
istr
y. V
ol. 2
3(1
): 4
9-6
2.
PR
INC
IPA
LES
TEC
NO
LO
GÍA
S D
E F
AB
RIC
AC
IÓN
DE M
ICR
OA
RR
AY
S D
E A
DN
2.1.4. Técnicas de detección de la hibridación en microarrays de ADN
La detección de la hibridación es un paso clavepara revelar qué sondas se han unido a susdianas complementarias procedentes de lamuestra. Determinadas técnicas de detección dela hibridación del ADN requieren del marcajeprevio de la sonda a la molécula diana, por lo quela detección de la hibridación es un proceso que
limita el desarrollo de nuevas plataformas de
biochips. Los métodos de detección en los cuales
no se necesita el marcaje de la diana están
tomando relevancia en nuevas aplicaciones de los
biochips, ya que permiten una mayor sensibilidad,
reducción de la muestra necesaria y simplificación
del proceso de preparación de la muestra11.
La siguiente tabla muestra las diferentes técnicas de
detección de la hibridación en los microarrays de
ADN con su transductor y marcaje correspondiente:
15
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Técnicas Transductor Marcaje
Fluorescencia
Piezoeléctrico
Óptico
Piezoeléctrico
Fluoróforos
No necesario
CronopotenciometríaVoltametríaImpedancia
ElectroquímicoComplejos catiónicosCompuestos redox
Cronoamperometría Electroquímico Enzimas redox
Capacitancia Electroquímico No necesario
Colorimetría Óptico Enzimas
Resonancia de plasmones en superficie Óptico No necesario
Quimioluminiscencia electroquímica Óptico Quelato rutenio
Tabla 3. Técnicas de detección de la hibridación en microarrays de ADN.Fuente: Campàs, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analyticalchemistry. Vol. 23(1)1: 49-62.
TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE LA HIBRIDACIÓN EN MICROARRAYS DE ADN
11 López, M.; Mallorquín, P.; Vega, M. (2002). Informe de Vigilancia Tecnológica Microarrays y Biochips de ADN. Genoma España.
2.1.5. Sistemas de amplificación de la señal de hibridación del ADN
El análisis de ADN por medio de microarrays
requiere de la amplificación de la muestra y/o de la
señal para alcanzar una sensibilidad apropiada, si
bien es cierto que la mayoría de los sistemas de
amplificación realizan ambas tareas. A pesar del
tiempo que requiere, la técnica de PCR se ha venido
empleando de manera habitual en la amplificación y
marcaje fluorescente de muestras de ADN, e incluso
se ha integrado en sensores y microarrays para
minimizar el tiempo de ensayo necesario. Además
de la técnica de PCR, existe toda una serie de
métodos de amplificación de la señal que pueden
ser incorporados en el sistema de detección:
– La Amplificación por círculo rodante o Rolling
Circle Amplification es una técnica de
amplificación de la señal de hibridación que
emplea oligonucleótidos circularizados. Mediante
dos pasos sucesivos con sondas de hibridación,
se consigue obtener una secuencia de ADN
inmovilizado en el soporte capaz de hibridar con
un ADN circular. Posteriormente, la acción
conjunta del ADN polimerasa12 y el molde de
ADN circular desplazándose a lo largo del
fragmento de ADN inmovilizado genera copias del
ADN original unidas entre sí por sus extremos.
Para detectar la señal, se procede a añadir
marcadores fluorescentes complementarios para
su hibridación con los múltiples sitios repetidos
en la secuencia de ADN elongada. Este método
de amplificación es rápido, técnicamente sencillo,
y capaz de detectar mutaciones en presencia de
una gran cantidad de ADN original. Esta técnica
cuenta con la desventaja de requerir una gran
cantidad de muestra de ADN de partida (100
nanogramos).
16
Sonda
Eliminación diana
Adición oligos marcados Eliminación ADN circular
AdiciónADN circular
ADN polimerasa
Adición diana Adición sonda 2 ADN ligasa
Fig. 1. Amplificación por círculo rodante.Fuente: Campàs, M., Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analyticalchemistry. Vol. 23(1): 49-62.
12 Las ADN polimerasas son las enzimas que realizan la replicación del ADN.
– La amplificación mediante ADN ramificado esotro de los métodos empleados para aumentarla señal de la hibridación, que en este casoemplea ADN ramificado13 o hiperpolimérico, quedebido a sus ramificaciones puede realizar
hibridaciones simultáneas. Este tipo de ADNrequiere ciertas características como son suhomogeneidad, uniformidad, y el control de lacomposición y tamaño de la longitud de susfragmentos.
17
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Fig. 2. Amplificación por ADN ramificado.Fuente: Genospectra (http://www.genospectra.com).
– La amplificación de la señal de hibridaciónmediante nanopartículas dendríticas estábasada en el uso de nanopartículas de oroactivadas con nucleótidos, como las empleadasen los métodos piezoeléctricos. Estasnanopartículas contienen fragmentos de
oligonucleótidos que hibridan con la diana unavez que ésta ha hibridado con la sondainmovilizada. Empleando el tamaño apropiadode partícula se pueden conseguir sensibilidadesde detección muy elevadas.
13 bDNA (branched DNA o ADN ramificado): el ADN ramificado contiene múltiples cadenas ramificadas en forma de árbol ycada una de estas ramas constituye un sitio de hibridización con una sonda marcada con una enzima, que reacciona conun sustrato que permite la demostración colorimétrica o quimioluminiscente.
Célula
Sondas
ADNramificado
Marcadoresde sondas
Sustratoquimioluminiscente
Lisado de célula paraobtener ARNm
Adición de sondas
Hibridación
Cuantificacióndel ARNm
– El método de amplificación de la Tiramida oTSA (Tyramide Signal Amplification) consiste enuna combinación de tres pasos que comienzanen el marcaje de la molécula diana con unanticuerpo unido a peroxidasa o estreptavidina.Tras la hibridación a la sonda, se añadenmúltiples derivados de tiramida marcados conbiotina o agentes fluorescentes, que sonactivados por la enzima peroxidasa, liberandofinalmente radicales de tiramida que emitenuna señal detectable. Este es un método de
marcaje indirecto que consigue unaamplificación de la señal hasta 100 vecesmayor que las técnicas directas de marcaje confluorescencia, sin incrementar el ruido defondo. A pesar de ser una técnica laboriosa, laamplificación con Tiramida compite con lastecnologías actuales de amplificación por PCR14.Sin embargo, los análisis comparativos soncomplicados debido a la variabilidad existenteen la eficiencia del marcaje15.
18
Fig. 3. Amplificación mediante nanopartículas dendríticas.Fuente: Fritzsche, W. & Taton, A. (2003) Metal nanoparticles as labels for heterogeneous, chip-based DNA detection.Nanotechnology 14, R63-R73.
14 Càmpas, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analyticalchemistry Vol. 23 (1): 49-62.
15 Tyramide Signal Amplification (TSA) Technology, Molecular Probes, Invitrogen detection technologies(http://probes.invitrogen.com/handbook/sections/0602.html).
Fig. 4. Amplificación de la Tiramida.Fuente: Tyramide Signal Amplification (TSA) Technology, Molecular Probes, Invitrogen detection technologies(http://probes.invitrogen.com/lit/catalog/2/sections/4021.html).
– La amplificación de la señal por medio deliposomas funcionalizados se puede emplearen las técnicas de detección electroquímica dela hibridación. Este sistema está basado en lainhibición de la transferencia de electronesentre la sonda y la superficie del electrodo
donde la sonda está inmovilizada. Existen dosformas de conseguir la transferencia deelectrones, mediante la activación de losoligonucleótidos cargados negativamente, obien mediante la funcionalización de losliposomas con biotina.
ADN dianaNanopartículaunida aoligonucleótido
PeroxidasaH2O2
EstreptavidinaBiotina
ADN
2.2. Tipos de microarraysde ADN
Los microarrays de ADN surgieron de la necesidadde analizar la ingente cantidad de informaciónsurgida de los grandes proyectos de secuenciaciónde genomas desarrollados en los últimos años16. Portanto, las principales aplicaciones de los microarraysde ADN se centraron inicialmente en el análisis de laexpresión génica y el diagnóstico genético, basadosen la búsqueda de mutaciones o polimorfismos deun solo nucleótido o SNP17. Los nuevos desarrollostecnológicos han permitido ampliar estasaplicaciones hacia nuevas áreas de interés como lafarmacogenómica, así como la integración de losmicroarrays de ADN en el proceso dedescubrimiento e identificación de fármacos.
• El área de diagnóstico molecular mediantemicroarrays de ADN posee entre sus principalesaplicaciones el cribado genético de mutacioneso polimorfismos relacionadas con enfermedadesmediante técnicas de resecuenciación del ADN.Por otra parte, la identificación demicroorganismos patógenos (virus, bacterias,hongos o protozoos) mediante microarrays deoligos que contengan secuencias de ARNribosomal de dichos microorganismos es deutilidad en el diagnóstico de patologíasinfecciosas. Asimismo, tanto los análisis deSNPs como de expresión génica mediantemicroarrays de ADN permitirían identificar los
mecanismos implicados en la resistencia de
patógenos a ciertos agentes antimicrobianos18.
Por último, el uso de microarrays de ADN para
el análisis de los perfiles de expresión génica en
procesos tumorales, ha posibilitado elaborar
para ciertos tipos de cáncer una clasificación de
los tumores que ha permitido un diagnóstico y
pronóstico más preciso que el obtenido
mediante otras técnicas moleculares.
• Las estrategias de farmacogenética yfarmacogenómica19 constituyen otras de las
áreas de aplicación de los microarrays de ADN.
La combinación de los datos obtenidos a partir
de la identificación de SNPs, junto con la
información obtenida del estudio de perfiles de
expresión génica, permite establecer una
correlación entre el genotipo y el fenotipo de un
determinado individuo. El resultado de esta
combinación está resultando de enorme
importancia para la identificación de genes que
puedan constituir nuevas dianas terapéuticas.
• El proceso de descubrimiento y desarrollode fármacos se ha beneficiado del uso de
herramientas genómicas de alto rendimiento
como los microarrays de ADN, que hacen
posible el análisis de la expresión génica en
miles de muestras simultáneamente. El diseño
y estratificación de los ensayos clínicos en
función del genotipo es otra de las aplicaciones
que los microarrays de ADN han aportado a la
industria farmacéutica.
19
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
16 The Sanger Institute: Human Genome Project (http://www.sanger.ac.uk/HGP).The Institute for Genomic Research, TIGR (http://www.tigr.org/tdb).
17 SNP: Single Nucleotide Polymorphism.18 Doménech-Sánchez, A. & Vila, J. (2004). Fundamento, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiología
médica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 22(1):46-54.Bryant, P. A., et al. (2004). Chips with everything: DNA microarrays in infectious diseases. Lancet Infect. Dis. 4:100-111.
19 Farmacogenética: disciplina que se ocupa de estudiar las diferentes respuestas de los individuos frente a los fármacosbasándose en los patrones de variabilidad genética de cada paciente.Farmacogenómica: término más amplio que persigue buscar genes candidatos de respuesta a determinados fármacos opersonalizar medicamentos empleando herramientas genómicas.
20
Áreas Aplicaciones Técnicas
Diagnósticomolecular
Cribado genético
Identificación de patógenos
Resecuenciación
Detección de secuencias de ADNprocedentes de patógenos
Resistencia a fármacos demicroorganismos infecciosos
Genotipado de SNPsAnálisis de la expresión génica
Diagnóstico y pronóstico oncológico Análisis de la expresión génica
Farmacogenética yFarmacogenómica
Identificación de genesAnálisis de la expresión génicaGenotipado de SNPsResecuenciación
Respuesta a fármacos Genotipado de SNPs
Diagnóstico predictivo Genotipado de SNPs
Descubrimiento ydesarrollo de fármacos
Cribado de fármacos Análisis de la expresión génica
Diseño y estratificación de ensayosclínicos
Genotipado de SNPs
Tabla 4. Aplicaciones de los microarrays de ADN en salud humana.Fuente: Elaboración propia.
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE ADN EN SALUD HUMANA
A continuación se describen las principales técnicas genómicas que emplean los diferentes microarrays de ADNen función del objetivo que se persiga:
2.2.1. Resecuenciación génica
El descubrimiento de genes o la identificación
mediante secuenciación de determinadas
secuencias de ADN, requiere arrays con sondas
que incluyan todas las posibles combinaciones de
nucleótidos para una determinada longitud. El
fragmento de ADN a analizar se divide en
fragmentos de entre 200 y 600 nucleótidos, y
posteriormente se marca e hibrida con las sondas
inmovilizadas. Al detectar la localización de la
hibridación mediante técnicas de análisis y
procesamiento de las señales, se puede identificar
la secuencia total del fragmento de ADN.
La resecuenciación es una las últimasaplicaciones de los microarrays de ADN, quepermite la identificación de mutaciones y SNPs enel genoma a partir de una secuencia conocida.Para cada base nucleotídica de una secuencia sediseñan cuatro sondas que difieren entre sí en unnucleótido (A,T,G,C) generalmente en su posicióncentral. Posteriormente se marca el ADN de lamuestra mediante reactivos fluorescentes, y se
pone en contacto con las sondas inmovilizadas enel microarray. Los fragmentos de ADN quecontengan una secuencia complementariahibridarán únicamente con una de las cuatrosondas, dando lugar a una señal fluorescente20.La principal ventaja de esta técnica consiste enque permite conocer la secuencia de fragmentosde ADN de hasta 30 Kb de longitud.
21
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Fig. 5. Resecuenciación mediante microarrays de ADN.Fuente: Cutler, DJ, et al. (2001). High-throughput variation detection and genotyping using microarrays.Genome Res. 11(11):1913-25.
20 CustomSeq™ Resequencing Arrays, Affymetrix (http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/custom_seq.affx).21 López, M.; Mallorquín, P.; Vega, M. (2001). Informe Sectorial de Vigilancia Tecnológica sobre Microarrays y Biochips de
ADN. Genoma España.
2.2.2. Análisis de la expresióngénica
La expresión génica es el proceso por medio delcual la información codificada en el ADN setransforma en las proteínas necesarias para eldesarrollo y funcionamiento de la célula. Esteproceso tiene lugar por medio de una moléculaintermediaria que transmite la informacióngenética denominada ARN mensajero (ARNm).Una de las principales aplicaciones de losmicroarrays de ADN es la determinación del perfilde expresión, es decir la cuantificación relativa delos ARN transcritos, mediante la comparación delos ARNm aislados de dos muestras diferentes.Por tanto, los microarrays de ADN proporcionanindirectamente información de los distintos
niveles de proteínas que se producen durante un
estado patológico o en una determinada situación
metabólica.
El análisis de la expresión génica mediante
microarrays de ADN requiere realizar previamente
la copia del ARNm a ADN complementario
mediante un proceso de transcripción inversa.
Este ADN copia (ADNc) posee una mayor
estabilidad que el ARNm y además permite la
adición de marcadores para su detección21. Las
moléculas marcadas de ANDc se hibridan a
microarrays que contienen sondas de ADN
específicas para genes concretos. La señal que
emite el ADNc será indicativa de la presencia de
expresión génica, que también puede ser
cuantificada.
El perfil de expresión génica de una célula
proporciona información sobre su fenotipo y su
respuesta al medio (estado metabólico, ciclo
celular, respuesta a condiciones de estrés,
presencia de toxinas o microorganismos
patógenos). La medida de la expresión génica es
una importante herramienta para estudiar los
mecanismos de regulación, rutas bioquímicas y
funciones celulares.
Las aplicaciones de los microarrays de expresión
génica son diversas, y actualmente el número de
productos dirigidos a la industria farmacéutica se
ha multiplicado considerablemente (ver Anexo I).
No obstante, una de las aplicaciones más
atrayentes es el empleo de microarrays de
expresión génica en clínica. La empresa
holandesa Agendia22 ha desarrollado microarrays
de expresión génica que permiten predecir el
riesgo de sufrir metástasis en pacientes con cáncer
de mama, así como arrays de expresión que
facilitan la identificación de tumores primarios. La
empresa californiana Genomic Health23 posee
entre sus productos un microarray de expresión
génica que cuantifica la probabilidad de recurrencia
en pacientes con cáncer de mama, e incluso
proporciona información acerca de las terapias más
efectivas para el paciente.
22
Fig. 6. Análisis de la expresión génica mediante microarrays de ADN. Fuente: Institute for Mikrobiology and Genetics, Georg-August-University of Göttingen, Functional Genomics Group.(http://wwwuser.gwdg.de/~aehrenr/arrays/c_arrays.html).
Tejido sanoMuestra A
Tejido enfermoMuestra B
Interpretación
A > B
B > A
A = B
Combinaciónde ambas señalesfluorescentes
Emisiónde fluorescencia
Incidencia luzfluorescente
A B
ExtracciónARNm
ADNc marcadocon sondasfluorescentes
Hibridación con ADNinmovilizado
22 MammaPrint®, CupPrint™ (Agendia, BV; http://www.agendia.com).23 Oncotype DX™ (Genomic Health, Inc.; http://www.genomichealth.com/oncotype/hcphome.aspx).
Aplicaciones de los microarrays de expresión génica
• Identificación de genes involucrados en procesos patológicos, fisiológicos y de desarrollo.
• Caracterización de tumores.
• Estudio de procesos de regulación génica.
• Diagnóstico mediante la identificación de patrones de expresión relacionados con diferentesestados patológicos.
• Identificación de dianas terapéuticas en el proceso de desarrollo de fármacos mediante lacomparación de los genes expresados en tejido normal y tejido enfermo.
2.2.3. Genotipado de SNPs
Menos del 0,1% del genoma humano presenta
variaciones entre los distintos individuos, siendo
las formas más frecuentes de variación los SNPs o
polimorfismos de una sola base24, que consisten
en sustituciones de una base por otra. La mayoría
de los SNPs conocidos hasta hace unos años
habían sido identificados a partir de proyectos de
secuenciación como el Proyecto Genoma Humano,
y de experimentos de secuenciación de
fragmentos concretos de ADN. En la actualidad
varias compañías biotecnológicas disponen de
tests farmacogenómicos que permiten la
identificación de polimorfismos relacionados con el
metabolismo de fármacos. Los principales tests
toxicogenómicos se centran en el genotipado de
genes de enzimas de la familia del citocromo
p450, relacionada con la toxicidad de un gran
número de fármacos25.
23
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
24 Las diferencias entre las secuencias de ADN de los diferentes individuos y especies se deben primordialmente amutaciones que alteran una de las cuatro letras del código ACGT. Tales cambios de una sola letra de posición variable sonlos SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Además, se conocen otros sistemas de reordenamiento genético, tales comoinserciones o deleciones de fragmentos de ADN.
25 Prometheus Laboratories Inc., PRO-PredictRx TPMT (http://www.prometheuslabs.com).Roche Diagnostics, con tecnología de Affymetrix (http://www.roche-diagnostics.com).GE Healthcare, CodeLink P450 Bioarrays (http://www.gehealthcare.com).Jurilab, DrugMEtTM Genotyping Test (http://www.jurilab.com).Roche Group, AmpliChip CYP450 Test (http://www.roche-diagnostics.com).TM Bioscience Corp., Tag-ItTM Mutation Detection Kits (http://www.tmbioscience.com).
26 Vysis (http://www.vysis.com).27 CNIO, Investigación de Transferencia en Cáncer: del Laboratorio a la Clínica
(http://www.cnio.es/es/news/transferencia.htm).
Fig. 7. Microarray de análisis farmacogenómico AmpliChip CYP450. Fuente: Roche Group, AmpliChip CYP450 Test(http://www.roche-diagnostics.com/products_services/amplichip_cyp450.html).
2.2.4. Hibridación genómicacomparada
Los microarrays de hibridación genómicacomparada (CGH Arrays) son herramientas deanálisis genómico de escaneado global que seemplean para detectar la presencia de ganancias(duplicación o amplificación) o pérdidas (delecióno nulisomía) de segmentos del genoma. Suaplicación en el campo de la oncología incluye ladetección de nuevas amplificaciones genómicasasociadas a tumores humanos y murinos, ladefinición en detalle de regiones comúnmenteamplificadas (amplicones), y la detección dedeleciones asociadas a tumores.
Un ejemplo de este tipo de microarrays dehibridación genómica comparada es elGenosensor System de la compañía Vysis26 quepermite establecer correlaciones entre el númerode copias de un gen y una determinadaenfermedad. Éste es un sistema que por elmomento sólo se emplea en investigación enlaboratorios y aún no se ha empleado con finesdiagnósticos. En la actualidad, el CentroNacional de Investigaciones Oncológicas(CNIO) está poniendo en marcha una plataformapara la producción de microarrays de hibridacióngenómica comparada que posean una coberturacompleta de los genomas humano y murino27.
Los microarrays y biochips de ADN se hanconsolidado como una herramienta fundamentalpara el análisis de la expresión génica a nivelgenómico. Sin embargo, la determinación de lacantidad de ARNm mediante microarrays de ADNno proporciona la información suficiente sobre lasproteínas que se traducen a partir de estamolécula. Esto es debido a que las proteínassufren toda una serie de modificaciones post-traduccionales a lo largo de su proceso desíntesis, que consisten fundamentalmente enprocesamientos proteolíticos, glicosilaciones28, yformación de complejos proteicos. Por otra parte,las proteínas han de plegarse correctamente conel fin de ser totalmente funcionales.
Para completar el estudio de las funciones de lasproteínas se ha de recurrir a la información
contenida en el proteoma. El proteoma es elconjunto de proteínas expresadas por un tejido opor una célula en un momento determinado. Portanto, la proteómica es la disciplina que estudiaglobalmente la expresión génica a nivel de lasproteínas, aglutinando proteómica comparativa,funcional y estructural.
