POSGRADO EN ~:.: BIOLÓGICAS CIENCIAS manera muy especial agradezco a mi asesor el Doctor Luis...
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·> POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS CICY Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Posgrado en Ciencias Biológicas CARACTERIZACIÓN DE UN ANTICUERPO· POLICLONAL DIRIGIDO CONTRA UNA PROTEÍNA DE MEMBRANA DEL FITOPLASMA DEL AMARILLAMIENTO LETAL Tesis que presenta NALLELY DOLORES COCOM CHAN En opción al título de MAESTRO EN CIENCIAS (Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología)
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·> ~:.:
POSGRADO EN
CIENCIAS BIOLÓGICAS
CICY Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
CARACTERIZACIÓN DE UN ANTICUERPO ·
POLICLONAL DIRIGIDO CONTRA
UNA PROTEÍNA DE MEMBRANA DEL FITOPLASMA
DEL AMARILLAMIENTO LETAL
Tesis que presenta
NALLEL Y DOLORES COCOM CHAN
En opción al título de
MAESTRO EN CIENCIAS
(Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología)
CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTfFICA DE YUCA TAN, A. C.
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
CIC
RECONOCIMIENTO
~ ( P oSGRADO EN
( ) CIENCIAS ( BIOLÓGICAS
Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado
CARACTERIZACIÓN DE UN ANTICUERPO POLICLONAL DIRIGIDO CONTRA
UNA PROTEÍNA DE MEMBRANA DEL FITOPLASMA DEL AMARILLAMIENTO LETAL
fue realizado en los laboratorios de la Unidad de Biotecnología del Centro de
Investigación Científica de Yucatán, A.C. bajo la dirección del Luis Alfonso Sáenz
Carbonell , dentro de la opción de Biotecnología de Plantas, perteneciente al Programa de
Posgrado en Ciencias Biológicas de este
Atentamente.
Dr. Felipe A. Vázquez Flota
Coordinador de Docencia
Mérida, Yucatán, México, Enero 2014
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos
Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para
desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación
Científica de Yucatán, A.C. , y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los
servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos
de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece
patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya
manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le
pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. , y en
el mismo tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o
desarrollos tecnológicos, en lo especial, estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por
la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial , en el tenor de lo
expuesto en la presente Declaración.
Firma: --=:kiÜ~d!~tY~~~--Nombre: I.B.Q Nallely Dolores Cocom Chan
Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Biotecnología de plantas del Centro de
Investigación Científica de Yucatán A.C. y forma parte del proyecto titulado
CARACTERIZACIÓN DE UN ANTICUERPO POLICLONAL DIRIGIDO CONTRA
UNA PROTEÍNA DE MEMBRANA DEL FITOPLASMA DEL AMARILLAMIENTO LETAL en
el que participe bajo la dirección del Dr. Luis Alfonso Sáenz Carbonell.
AGRADECIMIENTOS
Al CONACYT por la beca otorgada durante mi formación (Clave: 265344) Muchas gracias!
La presente tesis fue financiada parcialmente por el proyecto "Estudio de los
mecanismos de defensa de cocotero a fitoplasmas del amarillamiento letal con
técnicas Moleculares CONACYT modalidad ciencia básica (Clave: CB 129717).
"Durante el proceso de elaboración de esta tesis muchos familiares y amigos
contribuyeron con un "granito de arena" brindado en el momento oportuno las palabras de
aliento y de confianza que uno requiere, escribir todo lo vivido en esta tesis es casi
imposible por lo que de todo corazón les agradezco por el apoyo brindado".
De manera muy especial agradezco a mi asesor el Doctor Luis Alfonso Sáenz Carbonen,
por aceptarme para realizar la tesis en su laboratorio, por la confianza brindada para llevar
a cabo este trabajo , por sus comentarios y su apoyo brindado. Mil gracias!.
De igual forma de manera muy especial al Doctor Carlos M. Oropeza Salín, por todas las
facilidades otorgadas, por sus comentarios y sobre todo por la confianza para sacar
adelante este trabajo. Mil gracias!
Al Centro de Investigación Cientffica de Yucatán A.C., por todas las instalaciones
prestadas para llevar a cabo este trabajo de investigación, por darme la valiosa
oportunidad para formarme como Maestro en Ciencias.
Al Dr. Ignacio Islas Flores, muchas gracias por toda la asesoría que me brindo por sus
sugerencias, por todas las facilidades otorgadas en su laboratorio y sobre todo la
confianza brindada.
Al Dr. Celso Reyes Martfnez, muchas gracias por toda la asesoría que me brindo y por el
conocimiento transmitido en el laboratorio. Le agradezco de manera incondicional su
apoyo, el cual fue fundamental para concluir con este trabajo.
Al M. en C. lván Córdova Lara, por el apoyo técnico brindado, por el conocimiento
transmitido en el laboratorio, por sus comentarios que fueron de mucha importancia para
enriquecer este trabajo. Le agradezco sinceramente por su apoyo, el cual fue fundamental
para concluir este trabajo.
A la M. en C. Maria Narváez Cab, por el apoyo técnico brindado, mil gracias por toda la
asesoría brindada, por los comentarios que enriquecieron este trabajo, le agradezco
absolutamente su apoyo el cual fue fundamental para concluir este trabajo.
A la M. en C. Ligia Brito Argáez, por el apoyo técnico brindado, gracias por transmitirme
sus conocimientos fueron de gran importancia para concluir este trabajo.
A los miembros de mi comité tutoral, por sus comentarios y observaciones que de una u
otra forma enriquecieron y fueron de gran importancia para concluir satisfactoriamente
este trabajo. Mil gracias Dr. Luis Sáenz Carbonen, Dr. Ignacio Islas Flores, Dr. Antonio
Andrade Torres y Dr. Carlos Oropeza Salfn.
A la I.B.Q. Ana María Collf Rodríguez por el apoyo técnico y diversos aspectos del
laboratorio.
A la Dra. Goretty Caamal Chan por su amistad por sus consejos y por dudas aclaradas,
un paso más Gore, mil gracias por estar cuando apenas iniciaba en CICY y ahora
concluyendo una etapa más en mi vida profesional.
A todos los compañeros de laboratorio de cocotero con quienes interactué durante el
periodo de la maestría.
A mis padres mi mayor motivación para mi superación personal, de todo corazón gracias
infinitamente por todo su apoyo para lograr una meta un sueño más en vida profesional ,
sabiendo que siempre existirá una vida de lucha, sacrificios y esfuerzos para con mis
hermanos, les agradezco infinitamente todo lo inculcado. Son mi mayor orgullo, los amo.
A Dios, mi fortaleza en los mejores y peores momentos, y las ganas de superación , por la
salud y la de mi familia . Tú eres mi fortaleza siempre.
Sólo me resta decir que no encuentro palabras apropiadas para expresar lo que significó
para mí el apoyo de cada una de las personas mencionadas, por ello me limito a la forma
más simple de decirles mil gracias.
DEDICATORIAS
Primeramente a DIOS por ser el mejor amigo, mi fortaleza, darme todo lo que
tengo y no dejarme caer nunca.
Con todo mi amor a mis padres, Luciano Cocom Peralta y Geimy Chan Puc.
Sabiendo que siempre existirá una vida de luchas, sacrificios y esfuerzos; hoy
finalizo una etapa más en mi vida profesional, agradezco la confianza que han
depositado en mí, su apoyo al compartir conmigo logros y tropiezos, el esfuerzo
que han realizado toda su vida , gracias a dios y a ustedes que han guiado mis
pasos, he finalizado una meta un sueño mas en mi vida profesional. Con todo mi
amor de hija, esta tesis es de ustedes papas.