Los microarrays de proteínas son de gran utilidad en el análisis proteómico funcional, yconsisten en chips de proteínas inmovilizadas enuna posición concreta sobre una superficie sólida,dispuestas de forma similar a como se disponenlas sondas en los microarrays de ADN. A la horade construir un microarray de proteínas es muyimportante plantearse una serie de cuestionesprevias, al igual que sucedía con el diseño delmicroarray de ADN:
24
28 Glicosilación: proceso químico por el que se añaden cadenas de azúcares a una proteína.
3. Microarrays de proteínas
Factores de relevancia en el diseño de microarray de proteínas
• Naturaleza de la superficie sobre la cual inmovilizar (soporte).
• Proteínas a inmovilizar.
• Método de inmovilización.
• Formato del microarray.
• Agente de captura (en el caso de microarray de detección).
• Método de detección a emplear.
Cada una de estas cuestiones lleva asociada una tecnología concreta, que al combinarse permiten lageneración de microarrays de proteínas. En la siguiente figura se muestran las tecnologías asociadas a losmicroarrays de proteínas:
25
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Tecnologíade producción
Moléculasde capturaSuperficies Detección Aplicaciones
Impresiónpor contacto
Impresión sincontacto
Uniónno covalente
• Electrostática
• Reconocimientomolecular
• Hidrofóbica
Proteínas fusiónFluorescencia
Diagnóstico
Proteómica
Cribado defármacos
Quimio-luminiscencia
Resonanciade plasmonessuperficiales
Radioactividad
Espectrometríade masas
Anticuerpos
Receptor/ligando
Enzima/sustrato
Aptómeros
Unión covalenteLitografía
Affibodies
Fig. 8. Tecnologías implicadas en la producción de microarrays. Fuente: Ojos, T. & Bachmann, J. (2003). Business Briefing: Future Drug Discovery. 1-4.
3.1. Diseño de un microarrayde proteínas
La complejidad y diversidad estructural de lasproteínas ha hecho que el desarrollo de losmicroarrays de proteínas haya sido técnicamentecomplicado. Al contrario que los ácidos nucleicos,las proteínas no tienen una estructura homogéneani un patrón de unión específico, sino que cadaproteína posee unas características bioquímicas
particulares. En cuanto a los procesos deamplificación de muestra, no existe una técnicaequivalente a la PCR capaz de amplificar lacantidad de proteína existente en una muestra.Por lo tanto, la tecnología de microarrays deproteínas se encuentra ante dificultades técnicasen cuanto a la adquisición y unión estable deproteínas a superficies donde puedaninteraccionar con otras proteínas o ligandos ydetectarse tal interacción29.
29 Hardiman, G., et al. (2002). Protein microarrays: challenges and promises. Pharmacogenomics. Vol. 3 Nº 4: 1-10.
3.1.1. Tipos de soporte de microarrays de proteínas
Durante el diseño de un microarray de proteínas la elección del soporte habrá de tenerse en cuenta enprimera instancia ya que condicionará tanto el formato final del array como el método de detecciónpreferible. De la misma forma, la tecnología de inmovilización elegida ha de tener en cuenta tanto lanaturaleza del compuesto que se ha de inmovilizar como la superficie a la cual se acopla, manteniendosiempre la funcionalidad y accesibilidad de las proteínas presentes en el array.
26
Características de un soporte ideal de proteínas
• Estabilidad química.
• Buena morfología de los puntos o spots.
• Mínimas uniones no específicas.
• Baja señal de fondo.
• Alto ratio superficie/volumen.
• Compatibilidad con los distintos sistemas de detección.
• Baja autofluorescencia.
En el caso del ADN, éste posee una carganegativa que podría aprovecharse para inmovilizarla molécula sobre la superficie del array mediantefuerzas electrostáticas. Por el contrario, la cargade las proteínas es muy variable, y por estemotivo se han realizado grandes esfuerzos en laestandarización de materiales de soporte quesean adecuados para cada tipo de microarray deproteínas. Los soportes porosos como lasmembranas de nitrocelulosa, nylon o fluoruro depolivinilo, son más adecuados para lainmovilización de proteínas que los soportes lisos,ya que poseen mayor superficie y por tantocapacidad de unión30.
No obstante, la nueva generación de química desuperficies de membrana y de vidrio ha logradoofrecer una variedad de superficies de soporteque no requieren del empleo de agentesbloqueantes para eliminar el ruido de fondo, y que a la vez previenen el contacto directo de laproteína con la superficie mediante la introducciónde grupos funcionales como polietilenglicol (PEG).Otras estrategias empleadas son capaces deaumentar la densidad de los grupos funcionalesaccesibles mediante el empleo dedendrímeros31,32.
30 Espina, V., et al. (2004). Protein microarray detection strategies: focus on direct detection technologies. Journal ofImmunological methods. Vol. 290: 121-133.
31 Agenendt, P., et al. (2003). Next generation of protein microarray support materials: evaluation for protein and antibodymicroarray evaluations. Journal of Chromatography A. Vol. 1009:97-104.
32 Los dendrímeros son agrupaciones esféricas de moléculas anidadas, de importante aplicación en la fabricación dedispositivos miniaturizados para el almacenaje de información.
33 Biotina (unión a estreptavidina); Proteína G (unión a anticuerpo Fc); Proteína A (unión a anticuerpo Fc); GST, GlutationS-transferasa (unión a anti-GST); MBP, proteína de unión a la maltosa (unión a anti-MBP); TRX, tiorredoxina reductasa(unión a anti-TRX), GFP, proteína verde fluorescente (unión a anti-GFP).
34 Poli-aminoácidos empleados como moléculas de afinidad en microarrays de proteínas: Poli-Histidina (soporte de resina deníquel); Poli-Lisina (uniones amida y bases de Schiff); Poli-cisteina (uniones tioéter).
35 Hardiman, G., et al. (2002). Protein microarrays: challenges and promises. Pharmacogenomics. Vol. 3 (4): 1-10.
27
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Soporte Química de superficie Proveedor
Placas de dendrímero(prototipo)
Capa de dendrímero con gruposreactivos epoxi
Chimera Biotech GmbH
Placas de epoxi-PEG(prototipo)
Capa de PEG con grupos reactivosepoxi
Jen Sobek, Functional GenomicsCenter
Placas MaxisorbSuperficie de poliestirenomodificada
Nunc A/S
Placas amino Grupos amino Telechem International
Placas epoxi Grupos epoxi Telechem International
Placas silanizadas Grupos amino Telechem International
Placas FAST Matrices de nitrocelulosa Schleicher and Schuell Biosciences
Placas en cultivo celular enpoliestireno
Poliestireno Nalge Nunc International
Tabla 5. Principales soportes empleados en la inmovilización de proteínas sobre arrays.Fuente: Angennendt, P. & Glöker, J. (2003). Protein and antibody microarray technology. Journal of Chromatography B Vol. 797: 229-240.
PRINCIPALES SOPORTES EMPLEADOS EN LA INMOVILIZACIÓN DE PROTEÍNASSOBRE ARRAYS
Placas de aminosilanos Grupos amino Sigma Aldrich Chemie GmbH
HydroGel Gel de poliacrilamida modificado Perkin-Elmer
Microarray reflectivo Trietoxilsilano 3-amino propil Amersham Biosciencies
Placas epoxi QMT Grupos epoxi Quantifoil Micro Tools GMBH
Placas de polilisina Grupos amino Preparadas manualmente
Placas de poliacrilamida Poliacrilamida Preparadas manualmente
Para favorecer la inmovilización de las proteínas es frecuente recurrir a moléculas adaptadoras de afinidad,que consisten fundamentalmente en proteínas33, poliaminoácidos34 o polipéptidos. Las estrategias máshabituales se centran en el empleo de moléculas de afinidad ancladas en la superficie del array, que a suvez mantendrán unidas las proteínas por medio de una segunda molécula adaptadora35.
3.1.2. Tipos de formato de microarrays de proteínas
Los formatos que se pueden emplear para construir un microarray de proteínas son muy variados, aunqueel más extendido es el formato de array plano que se comercializa por numerosas empresas:
28
Fig. 9. Estructura de un microarray de proteínas.Fuente: Hardiman, G., et al. (2002) Protein microarrays: challenges and promises. Pharmacogenomics. Vol. 3 (4): 1-10.
Empresa Producto Aplicación
Schleicher & SchuellBioscience
ProvisiónTM HCA Perfil de citoquinas
Zymoyx Inc.Simios protein profiling biochipsystem
Perfil de citoquinas
Pierce Biotechnology Inc. Search LightTMArrays Perfil de citoquinas
RayBiotech Inc.RayBioTM Cytokine Arrays, CustomAb Arrays
Perfil de citoquinas
BD Biosciences BD ClontechTM Ab Microarray Análisis comparativo de proteínas
Sigma Aldrich Co.PanoramaTM Ab Microarray CellSignalling KitTM Análisis comparativo de proteínas
Protometrix Inc. The Yeast ProtoarrayTM Estudios de interacción de proteínas
Molecular Staging Inc.Rolling circle amplificationtechnology (RCATTM)
Perfil de proteínas multiplexado
Tabla 6. Microarrays planos de microarrays de proteínas disponibles comercialmente. Fuente: Joos, T. O. Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research. Drug DiscoveryToday (2004). Vol. 3 (1): 24-31.
MICROARRAYS PLANOS DE MICROARRAYS DE PROTEÍNAS DISPONIBLESCOMERCIALMENTE
Zeptosen AG ZeptoMARTM CeLyA Cell Lysate Arrays Screening reverso
Ciphergen Biosystems inc SELDI Protein Chip® Technology Screening reverso
Proteína
Molécula adaptadora
Molécula de afinidad
Soporte recubiertode una capa orgánica
Otros formatos alternativos están encaminados a disminuir la cantidad de muestra y reactivos necesariospor medio de la miniaturización y la combinación con tecnologías de microfluídica:
29
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
• CD de centrifugación como el GyrolabBioaffy™ comercializado por Gyros36. El giro delCD hace que la fuerza centrífuga dirija lamuestra a través de microcanales, que permitenla cuantificación de proteínas a escalananométrica por medio de inmunoensayos tiposándwich u otras técnicas.
• Microcanales desarrollados por Biotrove37 pormedio de la tecnología Thru-Hole™, queconsiste en una plataforma miniaturizada parael procesamiento en paralelo de alta densidadde muestras a escala nanométrica.
• 3D sobre superficies de silicio como ProteinProfiling Biochip™ System de Zyomyx38 quepermite la orientación de los anticuerpos graciasa su estructura en pilares. Esta plataformapermite la cuantificación de múltiples citoquinaspresentes en suero de plasma humano ymurino.
36 Microarray de proteínas sobre CD de centrifugación (Gyrolab BioaffyTM). Gyros AB (http://www.gyros.com).37 Microarray de microcanales. Biotrove (http://www.biotrove.com).38 Protein Profiling BiochipTM System de Zyomyx (http://www.zyomyx.com) (en la actualidad está en uso en centros de
Investigación de GlaxoSmithkline y Partners Healthcare).Wagner, P.; Raymond, K. (2002). Protein biochips: an emerging tools for proteomic research. Current Drug Discovery.May: 23-28.
Anticuerpomarcado
18 mm
CD
Proteína
Las partículas en suspensión también pueden emplearse como base para el microarray, teniendo en cuentaque estas partículas pueden codificarse para su posterior identificación. Existen diferentes sistemas decodificación de estas partículas que emplean tecnologías muy diversas:
30
• Microesferas sometidas a citometría deflujo, comercializadas por BD Biosciences bajoel nombre comercial de BDTM Cytometric BeadArray39: la captura de proteínas se realiza pormedio de inmunoensayos tipo ELISA, mientrasque la detección se basa en fluorescencia y lacuantificación se realiza por citometría de flujo.
• Microesferas codificadas con colores, comoel sistema Bio-Plex Protein Array Systemdesarrollado por Luminex40 y Bio-Rad41.Mediante este sistema, se pueden medir lasreacciones bioquímicas que tienen lugar en lasuperficie de las microesferas en función de lasintensidades de las fluorescencias.
• Nanocristales de semiconductorescodificadas con colores, que reciben elnombre comercial de Nanocristales Qdot®42 yhan sido desarrollados por Quantum Dots Corp.Estos nanocristales están formados pormateriales semiconductores que emiten luz enel espectro de luz visible, permitiendo elmarcaje de proteínas dentro de las células.
• Microesferas con códigos de barras como latecnología UltraPlexTM desarrollada porSmartbeads43, que permite realizar ensayosmultiplexados para una serie de anticuerposidentificados con su código de barrascorrespondiente.
• Micropartículas con códigos de barrasformadas por metales intercalados, como lasnanopartículas NanobarcodesTM de NanoplexTechnologies44, que permiten identificar con unagran precisión la molécula para la cual sirve demarcador.
39 BDTM Cytometric Bead Array, BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com).40 Luminex xMAP technology (http://www.luminexcorp.com).41 Sistema Bio-Plex Protein Array System, Bio-Rad (http://www.bio-rad.com).42 Qdot® Nanocrystals (http://www.qdots.com).43 UltraPlexTM, Smartbeads (http://www.smartbead.com).44 Nanopartículas NanobarcodesTM, Nanoplex Technologies (http://www.nanoplextech.com).
Esferasmarcadascon fluorescencia
Anticuerposde captura Anticuerpos
de detección
láser
Nanocristal
Antígenos
Anticuerpos
Micropartículas concódigos de barras
Marcadorfluorescente
Anticuerpos
Banda de plata
Banda de oro
Proteína
3.1.3. Técnicas de detección de la señal en microarrays de proteínas
Los métodos de detección empleados en microarrays de proteínas se pueden clasificar en métodos libresde marcaje y métodos que emplean sondas marcadas con diferentes técnicas. Los métodos libres demarcaje presentan la ventaja de no necesitar un marcaje previo de las proteínas diana, evitando de estaforma modificar su actividad. Entre ellas destacan las siguientes:
31
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
• Espectrometría de masas: técnica en la quelas moléculas proteicas se ionizan yposteriormente se aceleran a través del vacíomediante un campo magnético. Las partículasde distinta relación masa/carga se separan porsu deflexión (desviación de la dirección de lacorriente) en un campo magnético. Dentro de laespectrometría de masas las variantes másrepresentativas son la denominadaespectrometría MALDI-TOFF45 y laespectrometría de masas en tandem (MS/MS).
• Resonancia de Plasmones Superficiales(SPR): técnica basada en fenómenos ópticosque tienen lugar sobre la superficie de unmetal, permitiendo la detección de cambios deconcentración de la masa del chip debidos a launión de un ligando a la proteína inmovilizada.
Campomagnético
Luzpolarizada
e
Luzreflejada
Dentro de las estrategias que emplean métodos de marcaje, se pueden clasificar a su vez en técnicas dedetección directa si utilizan una sonda marcada que sea compatible con el sustrato, y métodos dedetección indirecta, donde se marca directamente la proteína de interés46. En función del marcajerealizado, la técnica de detección empleada será diferente:
45 MALDI-TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (desorción/ionización mediante láser asistida por matriz.46 Espina, V. (2004). Protein microarray detection strategies: focus on direct detection technologies. Journal of
Immunological Methods. Vol. 290: 121-133.
• Detección cromogénica: los cromógenos sonsustancias que sirven como sustratos parareacciones enzimáticas que generan productoscoloreados. La detección cromogénica demicroarrays de proteínas produce señalespermanentes de fácil visualización para suanálisis. Los cromógenos empleados con mayorfrecuencia en microarrays de proteínas son laperoxidasa y la fosfatasa alcalina.
• Detección por quimioluminiscencia: laemisión de la luz se produce por los productosde una reacción química en la que participa laenzima luciferasa. La quimioluminiscencia puedeemplearse con cualquiera de los métodos dedetección por marcaje de sonda. La principalventaja de la detección por quimioluminiscencia
es que crea un registro permanente de losresultados con alta sensibilidad y rapidez.
• Detección por fluorescencia: las moléculasfluorescentes (fluoróforos) absorben fotones deluz de una fuente externa, generalmente unláser monocromático, que provoca la excitaciónde los electrones de la molécula y la posterioremisión de luz en una longitud de onda mayor ala de la luz incidente. La principal limitación deesta técnica de detección es su incompatibilidadcon los soportes que poseen autofluorescencia,ya que esta característica hace muy difícildistinguir la señal del ruido de fondo. Losprincipales fluoróforos empleados sonfluoresceína, rodamina, ficobiliproteínas,acridinas y cianinas.
• Detección por desintegración radiactiva: laposibilidad de incorporar 32P en proteínas, ADNy ARN permite la detección de las interaccionesproteína-proteína, proteína-ADN, proteína-ARN yproteína-ligando. Sin embargo, el empleo de laradiactividad como método de detección paramicroarrays no está muy extendido porcuestiones de seguridad.
Desafíos tecnológicos a los que se enfrentanlos microarrays de proteínas
El análisis de proteínas mediante microarrays seenfrenta a una serie de limitaciones referidasprincipalmente a problemas de detección de lainteracción y de estabilidad de las proteínasinmovilizadas.
• Disponibilidad de proteínas y anticuerposespecíficos: en el caso de los microarrays deanticuerpos, una de las principales limitacionesante las que se enfrenta su fabricación no esúnicamente obtener grandes cantidades, sino alhecho de que es necesario obtener anticuerposde gran diversidad. Para solucionar estosproblemas, se está recurriendo a la producciónde fragmentos de anticuerpos como scFvs oFabs mediante librerías de fagos u otras, enlugar de producir anticuerpos en hibridomas quesuponen un alto coste.
• Detección específica de proteínas: unaalternativa para la detección de proteínas es elempleo de aptámeros. Estas moléculasconsisten en ácidos nucleicos generalmentecortos y obtenidos por métodos de selección invitro, que son capaces de reconocer y unirse auna molécula específica como una proteína o unligando.
• Deshidratación de las proteínas: la miniaturización
de los microarrays de proteínas es consecuencia
de los problemas de deshidratación e inactivación
de las proteínas, que se acentúan bajo el empleo
de soportes de cristal. Por este motivo, la
nanotecnología y microfluídica son campos que
están desarrollando nuevas estrategias como son
las estructuras de microcanales, que previenen la
deshidratación de las proteínas debido a su
arquitectura cerrada. Otra de las alternativas que
se está estudiando consiste en el empleo de
sustancias químicas que estabilicen las proteínas.
• Fenómenos de reactividad cruzada: dada la
naturaleza de los anticuerpos que en su mayoría
se encuentran glicosilados, el fenómeno de
reactividad cruzada sucede a menudo, creando
falsos positivos y falsos negativos al formarse
complejos de cierta estabilidad. Por ello, las
estrategias actuales van encaminadas a la
selección de anticuerpos altamente específicos,
o al empleo de otras moléculas de afinidad
como los aptámeros o esqueletos proteicos.
• Detección no uniforme de las interacciones
entre proteínas: el empleo de técnicas de
marcaje en microarrays de proteínas supone
una limitación importante, ya que es imposible
lograr un marcaje homogéneo en mezclas de
proteínas debido a su diversidad y complejidad.
La detección de proteínas en un microarray
requiere un rango mucho más dinámico de
operaciones que el caso de los microarrays de
ADN, ya que la concentración de proteínas en el
interior de las células es muy variable. Esta
característica hace que sea necesario el empleo
de anticuerpos con afinidades variables, que
sean capaces de detectar proteínas a distintas
concentraciones.
32
3.2. Tipos de microarraysde proteínas
En función de la aplicación que se persiga con el
uso de microarrays de proteínas, se pueden
clasificar en microarrays de detección de
proteínas y microarrays de función o interacción
de proteínas.
3.2.1. Microarrays de identificacióny cuantificación de proteínas
Los microarrays de identificación de proteínas
constituyen herramientas muy útiles de
diagnóstico. Se basan en la captura de proteínas
por medio de moléculas de diversa naturaleza que
permanecen ancladas a la superficie del
microarray.
Los microarrays de captura de proteínas se pueden
construir mediante el empleo de diferentes agentes
de captura, dando lugar a los microarrays de
identificación de proteínas comerciales que se
recogen en la tabla 7. Los agentes de captura
empleados de manera más frecuente son:
a. Anticuerpos: proteínas altamente específicas
producidas por el sistema inmune que
reconocen a los agentes infecciosos y otras
sustancias extrañas que invaden el organismo.
b. Affibodies: moléculas que mimetizan las
funciones de los anticuerpos y que se pueden
sintentizar de manera sencilla con una
determinada especificidad y afinidad de manera
que se dirijan a una diana específica.
c. Aptámeros: moléculas de ADN o ARN capaces
de reconocer y unirse a una molécula específica
(proteína u otro ligando).
33
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Affibodies
Aptámeros
Anticuerpos
Fig. 10. Modo de interacción de los affibodies, aptámeros y anticuerpos como agentes de captura.Fuente: Joos, T. O. (2004). Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research. DrugDiscovery Today. Vol. 3 (1):24-31.
En el caso de los microarrays basados en anticuerpos como agentes de captura, se emplean dosestrategias de detección basadas en las técnicas de inmunoensayos. La primera consiste en uninmunoensayo tipo sándwich, donde los anticuerpos se inmovilizan sobre la superficie del array, y lasproteínas que se unen a ellos serán detectadas por un segundo anticuerpo marcado. En el segundo tipo deinmunoensayo, las proteínas interaccionan de manera similar con los anticuerpos inmovilizados, pero eneste caso las proteínas se marcan química o fluorescentemente antes de incorporarlas sobre el microarray,sin necesidad de utilizar un anticuerpo adicional.
Sandwich Captura de antígenos
Fig. 11. Estrategias de detección empleadas en los microarrays de proteínas.Fuente: MacBeath, G. (2002). Protein microarrays and proteomics. Nature Genetics Suppl. Vol. 32:526-532.
La ventaja de los microarrays de identificación deproteínas es que permiten la amplificación de laseñal, si bien en contrapartida la detección deproteínas en bajas concentraciones es complicadaya que para su unión deben competir con otrasproteínas presentes en mayores concentraciones.La principal limitación de estos microarrays radicaen la necesidad de conseguir una elevadaespecificidad de los anticuerpos inmovilizados yen la precisión de la detección, que se encuentralimitada por la reproducibilidad del experimento,tanto de la preparación de la muestra como de sudeposición.
Los microarrays de proteínas han alcanzado elmercado con una gran variedad tanto de superficies,de sistemas de inmovilización de los agentes decaptura, y de agentes de captura en sí mismos. Porel contrario, la tecnología de detección de la señalempleada en estos ensayos es fundamentalmente lafluorescencia. Esta variedad de productoscomerciales se muestra en la tabla 7 del presenteinforme. Un ejemplo de los microarrays de detecciónde proteínas que emplean anticuerpos es eldesarrollado por la empresa Chemicon, que haintroducido en el mercado microarrays para ladetección de los perfiles de expresión de citoquinasen muestras biológicas47.
34
47 ChemiarrayTM, Chemicon International Inc. (http://www.chemicon.com/Product/Research.asp).
35
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Empresa Material del chip
Ciphergen BiosystemsSílice recubierto dealuminio
Lumicyte Sílice
Agente de captura
Afinidad de metales,cromatografía cargada ohidrofóbica, anticuerpos
Afinidad de superficiequímica, bioquímica obiológica
Detección de la señal
SELDI y MS
SELDI y MS
Biacore Vidrio recubierto concapa de oro, superficiede hidrogel de dextrano
NHS/EDC superficieactivada, superficie de Ni2+,anticuerpos, estreptavidina
SPR
HTS Biosystems
Plástico con finaretícula en lasuperficie, recubiertopor fina capa de oro
Anticuerpos y fragmentosde anticuerpos
SPR
Large Scale Biology Plástico Anticuerpos Fluorescencia
Biosite Diagnostics Plástico Anticuerpos Fluorescencia
Zyomyx Sílice Anticuerpos y fragmentosde anticuerpos
Fluorescencia
Phylos N/A Estructuras de polipéptidosbasadas en fibronectina
Florescencia
Somalogic N/A Aptámeros Fluorescencia
Akceli Vidrio CADN expresado porcélulas humanasembrionarias de riñón
Fluorescencia
Packard Bioscience Hidrogel depoliacrilamida
Anticuerpos Fluorescencia
BD Biosciences Vidrio Anticuerpos Fluorescencia
Molecular Staging Inc. Vidrio Anticuerpos y amplificaciónpor círculo rodante
Amplificación del ADNmarcado asociado
InteractivaBiotechnology
Alquiltioles de cadenalarga en superficie deoro biotinilada
Captura de las moléculasbiotiniladas porestreptavidina
Fluorescencia
Tabla 7. Principales tecnologías empleadas en microarrays de proteínas.Fuente: Hardiman, G., et al. (2002). Protein microarrays: challenges and promises. Pharmacogenomics. Vol. 3 (4): 1-10.MS: Mass Spectrometry; NHS: N-hydroxysuccinimide; SELDI: Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization; SPR: SurfacePlasmon Resonance.
PRINCIPALES TECNOLOGÍAS EMPLEADAS EN MICROARRAYS DE PROTEÍNAS
Protometrix Vidrio
Superficie recubierta deNi2+ para la captura deproteínas marcadas conHistidina
Fluorescencia
3.2.2. Microarrays de función einteracción de proteínas
Mediante los arrays de proteínas de función einteracción se puede estudiar de manerasimultánea diferentes interacciones existentes
entre proteínas, proteína-oligosacárido, proteína-ADN, y proteína-fármaco. Además estosmicroarrays pueden emplearse en la verificaciónde la diana de un determinado anticuerpo o bienen la identificación del sustrato de una enzima, taly como se ha representado en la siguiente figura:
36
Receptor-ligando
Enzima-sustrato
Proteína-proteína
Proteína-oligosacárido
Proteína-ADN
Fig. 12. Microarrays de función e interacción de proteínas.Fuente: Joos, T. O. (2004). Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research. Drug Discovery Today. Vol. 3 (1):24-31.
Las aplicaciones comerciales de los microarraysde función e interacción se centran en los arraysde interacción enzima-sustrato y proteína-proteína:
• Arrays de interacción enzima-sustrato: labúsqueda de sustratos para enzimas se hacentrado en gran medida en el desarrollo denuevas aplicaciones orientadas a laidentificación de sustratos para proteínaskinasas. Esta aplicación de los microarrays deproteínas es de gran relevancia, ya que laidentificación de los sustratos de este tipo deproteínas es un paso clave en la comprensiónde su función. Hasta ahora, este tipo deidentificación resultaba muy lenta y costosa,además de carecer de la sensibilidadnecesaria48.
Entre las empresas que desarrollan microarraysde proteínas para estudiar la función de kinasasse encuentra PepScan49. Esta empresa halanzado al mercado el PepChip® Kinasemicroarray que permite la selección delsustrato óptimo para ensayos de altorendimiento, de manera que se pueda generar
una huella de la actividad celular de la kinasa,
analizar los efectos y especificidad de sus
inhibidores, y determinar la actividad kinasa en
una mezcla compleja de enzimas. Otra de las
empresas que desarrollan microarrays enzima-
sustrato es Jerini AG50, que ha lanzado el
PepstarTM peptide microarray, con diferentes
aplicaciones como el screening de sustratos
específicos de enzimas y de proteasas, la
optimización de los sustratos enzimáticos ya
conocidos, el estudio de las rutas de
transducción de la señal, la detección de las
actividades enzimáticas contaminantes, o el
mapeado de las regiones inmunodominantes de
los antígenos.
• Arrays de interacción proteína-proteína:
esta estrategia está siendo comercializada por
la compañía Protometrix Inc. y ofrece un amplio
abanico de posibilidades para el estudio de la
interacción entre fármacos y proteínas, o bien
el efecto de un determinado fármaco sobre las
interacciones proteína-proteína con productos
como el array que comercializa bajo el nombre
de Yeast ProtoarrayTM PPI Proteome
Microarray.
48 Invitrogen (http://www.invitrogen.com).49 PepScan (http://www.pepscan.nl).50 Jerini AG (http://www.jerini.com).
3.2.3. Microarrays de screeninginverso de proteínas
Mediante el screening inverso se inmovilizanlisados celulares que representan todo elrepertorio de proteínas celulares en undeterminado estadío celular. La interaccióninespecífica de las proteínas con el soporte delmicroarray tiene lugar mediante interaccioneselectrostáticas, fuerzas iónicas o de Van derWaals. Las proteínas capturadas en estos tipos dearrays pueden ser identificadas mediante
espectrometría de masas o bien medianteanticuerpos específicos.
Gracias a estos microarrays es posible realizar unscreening de todos los anticuerpos presentes enel suero de un paciente en busca de unadeterminada proteína diana. Las muestras detejido inmovilizado o de células pueden serempleadas para este tipo de ensayos. Estastécnicas tienen un enorme potencial en ladetección de biomarcadores en análisisproteómicos.
37
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Lisado de proteínas(detección por EM)
Lisado de proteínas(detección por anticuerpos)
Células
Tejidos
Fig. 13. Microarrays de proteínas de screening inverso.Fuente: Joos, T. O. (2004). Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research. Drug Discovery Today. Vol. 3 (1):24-31.
La principal ventaja de este tipo de microarrayreside en que las muestras inmovilizadas norequieren un paso previo de desnaturalización nimarcaje. Los microarrays de proteínas descreening inverso permiten la identificación denuevos biomarcadores, el análisis de perfiles deexpresión de proteínas y el perfilado temprano dela toxicidad y eficacia de fármacos potenciales.Empresas como Zeptosens AG51 ofrecen este tipode plataformas de screening inverso, que en estecaso emplea el nombre comercial deZeptoMARKTM.
La empresa Ciphergen Biosystems Inc.52 tambiénha desarrollado tecnologías de screening inversocomo SELDI53, que emplea espectrometría demasas como método de lectura. Mediante lacomparación de los espectros de dos muestrasdiferentes se pueden identificar las proteínas quese expresan de manera diferencial a través de sumasa molecular. La tecnología SELDI es muyapropiada para la detección rápida de lasdiferentes cantidades de proteína total enmuestras diferentes, así como para la detecciónde proteínas pequeñas y péptidos, si bien su usoes limitado en proteínas de alto peso molecular oproteínas de membrana54.
51 Zeptosens (http://www.zeptosens.com).52 Ciphergen (http://www.ciphergen.com).53 SELDI: desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization).54 Joos, T.O. (2004) Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research. Drug Discovery
Today. Vol. 3 (1):24-31.
Los arrays de proteínas suministran una grancantidad de información acerca de la función einteracciones de las proteínas que los arrays deADN no pueden proporcionar. No obstante, losmicroarrays de proteínas no son suficientes paraanalizar las modificaciones post-traduccionalesque sufren las proteínas, generalmente debidas ala unión covalente de azúcares en un procesollamado glicosilación. Por otro lado, existe unamplio número de procesos celulares en los queestán involucrados receptores de unión aazúcares, por lo que los microarrays decarbohidratos son una herramienta fundamentalen el estudio de los procesos biológicos en los queestán implicadas las proteínas de interés.
Los carbohidratos o azúcares complejos estánconstituidos por mocosacáridos que pueden unirsede formas muy diversas, dando lugar a distintostipos de oligosacáridos y polisacáridos condiferentes configuraciones y ramificaciones. Lasinteracciones entre proteínas y carbohidratosestán implicadas en numerosos procesosbiológicos de relevancia, que tienen lugar tantoen el interior como en el exterior de la célula. Enlos últimos años ha tenido lugar un desarrollocontinuo de herramientas moleculares quepermiten identificar estos oligosacáridos y lasproteínas con las que interactúan, aumentando engran medida la sensibilidad de los ensayos,principalmente gracias a la espectrometría demasas. Sin embargo, el progreso que han sufridolas técnicas relacionadas con la identificación deproteínas y ADN ha sido mucho mayor, por lo queel análisis de oligosacáridos clave es unaasignatura pendiente. Una de las razones
principales radica en el hecho de que losoligosacáridos no pueden ser clonados niamplificados, ya que son sintetizados por laacción conjunta de múltiples glicotransferasas yotras enzimas. Por otra parte, la cantidad deoligosacáridos que pueden ser aislados esgeneralmente muy limitada55.
Existen dos categorías de microarrays deoligosacáridos en función del tipo de carbohidratoinmovilizado. Los primeros están compuestos pormacromoléculas de tipo glicoproteínas ypolisacáridos, inmovilizados sobre soportes comocristales cubiertos de nitrocelulosa o poliestireno.Estos microarrays tienen una aplicación directa enestudios serológicos con el fin de identificarinteracciones con anticuerpos y otras proteínas.Este es el caso de microarrays de polisacáridoscomo el dextrano e inulina, empleados en análisisantigénicos de polisacáridos bacterianos. Laprincipal desventaja de este tipo de microarraysde oligosacáridos radica en la imposibilidad deidentificar la secuencia del oligosacárido una vezse ha producido la interacción. El segundo tipo demicroarrays de carbohidratos está formado pormonosacáridos como la N-acetilglucosamina, odisacáridos como la lactosa, celobiosa o manosaen forma de glucosaminas56. En este último tipode microarrays, la inmovilización al soporte seconsigue por medio de lectinas procedentes deplantas o anticuerpos modificados por medio de laenzima glicosiltransferasa. Una estrategiaalternativa que sigue el Consorcio de GlicómicaFuncional57 consiste en la biotinilización deoligosacáridos y su posterior anclaje a unasuperficie cubierta con estreptavidina.
38
4. Microarrays de carbohidratos
55 Fukui, S., et al. (2002). Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments ofcarbohydrate-protein interactions. Nature Biotechnology. Vol. 20: 1011-1017.
56 Feizi, T., et al. (2003). Carbohydrate microarrays- a new set of technologies at the frontiers of glycomics. Current Opinionin Structural Biology. Vol. 13: 637-645.
57 Consortium for Functional Glycomics, CFG, NIH (http://www.functionalglycomics.org/static/consortium).
Los neoglicolípidos58 son uno de los ejemplos deestos microarrays de carbohidratos. Losneoglicolípidos inmovilizados en nitrocelulosa sehan utilizado con proteínas específicas de unión acarbohidratos para confirmar la predicción de lasinteracciones entre las proteínas y losoligosacáridos59.
4.1. Diseño de un microarrayde carbohidratos
El elemento más importante a tener en cuenta ala hora de construir un microarray decarbohidratos reside en la obtención demonosacáridos u oligosacáridos puros. Losprincipales métodos de obtención de estoscarbohidratos son la síntesis química o enzimáticay la extracción de oligosacáridos a partir defuentes naturales. La inmovilización de losoligosacáridos es el siguiente paso clave en eldiseño de un microarray, y existen diversosprocedimientos y soportes.
4.1.1. Síntesis de oligosacáridos
A pesar de la dificultad de la síntesis química deoligosacáridos debido a su complejidad estructural,se ha conseguido sintetizar un número
considerable de ellos con el objeto de estudiar la
especificidad de anticuerpos y otras proteínas de
unión a carbohidratos. Una alternativa a la síntesis
química consiste en la síntesis enzimática mediante
reacciones catalizadas por enzimas como las
glicosiltransferasas o glicosidasas. La ventaja de
esta técnica radica en que los sustratos que se
utilizan en estas reacciones son naturales, mientras
que su principal desventaja reside en la escasa
disponibilidad de enzimas y su elevado coste60.
4.1.2. Aislamiento de oligosacáridosde fuentes naturales
Los oligosacáridos con extremos reductores61 son
ideales para la derivatización o modificación de
sus grupos funcionales, necesaria en los procesos
de inmovilización de carbohidratos. Estos
oligosacáridos reductores pueden aislarse a partir
de leche y orina tanto animal como humana, o
bien pueden ser liberados de oligosacáridos
mediante enzimas hidrolíticas específicas. La
obtención de fragmentos de oligosacáridos a
partir de los polisacáridos de plantas y bacterias
también es posible mediante métodos químicos
como la hidrólisis, acetolisis o degradación de
Smith62. El aislamiento y purificación de
oligosacáridos es un proceso muy laborioso que
implica la realización múltiples ensayos
cromatográficos mediante HPLC63.
39
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Fig. 14. Espectrometría de masas para la identificación de los oligosacáridos Fuente: Consortium for Functional Glycomics, CFG, NIH. (http://www.functionalglycomics.org/static/consortium).
58 Los neoglicolípidos son oligosacáridos unidos a lípidos.59 Fukui, S., et al. (2002). Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments of
carbohydrate-protein interactions. Nature Biotechnology. Vol. 20: 1011-1017.60 Feizi, T., et al. (2003). Carbohydrate microarrays- a new set of technologies at the frontiers of glycomics. Current Opinion
in Structural Biology. Vol. 13: 637-645.61 Extremo reductor o libre (R): grupo funcional que en presencia de O2 tiene mucha tendencia a oxidarse (-OH, -NH, -SH),
posibilitando la formación de nuevos compuestos y macromoléculas.62 Feizi, T., et al. (2003). Carbohydrate microarrays- a new set of technologies at the frontiers of glycomics. Current Opinion
in Structural Biology. Vol. 13: 637-645.63 HPLC, High Performance Liquid Chromatography (Cromatografía líquida de alta resolución).
4.1.3. Inmovilización de los carbohidratos
La inmovilización de carbohidratos se puede llevar a
cabo mediante dos estrategias, la inmovilización
covalente y no covalente. La inmovilización no
covalente inespecífica sobre placas de vidrio
cubiertas de nitrocelulosa puede ser empleada con
carbohidratos no modificados. Sin embargo, la
inmovilización de oligosacáridos mediante esta
técnica es dependiente de la longitud de las cadenas
de carbohidratos, siendo mayor la afinidad de
oligonucleótidos de alto peso molecular por los
soportes de nitrocelulosa. Ejemplos de carbohidratos
inmovilizados no covalentemente son polisacáridos
diversos, glicosaminoglicanos, glicoproteínas, o
neoglicolípidos. La inmovilización covalente de
carbohidratos se puede realizar tanto en soportes de
cristal como de oro, que previamente han de ser
funcionalizados mediante grupos tiol, maleimida o
benzoquinona. La unión covalente entre estos grupos
y los carbohidratos se realiza por medio de moléculas
de enlace unidas a los extremos de los carbohidratos
como los ciclopentanos y maleimidas64.
4.2. Aplicaciones de losmicroarrays decarbohidratos
La principal aplicación de los microarrays de
carbohidratos es el descubrimiento de compuestos
terapéuticos implicados en diversos procesos
fisiológicos, desde la aparición de una respuesta
inmune hasta procesos inflamatorios o infecciosos
desencadenados por bacterias o virus. La mayoría
de los microarrays de carbohidratos han sido
empleados como sistemas modelo para la
investigación de interacciones entre carbohidratos
y lectinas. Las lectinas son grupo de proteínas de
origen no inmune presentes en la mayoría de los
seres vivos, que comparten en común la
propiedad de unirse de forma específica y
reversible a carbohidratos. Esta propiedad hace
que las lectinas constituyan una herramienta muy
valiosa para el estudio de la estructura de
membranas celulares, determinación de la
patogenicidad de los microorganismos, tipaje de
grupos sanguíneos, y estudio de otros procesos
de reconocimiento mediados por interacciones
especificas de carbohidratos con receptores.
Los principales ejemplos de microarrays de
carbohidratos son los microarrays de antibióticos
aminoglicósidos y los microarrays de manosa:
• Los microarrays de antibióticos
aminoglicósidos se han empleado en la
determinación de las interacciones de los
antibióticos con dianas terapéuticas y enzimas
asociadas a resistencia frente a antibióticos. Esta
herramienta es de gran utilidad, ya que permite
acelerar el descubrimiento de nuevos antibióticos.
• Los microarrays del monosacárido manosa
han sido empleados en la caracterización de los
carbohidratos que específicamente se unen a las
proteínas neutralizantes del virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV). Estos estudios
podrían ser de gran relevancia para el desarrollo
de vacunas anti-VIH basadas en carbohidratos65.
Un ejemplo de las diversas aplicaciones que un
microarray de carbohidratos puede ofrecer se
encuentra en el producto comercial GlycoChip®,
desarrollado por la compañía israelí Glycominds.
Las aplicaciones de este microarray consisten en
la identificación de nuevas proteínas con dominios
de unión a carbohidratos, y el cribado de
anticuerpos frente a determinados glicanos.
40
64 Disney, M. & Seeberger, P. (2004). Carbohydrate arrays as tools for the glycomics revolution. Drug Targets Today:Targets. Vol. 3(4): 151-158.
65 Seeberger, P. H., et al. (2004). Carbohydrate arrays as tools for the glycomics revolution. Drug Discovery Targets. Vol. 3(4): 151-158.
Fig. 15. GlycoChip® empleado en la identificación de las interaccionesde glicanos con células T CD4.Fuente: Glycominds Ltd (http://www.glycominds.com).
Hasta la fecha, el análisis in vivo de la expresión
génica se realizaba únicamente gen a gen, por
medio de la introducción de un gen en un célula,
y la posterior observación de su efecto fisiológico
o fenotipo. Los microarrays de células permiten el
análisis de la expresión génica in vivo a gran
escala en células humanas y animales.
La estrategia empleada para su diseño consiste en
el cultivo de células sobre fragmentos de ADN
inmovilizados en un microarray. Estos fragmentos
de ADN se transfectan o introducen en las células,
que posteriormente expresan las proteínas
codificadas por su secuencia. Una estrategia
alternativa consiste en transfectar las células
inmovilizadas en el array con ARN interferente, de
modo que en vez de activarse la expresión de un
gen, se produzca el silenciamiento del mismo. Este
bloqueo de la expresión génica define un conjunto
de puntos en el array que se corresponderán con la
expresión del fenotipo esperado. Las principales
técnicas de detección empleadas en los
microarrays de células son la hibridación in situ,
inmunofluorescencia y autorradiografía.
41
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
5. Microarrays de células
ADNc depositado en placa
1 3
2
Incubación de ADN con célulasde mamífero para su transfección
Detección de las células transfectadasa partir del fenotipo
Fig. 16. Diseño de un Microarray de células.Fuente: Howbrook, D. N., et al. (2003). Developments in microarray technologies. Drug Discovery Today Vol. 8Nº 14:642-651.
Aplicaciones de los microarrays de células
• Identificación de dianas terapéuticas mediante la caracterización funcional a gran escala deproductos génicos.
• Evaluación de la especificidad de fármacos candidatos.
• Identificación de las proteínas de unión en aquellos fármacos con mecanismos de accióndesconocidos o bien identificados mediante análisis basados en fenotipo.
• Análisis de pérdida de función mediante ARN interferente66.
66 El ARN de interferencia (ARNi) es una tecnología que se basa en el empleo de moléculas cortas de ARN de cadenasencilla o doble para bloquear la expresión de genes específicos. El mecanismo del ARNi está presente en la naturalezacomo una respuesta celular innata que permite combatir las infecciones virales regulando la expresión del ARN.
Los microarrays de células ofrecen varias ventajasfrente a los microarrays de proteínas, debido a laheterogeneidad de estas últimas y a la dificultadpara mantener su estabilidad. El empleo demicroarrays de células evita estos problemas,además de permitir que tengan lugar los procesos
de modificación transcripcional necesarios para elcorrecto funcionamiento de las proteínas, comopor ejemplo proteínas de membrana, un tipo dediana muy común. Los microarrays de célulastransfectadas tienen una serie de ventajas sobreotros métodos convencionales de expresión67:
42
Principales ventajas de los microarrays de células
• Miniaturización, automatización y multiplexado del ensayo.
• Permite el empleo de diversos métodos de detección.
• Emplean los mismos arrayers robóticos que los microarrays de ADN y por ello pueden llegar adensidades de hasta 6.000-10.000 clusters de células por soporte.
• Posibilidad de inmovilizar células en el array, permitiendo la detección de fenotipos transitoriostales como cambios en la concentración de una determinada sustancia.
• Las proteínas son sintetizadas por las células inmovilizadas en el array, aumentando la probabilidadde adquirir las necesarias modificaciones post-traduccionales.