Nunca consíáeres e( estuáío como una oElioacíón síno como una
oyortunúfaá yara yenetrar en e( EeCCo y maravíCCoso mundó áe( saEer
[N DICE
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ... .... ........ ..... ..... .... .... .... .. ... .. ...... .. ....... .. ... .... ... ....... .. ..... .. .. ....... ... .. .... ..... . 1
CAPÍTULO 1 .•••.•.••••..........................••...•.•.••••..................................•......••••••••••••••••••••••••••• 3
ANTECEDENTES GENERALES ........................................................................................................ 3
1.1. DESCRIPCIÓN DEL COCOTERO ... ...... ...... ..... .... . .... .... .. ............. .. ..... .. ... ... ........... ... .................... ........ 3
1.1.1. IMPORTANCIA DEL COCOTERO .... .. ........... .................. .... ............... .......................... ... .................... 4
1.1 .2 . PROBLEMÁTICA DEL COCOTERO ...... .... ... ... ... ... ... ... . .. . .... ...... ... ...... ...... ....... . ..... .... ... ... .... .. .. ..... .... ... S
1.1.3. ECOTIPOS DE COCOTERO CON CIERTO GRADO DE RESISTENCIA .. ... ... .. .... .... ... ...... .... ..... ... .. ..... .. .. .... 7
1.2.1. SINTOMATOLOG[A DEL AMARILLAMIENTO LETAL (AL} .. ... .. .. .. .... ..... .... ... .. .................. ...... ...... ....... .... ?
1.2.2. AGENTE Y FORMA DE TRANSMISIÓN DEL AL ............ ........ .......... ................. .. ... ....... ... . .... ..... .. .... ... .. 9
1.2.3. AGENTE CAUSAL DE LA ENFERMEDAD DEL AL. ..... ... ........... ... .... .. .. ....... ..... . .. .. ... ...... .... ... ..... .. .. .. ... 1 0
1.2.4. CARACTERiSTICAS GENERALES DE LOS FITOPLASMAS ................. .. .... ........ ... ....... .. ... ...... ... ... ........ 1 0
1.2 .5. TRANSLOCACIÓN EN PLANTAS .. ..... ... ... ............ ................ .. ... .... .. ............. ...... .. .............. .... ........... 12
1.2.6. LA INTERACCIÓN DE LOS FITOPLASMAS CON SUS HOSPEDANTES .. .. .... ..... .. ... .... .......... ...... .. ...... .. .. . 12
1.2 .7. DIVERSIDAD Y FUNCIÓN DE LAS PROTE[NAS DE MEMBRANA DE FITOPLASMAS ............. ...... .............. 13
1.2.8. TÉCNICAS TRADICIONALES PARA EL ESTUDIO DE FITOPLASMAS . ...... .. ........ ...... .. ... .. .. .... .. ... .. .. ... ..... 17
1.2.9. IMPORTANCIA DE ANTICUERPOS ......... .. ... ...... ...... .... .... .... ......... ..... .. .. .. ... ........ ........ ... .... .. ... ......... 19
1.2.1 0. ANTICUERPOS GENERADOS CONTRA FITOPLASMA ...... ... ............. .. ... .. .. .... ....... .. ........ .. ... ..... ... .... . 20
1.3. HIPÓTESIS .. .... .... .. .. ....................... .. ..... ... . .. ..................... ....... ........ . .. .. .. ... . ... ..... ... ............ ... ...... 23
IN DICE
1.4. OBJETIVOS .................... ................................... ............................... .... ... ... .... ............................ 24
1.4.1. OBJETIVO GENERAL. .. .. .............................. ... .. .. .. ............. .............................. ...................... 24
1.4.2. OBJETIVOS ESPEC[FICOS ..... ........... .. ......................... .... .......... .... ........... .. .. .... ................... 24
1.5. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL .................. .. .. ..... .. .. .. ... .... .... ........... ..... .... .. ........... .. ....... .......... 25
1.6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .... .. .... ........ ....... .. .... ...................... .............. .. ...................... 26
CAPÍTULO 11 ....... .. ... .. ... ... ........ .. ... ...... ........... .. ....... ..... ....... ........ ........ ... ... .... .. .. .. .. ... .. .... . 35
ANÁLISIS BIOINFORMATICO DE LA SECUENCIA DE LA PROTEÍNA DE MEMBRANA
INMUNODOMINANTE (IMP) DEL FITOPLASMA DEL AMARILLAMIENTO LETAL. ..................... 35