Principales limitaciones de los microarrays de células
• El fenotipo observado debido a la transfección transitoria de las células puede no correspondersecon la función celular del gen in vivo.
• Sólo es posible realizar esta técnica en células con eficiencias de transfección mayores del 1%.
• Requiere el diseño previo de colecciones de ADNc.
Cabe destacar el diseño de colecciones de ADNc como una limitación importante a la hora de elaborararrays de células de alta densidad. Actualmente existen distintas iniciativas en marcha para la creación decolecciones de ADNc a partir del genoma humano68.
67 Sabatini, D. M. and Ziauddin, J. (2001). Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. Vol. 411: 107-110.Bailey, S. N., et al. (2002). Applications of transfected cell microarrays in high-throughput drug discovery. DDT Vol. 7, Nº 18 (Suppl.): 1-6.
68 Harvard Institute of Proteomics, Boston, MA, USA (http://www.hip.harvard.edu/research.html).Mammalian Gene Collection, MGC (http://mgc.nci.nih.gov/).
Los microarrays de tejidos (TMAs, Tissue
Microarrays) constituyen una de las más recientes
novedades en el campo de los biochips. Consisten
en colecciones miniaturizadas de hasta 1.000
muestras de tejidos inmovilizadas sobre un
soporte, que permiten el screening de ADN, ARN
y proteínas. Prácticamente la mayoría de los
artículos publicados sobre microarrays de tejidos
están relacionados con el análisis de tumores,
aunque se ha demostrado su valor en otro tipo de
patologías relacionadas con el sistema nervioso69.
El proceso de desarrollo de fármacos está
compuesto por una serie de etapas que requieren
del análisis de tejidos de los pacientes
participantes en ensayos clínicos. Los métodos
empleados hasta el momento en el análisis y
caracterización de tal cantidad de muestras de
tejidos hacían que el proceso de descubrimiento y
desarrollo de fármacos fuera largo, de alto coste y
con una difícil estandarización. La tecnología de
microarrays de tejidos permite el análisis in situ a
gran escala de muestras de tejidos70 y aunque
básicamente se emplea en estudios relacionados
con el cáncer, son de gran utilidad en cualquier
tipo de patologías en los que se necesitan
muestras de tejidos como es el caso de estudios
con tejido nervioso.
43
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
6. Microarrays de tejidos
Ventajas derivadas del empleo de microarrays de tejidos
• Estandarización de los ensayos clínicos y moleculares en tejidos.
• Pueden someterse a un amplio rango de técnicas (tinción histoquímica e inmunológica, hibridaciónin situ).
• Requerimiento de pequeñas cantidades de reactivos.
Limitaciones derivadas del empleo de microarrays de tejidos
• La cantidad de tejido empleada podría no ser representativa del tejido del que deriva (ej. Displasias ycarcinomas in situ).
• Requiere material de partida fijado en formol e incluido en parafina.
Según se muestra en la figura 17, la construcción de un microarray de tejidos requiere la extracción previade muestras de tumor en forma de pequeños cilindros de 0,6 mm de diámetro que posteriormente seinsertan en las cavidades a medida de un bloque de parafina. La transferencia de estas secciones de tejidoa una placa se facilita mediante el empleo de láminas adhesivas.
69 Sauter, G., et al. (2003).Tissue microarrays in drug discovery. Nature Review: Drug discovery 2: 962-972.70 Hillan, K., et al. (2003). Tissue microarrays in drug discovery. Nature Reviews in Drug Discovery. Vol. 2 (962-972).
Una de las posibilidades que ofrecen losmicroarrays de tejidos es su combinación conmicroarrays de ADNc para la validación de losresultados obtenidos con estos últimos. De esta
manera, se pueden obtener perfiles de expresiónmediante microarrays de tejidos para aquellosgenes que se expresen de manera diferencial entejidos sanos y enfermos.
44
a
b c
d
e
Fig. 17. Diseño de un microarray de tejidos.Fuente: Hillan, K., et al. (2003). Tissue microarrays in drug discovery. Nature Reviews in Drug Discovery. Vol. 2 (962-972).
Aplicaciones de los microarrays de tejidos en combinación con microarrays de ADNc:
• Determinación de la distribución celular y subcelular de las dianas moleculares.
• Integración de la información obtenida a nivel de ADN, ARN y proteína sobre una misma dianamolecular.
• Validación in vivo de los resultados obtenidos del análisis de líneas celulares o de modelosanimales de enfermedades en muestras de tejidos de pacientes.
• Extensión de los resultados obtenidos del análisis de un número limitado de arrays de ADNc a unacohorte epidemiológicamente representativa mediante arrays de tejidos.
• Exploración de la prevalencia de las potenciales dianas en diferentes estados de progresión deltumor.
• Correlación de los datos moleculares con evidencias clinicopatológicas de los pacientes.
45
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Tip
os
de m
icro
arr
ays
Ven
taja
sD
esv
en
taja
s
Mic
roar
rays
de
AD
N
Mic
roar
rays
de
pro
teín
as
• Est
andar
izac
ión y
am
plio
des
arro
llo d
e la
téc
nic
a.
• Anál
isis
de
expre
sión g
énic
a, g
enotipad
o, e
hib
ridac
ión g
enóm
ica
com
par
ada.
• Anál
isis
pro
teóm
ico f
unci
onal
.
• Anál
isis
de
pro
teín
as q
ue
sufr
en m
odific
acio
nes
post
-tr
ansc
ripci
onal
es.
• N
o p
erm
iten
anal
izar
pro
teín
as q
ue
sufr
enm
odific
acio
nes
post
-tra
nsc
ripci
onal
es.
• D
epen
den
cia
de
la c
alid
ad y
can
tidad
de
info
rmac
ión
exis
tente
par
a el
dis
eño d
e la
s so
ndas
.
• Req
uie
ren d
e m
olé
cula
s ad
apta
dora
s par
a an
clar
las
pro
teín
as a
l so
port
e.
• D
isponib
ilidad
de
pro
teín
as y
anticu
erpos
espec
ífic
os.
• D
etec
ción e
spec
ífic
a de
pro
teín
as.
• D
eshid
rata
ción d
e la
s pro
teín
as
• Fe
nóm
enos
de
reac
tivi
dad
cru
zada.
• D
etec
ción n
o u
niform
e de
las
inte
racc
iones
entr
epro
teín
as.
Mic
roar
rays
de
carb
ohid
rato
s•
Anál
isis
de
las
modific
acio
nes
post
-tra
ducc
ional
es d
e glic
osi
laci
ón
que
sufr
en c
iert
as p
rote
ínas
.
• M
enor
des
arro
llo q
ue
otr
os
tipos
de
mic
roar
rays
.
• Lo
s olig
osa
cáridos
no p
ued
en s
er c
lonad
os
ni
amplif
icad
os.
• La
can
tidad
de
olig
osa
cáridos
que
pued
en s
er a
isla
dos
es g
ener
alm
ente
muy
limitad
a.
Mic
roar
rays
de
célu
las
• M
inia
turiza
ción,
auto
mat
izac
ión y
multip
lexa
do d
el e
nsa
yo.
• Em
ple
o d
e div
erso
s m
étodos
de
det
ecci
ón.
• D
etec
ción
de
fenot
ipos
tra
nsi
torios
(ej
. ca
mbi
os e
n la
con
centr
ació
n).
• Anál
isis
de
pro
teín
as q
ue
sufr
en m
odific
acio
nes
post
-tr
ansc
ripci
onal
es.
• El fe
notipo o
bse
rvad
o d
ebid
o a
la
tran
sfec
ción
tran
sito
ria
de
las
célu
las
pued
e no c
orr
esponder
se c
on
la f
unci
ón c
elula
r del
gen
in v
ivo.
• Efici
enci
a de
tran
sfec
ción n
eces
aria
may
or
del
1%
.
• Req
uie
re e
l dis
eño p
revi
o d
e co
lecc
iones
de
AD
Nc.
Mic
roar
rays
de
tejidos
• Est
andar
izac
ión d
e lo
s en
sayo
s cl
ínic
os
y m
ole
cula
res
en t
ejid
os.
• Am
plio
ran
go d
e té
cnic
as d
e det
ecci
ón (
tinci
ón h
isto
quím
ica
ein
munoló
gic
a, h
ibridac
ión in s
itu).
• Req
uie
ren p
equeñ
as c
antidad
es d
e re
activo
s.
• La
can
tidad
de
tejido e
mple
ada
podría
no s
erre
pre
senta
tiva
del
tej
ido d
el q
ue
der
iva.
• Req
uie
re m
ater
ial de
par
tida
fija
do e
n f
orm
ol e
incl
uid
oen
par
afin
a.
Tabla
8.
Ven
taja
s y
des
venta
jas
de
los
dis
tinto
s tipos
de
mic
roar
rays
.Fu
ente
: Ela
bora
ción p
ropia
.
VEN
TA
JAS
Y D
ES
VEN
TA
JAS
DE L
OS
DIS
TIN
TO
S T
IPO
S D
E M
ICR
OA
RR
AY
S
Las principales aplicaciones de las tecnologías demicroarrays en salud humana son muy diversas yestán interrelacionadas entre si, pudiéndoseemplear clasificaciones que hacen referencia a losusuarios de la tecnología (industria farmacéutica,clínica o académica), o bien al tipo de estudio quese puede llevar a cabo (genotipado o expresióngénica). Para los propósitos del presente informe,las aplicaciones de los microarrays se han divididoen cinco sectores que se corresponden con laidentificación de dianas terapéuticas,descubrimiento y desarrollo de fármacos,diagnóstico clínico, farmacogenómica yfarmacogenética, e investigación básica.
7.1. Identificación de dianasterapéuticas
La comparación de los niveles de expresión degenes en tejidos enfermos y sanos permite laidentificación de genes implicados enenfermedades de interés, así como la asociacióncon las proteínas que forman parte del procesopatológico. Esta información es imprescindiblepara el desarrollo de fármacos que actúenbloqueando o modulando los mecanismosmoleculares de la enfermedad.
Las técnicas de análisis de la expresión génicamediante microarrays de ADN se emplean en laidentificación de nuevas dianas terapéuticas, comoparte de las primera etapas del proceso deinvestigación en la industria farmacéutica. El estudiode interacciones proteína-proteína es también otrade las estrategias tenidas en cuenta, para la cual losmicroarrays de proteínas son de gran utilidad.
46
7. Aplicaciones de los microarrays en salud humana
Descubrimientode dianas
Descubrimientode fármacos
Desarrollode fármacos
Identificaciónde dianas
Validaciónde dianas
Selecciónde compuestos
Optimizaciónde compuestos
FasePreclínica
FaseClínica
Fig. 18. Fases principales del desarrollo farmacológico.Fuente: Whittaker P. A. (2003). What is the relevance of bioinformatics to pharmacology? Trends In PharmacologicalSciences, 24 (8):434-439.
7.2. Descubrimiento y desarrollo de fármacos
El proceso de descubrimiento y desarrollo defármacos se ha beneficiado del uso deherramientas genómicas de alto rendimientocomo los microarrays de ADN, que hacen posibleel análisis de la expresión génica en miles demuestras simultáneamente. El empleo de biochipspermite analizar de forma rápida los cambios deexpresión génica que tienen lugar durante laadministración de un fármaco, así como lalocalización de nuevas posibles dianasterapéuticas y efectos toxicológicos asociados. Porotra parte, los microarrays de carbohidratosposeen un papel fundamental en eldescubrimiento de compuestos terapéuticosimplicados en diversos procesos fisiológicos,desde la aparición de una respuesta inmune hastaprocesos inflamatorios o infecciososdesencadenados por bacterias o virus.
El objetivo principal de la toxicogenómica radicaen el estudio de los cambios que se producen enel perfil de expresión génica como respuesta asustancias tóxicas para el organismo. Losmicroarrays pueden ser utilizados por tanto enensayos de toxicidad, seguridad y efectividad delfármaco candidato como parte integral de losestudios clínicos. Las principales ventajas delempleo de microarrays durante los estudios detoxicidad radica en que permiten reducir elempleo de animales en los ensayos clínicos yproporcionan una herramienta de gran utilidad enenfermedades complejas para los cuales noexisten modelos animales disponibles.
La determinación de la toxicidad de un fármacodurante las primeras fases del desarrollofarmacéutico permite ahorrar tiempo y dinero, deforma que sólo superen estas etapas preliminareslos candidatos más adecuados.
47
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Test de seguridad en individuos sanos(30-100 indiv.)
Fase I
Fase II
Fase III
Fase IV
Tecn
olo
gía
s d
e m
icro
arr
aysTest de seguridad e
impacto en el estadopatológico (cientos depacientes)
Test de seguridad,impacto, dosificación yestudios comparativos(miles de pacientes)
Monitorización del fármaco (estudios post-marketing)
ETAPAS DEL DESARROLLO DE UN FÁRMACO
Fig. 19. Situación de los estudios toxicológicos en las distintas fases de ensayos clínicos que forman parte del proceso dedesarrollo de fármacos.Fuente: Elaboración propia.
7.3. Diagnóstico clínico
El diagnóstico molecular de enfermedades serealiza principalmente mediante microarrays deADN, que permiten el estudio de los posiblespolimorfismos y la detección de mutaciones engenes complejos asociados a una enfermedadconcreta. Por otro lado, los microarrays tambiénse pueden emplear en el ámbito clínico para ladiagnosis de diferentes tipos de tumores gracias asus perfiles de expresión génica o patronesmoleculares. El análisis de la expresión génica delos pacientes y la consiguiente identificación depatrones de expresión posee un impacto directoen el diagnóstico molecular del cáncer. De estaforma, cuanto mayor sea la capacidad paraclasificar un tumor determinado, se dispondrá demayor información acerca de la biología y elpronóstico del tumor.
Por otra parte, la identificación de microorganismospatógenos (virus, bacterias, hongos o protozoos)mediante microarrays de ADN es de gran utilidad enel diagnóstico de patologías infecciosas y otra seriede aplicaciones relacionadas con la microbiologíaclínica71. Los microarrays de ADN pueden emplearseen la detección simultánea de un amplio número demicroorganismos, incluyendo bacterias, virus,parásitos y hongos. La finalidad del empleo demicroarrays en microbiología abarca múltiplesaplicaciones, que van desde la comprensión de labiología de los microorganismos, el estudio de losmecanismos de resistencia frente a antibióticos, laidentificación de las cepas o serotipos, a lacaracterización de nuevas dianas génicas con valorterapéutico. Tanto los análisis de SNPs como deexpresión génica mediante microarrays de ADNpermitirían identificar los mecanismos implicados enla resistencia de patógenos a ciertos agentesantimicrobianos72.
48
71, 72 Doménech-Sánchez, A. & Vila, J. (2004). Fundamento, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiologíamédica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 22(1):46-54.Bryant, P. A., et al. (2004). Chips with everything: DNA microarrays in infectious diseases. Lancet Infect. Dis. 4:100-111.
Amplificaciónpor PCR
Fabricacióndel chip
Hibridación
Detección de laseñal y análisis
Marcajefluorescente
Aislamientode ADN
• Detección de secuencias virales y subtipos
HIV-1EBVHHV-6KSHV
HTLV-1HTLV-2
HCV
Infection
Fig. 20. Aplicación de los microarrays en el diagnóstico de VIH.Fuente: Shieh, B. & Li, C. (2004). Multi-faceted, multi-versatile microarray: simultaneous detection of many viruses andtheir expression profiles. Retrovirology 26 May, 1:11.
Es interesante señalar que no sólo los microarraysde ADN se emplean en las aplicacionesrelacionadas con el diagnóstico, ya que losmicroarrays de proteínas muestran un granpotencial como herramientas de diagnósticoclínico en alergias humanas de distinta índole.Otra posible aplicación de este tipo demicroarrays de proteínas es la posibilidad de
desarrollar estudios de inmunogenicidad para supotencial aplicación en el desarrollo de vacunas.En este tipo de estudios se podrían inmovilizardiferentes epítopos73 y analizar que anticuerpospresentan una mayor respuesta, o bien analizarsimultáneamente una gran cantidad deanticuerpos frente a un mismo antígeno.
49
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
73 Epítopo: región de la superficie de un antígeno que las moléculas de anticuerpos pueden identificar y a la cual se puedenfijar. Antígeno: Sustancia que el organismo reconoce como extraña y posiblemente perjudicial.
Principales aplicaciones de los microarrays en microbiología clínica:
• Estudio epidemiológico molecular de microorganismos: identificación de los genes responsables deuna menor patogenicidad en determinadas cepas de microorganismos. Ejemplo: Microarray de ADNcon genes de 19 cepas diferentes de M. tuberculosis.
• Diagnóstico microbiológico: la mayoría de los arrays empleados hasta le fecha en diagnósticoclínico consisten en arrays de baja densidad. Ejemplos: estos arrays se centran fundamentalmenteen la detección de varias especies de un mismo género de bacterias (Staphylococcus sp.Pseudomonas sp.), presencia de parásitos infecciosos (Cryptosporidium sp.), o en el ámbito de lavirología clínica, básicamente en su utilización en el genotipado del virus VIH.
• Estudio de los mecanismos de acción y de resistencia a los agentes antimicrobianos: losmicroarrays de ADN se han empleado para el estudio del mecanismo de acción de ciertoscompuestos frente a determinados microorganismos, así como en el análisis de la resistencia aantibióticos mediante detección de genes específicos o mutaciones. Ejemplo: Microarrays de ADNpara la detección de resistencia a rifampicina en M. tuberculosis.
7.4. Farmacogenómica y farmacogenética
Las estrategias de farmacogenética yfarmacogenómica constituyen otras de las áreas deaplicación de los microarrays de ADN. Lafarmacogenética consiste en el estudio de las basesgenéticas que influencian la respuesta individual alos fármacos, mientras que el términofarmacogenómica es más amplio y se suele referir alas aplicaciones comerciales de la tecnologíagenómica en el desarrollo de fármacos y terapia. Lacombinación de los datos obtenidos a partir de laidentificación de SNPs, junto con la informaciónrecopilada del estudio de perfiles de expresióngénica, permite establecer una correlación entre elgenotipo y el fenotipo de un determinado individuo.
El último objetivo de la farmacogenómica consiste
en definir una enfermedad a nivel molecular de
tal manera que las herramientas preventivas y
terapéuticas de las que se disponga puedan
frenar o mitigar los efectos de la enfermedad. Las
aplicaciones clínicas de la farmacogenómica se
encuentran dirigidas al empleo de estrategias
terapéuticas más efectivas en función del perfil
genómico del paciente, permitiendo identificar
aquellos fármacos y dosificaciones de los mismos
para los cuales el paciente ofrece una respuesta
óptima. De la misma forma, es posible identificar
los medicamentos o concentraciones de los
mismos que desencadenan reacciones de
toxicidad en algunos pacientes. Esta
estratificación de la enfermedad en función del
genotipo del paciente, haría posible además la
7.5. Investigación básica
El estudio de la regulación de genes por medio de
microarrays de ADN ha proporcionado ingentes
cantidades de datos de gran valor para la
identificación de genes involucrados en procesos
patológicos, fisiológicos y de desarrollo, además
de servir como paso previo en el proceso de
desarrollo de fármacos. Los microarrays de ADN
permiten estudiar la función de los genes
facilitando la identificación de aquellos que están
activados de forma diferencial cuando se
comparan dos condiciones diferentes, como por
ejemplo un tejido sano y otro afectado por algún
tipo de patología.
salida al mercado de nuevos fármacos, dirigidos a
segmentos de la población para los cuales los
medicamentos actuales no resultan eficaces. Por
último, el conocimiento del perfil genético de las
poblaciones permitirá conocer la predisposición
individual de cada persona a sufrir algún tipo de
enfermedad, antes incluso de que aparezcan los
síntomas, permitiendo así la realización de una
mejor y auténtica medicina preventiva. Esto se
llevará a cabo a través de estudios de
epidemiología genética.
Otro de los usos más prometedores de los
microarrays consiste en el empleo de los patrones
de expresión como predictores de la respuesta al
tratamiento. Se conocen datos confirmatorios en
relación con el tratamiento de linfomas, leucemias
agudas y cáncer de mama74.
50
74 Cigudosa, J. C. (2004).The microarray revolution in biomedical research: types of platforms, uses and perspectives inoncology .An. Sist. Sanit. Navar. 27 (1): 11-20.
ARNm
Microarrays
Subgrupo 1:gen inactivo
Subgrupo 2:gen activo
Distinto GenotipoRespuesta a fármacos, toxicidad, predisposición a desarrollar determinadas enfermedades, etc.
Fig. 21. Tecnologías de microarrays de ADN aplicadas a la farmacogenómica.Fuente: Elaboración propia.
{
51
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Distinta expresión génicaIdentificación de genes implicados en procesos biológicos de interés
Cultivoscelulares
ARNm
Microarrays
Tejidosano
Tejidoenfermo
Fig. 22. Tecnologías de microarrays de ADN aplicadas a la investigación básica.Fuente: Elaboración propia.
Este tipo de estudios se pueden complementar conanálisis realizados mediante otros tipos demicroarrays, como por ejemplo microarrays deproteínas, anticuerpos, células o tejidos. Por otraparte, los microarrays de carbohidratos ofrecengrandes ventajas como sistemas modelo para lainvestigación de interacciones entre carbohidratos ylectinas. Éstas constituyen un grupo de moléculasmuy valiosas para el estudio de la estructura demembranas celulares, patogenicidad de
microorganismos, tipaje de grupos sanguíneos, yotros procesos de reconocimiento mediados porinteracciones especificas de carbohidratos conreceptores. Los microarrays de ADN también se hanempleado en la investigación de patógenosbacterianos, tanto de los factores de patogenicidaddel organismo, como de la respuesta de la célulahospedadora frente a la acción del microorganismo(Ejemplo: Microarrays de ADN que contienen genesconstituyentes del genoma de H. pylori75).
Tipos de microarrays ADN Proteínas Carbohidratos Células Tejidos
Identificación de dianasterapéuticas √ √ √ √ √
Descubrimiento ydesarrollo de fármacos √ √ √ √ √
Fármacogenómica √
Diagnóstico clínico √ √ √
Investigación básica √ √ √ √ √
Tabla 9. Aplicaciones de las tecnologías de microarrays en salud humana.Fuente: Elaboración propia.
APLICACIONES DE LAS TECNOLOGÍAS DE MICROARRAYS EN SALUD HUMANA
75 Doménech-Sánchez, A.; Vila, J. (2004). Fundamentos, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiologíamédica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. Vol. 22 (1):46-54.
La técnica de microarrays cuenta con una serie de
barreras a su desarrollo que, si bien durante los
últimos años se está trabajando de manera activa
en solventarlas, no dejan de seguir siendo
importantes.
• Entre las principales limitaciones de los
microarrays está su precio, ya que pese al
descenso paulatino de su coste, sigue siendo
una técnica cara que en muchos casos no
permite incorporarla como un análisis rutinario.
• En cuanto a las limitaciones técnicas, la
reproducibilidad de los arrays de expresión es
la que más se cita entre los usuarios de esta
tecnología. Hay que tener en cuenta que la
variabilidad de los parámetros implicados en
estos análisis ha de ser mínima y la detección
de pequeños cambios en la expresión de genes
únicamente deberían ser atribuidos a la biología
de la muestra en sí. En la actualidad existe la
posibilidad de cuantificar la integridad del ADN,
favoreciendo la fiabilidad y robustez de los
microarrays. Varios estudios publicados en el
último año destacan el descenso de la
variabilidad técnica entre las principales
plataformas tecnológicas de microarrays de
ADN, lo que indica un mejor conocimiento de
esta tecnología y mayor experiencia en el
correcto uso de dichas herramientas76.
• Dado que es una tecnología que aún se
encuentra en desarrollo, resulta difícil su
estandarización, una necesidad que está
favoreciendo el uso de microarrays de oligos
frente al ADNc por su mejor estandarización y
portabilidad. Algunos estudios recientes ya
señalan la relevancia de la estandarización en la
utilización correcta de microarrays77. La FDA78
ha puesto en marcha en el año 2005 un
proyecto denominado MAQC (MicroArray Quality
Control Project)79, que pretende proporcionar a
la comunidad científica herramientas de control
de calidad en microarrays. El objetivo último de
este proyecto consiste en la elaboración de una
guía de referencia que facilite la estandarización
del uso de microarrays, como complemento a la
guía sobre farmacogenómica publicada a
comienzos del año 2005 por la misma agencia80.
• Hasta ahora, la cantidad de muestra
necesaria para ser analizada era un factor
limitante, pero gracias a la aportación de
diferentes tecnologías de miniaturización como
la microfluídica y la nanotecnología, el problema
de la cantidad de muestra está reduciendo
progresivamente su impacto.
• El Proyecto Genoma Humano ha permitido la
construcción de mapas genéticos y físicos
detallados del genoma humano, así como
determinar su secuencia y localizar la posición de
los genes que lo componen. Esta información ha
sido de gran valor a la hora de desarrollar
microarrays de ADN, a pesar de que la anotación
incorrecta o incompleta de secuencias del
genoma puede dar lugar a errores que pueden
pasar desapercibidos. La anotación de secuencias
va paulatinamente ganando en exactitud a medida
que se dispone de más información, lo que
permite no sólo identificar la secuencia, sino
además describir su función.
52
8. Barreras existentes para la implantaciónde los microarrays
76 Sherlock, G. (2005). Of fish and chips. Nature Methods 2:329-30; Irizarry, et al. (2005). Multiple-laboratory comparisonof microarray platforms. Nature Methods 2: 345-50; Larkin et al. (2005). Independence and reproducibility acrossmicroarray platforms. Nature Methods 2: 337-44; Weis, B. K. (2005). Standardizing global gene expression analysisbetween laboratories and across platforms. Nature Methods 2:351-356.
77 Michiels, S., et al. (2005). Prediction of cancer outcome with microarrays: a multiple random validation strategy. Lancet.5-11;365(9458):488-92.
78 FDA, Food & Drug Administration, USA (http://www.fda.gov/default.htm).79 MicroArray Quality Control (MAQC) Project (http://www.fda.gov/nctr/science/centers/toxicoinformatics/maqc).80 Guidance for Industry: Pharmacogenomic Data Submissions (2005). FDA, March.
(http://www.fda.gov/cder/guidance/6400fnl.pdf).
• Por último, una característica inherente a lastecnologías basadas en microarrays es la grancantidad de información que se genera a partirde ellas. El manejo de los datos obtenidos apartir de estos experimentos y su análisisposterior es uno de los mayores retos ante losque se enfrenta esta tecnología81. Para lograrsuperar esta barrera, se está avanzandoconsiderablemente en el desarrollo deherramientas bioinformáticas entre las quepodemos mencionar las técnicas de minería dedatos como el clustering, el análisis estadístico,
los algoritmos genéticos, las redes neuronales,las herramientas de preprocesamiento de datos,la representación de modelos biológicos, labiología computacional o la minería de textos.Actualmente se está avanzandoconsiderablemente en el desarrollo deherramientas bioinformáticas en el contexto dela genómica funcional, que permiten elalmacenaje de información, agrupación degenes en base a una determinada característica,selección de características relevantes y sucorrelación.
53
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
81 The ABRF MARG Survey 2005: Taking the Pulse of the Microarray Field.(http://www.abrf.org/index.cfm/group.show/Microarray.30.htm).
Hace unos años las perspectivas de lastecnologías de microarrays y biochips augurabanun futuro prometedor en este campo, aunquetodavía no se observaba una implantacióngeneralizada de la técnica. La situación actualconfirma estas previsiones al revelar un aumento
exponencial en cuanto a las publicacionesrelacionadas con microarrays y biochips, así comoun crecimiento en las patentes concedidas en losúltimos años, lo que demuestra alto interéscomercial por las tecnologías de microarrays ybiochips.
54
9. Perspectivas de mercado de losmicroarrays y biochips en salud humana
Nº
de p
ub
lica
cio
nes
Año
0
4.000
8.000
12.000
2005200420032002200120001999199819971996199519941993199219911990
Nº
de p
ate
nte
s
Año
0
100
200
300
400
500
600
200420032002200120001999199819971996199519941993199219911990
Fig. 23. Crecimiento del número de publicaciones y patentes relacionadas con microarrays y biochips. Fuente: Elaboración propia (datos obtenidos de PubMed, USPTO, esp@cenet).
Según datos publicados en octubre de 2004 por laempresa consultora estadounidense FreedoniaGroup82, la demanda de productos y serviciosrelacionados con biochips está sufriendoaumentos progresivos anuales desde el año 2003,que alcanzarán la cifra de 2.100 millones dedólares en el año 2008. La demanda demicroarrays o biochips por separado tendrá un
valor de 875 millones de dólares para esta fecha,mientras que la demanda de productosrelacionados y servicios, tales como reactivos,instrumentación, software, soporte técnico ycontratación de servicios, completarán el total delos 2.100 millones de dólares. Las tendenciasdetectadas por este estudio se resumen en elsiguiente cuadro.
55
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
82 Freedonia Group, Inc. Freedonia Study “Biochips” (http://www.freedoniagroup.com/pdf/1854smwe.pdf).
Perspectivas de demanda de productos y servicios relacionados con biochips en el año2008 (Freedonia Group, Inc.):
• Los microarrays de ADN continuarán siendo los principales productos que generan la mayordemanda, aunque los microarrays de proteínas sufrirán una expansión mucho más rápida debido alcrecimiento del campo de la Proteómica en los últimos años.
• Los microarrays de alta sensibilidad y kits de procesamiento de muestras proporcionarán unvalor añadido y oportunidades de crecimiento.
• La demanda total para instrumentación de biochips se espera que alcance los 263 millones dedólares en el año 2008, con un crecimiento anual del 13% a partir del 2003.
• Las oportunidades de crecimiento para la detección, preparación de muestras y equipamientoen hibridación continuarán expandiéndose debido a la diversificación de las investigacionesproteómicas.
• La demanda de software especializado aumentará considerablemente ya que cada vez es másfrecuente el empleo de programas sofisticados por parte de los investigadores. Estos programasson capaces de almacenar inmensas cantidades de datos procedentes de los microarrays, así comodescifrar la complejidad de los perfiles de expresión de genes y proteínas.
• Se prevé que el mercado relativo a los servicios relacionados con biochips crecerá a un ritmo del19% anual a partir del 2003, alcanzando los 600 millones de dólares para el año 2008.
• En cuanto a las labores de consultoría y contratos de investigación el crecimiento del 23%continúa situándolos en cabeza, debido principalmente a que las grandes compañías farmacéuticascontratan estas labores a terceros con mayor frecuencia.
• Por último, las oportunidades de crecimiento de la demanda en soporte técnico ymantenimiento de instalaciones en microarrays se mantendrán en alza, como consecuencia de larenovación de instalaciones antiguas por otras más modernas.
El crecimiento de la demanda de productos yservicios relacionados con biochips estará dirigidoprincipalmente por las aplicaciones endescubrimiento de fármacos e investigaciónepidemiológica, siendo el análisis de proteínas ydel perfil de expresión génica las técnicas que seexpanden con mayor velocidad.
Debido a que el descubrimiento de fármacos siguesiendo la principal aplicación de los biochips, elmercado de la industria de los biochips estácompuesto fundamentalmente por empresasfarmacéuticas, biotecnológicas y grandes centrosde investigación. Otros mercados secundarioscomo proveedores médicos, agenciasgubernamentales de salud, medicina forense yagroalimentación, no serán tan relevantes,limitándose a aprovechar nichos de mercado enproductos concretos.
Una de las principales aplicaciones de los
microarrays de ADNc es el estudio de los niveles
de expresión de genes orientado a la
caracterización de tumores. Cabe destacar dentro
de esta aplicación el esfuerzo llevado a cabo por
el Centro Nacional de Investigaciones
Oncológicas (CNIO) para el desarrollo del
OncoChip83, que constituye la única plataforma
de análisis de expresión génica múltiple
específicamente dedicada a cáncer que se fabrica
en España. El Oncochip representa alrededor
de 9.300 genes de las formas de cáncer más
frecuentes y relevantes como el cáncer de mama,
colorrectal, pulmón, linfomas, leucemia y tumores
urinarios como el de riñón, vejiga o próstata. El
80% de los genes representados en el Oncochip
han sido seleccionados por su función biológica
directamente relacionada con procesos tumorales
como angiogénesis, adhesión celular, apoptosis y
metástasis, o por su expresión anómala en tejidos
tumorales. El 20% restante son genes de interés
por su localización en regiones cromosómicas
donde se detectan frecuentes alteraciones. El
empleo de este microarray en la caracterización
de tumores permitirá establecer la relación de los
patrones de expresión génica de los distintos
tipos de tumor con el comportamiento clínico de
los mismos, y definir criterios de tratamiento
diferenciado para cada tipo de tumor basados en
su perfil de expresión génica.
En cuanto a la utilización de los microarrays de
ADNc en el diagnóstico, tratamiento y
seguimiento de enfermedades, el Lipochip®84
comercializado por Laboratorios Lácer, S.A. es
uno de los ejemplos a resaltar. Este microarray ha
sido desarrollado a partir de la actividad
investigadora de la Fundación de
Hipercolesterolemia Familiar con la
colaboración del Departamento de Bioquímica y
Biología Molecular de la Universidad de
Zaragoza, y con el soporte tecnológico de
Progenika-MedPlant. El Lipochip® constituye el
primer test genético para el diagnóstico de la
Hipercolesterolemia Familiar y recoge 224
mutaciones del gen que codifica el Receptor LDL,
cuyo mal funcionamiento es el responsable de
esta enfermedad. Gracias a la detección precoz de
este tipo de enfermedad, se puede establecer un
tratamiento adecuado que reduce
considerablemente los riesgos cardiovasculares
asociados a esta enfermedad.
En la misma línea de diagnóstico, la empresa
Progenika en colaboración con el Servicio de
Gastroenterología del Hospital Clínico de
Barcelona ha desarrollado un chip de ADN capaz
de analizar el diagnóstico y pronóstico de la
Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) a
través del análisis de un panel de polimorfismos
de nucleótidos (SNPs). En el caso del biochip para
la EII, la información obtenida del análisis de
cada SNP aporta información sobre factores de
riesgo distintos, como la agresividad de la
dolencia, la necesidad de cirugía o la localización
de la patología a lo largo de todo el tracto
digestivo. Esta nueva herramienta genética
dirigida al diagnóstico de la colitis ulcerosa y la
enfermedad de Crohn, cuenta hasta el momento
con 46 genes relacionados con esta enfermedad.
56
10. Situación de la investigación y desarrolloen España en el área de microarraysaplicados a la salud humana
83 CNIO OncoChip (http://bioinfo.cnio.es/data/oncochip).84 Lipochip® (http://www.meiga.info/documentos/lipochip.pdf).
Además de los genes de mayor importancia en laEII, como el PAI-1 (inhibidor de la activación delplasminógeno), el CRAD-15 o el HLA de clase 2,también se han incluido otros relacionados con larespuesta del organismo del paciente a losfármacos con los que se trata la patologíagástrica, con el fin de valorar cómo reaccionanante determinados tratamientos.
En el anexo II y III se recogen las empresasespañolas con productos y servicios demicroarrays así como las empresas condesarrollos bioinformáticos aplicados amicroarrays. Por otra parte, los principalesproyectos de investigación llevados a cabo porgrupos españoles se encuentran recogidos en elanexo IV del presente informe.
El empleo de microarrays de ADN por parte degrupos de investigación españoles se ha vistopotenciado por medio de iniciativas para elfomento del uso de estas tecnologías como la deGenoma España. Con esta convocatoria, sepretende incentivar el empleo de microarrays deADN para medir la expresión de los genes graciasa la cofinanciación de Genoma España, quepermite por tanto rebajar el precio final de lascasas comerciales. De momento existen ya cuatroagrupaciones (Genochip, Aginet, AEMCES yCEMAB), que ofrecerán distintos servicios, aunquela convocatoria sigue abierta hasta noviembre del2006.
57
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
58
El objetivo de esta convocatoria de Genoma España es aumentar la competitividad de la investigaciónpública española en genómica, biomedicina y biotecnología mediante el incremento del consumo demicroarrays para el análisis de expresión génica. Esta iniciativa ha supuesto un ahorro en los costes deun 40%. El plazo de presentación de solicitudes comienza el 15 de noviembre de 2004 y la convocatoriase mantiene abierta hasta el 14 de noviembre de 2006.
Objetivo y duración
Genoma España dispone de 1.000.000 de euros para el presente año. Entre las cuatro agrupaciones sehan requerido un total de 1.490.878 euros y a cada una se le ha concedido la cantidad que ha solicitadocontra justificación de los servicios prestados. El reparto de la cantidad total es el siguiente:
Agrupación Primeros seis meses Total anual
GENECHIP 386.900,00 € (1.250 servicios) 773.800,00 €AGINET 139.860,00 € (600 servicios) 279.720,00 €AEMCES 120.000,00 € (400 servicios) 240.000,00 €CEMAB 98.679,00 € (378 servicios) 197.358,68 €
Situación económica
“Convocatoria de ayudas para el fomento del uso de tecnologías microarrays de ADN para elanálisis de expresión génica” (20 de diciembre de 2005)
Agrupación Genechip (empresa proveedora: Affymetrix Co.)• Centro de Investigación del Cáncer de Salamanca (CIC).• Institut d´Investigacions Biomédiques August Pi i Sunyer, Hospital Clinic de Barcelona (IDIBAPS).• Centro Nacional de Biotecnología de Madrid (CNB-CSIC).• Facultad de Medicina de Valencia. Universidad de Valencia (UVEG).• Asociación Genika de Bilbao (GENIKA)• Parque Científico de Madrid. Universidad Complutense de Madrid (PCM-UCM)• Institut de Recerca. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona (IR- HSCSP).• Institut de Recerca del Vall d’Hebron de Barcelona (IR-HUVH).
Agrupación Aginet (empresa proveedora: Agilent Technologies)• Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas de Madrid (CNIO).• Centro de Regulación Genómica de Barcelona (CRG).• Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares de Madrid (CNIC).• Hospital Clínico San Carlos de Madrid (HCSC).• Oryzon Genomics de Barcelona (ORYZON).• Fundación Gaiker de Vizcaya (GAIKER).• Dominion Pharmakine, SL de Vizcaya (DPK).• Parque Científico de Barcelona (PCB).
Agrupación Aemces (empresa proveedora: Amersham Biosciences, ahora parte de General ElectricHealthcare)• Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares de Madrid (CNIC).• Instituto de Investigaciones Biomédicas de Madrid (IIB-CSIC).• Centro de Investigaciones Biológicas de Madrid (CIB-CSIC).• Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Universidad Autónoma de Madrid (CBM-CSIC).
Agrupación Cemab (empresa proveedora: Applied Biosystems, en España, Applera Hispania)• Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares de Madrid (CNIC)• Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO)• Institut de Recerca Biomédica- Parc Cientific de Barcelona (IRB-PCB).
Coordinadores:• Dr. Xosé Ramón García Bustelo del Centro de Investigación del Cáncer de Salamanca (CIC) coordina la
agrupación Genechip que utiliza la tecnología de Affymetrix.• Dr. Miguel Ángel Piris del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) coordina la
agrupación Aginet que utiliza la tecnología de Agilent Technologies.• Dra. Ana Dopazo del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) que
coordina las agrupaciones Aemces y Cemab bajo las tecnologías Amersham Biosciences y AppleraHispania respectivamente.
Participantes
La situación actual de las tecnologías demicroarrays y biochips con aplicaciones en saludhumana ha cambiado considerablemente enEspaña y resto del mundo respecto a los últimosaños, tanto en el entorno investigador como en elempresarial. Las promesas que surgieron haceunos años respecto a esta tecnología se hancumplido con creces, y hoy por hoy supone unaherramienta imprescindible en cualquier proyectode genómica y proteómica.
Resulta de especial importancia no sólo el mayornúmero de proyectos de investigación queemplean estas tecnologías en España, sino lasdiferentes aplicaciones que han surgido de ella.Las tres grandes áreas donde los microarraysestán cobrando cada vez mayor relevancia son eldiagnóstico molecular, farmacogenética, y eldesarrollo de fármacos. En el caso del diagnósticomolecular, los microarrays se emplean en laclasificación de enfermedades, mejorando elpronóstico en patologías como el cáncer. En lasaplicaciones dirigidas a farmacogenómica ydesarrollo de fármacos, los microarrays ofrecen laposibilidad de diseñar tratamientos personalizadoscon fármacos dirigidos a grupos específicos depacientes, ya que mediante el análisis del perfilde expresión de cada tumor individual se puedeanticipar la respuesta a un determinadotratamiento. Gracias a las posibilidades queofrecen estas aplicaciones han surgido grandesproyectos de genotipado en España para elestudio de patologías como el cáncer,enfermedades psiquiátricas y cardiovasculares.
El panorama actual en cuanto al acceso de latecnología es muy diferente, y la mayoría decentros de investigación españoles disponen deinfraestructuras de apoyo que permiten elempleo de los microarrays. Además, existeniniciativas públicas como la convocada porGenoma España para aumentar la competitividadde la investigación pública en genómica,biomedicina y biotecnología gracias al aumentodel consumo de este tipo de herramientas. Estainiciativa ha dado como resultado la creación de
cuatro agrupaciones para el fomento del uso detecnologías microarrays de ADN para el análisisde expresión génica (GeneChip, Aginet, Aemces yCemab) con diferentes empresas líder en estecampo como proveedoras de la tecnología.
En cuanto al entorno empresarial, el graninterés de las industrias farmacéuticas por losmicroarrays reside en la posibilidad que ofrecenpara agilizar el proceso de descubrimiento defármacos, desde su contribución a la identificacióny validación de potenciales dianas terapéuticas,hasta la validación de nuevos fármacos facilitandolos ensayos de toxicidad. A este hecho se suma laposibilidad de realizar estudios a gran escala degenes en mucho menor tiempo maximizando losrecursos disponibles.
Existe actualmente una auténtica carreratecnológica entre las empresas por posicionarsecomo líderes de esta tecnología, y las empresasque en España surgen en este entorno tienden aser proveedoras de servicios o buscan nichos demercado a los que dirigirse con productos muyespecíficos como el Hepatochip, Onchochip oLipochip entre otros.
En cuanto al almacenamiento y procesado deinformación por medio de herramientasbioinformáticas, todavía no se ha superado estecuello de botella, que por otro lado es el campoque muestra mayor producción de I+D a nivelmundial. Iniciativas nacionales ya en marchacomo el Instituto Nacional de Bioinformática(INB), deben contribuir a generar y aplicarsoluciones bioinformáticas de proyectos deinvestigación con un enfoque genómico yproteómico.
Por último, es preciso que se haga un esfuerzoglobal para propiciar la puesta en marcha deproyectos multidisciplinares, que no consistanmeramente en la adquisición de tecnologías demicroarrays a gran escala, sino en proyectosenfocados hacia intereses estratégicos para laindustria y la comunidad científica.
59
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
11. Conclusiones
• ADNc: ADN complementario que ha sidosintetizado a partir de un ARN-mensajero.
• Análisis de expresión génica: identificaciónde los genes que se expresan de maneradiferente en la célula y cuantificación de losniveles de expresión de aquellos genes deespecial relevancia en funciones celulares comometabolismo, transporte o desarrollo entreotros. Los análisis de expresión permitenestablecer relaciones entre los perfiles genéticosde pacientes y respuestas a fármacos o agentestóxicos que actúan, alterando la función celular.
• Aptámero: moléculas de ADN o ARN capaces dereconocer y unirse a una molécula específica(proteína u otro ligando).
• ARN de interferencia: tecnología que se basaen el empleo de moléculas cortas de ARN decadena sencilla o doble para bloquear laexpresión de genes específicos.