2.1.1NTRODUCCIÓN ..... ... ........ ... .... ........................... ........................ ...... ... .................... ............. .... 35
2.2. MATERIALES Y MÉTODOS ... .. ............. .. ............. .. .... .... .. .... ...... ............. ..... ... .. .. ... .. .. ......... ....... 36
2.2.1. PORCENTAJE DE IDENTIDAD CON LAS ACCESIONES DEL GEN BANK ............... .. .. .. ....... .. .............. .. . 36
2.2.2. OBTENCIÓN DE LOS MARCOS DE LECTURA ABIERTA E IDENTIFICACIÓN DE LOS MOTIVOS
CARACTER[STICOS DE LAS PROTEÍNAS DE RESISTENCIA .... .. .................. .. ..... .. .. .. ..................................... 36
2.2.3. CLASIFICACIÓN DE LAS SECUENCIAS EN BASE A SU PORCENTAJE DE IDENTIDAD .. .... ..... .. ... ............. 36
2.3. RESULTADOS .. ..... ........ ...... .. .... ... .. ... .. ... ..... .. ... ...... .. ... ..... .. ... .... .. .... ..... ...... ... ............ ..... ....... .... 37
2.3.1. ANÁLISIS BIOINFORMATICO DE LA SECUENCIA DE LA PROTE[NA DE MEMBRANA INMUNODOMINATE
(IMP) .. ... ....... .. ...... ... . .. . ... ... .. ............................ ..... ................ .. ... . .. . .................. ..... . ...... 37
2.3.2. IDENTIFICACIÓN DE LOS MOTIVOS CARACTERÍSTICOS ............ .............. .. .. ... .. .. .......... .. .... ... .. ......... 39
2.4. DISCUSIÓN ... ... ...... ......... .............. .. ....... .. ................... ............ ............ ....... ........ ... .... .... ....... ...... 41
2.5. CONCLUSION .... ............ ...... ................................ ......... .. ... ......... .... .. .......... ........... .......... .......... 42
2.6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .. ...... ..... .... .. .. ... ........ ... ... ..... .. ..... ....... ... .. .... .... ..... .. ........ ... .. .43
iv
IN DICE
CAPÍTULO 111 ..... ...... ......... ........... .. ....................... ... .. ................ ....... .. ... .. ........ .. ... .. ........ 45
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA DETECCIÓN DE FITOPLASMA DEL AL CON UN
ANTICUERPO QUE RECONOCE A LA PROTEÍNA IMP DE DICHO FITOPLASMA ...... ... ............ .45
3 .11NTRODUCCIÓN .... ... .. .. ... ............... .... ................. ..... ...... .... .................. .. . ........... .. ...................... 45
3 .2. MATERIALES Y MÉTODOS ... ..... .. ............. .. .. .......... ... ....................... .. .... .. ..... .... ....... ... .... ......... 46
3 .2 .1. OBTENCIÓN DEL EXTRACTO PROTEICO ...... ..... .............. ................. ..... .. .. ........... ................ .. ........ 46
3.2.2. ANTICUERPOS EMPLEADOS ........... .............. ................ ..... ............ ..... ..... . .......... .. ....... ................ .46
3.2.3 . EXTRACCIÓN DE ADN PARA LA DETECCIÓN DEL FITOPLASMA DEL AL .. ........ .. .................... .. ........ .. 46
3 .2.4 . DETECCIÓN DEL FITOPLASMA DE AL .............. ................. ...... ...... ................................................. 47
3 .2 .5. MÉTODOS EVALUADOS PARA EL AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS ... .... .... .. .. .... ........ ...... .... .. ...... ... .. .... .47
3 .2 .6 . MÉTODO DE DOT-BLOT ................................... ...... .. ........................................ .. ............ ............. 49
3 .2.6 . INMUNODETECCIÓN DE LA PROTEÍNA INMUNODOMINANTE DE MEMBRANA (IMP) ....... ...... ................. 50
3.3. RESULTADOS ............. ................................................................................ , ......... .................... 51
3 .3 .1 COLECTA DE TEJIDO VEGETAL ........................... .... .... .. ................... ,. ....................... .... ...... ...... .... 51
3 .3 .2 OPTIMIZACIÓN DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS .... .. ................................................... 52