• ARN mensajero: molécula de ARN queproviene de la transcripción de un gen quecodifica una proteína, después de experimentarun proceso de corte y empalme. La informacióncodificada en la molécula de ARNm se traduce aun producto génico en los ribosomas.
• bDNA (branched DNA o ADN ramificado): elADN ramificado contiene múltiples cadenasramificadas a manera de árbol y cada una deestas ramas es un sitio de hibridización con unasonda marcada con una enzima, que reaccionacon un sustrato que permite la demostracióncolorimétrica o quimioluminiscente.
• Carbohidrato: término general utilizado paradenominar a los azúcares y compuestosrelacionados que contienen carbono, hidrógeno yoxígeno, habitualmente con la fórmula empírica(CH20)n.
• Expresión génica: fenómeno que incluye latranscripción de un gen en ARN mensajero y suposterior traducción a proteína.
• Farmacogenética: estudio de la respuesta a undeterminado fármaco como consecuencia de laherencia genética del paciente.
• Farmacogenómica: estudio de la importanciaque presentan las variaciones genéticas en laeficacia y toxicidad de los fármacos.
• Fotolitografía: técnica de fabricación de unmicroarray de ADN que se basa en la unión denucleótidos protegidos por un agente químicofotodegradable sobre un soporte de vidrio queposee determinados grupos reactivos.
• Genómica funcional: disciplina que estudia larelación existente entre un gen y su función, demanera que permita comprender elfuncionamiento de los sistemas biológicos.
• Glicosilación: proceso químico por el que seañaden cadenas de azúcares a una proteína.
• Hibridación: proceso por el cual dos hebrassencillas complementarias de polinucleótidos seasocian para formar una doble hélice.
• Microarray: conjunto de moléculas de ADN,proteínas, hidratos de carbono, muestras detejidos o células, inmovilizadas sobre unasuperficie sólida que nos permite el estudio deniveles de expresión génica a nivel genómica,función, modificaciones post-traduccionales deproteínas o de los niveles de expresión génica invivo, respectivamente.
• Oligosacáridos: grupo de hidratos de carbonode cadena corta (de 2 a 8 unidades de Carbono).
60
Glosario
• PCR (“polymerase chain reaction” o “reacción encadena de la polimerasa”): sistema deamplificación genética que permite obtenermillones de copias de un determinado fragmentode ADN o ARN mensajero, incluso a partir demuestras muy reducidas.
• PNA (“Peptide Nucleic Acid” o “Ácido NucléicoPeptídico”): análogo artificial del ADN en el queel esqueleto no es azúcar y fosfato, sinoentidades similares a péptidos o proteínas.
• Proteoma: conjunto de proteínas que seexpresan en un momento concreto en undeterminado tejido u organismo.
• Screening: término inglés derivado de lapalabra “screen” o “pantalla” cuyo significado,dentro del campo de la biología molecular o labiotecnología se refiere al seguimiento o lamonitorización de un proceso.
• Sonda: segmento de material biológico marcadoradioactivamente (o con algún grupo químicofácilmente visualizable), utilizado para detectarsecuencias de ácidos nucleicos o proteínascomplementarios mediante hibridación.
• Toxicogenómica: disciplina que estudia lasbases genéticas que permiten explicar losmecanismos de toxicidad en respuesta afármacos o compuestos tóxicos.
• Transcriptoma: conjunto de mRNAs que apartir de un genoma se pueden sintetizar en unmomento concreto en un determinado tejido.
• Validación de dianas: proceso que tiene porobjeto demostrar que una determinada dianamolecular está implicada en la aparición yprogresión de una enfermedad. La validación deuna diana permite establecer una relación entrela modificación de la diana y su potencialterapéutico.
61
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
62
AnexosAnexo I: Principales aplicaciones de los microarrays
disponibles comercialmente
Advanced ArrayTechnology SA
StaphyChips™
Microarray para la detección de las secuenciasde ADN de las 5 especies más importantes deStaphylococcus, así como para la detección deresistencia a antibióticos beta-lactámicos
Rat HepatoChips
Determinación del patrón de genes expresadosen cultivos de hepatocitos incubados enpresencia de compuestos químicos ocontaminantes ambientales
Affymetrix, Inc.
Lymphochip Clasificación molecular de linfomas
GeneChip® Porcine GenomeArray
Análisis del transcriptoma completo del cerdodoméstico
GeneChip® Maize GenomeArray
Análisis del transcriptoma completo del maízZea mays
CupPrint®Análisis del perfil genético para localización deltumor primario en pacientes diagnosticados concáncer de localización primaria desconocida
Agendia
MammaPrint®Análisis del riesgo de metástasis en cáncer demama
Agilent Technologies,Inc.
Agilent G4130A
Microarray para el screening del genoma derata y estudios toxicogenómicos para ladeterminación de los efectos en el organismode una sustancia tóxica, fármaco o pesticida
BioDoor GeneTechnology Ltd.
BioDoor4000Análisis de expresión de 4.000 genes humanoscompletos
ViriChip™ Perfil de expresión de ARN y detección de virus
BiodoorHCV Diagnóstico de Hepatitis C
BioForceNanosciences, Inc.
Rice Oligo Microarray Kit60-meR
Determinación de la actividad de genes en arroz ycereales. Identificación de variedades con altatolerancia a sequía, salinidad, frío o pestes parasembrar en terrenos poco cultivables
Empresa Producto Características
PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE ÁCIDOS NUCLEICOSDISPONIBLES COMERCIALMENTE
Human 1B Oligo MicroarrayAnálisis de expresión génica en desarrollo defármacos y estudio de enfermedades
Canberra LLC IntelliGene™Análisis de Arabidopsis, cáncer humano,citoquinas humanas, disrupción endocrina, ORF,ratón y E. coli
63
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
DR. ChipBiotechnology Inc.
DR. EV™ chip Diagnóstico de enterovirus
DR. BLAD™ ChipDetección de las mutaciones del genresponsable de la Deficiencia de AdhesiónLeucocitaria Bovina
DR. Mastitis™ ChipDetección de S. agalactiae, S. aureus, S. bovis, S. uberis, S. dysgalactiae, y E. coli
DR. Food Pathogen ChipDetección de Salmonella spp., E. coli, yStaphylococcus aureus
DR. HBV™ ChipDetección de hepatitis B virus en suero e identificagenotipos de HBV A, B, C, D, E, F y dos variantesresistentes a amivudina: YIDD y YVDD
DR. RV IVD Kit Detección de infección por coronavirus (SARS)
DR. Milk Kit18
Detección de siete agentes causantes demastitis Streptococcus spp., S. agalactiae, S. bovis, S. ysgalactiae, S. uberis, Escherichiacoli, and S. aureus
DR. EV IVD Kit
Detecta infección por enterovirus sin reactividadcruzada entre adenovirus, herpes simplex virustipo I y tipo II, citomegalovirus humanoDetecta género enterovirus y dos serotipos:enterovirus 71 y coxsackie A16
DR. Food Kit
Detecta nueve de los patógenos más comunesen alimentos: Staphylococcus aureus,Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Bacilluscereus, Clostridium perfringens, Listeria
EcoArray, L.L.C. BassChip®
Análisis de la expresión de genes deimportancia toxicológica
Fathead MinnowChip®
Eppendorf AG
DualChip™ human generalAnálisis de expresión génica diferencial enhumanos
DualChip™ human aging Análisis de expresión génica diferencial engenes humanos relacionados con el estrés y elenvejecimiento
DualChip™ rat GPCRAnálisis de expresión génica diferencial de losgenes GPCR de rata
DualChip™ hepatomicroarray series
Patrones de expresión génica de genesimportantes toxicológicos en células de hígadode rata
Eurogentec GEArray®Análisis de expresión de genes involucrados enrutas de señalización
Genomic Health Oncotype DX™Análisis de probabilidad de recurrencia decáncer de mama tras tratamiento contamoxifeno
Empresa Producto Características
64
GeneMasterLifesciences Co. Ltd.
GeneMaster MegiC” Diagnóstico de meningitis
GeneScan Europe AG
GMOChipDetección de organismos modificadosgenéticamente en alimentos
NUTRI®Chip Presencia de bacterias patogénicas en alimentos
Greiner Bio-OneGmbH/LambdaGmbH
ParoCheck™ IIdentificación y detección cualitativa de ADN depatógenos periodontales
CarnoCheck® Identificación y detección cualitativa de 8especies animales en alimentos y piensos
PapilloCheck® Tipaje de 17 papilomavirus humanos (HPV)involucrados en cáncer cervical
ParoCheck™ IDetección cualitativa e identificación de ADN depatógenos periodontales
PapilloCheck®Tipaje de 17 tipos de papilomavirus humanosinvolucrados en cáncer cervical
CarnoCheck® Food and feedDNA-C
Identificación y detección cualitativa de 8especies animales en alimentos y piensos
Icoria, Inc.Magnaporthe griseamicroarray
Detección del patógeno del arroz Magnaporthegrisea
IntegriDermDermArray™ GeneFilters®
Análisis de expresión de genes involucrados enenfermedades epiteliales y dermatológicas
PharmArray®
Ipsogen, LuminyBiotech Entreprises
MLL FusionchipDetección de reordenamientos de MLL en leucemiaaguda y la determinación del gen asociado
ProfileChip Biochip para el estudio de cáncer
Iris BioTechnologies,Inc.
Genetic ProfilingMicroarray™
BioPharma™ GPM System
Detecta deleciones y amplificaciones delnúmero de copias y mutaciones puntuales
Descubrimiento y desarrollo de fármacos
Lácer LipoChip®Detección de mutaciones del receptor LDLasociadas a Hipercolesterolemia Familiar
Memorec BiotecGmbH
PIQOR™ Immuno/Onco,human and mouse
Análisis de expresión de 1.076 genes relacionadoscon respuesta inmune, matriz extracelular, muertecelular, y transducción de señales
PIQOR™ Cytokines &Receptors, human and mouse
Análisis de expresión de 288/274 genes decitoquinas y receptores
PIQOR™ Cell death, humanand mouse
Análisis de expresión de 500/509 genesinvolucrados en muerte celular
PIQOR™ Kinase, human andmouse
Análisis de expresión de 498/481 genes dekinasas
Empresa Producto Características
PIQOR™ Toxicology, humanand rat
Análisis de expresión de 1.252/1.107 genesinvolucrados en citotoxicidad
65
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Empresa Producto Características
Mergen Ltd. ExpressChip™
Perfiles de expresión de diferentes categoríasde genes: apoptosis, ATPasa, GTPasa o ATP,proteínas de unión a GTP, canales,citoesqueleto, asociados a enfermedades,transducción de señales, factores detranscripción, supresores de tumores
NEN Life ScienceProducts Inc.
Operon GmbH
MICROMAX™ HumanOncogenes and TumorSuppressor Genes Array
Análisis de la expresión de oncogenes y genessupresores de tumores
MICROMAX™ Human Kinase& Phosphatase Array
Análisis de la expresión de genes de quinasas yfosfatasas
MICROMAX™ Humantranscription factor array
Análisis de expresión de genes de factores detranscripción
MICROMAX ™ Human IonChannel, Transporter &Receptor Array
Análisis de expresión de genes de canales deiones, transportadores y receptores
OpArray® Human collagenArray
Análisis de expresión de genes de colágeno
OpArray® Human ApoptosisArray
Análisis de expresión de genes involucrados enapoptosis
OpArray® Human Stress yAging Array
Análisis de expresión de genes involucrados enestrés y envejecimiento
OpArray® Yeast collage Array Análisis de expresión de genes de levadura
SensiChip Human Kinase Análisis de expresión de genes de quinasas
OrigeneTechnologies, Inc.
Smart set 1Análisis de expresión de genes receptoresnucleares de hormonas y correguladores
Smart set 2Análisis de expresión de genes factores detranscripción Homeobox/bZIP/bHLH
Smart set 3Análisis de expresión de genes factores detranscripción inducibles/específicos de tejido
Smart set 5Análisis de expresión de genes proteínas G yreceptores acoplados a proteína G
Smart set 7Análisis de expresión de genes de proteínas detransportadores
Smart set 8 Análisis de expresión de genes de proteinasas
Smart set 9 Análisis de expresión de genes de citoquinas,quimioquinas y receptores
Smart set 10Análisis de expresión de genes de moléculas deadhesión
Smart set 4Análisis de expresión de genes tirosinquinasas yfosfatasas
Smart set 6 Análisis de expresión de genes de canales de iones
66
Empresa Producto Características
PamGeneInternational B.V.
PamChip® Genotipado, perfiles de expresión y proteómica
PicoRapidTechnologie GmbH
Qiagen N.V.
PicoArrays™ RheumatismRheumatoid Arthritis andInflammation
Estudio de las bases patogénicas deenfermedades inflamatorias
PicoArrays™ ApoptosisAnálisis de la expresión de los principales genesinvolucrados en muerte celular, diferenciación yproliferación celular
SensiChip Human KinaseDNA Array Bar
Análisis de la expresión génica de todas lasquinasas y fosfatasas conocidas
AmpliChip CYP450Identificación de polimorfismos en dos genes,CYP2D6 y CYP2C19 implicados en elmetabolismo de medicamentos
ImmunoChip RZPD1.2Human cDNA microarray
Análisis de la expresión génica de 1.137 genesinvolucrados en procesos inmunológicos
Oncochip RZPD1Análisis de la expresión génica de 1.544 genesde importancia en procesos cancerígenos
sciTRACER Inflammation 170Estudio de la expresión diferencial de genesrelacionados con enfermedades inflamatorias
sciTRACER CardioVascular350
Estudio de genes humanos involucrados enenfermedades cardiovasculares
Panorama™ Gene E. coliGene Arrays E. Coli
Análisis de todos los genes codificantes paraproteínas de E.coli
F. Hoffmann-La Roche Ltd.
RZPD DeutschesRessourcenzentrumfür GenomforschungGmbH
Sigma-Genosys
Spectral Genomic,Inc.
STEAG microPartsGmbH
Scienion AG
Panorama™ GeneHelicobacter pylori GeneArrays Helicobacter pylori
Análisis de todos los posibles genes codificantespara proteínas de H. pylori
Panorama™ Gene B. subtilisGene Arrays B. Subtilis
Análisis de todos los genes codificantes paraproteínas de B. subtilis
Panorama™ Gene HumanCytokine Gene Arrays
—
Human Cancer OligoArray™
Genes involucrados en apoptosis, angiogénesis,ciclo celular, metástasis, oncogenes,transducción de la señal, factores detranscripción y supresores de tumores
Lilliput® Chip Empleados en microbiología clínica para laautomatización de los test de susceptibilidad aantibióticos e identificación de bacterias
Panorama™ Gene Human Apoptosis Gene Arrays
Amplicones de las regiones codificantes paraproteínas de genes involucrados en procesosapoptóticos
Spectral Chip™ 2600 DNAArray
Hibridación genómica comparativa con aplicacióna citogenética e investigación del cáncer
67
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Empresa Producto Características
Stratagene
GeneConnection™ DiscoveryMicroarray
Genes de 29 tejidos humanos
GeneConnection™ ControlMicroarray
Genes Housekeeping y de control exógeno
Takara Bio Inc.
IntelliGene™Functional DNA Chip HumanBrain ver 1
human ChoiceGEArray®
mouse GEArray®
mouse ChoiceGEArray®
Contiene 1.700 genes (fragmentos de ADNc)con cambios específicos en la expresión en elcerebelo, hipocampo y amígdala
Functional DNA Chip RatToxicology Ver.1.0
Análisis de la expresión de genes involucradosen el metabolismo de fármacos
9801A ICAN DNAFragmentos de unos 1.800 genes humanos(incluyendo 356 citoquinas )
X001 IntelliGene CyanoCHIP Ver. 2.0
Fragmentos de ORF de especies deSynechocystis PCC6803
IntelliGene Cyano CHIP Ver.2.0
Fragmentos de ORF (Open Reading Frame) dela bacteria Synechocystis
VirginiaCommonwealthCenter
Brain Tumour Biochip OligoDNA microarrays
Análisis de expresión génica de tumorescerebrales
Vysis, Inc.GenoSensor™ MicroarraySystem
Detección del número de copias de genes.Asesoramiento sobre las anormalidadescromosómicas, de genes individuales encromosomas y secuencias específicas en los genes
Xeotron Corp.
XeoExp Human Cancer chipAnálisis de expresión de genes humanos deimportancia en cáncer
XeoEX SARS chipAnálisis de los genes de coronavirus para ladetección de SARS
Xenopus XeochipAnálisis de genes de Xenopus para estudios dedesarrollo neuronal
Superarray, Inc.
human GEArray®
Fragmentos de ADNc de genes involucrados enuna determinada ruta de transducción deseñales
68
PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE PROTEÍNASCOMERCIALIZADOS
Empresa Producto Aplicación
Advanced GeneTechnology, Corp.
HerboChip® Búsqueda de compuestos activos en plantas.
HerboLink®(AGTChip)
Axcell Biosciences
TranSignal™ WW domainarrays
Determinación de interacción entreproteínas
TranSignal™ PDZ domainarrays
Determinación de la función de proteínasTranSignal™ SH3 domainarrays
Azign Bioscience A/SDesignarray™ Análisis de enfermedades concretas
Specifictargetarray™ Análisis de dianas terapéuticas
BD Biosciences -Clontech
Ab Microarrays Análisis completo de perfiles de expresiónde proteínas
BioForce Nanosciences,Inc.
NanoArray™
Ciphergen
Preactivated ProteinChip®Arrays
Hydrophobic ProteinChip®Arrays
Hydrophilic ProteinChip®Arrays
Cation ExchangeProteinChip® Arrays
Immobilized Metal affinityProteinChip® Arrays
Chromatographic surfaceProteinChip® Arrays
Determinación de la interacción entreproteínas y distintos ligandos.
Echelon Biosciences Inc Microarray PIP Array™Determinación de la selectividad ysensibilidad relativa fosfoinosítidos
GeneMaster LifesciencesCo., Ltd.
GeneMaster MegiC™ Diagnóstico de meningitis
GeneMaster NICE-Tha™ Diagnóstico de alfa-talasemia
GeneMaster HLA TypingChip™
Búsqueda de compatibilidad en transplantede órganos
69
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Empresa Producto Aplicación
Hypromatrix, Inc.
AntibodyArray™ SignalTransduction Antibody
400 anticuerpos contra proteínas deseñalización bien caracterizadas
Apoptosis AntibodyArray150 anticuerpos contra proteínas queregulan la apoptosis
CellCycle AntibodyArray60 anticuerpos contra proteínas involucradasen ciclo celular
Pepscan Systems Pep-Chip™ KinaseBúsqueda de sustratos para kinasas ybúsqueda de la especificidad de inhibidoresde kinasas
Phylos, Inc. TRINECTIN™ Proteome ChipDetección de proteínas en tejidosexpresadas en respuesta a fármacos o auna enfermedad
Pierce BiotechnologyInc.
Discover Light™Proteome Arrays
SearchLight™ ProteomeArrays
SearchLight™ CytokineArrays
SearchLight™ ChemokineArrays
SearchLight™ HumanPhosphorylated Kinase Array
SearchLight™ HumanAngiogenisis Array2
Análisis de proteínas, lisados celulares oanticuerpos en formatos de baja densidad
ProcogniaGen p53 y principalesvariantes SNP
Análisis de la función del gen p53
RayBiotech, Inc.
RayBio™ humanangiogenesis antibodyarrays
RayBio™ humanatherosclerosis antibodyarrays
Arrays de anticuerpos de citoquinas parahumanos, ratas y ratones
RayBio™ humaninflammation antibodyarrays
Schleicher & SchuellBioscience
ProVision™ Human CytokineArray
Determinación simultánea de la presenciade 16 citoquinas diferentes
Sigma-GenosysPanorama™ Ab Microarray -Cell Signaling Kit
Análisis de 224 anticuerpos de proteínasimplicadas en señalización celular
InvitrogenProtoarray™ Human ProteinMicroarray
Screening de 1.800 proteínas de diferentesfamilias génicas como quinasas, proteínasasociadas a membrana, proteínas deseñalización celular y proteínas implicadasen metabolismo
70
SomaLogic Inc. Aptamer ArraysDeterminación simultánea de la concentraciónde las proteínas correspondientes a losfotoaptámeros empleados
VBC-GenomicsBioscience ResearchGmbH
ISAC® Análisis de alergenos
Empresa Producto Aplicación
PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE CARBOHIDRATOSDISPONIBLES COMERCIALMENTE
Producto Empresa Caracteristicas
Glycominds Ltd. GlycoChip™
Microarray de alto rendimiento decarbohidratos complejos para el análisis delas interacciones proteína-glicano.Aplicaciones a genómica funcional,desarrollo de fármacos, prebióticos, ensayosenzimáticos, screening de anticuerpos einfecciones bacterianas
PicoRapid TechnologieGmbH
PicoArrays™ GlycoProfilerMicroarray para el estudio de los genes quecontrolan la glicosilación de lípidos yproteínas
PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE CÉLULAS DISPONIBLESCOMERCIALMENTE
Producto Empresa Caracteristicas
Biolog, Inc. Phenotype MicroArrays
Identificación y validación de cabezas deserie y dianas respectivamente, biologíafuncional y toxicogenómica. Disponiblespara células bacterianas y fúngicas
Cellomics, Inc. CellChip™ Análisis múltiple de péptidos y proteínas
Zeptosens AG ZeptoMARKTM Cell LysateArrays de densidad media/alta para análisismultiple de péptidos y proteínas
71
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Chemicon Inc. Chemicon's TMAsPerfil de expresión de proteínas endiferentes tipos de tumor
Clinomics Biosciences,Inc
HER-2neu response array, c-kit response array
Caracterización de alteraciones genéticas ypatrones de expresión
Expression Pathology,Inc
HistoChip™
Liquid Tissue™
Determinación de cambios cuantitativos enla expresión de proteínas en un grannúmero de muestras de tejido enfermo ysano.Identificación y validación de marcadoresproteicos
Imgenex Corp.Tissue Array/Histo-Array™human
Perfil de expresión de proteínas endiferentes tipos de tumor
Invitrogen Corp VastArray™Perfil de expresión de proteínas, screeningde anticuerpos, estudios de especificidad detejido y análisis de modelos de ratón
Oligene GmbH Tissue ArraysMicroarrays construidos a partir de susbancos de tejidos para estudios deexpresión y screening in situ de ARNm
Research Genetics, Inc. VastArray™ Tissue Arrays Estudios de expresión de proteínas,screening de anticuerpos, especificidad detejidos y determinación patológica
Zymed Laboratories,Inc.