3 .3 .3 . EVALUACIÓN DE FUNCIONALIDAD DEL ANTICUERPO MEDIANTE DOT-8LOT.. .................................... 53
3 .3.4. DETECCIÓN DE FITOPLASMAS POR PCR TIEMPO REAL ............... .. .... .. ........................................... 56
3 .3 .5 . EVALUACIÓN DE FUNCIONALIDAD DEL ANTICUERPO MEDIANTE DOT-BLOT EN DIFERENTES PALMAS DE
COCOTERO (COCOS NUCIFERA L.) INFECTADAS CON AL .... ......... ..... ., .................................................. .. 59
3 .3.6 . EVALUACIÓN DEL ANTICUERPO ANTI-L Y POR WESTERN BLOT ... ...... ................... .......................... 60
3 .4 . DISCUSIÓN ... ... .... ........... .. ..... .... ....... ............. ...... ............... .... .... ... ......... ..... ... ... .. . .. ........ ...... ..... 73
3 .5. CONCLUSIÓN ..... ... .. ................................... ............ .. ..... ........... ........ .. .... ........... .......... .............. 75
ÍNDICE
3.6. BIBLIOGRAFÍA ...... ... .......... ... ........ ... ....... ... .... ....... .. .. ... ....... ....... .... ....... .... .... ... .... ...... .. .. ......... .. 76
CAPÍTULO IV .. ..... ......... .. ... .. ... ... ... ... ...... ..... .... ....... ......................... ... ... ... .... .... ...... ... .. ... . 79
4.1 . DISCUSIÓN GENERAL ............................................................................................................. 79
4.2. CONCLUSIONES GENERALES .................. ... ............... .. .. ... ........ .. .................... ...... ............. .... 81
4.3. PERSPECTIVAS ... ...... ................... ....... .... ..... .... ..... ...... ..... .... .. ...... .. .. .... .. .............................. .. .. 82
4.4. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... .. .................... 83
5. ANEXOS ...................................................................................................................... 85
5.1. OBTENCIÓN DEL ANTICUERPO GENERADO CON PROTEINA DE MEMBRANA DEL FITOPLASMAS CAUSANTE
DE LA ENFERMEDAD DEL AL .. .. .... .. ....... ...... .................... .. ........................... .. ................... ................... .. 85
vi
[N DICE
LISTADO DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figura 1.1. Morfología de la palma de cocotero A) palma de cocotero, 8) inflorescencia y
C) fruto .... .. .... ..... ......... ... ... .. .. .. .. ....... .... .. ... .. ... ....... .... .. ... .... .... ... .. .. .... ... ... .. .... ...... .... ... .... .... 3
Figura 1.2. Productos derivados de la palma de cocotero (árbol de la vida) , (Lao, 2008;
http://www.conacoco.com.mx) , modificado de CONACOCO, 2011 .... .. .... ........ .................. 5
Figura 1.3. Cronolog ía de síntomas del AL en la palma de coco. A). Caída prematura de
los frutos; 8) . Inflorescencia necrótica; C). Clorosis y senescencia de las hojas más viejas;
D) . Clorosis de las hojas jóvenes y necrosis de la espata; E). Estado avanzado, caída de
la corona de hojas quedando el tronco desnudo (Harrison y Oropeza, 2008) . ... ...... ... ... .... 8
Figura 1.4. Fitoplasma (1 ), vector-Haplaxius crudus (2) , palma enferma con AL (3) . ..... . 1 O
Figura 1.5. Micrografías electrónicas de fitoplasmas en tubos cribosos. Secciones
transversales que muestran el polimorfismo en la forma y dimensiones de fitoplasma que
infecta a las plantas (8ertacini y Duduk, 2009) . ... ..... ..... .. .. ...... .... ... ........... ...................... 11
Figura 1.6. Proteínas de membrana inmunodominantes (IDPs) de fitoplasma (a)
organización de genes que codifican para los tres tipos de IDPs. La organización de los
tipos de genes 1, 2 y 3 fueron descritos usando la secuencia de SPW8 (U155224), WX
(AF533231) y OY-W (A8124806), respectivamente . (b) Representación esquemática de
los productos putativos de translocación de tres IDPs. Las regiones transmembranales
son las coloreadas en azul ; las regiones no transmembranales están coloreadas en rosa.