MaxArray™
Screening de anticuerpos, análisis deexpresión, especificidad de tejido, análisisde fenotipo frente a genotipo, hibridación insitu de ARN o ADN (FISH o CISH™)
Zyomyx Inc. Human Cytokine BiochipDesarrollo de fármacos empleando análisisparalelo de proteínas
PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE TEJIDOS DISPONIBLESCOMERCIALMENTE
Empresa Producto Características
Ambion, IncLandMark™ TissueMicroArrays
Análisis del perfil de expresión diferencial dedianas específicas
Ardais Corp. Ardais Tissue Arrays (ATAs) Validación de dianas de alto rendimiento
BD Biosciences -Clontech
BD Clontech™ Cancer CellLine Profiling Array
Perfil de expresión génica de 26 líneascelulares representadas en 11 tejidos
Tabla 10. Principales aplicaciones de los microarrays disponibles comercialmente.Fuente BioChipNet (http://www.biochipnet.com)
72
Anexo II. Empresas españolas que operan en el área de microarrays
Área de aplicación Salud humana
MisiónDesarrollo de tecnologías innovadoras para el progreso de la investigaciónpost-genómica y la producción industrial eficiente de nuevas biomóleculasútiles para la sociedad
Servicios relacionadoscon microarrays
• Lectura y procesamiento de ADN arrays• Asesoramiento y gestión de proyectos de I+D en biomedicina (estudios de
expresión semi-cuantitativa empleando tecnologías de DNA arrays)
I+D
• Desarrollo de vectores para genómica funcional en un amplio rango deorganismos
• Desarrollo de herramientas para mejorar la eficiencia en la expresión ypurificación de proteínas
• Desarrollo de herramientas para diagnóstico molecular
Acuerdos ycolaboracionescientíficas
Universidad de Sevilla, Université Clermont-Ferrand, Universidad MiguelHernández, Universidad Pablo de Olavide, Centro de InvestigacionesBiológicas (CSIC), Instituto de Biomedicina “López Neyra” (CSIC)
ContactoDirección: Avenida Américo Vespucio nº 5, Bloque E - Planta 1ª Módulo 12,Isla de la Cartuja, 41092, SevillaWeb: http://www.biomedal.es/espanol/index.htm
Biomedal, S.L.
Área de aplicación Salud humana
MisiónCompañía biofarmacéutica enfocada al desarrollo de productos y serviciosque permitan avanzar en la investigación, el diagnóstico y tratamiento delcáncer
Productos relacionadoscon microarrays
Arrays de tejidos:• Human Hepatic Colon-Carcinoma Metastasis Tissue Array • Organ-Specific Metastasis Melanoma Tissue Array • Multi-Organ Animal Tissue-Arrays• Arrays de tejido personalizadosArrays de células:• Array específico de células hepáticas (humano, rata, ratón)• Array de líneas celulares de melanoma humanoArrays de células personalizados
Servicios relacionadoscon microarrays
Genómica funcional:• Análisis de la expresión génica• Diseño de microarrays de ADN personalizados• Construcción de librerías de ADNc• Análisis de sistemas de expresión modificados
ContactoDirección: Parque Tecnológico de Bizkaia, Edificio 801, 1ª plantaWeb: http://www.pharmakine.com
Dominion Pharmakine, S.L.
73
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Área de aplicación Salud humana
MisiónEmpresa dedicada a la investigación y desarrollo en biomedicina y aldiagnóstico molecular de enfermedades humanas
Servicios relacionadoscon microarrays
Expresión génica mediante microarrays de ADN
I+D Trazado de marcadores de susceptibilidad genética en la población española.
Acuerdos ycolaboracionescientíficas
Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas de Madrid (CNIO), Centro deInvestigaciones Biológicas de Madrid (CIB/CSIC), Hospital Clínico San Carlos,Hospital Doce de Octubre (Madrid), Hospital Virgen del Rocío y Valme(Sevilla) Genetix (UK), Universidad de Utrech (Holanda), Universidad TorVergata (Roma)
ContactoDirección: Avda. Averroes nº8 Ed. Acrópolis, Mod. 110-111, SevillaWeb: http://www.neocodex.es
Neocodex, S.L.
Área de aplicación Salud humana, Agroalimentación
MisiónConstrucción de una plataforma tecnológica versátil que nos permitaidentificar de forma muy procesiva las relaciones entre los genes y susfunciones
Productos relacionadoscon microarrays
Tethys: sistema de alto rendimiento para diseñar un conjunto óptimo deoligonucleótidos con el objetivo de construir un chip de DNA para un ciertoorganismo
Servicios relacionadoscon microarrays
• Análisis de la expresión génica mediantes chips de ADN:Toxicogenómica, Cardiovascular, Enfermedades Neurodegenerativas,Inflamación, Enfermedades Humanas, Genes de Cáncer, Variantes de Spliceen tumores• Genotipaje: chips de ADN humano SNPs-INDELs
I+D Bioinformática
ContactoDirección: C/Josep Samitier 1-5, 08028 BarcelonaWeb: http://www.oryzon.com
Oryzon Genomics, S. A.
74
Área de aplicación Salud humana
MisiónIdentificación de marcadores moleculares y agentes terapéuticos para eldiagnóstico temprano y tratamiento de enfermedades hepáticas
Productos relacionadoscon microarrays
Hepatochip: chip de ADN que permite conocer la presencia deesteatohepatitis no alcohólica (NASH) a partir de la coexpresión de 85 genes
I+DDiagnóstico temprano de esteatosis hepática (EH) y esteatohepatitis noalcohólica (NASH)
Acuerdos ycolaboracionescientíficas
Universidad de Navarrra, Centro de Estudios e Investigaciones Técnicas deGuipúzcoa, Hospital Clínico de Barcelona, Hospital Gregorio Marañón,Hospital Universitario Príncipe de Asturias, Hospital Italiano de Buenos Aires,Noray Bioinformatics, Progenika, Proteómica
ContactoDirección: Parque Tecnológico de Bizkaia, Edificio 801, planta 2ª, 48160 DerioWeb: http://www.owlgenomics.com
Owl Genomics, S.L.
Área de aplicación Salud humana
MisiónIdentificación y validación de genes y proteínas implicadas en procesospatológicos, y su empleo en el desarrollo de nuevos fármacos y métodos dediagnóstico
Productos relacionadoscon microarrays
Affymetrix genechip® probe arrays Microarrays de Genotipado:• Human Familiar Hypercholesterolemia DNA Array (Lipochip,
comercializado)• Human Blood genotyping DNA Array (Bloodchip)• Inflammatory Bowel Disease DNA Array (IBDchip)Arrays de análisis de la expresión génica:• Human Blood Neoplasias Classification Array (hematochip)• Rat Genome 5K Microarray• Pseudomonas putida Genome Array• Pseudomonas aeruginosa Genome Array• Medplant Small Cell Lung Cancer Chemotherapy Resistance microarray
(en fase de validación clínica)
I+DIdentificación y validación de genes y proteínas relacionadas conenfermedades psiquiátricas, neurológicas y cáncer
Acuerdos ycolaboraciones científicas
Owl Genomics
ContactoDirección: Parque Tecnológico de Zamudio, Edificio 801 -A- 48160 DerioWeb: http://www.progenika.com
Progenika Biopharma, S.A.
75
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Área de aplicación Salud humana y agroalimentación
Misión
En el área de la Biomedicina, crear y proveer a la sociedad de métodos dediagnóstico que mejoren la salud y la calidad de vida. En el área de laAgroalimentación, satisfacer aquellas necesidades analíticas de las empresasdel sector que únicamente pueden cubrirse mediante el análisis de ADN delos alimentos
Productos relacionadoscon microarrays
Aplicaciones en el desarrollo de chips de ADN
I+DPredicción de Riesgo: Diagnóstico MolecularMedicina personalizada: Farmacogenómica
ContactoDirección: Parque Tecnológico de Valencia, Avda. Benjamín Franklin, 12,46980 Paterna (Valencia)Web: http://www.sistemasgenomicos.com
Sistemas Genómicos, S.L.
76
Anexo III. Empresas españolas que desarrollan productos de bioinformática aplicados a microarrays
Área de aplicación Salud humana
Misión Bioinformática
Servicios relacionadoscon identificación yvalidación de dianas
Consultoría, formación y desarrollo de software aplicado a los microarrays de ADN
I+DBioinformática aplicada a microarrays de ADNSistemas de extracción de información
Acuerdos ycolaboracionescientíficas
CNIO, Genetrix
ContactoDirección: Centro Empresarial Euronova, Ronda de Poniente, 4 2ª planta,Unidad C-D, 28760 Tres Cantos, MadridWeb: http://www.almabioinfo.com
Bioalma, S.L.
Área de aplicación Salud humana
MisiónDesarrollo de plataformas bioinformáticas para el análisis de secuencias, dela diversidad genética y de datos génomicos en general, con el objetivo desimplificar y acelerar la investigación biomédica.
Servicios relacionadoscon identificación yvalidación de dianas
EbioSNP: plataforma para la representación y análisis de la diversidadgenéticaServicio de análisis experto en los siguientes campos: asociación de factoresgenéticos y rasgos fenotípicos, búsqueda de dianas farmacológicas, análisisepidemiológicos y filogenéticos
I+D Diseño de plataformas bioinformáticas
Acuerdos ycolaboracionescientíficas
Noray Bioinformatics
ContactoDirección: Edifici M - Campus de la UAB, Vivero de Empresas deBiotecnologia y Biomedicina (VE3B), 08193, Bellaterra, BarcelonaWeb: http://www.ebiointel.com
Ebiointel, S.L.
77
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Área de aplicación Salud humana
MisiónProporcionar soluciones tecnológicas que faciliten la adquisición, manejo,procesamiento y análisis de grandes volúmenes de datos en la era post-genómica
Servicios relacionadoscon identificación yvalidación de dianas
ArrayHub© (gestión de datos de análisis de la expresión génica)Formación en bioinformática
Acuerdos ycolaboracionescientíficas
Applied Biosystems, Spotfire
ContactoDirección: Parque Científico de Madrid, Ciudad Universitaria Cantoblanco, C/ Einstein nº 13, Pabellón C, 1ª planta. 28049 MadridWeb: http://www.integromics.com
Integromics, S.L.
Área de aplicación Salud humana
MisiónDiseño, desarrollo e implantación de software a medida, con el objeto deservir como soporte al sector de la biotecnología en tecnologías de lainformación
Servicios relacionadoscon identificación yvalidación de dianas
Genómica funcional: software para el análisis correlacional de datos clínico-patológicos con datos genómicos en estudios de cáncer (BITIATM)Servicios: consultoría bioinformática, herramientas de gestión y explotaciónde resultados de laboratorio, proyectos de outsourcing en bioinformática.
I+D Bioinformática
Acuerdos ycolaboraciones científicas
Azeretia, H.U. La Paz, Dominion Pharmakine, Advancell, Owl Genomics,Aethia Universidad de Barcelona, Biolex, Judo, PharmaDatum, eBiointel.
ContactoDirección: Parque Tecnológico, 801 A, 48160 Derio, BizkaiaWeb: http://www.noraybio.com
Noray Bioinformatics, S.L.
78
ANEXO IV. Proyectos de investigación españoles relacionadoscon tecnologías de microarrays
Centro deInvestigacionesBiológicas, CIB(CSIC)
Instituto deQuímica OrgánicaGeneral, IQOG(CSIC)
PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN ESPAÑOLES RELACIONADOS CON TECNOLOGÍASDE MICROARRAYS
Centros de investigación pertenecientes al CSIC
Centro
MicrobiologíaMolecular
AnálisisEstructural yQuímicaAmbiental
Departamento
Genómica funcional para laresolución de problemasmedioambientales y biotecnológicos
Diseño y construcción de micro-chipspara análisis rápido y sensible deproteínas marcadoras de tumorescerebrales
Título del proyecto
MCyT
MCyT
Financiación
2002-2005
2003-2006
Duración
Centro de Biología Molecular SeveroOchoa, CBM (UAM-CSIC)
Análisis bioinformático demicroarrays para la detección derutas determinantes de la malignidadasociada a mutaciones del receptorde andrógenos en cáncer de próstata
MCyT2001-2003
Instituto deCiencias de losMateriales deMadrid, ICMM(CSIC)
MaterialesParticulados
Inmovilización de anticuerpos yoligonucleótidos en partículasmagnéticas para el diseño desistemas de detección precoz demarcadores tumorales
MCyT2000-2003
Centro Nacionalde Biotecnología,CNB (CSIC)
Inmunología yOncología
Desarrollo de un microarray de ADNbasado en transporte einmovilización por campo eléctrico
MCyT2001
A core DNA microarray facilityserving the fudged integrated project MCyT
Desarrollo de un microarray de ADNbasado en transporte einmovilización por campo eléctrico
CICYT2001-2004
Instalación de microarrays de cDNAal servicio del proyecto integradoFUGEDAD
MCyT2002-2005
BiotecnologíaMicrobiana
Modelos de evolución de la resistenciaa los antibióticos. Proteómica ygenómica de Pseudomonas aeruginosa
MCyT2001-2004
BiologíaMolecular yCelular
Genómica funcional para laresolución de problemasmedioambientales y de salud
MCyT2002-2005
—
Análisis de la conexión entre laregulación global del metabolismo, laresistencia de los antibióticos y lavirulencia de Pseudomonas utilizandomicroarrays de ADN
CAM2005
79
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Instituto deCatálisis yPetroleoquímica,ICP (CSIC)
Centros de investigación pertenecientes al CSIC (Continuación)
Centro
Biocatálisis
Departamento
Desarrollo de una plataformatecnológica de farmacogenómicafuncional basada en DNA microarrays
Título del proyecto
MCyT
Financiación
2001-2001
Instituto deInvestigacionesBiomédicas“Alberto Sols”,IIB (UAM-CSIC)
Laboratorio deBiologíaMolecular yCelular delCáncer
Laboratorio deRegulación de laExpresión Génica
Diseño de un microchip de cDNApara la detección de resistencia a laquimioterapia en pacientes concáncer de pulmón
Estudio de los factores molecularespredictivos de respuesta altratamiento de cáncer no microcíticode pulmón (NSCLC) medianteanálisis del transcriptoma a través demicroarrays
MCyT
FIS
2001
2002-2004
Aplicación de la tecnología de losmicroarrays de cDNA para analizar laexpresión diferencial de genes entremujeres afectadas de síndrome deovario poliquístico y normales
CAM2002-2004
Estudio del perfil de expresión génicamúltiple en tumores de Ewing comobase para la búsqueda de nuevosmarcadores y dianas terapéuticas
MCyT2001-2003
Desarrollo de un microarrayespecífico para la identificación dealteraciones genéticas con valordiagnóstico y pronóstico en tumoressólidos infantiles
MCyT2003
Genética molecular del retinoblastoma:nuevas metodologías para detecciónde portadores, relacionesfenotipo/genotipo en pacientes de bajapenetrancia y clasificación molecularde los tumores con técnicas deexpresión en matrices de ADN
ComunidadAutónoma deMadrid
2005
Estudio genómico mediante arrays deoligonucleótidos de un modelo humanode resistencia insulínica: Síndrome deovario poliquístico y obesidad
CAM2003-2004
Aplicación de la tecnología de losmicroarrays de cDNA para analizar laexpresión diferencial de genes entremujeres afectadas de síndrome deovario poliquístico y normales
CAM2002-2003
Duración
Laboratorio deEndocrinologíaMolecular
Implementación y aplicación de unatécnica de “cDNA microarrays” parael estudio simultáneo de la expresiónde miles de genes
MCyT2000-2002
80
Instituto deInvestigacionesBiomédicas“Alberto Sols”,IIB (UAM-CSIC)
Centros de investigación pertenecientes al CSIC (Continuación)
Centro Departamento Título del proyecto FinanciaciónDuración
Implementación y aplicación de unatécnica de “cDNA microarrays” parael estudio simultáneo de la expresiónde miles de genes
PN2002
Instituto deMicroelectrónicade Madrid, IMM(CNM-CSIC)
Dispositivos,Sensores yBiosensores
Laboratorio deEndocrinologíaMolecular
Desarrollo de nanobiochips de ADNcon tecnología micro/nanoelectrónica MCyT2002
Integrated Opto-Nanomechanicalbiosensor for functional genomicanalysis (OPTONANOGEN)
UE2002-2005
The application of functional genomicand proteomic technologies to thestudy of development and dissease
MCyT2002-2005
Prototipo de un nanobiodispositivopara la detección de alteraciones engenes humanos (NANOBIOGEN)
MCyT2002-2003
Microsistema Biosensor Opto-nanomecánico para análisis engenómica funcional
MCyT2003-2006
Centro deInvestigación delCáncer (USAL-CSIC)
Investigaciónbásica
Análisis de alteraciones molecularesde los activadores de Ras en tumoresusando la tecnología convencional deRT-PCR y ampliada con la tecnologíade los chips microarrays
MCyT2001
Bioinformática ygenómicafuncional
Análisis estadístico y biológico pormétodos informáticos de resultadosde chips genómicos de hemopatíasmalignas
FIS2003-2005
Investigaciónaplicada
Perfil genómico y de expresióngénica en gliomas humanos. Relacióncon las característicashistopatológicas y el pronóstico
FIS2002-2005
Instituto de Biología y GenéticaMolecular, IBGM (CSIC-Universidad deValladolid)
Utilización de la técnica de arrayspara determinar perfiles de expresiónrelativa de moléculas efectoras de lalesión intestinal en la enfermedadcelíaca
ACM2004-2005
Centro deAstrobiología,CAB (CSIC-INTA)
Laboratorio deEvoluciónMolecular
Análisis genético de cuasiespeciesvirales mediante chips de DNA parala planificación de tratamientosantivirales (Proyecto VIROCHIP)
Detección de genomas minoritarios encuasiespecies. Aplicación al desarrollode un nuevo método de diagnóstico devirus patógenos basado en memoriamolecular
MCyT
CAM
2002-2005
2001-2003
81
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Centro deAstrobiología,CAB (CSIC-INTA)
Centros de investigación pertenecientes al CSIC (Continuación)
Centro
Laboratorio deEvoluciónMolecular (cont.)