La región N-terminal transmembranal de la Amp (tipo 3) es clave durante la localización
de la proteína (Kakizawa et al. , 2004) y el sitio de escisión. Abreviaturas empleadas en la
imagen: C, C terminal , N, N terminal , aa: aminoácidos. (C) Representación esquemática
de las estructuras transmembranales hipotéticas de tres tipos de IDPs. (Modificado de
Hogenhout et al. , 2008) ............. ........ ..... ........................ .......................... ....... ..... .... .... .. . 17
ÍNDICE
Figura 1.7. Estructura de un anticuerpo. lgG. (A) Los anticuerpos tipo lgG consisten de
cuatro cadenas, dos cadenas pesadas (en azul) y dos ligeras (en rojo) , unidas por
puentes disulfuro. La cadena ligera y pesada se une para formar los dominios Fab que
tiene los centros de unión al antígeno en sus extremos. Las dos cadenas pesadas forman
el dominio Fe, los dominios Fab se unen al dominio Fe mediante conexiones flexibles. (B)
representación esquemática de una molécula de lgG (Mocarulla, 2007) .... .. ...... ... .. ... ..... 19
CAPÍTULO 11
Figura 2.1. Alineamientos de las secuencias de aminoácidos de lmps aisladas de
'Candidatus fitoplasma aurantifolia y la accesión ACJ45993.1 del fitoplasma de
'Candidatus fitoplasma palmae ..... ............ .... ............ .... .. .. ........... .......... .......... ................ 40
CAPÍTULO 111
Figura 3.1. Palmas de cocotero (Cocos nucifera) imágenes tomadas en Chicxulub puerto.
Donde A: Cocos nucifera sano y B: Cocos nucifera con síntomas de AL (Fotos tomadas
de distintas localidades de Yucatán) ......... ... .. ..... ... ... ... .. ... .... .... ... ..... .. ...... ..... ...... ............ 51
Figura 3.2. Palmas de Cocotero (Cocos nucifera) de diferentes partes de la pen ínsula,
palmas con síntomas de amarillamiento letal (Fotos tomadas de distintas localidades de
Yucatán) . ... ..... .... .... .... .... ... .. .... .. .. ... .... .. .. .. .. ......... .... ... ... .. ....... .. .. ... .. .. .. ... ... ....... ..... ..... ..... 52
Figura 3.3. Comparación de perfiles proteicos, entre los distintos métodos de extracción.
Gel de poliacrilamida al 12%. Carriles del 1-6 corresponden a las variaciones de los
métodos de extracción, 1 O IJL de cada muestra fueron cargados, M: corresponde al
marcador de peso molecular ............................................. ..... ..... ... ..... ....................... ..... 53
Figura 3.4. lnmunodetección en membrana de nitrocelulosa de extractos de proteínas de
plantas e insectos infectados con fitoplasmas asociados al amarillamiento letal (AL) . (1)
Cocos nucifera Infectado, (2) Pritchardia pacifica infectada, (3) Cocothrinax readdi
viii
[N DICE
infectada, (4) Pritchardia pacifica sana, (5) Cocos nucifera, (6) Myndus crudus . ............ . 54
Figura 3.5. lnmunodetección de extractos de proteína de palmas de cocotero sanas e
infectadas con fitoplasmas, donde A1-2 y 81-2 tejido de hoja sana, y A3-4 y 83-4 tejido de
hoja infectado. 15 ¡Jg del extracto se cargaron en una determinada área de la membrana .
... ...... ... .... .............. ....................... .................................... .. .. ...... ............ ..... ... ...... ...... ..... 55
Figura 3.6. Evaluación de las tres diferentes diluciones del anticuerpo primario (Anti-L Y) y
anticuerpo secundario (Anti-rabit). Panel A: dot blot de extractos proteícos de tejidos de
cocotero infectado incubados con una dilución 1:1000 el anticuerpo primario y 1 :5000
anticuerpo secundario. Panel 8: dot blot de extractos proteicos de tejidos de cocotero
infectado incubados con una dilución 1 :5000 del anticuerpo primario y 1:10000 anticuerpo
secundario. Panel C: dot blot de extractos proteicos de tejidos de cocotero infectado
incubados con una dilución 1:10000 del anticuerpo primario y 1:15000 anticuerpo
secundario ............................ ............ ... ........................... .. .. ......... ...... .. ... ...... .. .... ....... .... .. 56
Figura 3.7. lnmunodetección en membrana de nitrocelulosa de extractos proteicos, tejido
de hoja de 5 palmas de cocotero sanas (A) y 7 palmas de cocotero infectadas con AL y
los valores de Cts representado en los recuadros (8). 50 ¡Jg de proteína . .. .. .. .... .. .. ......... 59
Figura 3.8. lnmunodetección en membrana de nitrocelulosa de extractos proteicos, tejido
de hoja de 5 palmas de cocotero sanas (A) y 7 palmas de cocotero infectadas con AL.,
valores de Cts representado en los recuadros (8) . 75 ¡Jg de proteína .. .. ........ .. ... ..... .. .... .. 60
Figura 3.9 Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE (12% a 100 volts por 1.30
horas) del extracto proteíco de hoja de cinco palmas de cocotero sanas (50 ¡Jg). Donde: M
marcador de peso molecular en kDa. Siendo P1-P5 extracto proteico de hoja de palmas
de cocotero sanas . .................................................................................. .. .... ..... ............. 61
Figura 3.10. Análisis de Western blot, de proteínas de la membrana del fitoplasma del AL.
Donde: M marcador de peso molecular en kDa. Siendo P1-P5 extracto proteico de tejido
de hoja de cinco palmas de cocotero sanas ..................... ... .............. .. ........ .. ........ .. ........ 62
Figura 3.11. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE (12% a 100 volts por 1.30
horas) del extracto proteíco de hoja de siete palmas de cocotero infectadas con AL (50
[N DICE
j.Jg) . Donde: M marcador de peso molecular en kDa. Siendo P1-P7 extracto proteico de
hoja de palmas de cocotero infectadas con AL ...... ... ........ .. ..................... .. ... .. ..... .... ... ..... 63
Figura 3.12. Análisis de Western blot, de proteínas de la membrana del fitoplasma del AL.
Donde: M marcador de peso molecular en kDa. Siendo P1-P7, extracto proteico de hoja
de siete palmas de cocotero infectadas con AL . ............... ........ ...................... ..... ..... .. .... . 64
Figura 3.13. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE (12% a 100 volts por 1.30
horas) del extracto proteíco de hoja de cinco palmas de cocotero sanas (75 j.Jg). Donde: M
marcador de peso molecular en kDa. Siendo P1-P5 extracto proteico de hoja de palmas
de cocotero sanas . ..... .. .. ....... .... .... ... .. ..... ............... ....... ..... ... ... .... ... .. .. ............................ 65
Figura 3.14. Análisis de Western blot, de proteínas de la membrana del fitoplasma del AL.
Membrana de nitrocelulosa Donde: M marcador de peso molecular en kDa. Siendo P1 -P5
extracto proteico de tejido de hoja de cinco palmas de cocotero sanas .... ................. ..... . 66
Figura 3.15. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE (12% a 100 volts por 1.30
horas) del extracto proteíco de hoja de siete palmas de cocotero infectadas con AL (75
IJg). Donde: M marcador de peso molecular en kDa. Siendo P1-P7 extracto proteico de
hoja de palmas de cocotero infectadas con AL .................. ...... .... .. ................ ...... ...... .. ... . 67
Figura 3.16. Anál isis de Western blot, de proteínas de la membrana del fitoplasma del AL.