Departamento
Hacia un nuevo tipo de biosensorbasado en el uso de ácidos nucleicospeptídicos (PNAs) y nanopartículasmagnéticas
Título del proyecto
CSIC
Financiación
2004-2005
Laboratorio deEcologíaMolecular
Microarrays de ADN para estudios debiodiversidad FIS2003-2005
Desarrollo de tecnologías basadas enmicroarrays para la detección debiomarcadores de interésastrobiológico y medioambiental
MCyT2004-2006
Instituto deBiomedicina deValencia, IBV(CSIC)
Unidad deGenéticaMolecular
Identificación de genes relacionadoscon el síndrome de Parkinson MCyT2002-2005
Universidad deNavarra
Lab. InvestigaciónMetabólica, Lab.Biotecnología,Dpto. Cirugía,Dpto.Endocrinología.ClínicaUniversitaria deNavarra
Estudio del patrón diferencial deexpresión génica en tejido adiposode pacientes obesos e individuos connormopeso mediante la técnica demicroarrays
Gobierno deNavarra2001-2002
Fisiología ynutrición
Susceptibilidad o resistencia aldesarrollo de obesidad inducida porla grasa de la dieta en humanos:identificación de genes de tejidoadiposo implicados mediantetecnología de microarray
Gobierno deNavarra2002-2004
Centro deInvestigaciónMédica Aplicada,Universidad deNavarra
Grupo deFarmacogenómicadel Cáncer
Farmacogenómica en cáncer de colonmetastásico mediante tecnologíamicroarray
Fundación deInvestigaciónMédica MutuaMadrileñaAutomovilista
2004-2007
Universidade da Coruña
Bioloxía Celular eMolecular
Sistema de determinación de nivelesde expresión génica por microarray ——
UniversidadComplutense deMadrid
AnatomíaPatológica
Estudio de microarrays de cDNA para laidentificación de genes de expresióndiferenciada como potencialesmarcadores de riesgo de transformaciónmaligna en células bronquiales
FIS2002
BiologíaMolecular yBioquímica I
Acción antitumoral de loscannabinoides: análisis de laexpresión génica en gliomasmediante arrays de DNA
CAM2005
Duración
Universidades
Centro Departamento Título del proyecto FinanciaciónDuración
82
Universidad deOviedo
InstitutoUniversitario deOncología
Análisis del Fracaso Primario y delrechazo usando chips de ADN eninjertos de islotes
FIS2004-2006
Universidad deSalamanca
Facultad deMedicina
Valor pronóstico de variablesbiológicas definidas mediante tissuemicroarrays (TMA) en cáncer depróstata. Influencia del tratamientohormonal sobre el perfil de expresión
FIS2002
—
Estudio, mediante microarrays, de lainhibición de la maduración de lascélulas presentadoras de antígenoscomo mecanismo de inducción detolerancia inmunológica postrasplante
Junta de Castillay León2005
Universidad deValladolid
Bioquímica,Biología Moleculary Fisiología
Analisis de la respuesta a hipoxia delas células quimiorreceptoras delcuerpo carotideo de raton mediantemicroarrays de oligonucleotidos
2003-2004
UniversitatAutònoma deBarcelona
Bioquímica yBiologíamolecular
Creación y distribución de microchipsde la levadura S. cerevisiae MCyT2002
UniversidadPolitécnica deValencia
Grupo deSistemas Radio-Fibra Óptica
Sensores biofotónicos: estudio de ladetección de ADN usandodispositivos basados en cristalesfotónicos 2D
—2003-2005
Universidad deHuelva
IngenieríaElectrónica, deSistemasInformáticos yAutomática
Extracción de conocimiento de losmicroarrays de ADN usandotecnología difusa
MEC2003
Universidad deGranada
Ciencias de lacomputación einteligenciaartificial
Extracción de conocimiento de losmicroarrays de ADN usandotecnología difusa
MCyT2003-2006
CienciasComputacionales
Procesos de regulación genéticasobre microarrays usando extracciónde conocimiento
PN2004
Universidades (Continuación)
Centro Departamento Título del proyecto FinanciaciónDuración
Universidad deCastilla laMancha
Ingenieríaeléctrica,electrónica yautomática, Áreade TecnologíaElectrónica
Biochips de ADN con controlelectrónico MCyT2003-2004
83
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Universidad deSevilla
Grupo deExpresión Génicaen Eucariontes
Nuevas técnicas de genómicafuncional: análisis mediante DNA-arrays de potenciales genes blancode los immunosupresores en célulaslinfoides y granulocíticas
FIS2003-2005
Grupo deTecnologíaElectrónica
Sistema de producción masiva debiochips matriciales (microarrays)ultradensos
MCyT2001-2004
Universidad deLas Palmas deGran Canaria
Ciencias Clínicas
Identificación de perfiles deexpresión génicahormonodependientes: aplicación debiochips al estudio de losmecanismos moleculares de lahormona de crecimiento humana
Pharmacia Spain S.A.2002-2003
Universidad deSantiago deCompostela
Microbiología yParasitología
Detección de genes de virulencia deEscherichia coli patógenos para sereshumanos y animales por nuevastecnologías de biología molecular: PCRclásica, PCR cuantitativa en tiemporeal y chips de DNA/RNA microarrays
Plan Gallego deInvestigación yDesarrolloTecnológico(2002-2005)
2002
Instituto deMedicina Legal
Desenvolvemento dun método dedetección de mutacións en xenomamitocondrial mediante arrays deoligonucleótidos e análises defluorescencia
Xunta de Galicia2002-2005
Análisis de bajo número de copiasADN en problemas forenses usandopolimorfismos nucleotídos simples ymiocroarrays de ADN
PN2003-2005
Universidad deBarcelona
GenéticaMicroarrays y análisis computacionalde genes del desarrollo y laregeneración en Drosophila
MCyT2002-2004
División deCienciasExperimentales
Funcion de las proteinas asociadas alnucleoide h-ns y hha en la regulacionde la expresion genica global ensalmonella. Estudio por dna array
DGI2001-2007
Universidades (Continuación)
Centro Departamento Título del proyecto FinanciaciónDuración
Desarrollo de “Microarrays” de ADNpara diagnóstico de paternidadmediante el análisis de SNPs
PN2001-2003
84
Hospital Ramóny Cajal
Red temática deinvestigacióncooperativa“Estudio genético,metabólico,clínico,terapéutico yepidemiológico delas hiperlipemiashereditariasgenéticas enEspaña”
Patrón de expresión génica mediantemicroarrays en las hiperlipemiasgenéticas
FIS2003-2005
Hospital Valld'Hebron(UniversitatAutònoma deBarcelona)
Grupo deInvestigación enEndocrinologíaMolecular
Identificación de marcadorestumorales del adenocarcinomaendometrial a partir de un panel de297 secuencias diferencialmenteexpresadas aisladas por hibridaciónde microarrays
FIS2002
Hormonodependencia y tumoressólidos
Identificación de marcadores tumoralesdel adenocarcinoma endometrial apartir de un panel de 297 secuenciasdiferencialmente expresadas halladaspor hibridación de microarrays
FIS2003-2005
AnatomíaPatológica
Perfiles de expresióninmunohistoquímica y de amplificacióngenética en cáncer de endometrioestudiados mediante matrices detejidos (tissue microarrays)
FIS2003-2005
HospitalUniversitario LaPaz (UAM)
HospitalUniversitario deLa Princesa (UAM)
HospitalMaterno-Infantilde Las Palmas deGran Canaria
OncologíaPediátrica
Identificación de marcadoresmoleculares de diagnóstico ypronóstico en sarcomas de Ewingmediante el empleo de microarrays
Investigación enOncologíaPediátricaFundaciónEnriquetaVillavecchia
2004-2005
AnatomíaPatológica
Diferenciación celular en linfomas Bde célula pequeña. Análisis deexpresión con microarrays de cDNA
CAM2000-2003
Hospitales
Centro Departamento Título del proyecto FinanciaciónDuración
Hospital LasCruces - CentroVasco deInvestigación enCáncer, CVIC
Oncología Médica
Estudio farmacogenómico mediantemicroarrays y técnicas de BiologíaMolecular Clásica de resistencia aquimioterapia en pacientes con cáncercolorectal metastásico tratados enprimera línea con una combinación deoxaliplatino y una fluopirimidina
Gobierno Vasco2003-2005
Hospital Clínic BarcelonaExpresión génica del componenteinfiltrante de los gliomas: investigaciónde nuevos marcadores y dianas
AECC2004-2006
Hospital Doce deOctubre
Servicio deOncología
Análisis del valor pronóstico ypredictivo del perfil de expresióngénica tumoral, mediante arrays deoligonucleótidos, en la evolución delos pacientes con cáncer de pulmón
FIFO
85
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Centro deRegulaciónGenómica, Parcde RecercaBiomèdica deBarcelona
Laboratorio deMicroarrays
Estudio genómico funcional del genLRRN6A en la diferenciación neuronal.Optimización de metodologíasexperimentales y bioinformáticas parala aplicación de los microarrays aestudios de expresión
MCyT2004
—
Función del gen neuronal lern1.Optimización de microarrays paradetección de aneuploidías enpoblaciones celulares heterogéneas
MCyT2003
—
Acción especial de ayudas para elfomento de tecnologías microarraysde DNA para el análisis de expresióngénica
FundaciónGenoma España-Agilent
—
Instituto Canariocontra el Cáncer,ICIC
Ciencias Clínicas
Aplicación de la tecnología de biochipsal estudio de los mecanismosmoleculares de la hormona decrecimiento - Identificación de perfilesde expresión génica inducidos porhormonas
FundaciónUniversitaria deLas Palmas
2003
Tecnologia de microarrays aplicada al'anàlisi genòmic de tumors de bufeta ia la validació de marcadors tumorals
—2002-2005
Institut deBiotecnologia ide Biomedicina(IIB-UAB)
Institut de Biotecnologia i Biomedicina"Vicent Villar Palasi"
Unitat deCitogenètica
Línea de investigación: citogenèticamolecular de tumors sòlids:Hibridació Genòmica Comparada enmicroarrays de DNA.
——
Fundación para la Investigación HospitalUniversitario la Fe
Aplicación de la CGH array para ladetección de reordenamientosgenómicos responsables de retrasomental de causa desconocida
MCyT2004
Centro NacionaldeInvestigacionesOncológicas,CNIO
Programa deOncologíamolecular
Genómica funcional del ratón:biochips y modelos genéticos encáncer
MCyT2002-2005
Genómica funcional del ratón:biochips y modelos genéticos
FundaciónRamón Areces2002-2005
Diseño de una estirpe de ratón porreemplazamiento génico necesariapara la generación de mutantescondicionales: un útil de usouniversal para el desarrollo de lagenómica funcional
MCyT2001-2004
Otros centros de investigación
Centro Departamento Título del proyecto FinanciaciónDuración
86
Centro NacionaldeInvestigacionesOncológicas,CNIO
Programa dePatologíamolecular
Identificación de nuevas dianas deinactivación epigenética (metilaciónaberrante del DNA y alteraciones dela cromatina) en cáncer humanousando microarrays y otras técnicasgenómicas
FIS2002-2004
Perfil de expresión génica enlinfomas no Hodgkin a partir de unbiochip de 400 cDNA procedentes degenes relacionados con el procesotumoral
CAM2001
Diferenciación celular en linfomas Bde célula pequeña. Análisis deexpresión con microarrays de cDNA
CAM2002-2004
Patrones de expresión genética encáncer de endometrio: estudiomediante micro-arrays de cDNA
FIS2002-2004
Aproximación multidisciplinaria alcáncer de mama hereditario noasociado a mutaciones en los genesBRCAs. Desarrollo de un biochip deexpresión de cDNAs
MCyT2002-2004
Extracción de conocimiento de losmicroarrays de ADN usando métodosestadísticos
MCyT2003-2006
Estudio mediante arrays de cDNA delos genes implicados en lasensibilidad y resistencia a paclitaxelen cáncer de mama y ovario
MCyT2002-2004
Aplicación de nuevas tecnologías alestudio del linfoma de Hodgkin: tissuearrays (matrices de multitejidos),microdisección y análisis de expresióncon microarrays de cDNA
FIS2002-2004
Perfiles de expresióninmunohistoquímica y de amplificacióngenética en cáncer de endometrioestudiados mediante matrices detejidos (“tissue microarrays”)
FIS2003-2005
Diseño y fabricación de un biochip deexpresión para la predicción de larespuesta a gemtabicina en pacientescon cáncer de mama: GEMZACHIP
MCyT2004-2007
Programa deBiotecnología
Cáncer colorrectal: estudioproteómico de expresión diferencialmediante microarrays de proteínasencaminado a mejorar la detecciónprecoz y el diagnóstico molecular
CAM2005
Otros centros de investigación (Continuación)
Centro Departamento Título del proyecto FinanciaciónDuración
87
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Centro NacionaldeInvestigacionesOncológicas,CNIO
Programa deBiotecnología
Diseño y fabricación de un biochip deDNA de baja complejidad para laevaluación pronóstica del cáncer demama
MCyT2003
Desarrollo de metodologías de matricesde DNA en soportes interactivos (CD-ROM) para análisis de polimorfismos yexpresión génica (CD-DNA)
MCyT2001-2003
Genomic approaches to microarraydata analysis
EuropeanScienceFoundation
2003
Desarrollo de nuevos métodos deselección de genes y construcción depredictores para el pronóstico deparámetros clínicos usandomicroarrays de ADN
CAM2005
Marcadores genéticos del malpronóstico en leucemias mieloidesagudas y mielodisplasias: análisispor citogenética molecular y perfilesde expresión con cDNA arrays
MCyT2002-2004
Programa deGenética delCáncer Humano
Diseño y producción de biochips deADN (CGH-arrays) con coberturacompleta de los genomas humano yde ratón
CAM2005
Caracterización mediante CGH-arraysde reordenamientos genómicos decambios de dosis génica en procesosneoplásicos
FIS2005-2007
Búsqueda de genes implicados enpatogénesis deFeocromocitomas/Paragangliomas, yde marcadores asociados a cursoclínico usando 3 aproximaciones: cDNAarrays, CGH e inmunohistoquímicasobre arrays de tejido
FIS2005-2007
Caracterización molecular einmunohistoquímica mediante matricesde tejido, y búsqueda de alelos de bajapenetrancia en el cáncer colorrectal nopolipósico familiar
FIS2005-2008
Caracterización de la heterogeneidadmolecular de los linfomas T humanosmediante microarrays: implicación dela ruta de activación de NFKB
CAM2005
Otros centros de investigación (Continuación)
Centro Departamento Título del proyecto FinanciaciónDuración
Desarrollo de los modelos estadísticospara el análisis conjunto de arrays deCGH y de expresión génica para elestudio de neoplasias humanas
Mutua MadrileñaAutomovilista—
88
Genetrix, S.L.
Genómica, S.A.
Medplantgenetics, S.L.
Neocodex, S.L.
Bioalma
Análisis genético de cuasiespecies virales mediante chipsde ADN para la planificación de tratamientos antivirales PROFIT2003
Desarrollo de un microarray específico para laidentificación de alteraciones genéticas con valordiagnóstico y pronóstico en tumores sólidos infantiles
PROFIT2003
Desarrollo de sistemas de diagnóstico molecular basadosen microarrays de baja densidad PROFIT2003
Diseño de un microchip de ADNc para la detección deresistencia a la quimioterapia en pacientes con cáncer depulmón
PROFIT2003
Proyecto Iberoeka Medchip - desarrollo de sistemas dediagnóstico precoz e identificación de dianas terapéuticas,mediante tecnología ADN-chip
PROFIT2003
Desarrollo de SNPs y Biochips aplicables al diagnósticomolecular de la esterilidad humana PROFIT2003
Desarrollo e implementación de sistemas de clasificaciónde muestras para datos de microarrays de expresióngénica o de tejidos
PROFIT2003
Empresas
Centro Título del proyecto FinanciaciónDuración
Proyecto linfo-chip: desarrollo de un ADN-chip para eldiagnóstico diferencial de neoplasias hematológicas PROFIT2003
Tabla 11. Proyectos de investigación españoles relacionados con tecnologías de microarraysFuente: Elaboración propia
Acrónimos:
PN, Plan Nacional; FIS, Fondo de Investigaciones Sanitarias; MCyT, Ministerio de Ciencia y Tecnología; CAM, Comunidad de Madrid; DGESI, MEyC, Ministerio de Educación y Cultura; FRA, fundación Ramón Areces; CICYT, Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología; UAB, Universidad Autónoma de Barcelona; UE, Unión europea;PGI y DT, Plan Gallego de Investigación y Desarrollo Tecnológico; DGES, Dirección General de Enseñanza Superior; FCRG, Fundación Centro de Regulación Genómic; NIH, National Institutes of Health, USA; NIH/ NHLBI, National Institutesof Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI); CSIC, Consejo Superior de Investigaciones Científicas;Asociación Española Contra El Cáncer (AECC); Fundación para la Investigación y Formación en Oncología (FIFO).
Instituto deSalud Carlos III
Bioinformática ysalud pública
Sistemas de Identificación Rápida deAgentes Biológicos AgresivosSIRABAD
Ministerio deDefensa2003-2005
Otros centros de investigación (Continuación)
Centro Departamento Título del proyecto FinanciaciónDuración
89
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
ANEXO V. Patentes recientes en Microarrays
WO2005018796
US20050048580
US20050048554
US20050046758
US20050048648
US20050048531
WO2005016869
Microarray support for bioprobe synthesis 03/03/2005PamGene(Hertogenbosch,Países Bajos)
Nucleic-acid programmable protein arrays 03/03/2005Harvard Collage(Cambridge, MA,USA)
Method of making and using hybrid polymeric thin films forbio-microarray applications 03/03/2005Zhou J; Zhou X
Method of transcribing biomolecular patterns, method ofmanufacturing chip boards, and method of manufacturingbiochips
03/03/2005
Omron KK(Tokyo); AoyamaS; Matsushita T;Nisjikawa T;Norioka S; TsudaY; Wazawa T
Methods for genetic analysis 03/03/2005Affymetrix(Santa Clara,CA, USA)
Novel dendrimer compound, a biochip using the same anda fabricating method thereof 24/02/2005
Pohang Iron andSteel Co.;PohangUniversity ofScience andTechnologyFoundation(Pohang, Korea)
US20050042363 Method for fabrication of biochips with a macroporouspolymer substrate 24/02/2005
Chernov BK;Gemmell MA;Golovaj B;Kukhtin AV;Yershov GM
WO2005014852 Microarrays of immobilized biomolecules, productionthereof, and use thereof 17/02/2005
SusTech GmbH& Co.(Darmstadt,Germany)
KR2004094982A method for highly concentrating a target material in asample using a scanning probe microscope to manufacturea highly integrated nano-bioarray
12/11/2005SogangUniversity(Seoul, Korea)
Patentes recientes en Microarrays
Nº de Patente TítuloFecha de
PublicaciónSolicitante
Compositions & methods for reformulating biologicalmembranes for arrays 03/03/2005Fang Y; Ferrie
AM
Tabla 12: Patentes recientes en Microarrays.Fuente: Recent patent applications in microarrays. Patents. (2005). Nature Biotechnology 23:550.
90
• Angenendt, P,. et al. (2003). Next generation ofprotein microarray support materials: evaluationfor protein and antibody microarray evaluations.Journal of Chromatography A. Vol. 1009:97-104.
• Angenendt, P.; Glökerm, J. (2003). Protein andantibody microarray technology. Journal ofChromatography B. Vol. 797:229-240.
• Bachmann, J.; Pluskal, M. (2004). Advancingapplications of microarrays. Drug DiscoveryToday. Vol. 9(2):61-63.
• Bailey, S. N., et al. (2002). Applications oftransfected cells microarrays in high-throughputdrug discovery. DDT Vol. 7 (18) (Suppl.): 1-6.
• Briones, C., et al. (2004). Ordered self-assembled monolayers of peptide nucleic acidswith DNA recognition capability. Physical ReviewLetters, Vol. 93:208103 (1-4).
• Bryant, P. A., et al. (2004). Chips witheverything: DNA microarrays in infectiousdiseases. Lancet Infect. Dis. Vol. 4:100-111.
• Campàs, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochiparraying, detection and amplification strategies.Trends in analytical Chemistry. Vol. 23 (1):49-62.
• Cigudosa, J. C. (2004).The microarray revolutionin biomedical research: types of platforms, usesand perspectives in oncology. An. Sist. Sanit.Navar. 27 (1): 11-20.
• Clarke, P. A., et al. (2004). Gene expressionmicroarray technologies in the development ofnew therapeutic agents. European Journal ofCancer. Vol. 40: 2560-2591.
• Culter, P. (2003). Protein arrays: the currentstate of the art. Proteomics. Vol. 3:3-18.
• Dhanasekaran, N.; Goldsmith, Z. (2004). Themicrorevolution: applications and impacts ofmicroarray technology on molecular biology andmedicine. International Journal of MolecularMedicine. Vol. 13:483-495.
• Disney, M.; Seeberger, P. (2004). Carbohydratearrays as tools for the glycomics revolution.Drug Targets Today: Targets. Vol. 3(4):151-158.
• Doménech-Sánchez, A.; Vila, J. (2004).Fundamentos, tipos y aplicaciones de los arraysde ADN en la microbiología médica. Enferm.Infecc. Microbiol. Clin. Vol. 22 (1) :46-54.
• Espina, V., et al. (2004). Protein microarraydetection strategies: focus on direct detectiontechnologies. Journal of Immunological MethodsVol. 290:121-133.
• Feizi, T., et al. (2003). Carbohydratemicroarrays- a new set of technologies at thefrontiers of glycomics. Current Opinion inStructural Biology. Vol. 13:637-645.
• Fukui, S., et al. (2002). Oligosaccharidemicroarrays for high-throughput detection andspecificity assignments of carbohydrate-proteininteractions. Nature Biotechnology. Vol.20:1011-1017.
• Hardiman, G. (2004). Microarray platforms -comparisons and contrasts. Pharmacogenomics(2004). Vol. 5 (5):487-502.
• Hardiman, G., et al. (2002). Protein microarrays:challenges and promises. Pharmacogenomics.Vol. 3 (4):1-10.
• Howbrook, D. N., et al. (2003). Developments inmicroarray technologies. Drug Discovery Today.Vol. 8 (14):642-651.
• Irizarry, et al. (2005). Multiple-laboratorycomparison of microarray platforms. NatureMethods 2: 345-50
• Jain, K. (2004). Applications of biochips: Fromdiagnostics to personalized medicine. CurrentOpinion in Drug Discovery & Development. Vol. 7(3):285-289.
• Joost, T.; Bachmann, J. (2003). Proteinmicroarray technology. Business Briefing: FutureDrug Discovery.
• Kallioniemi, O. P. (2001). Clinical and functionaltarget validation using tissue and cellmicroarrays. Proteomics and Genomics CurrentOpinion in Chemical Biology. Vol. 6:97-101.
Referencias bibliográficas
• Larkin, et al. (2005). Independence andreproducibility across microarray platforms.Nature Methods 2: 337-44.
• López, M.; Mallorquín, P.; Vega, M. (2002).Informe de Vigilancia Tecnológica Microarrays yBiochips de ADN. Genoma España.
• Meloni, R., et al. (2004). DNA Microarrays andPharmacogenomics. Pharmacological Research.Vol. 49 (4):303-308.
• Rim, D. (2001). Amplification of tissue byconstruction of tissue microarrays. Experimentaland Molecular Pathology. Vol. 70:255-264.
• Sabatini, D. M.; Ziauddin, J. (2001). Microarraysof cells expressing defined cDNAs. Nature. Vol.411:107-110.
• Sauter, G. (2003). Tissue microarrays in drugdiscovery. Nature Reviews in Drug Discovery.December. Vol. 2:962-972.
• Seong, S.; Choi, C. (2003). Current status ofprotein chip development in terms of fabricationand application. Proteomics. Vol. 3:2176-2189.
• Sherlock, G. (2005). Of fish and chips. NatureMethods 2:329-30; .
• Snyder, M. (2005). Global analysis of proteinfunction using protein microarrays. Mechanismsof Ageing and Development. Vol. 126:171-175.
• Stoll, D., et al. (2004). Microarray technology:an increasing variety of screening tools forproteomic research. Drug Discovery Today. Vol.3 (1):24-31.
• The ABRF MARG Survey 2005: Taking the Pulseof the Microarray Field.(http://www.abrf.org/index.cfm/group.show/Microarray.30.htm).
• Wang, D., et al. (2002). Carbohydratemicroarrays for the recognition of cross-reactivemolecular markers of microbes and host cells .Nature Biotechnology. Vol. 20:1011-1017.
• Weis, B. K. (2005). Standardizing global geneexpression analysis between laboratories andacross platforms. Nature Methods 2:351-356.
• Whittaker, P. A. (2003). What is the relevance ofbioinformatics to pharmacology? Trends InPharmacological Sciences, 24 (8):434-439.
91
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Orense, 69, planta 2ª28020 MadridTeléfono: 91 449 12 50Fax: 91 571 54 89www.gen-es.org