Membrana de nitrocelulosa, Donde: M marcador de peso molecular en kDa . Siendo P1 -P7
extracto proteico de hoja de siete palmas de cocotero sintomáticas ....... .. ....................... 68
Figura 3.17. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE (12% a 100 volts por 1.30
horas) del extracto proteíco de hoja de siete palmas de cocotero infectadas con AL (1 00
j.Jg). Donde: M marcador de peso molecular en kDa. Siendo P1-P6 extracto proteico de
hoja de palmas de cocotero infectadas con AL .. .... .. .. ..... .. ............. ... ... .. .... ... ... .... ...... .. .... 69
Figura 3.18. Análisis de Western blot, de proteínas de la membrana del fitoplasma del AL
Membrana de nitrocelulosa, Donde: M marcador de peso molecular en kDa. Siendo P1 -P6
extracto proteico de hoja de 6 palmas de cocotero infectadas . ... ............. .... ... ............. ... . 70
X
IN DICE
Figura 3.19. Análisis de Western blot, de proteínas de la membrana del fitoplasma del AL.
Membrana de nitrocelulosa, Donde: M marcador de peso molecular en kDa. Comparación
de las tres cantidades de proteína A: 50 IJ9 , B: 75 1.19 y C: 100 1.19 · Siendo la de B: 75 1.19 la
cantidad optima . ..... ... ............... ..... ...... ... .... ... ...... ..... .. .... ..... ... .... ... .... ... ...... ...... ............... 71
fNDICE
LISTA DE CUADROS
Cuadro 1. Palmas susceptibles al fitoplasma Ca. Phytoplasma palmae causante del
amarillamiento letal. ... ....................... ......... ... ....... ......... .......... .. ........ .. .. .. ... .. ... .. .. 6
Cuadro 2. Reportes enfocados a la generación de anticuerpos para detección de
fitoplasmas ........ ... . ................ ...... .... ......... .. ...... ... ....... ..... ..... .. ... ................... .. . 21
Cuadro 3. Resultados de la identidad encontrada entre las secuencia deducida de
aminoácidos de la lmp del fitoplasma del AL y las secuencia del Gen Bank usando el
programa BlastX ........ . .. .... .... ... ............ .. . .. ....................... .. .......................... ..... 38
Cuadro 4. Lista de aislados de fitoplasmas del grupo 16Sr-ll (Siampour et al.,
2013) ................. . .. .. .............................................................. ······· ·· ... ............. 39
Cuadro 5. Lotes de palmas analizadas para la detección del fitoplasma causante del
amarillamiento letal. .. ... .. ..................... ... ........ ... .............. ...... ... ..... ....... ...... ....... 57
Cuadro 6. Detección de fitoplasmas de diferentes palmas de cocotero, por PCR tiempo
real y métodos inmunológicos ... .... ..... ..... .......... ..... ... ....................... ..... .. ........ .. .. 78
xii
ABREVIA TU RAS
AL
LY
AP
EMA
AA
ADN
PCR
lgG
IDPs
lmp
Amp
ldpA
sos
PAGE
TCA
N/ A
Amarillamiento letal
Lethal yellowing
Alto Pacifico
Enano Malayo Amarillo
Alto Atlántico
Acido desoxirribonucleico
Reacción en cadena de la Polimerasa
inmunoglobulina
Proteínas de membrana inmunodominates
Proteína de membrana inmunodominante
Proteína de membrana antigénica
Proteína de membrana inmunodominante tipo A
Dodecil Sulfato de Sodio
geles de poliacrilamida.
ácido tricloroacético
No amplificado
ÍNDICE
RESUMEN
RESUMEN
El amarillamiento Letal (AL) es una enfermedad del cocotero y de otras palmas, es
causado por el fitoplasma 'Candidatus Phytoplasma palmae', el insecto vector es
conocido como "Chicharrita" (Haplaxius crudus). Hasta la fecha no existe un control
efectivo del AL, además de que los fitoplasmas no se han podido cultivar in vitro, por lo
que su caracterización es limitada. Se han reportado diversos métodos para detectar
fitoplasmas, microscopía electrónica, sondas moleculares, PCR directo, PCR en su
modalidad anidado y PCR en tiempo real , sin embargo la generación de anticuerpos que
es una herramienta importante para la detección de patógenos se ha usado poco en
fitoplasmas. El uso de anticuerpos se ha reportado en algunos tipos de fitoplasmas como
'Candidatus Phytoplasma asteris', ' Candidatus Phytoplasma aurantifolia' sin embargo no
se había obtenido un anticuerpo contra el fitoplasma del AL. Por lo tanto el objetivo de
este trabajo fue caracterizar un anticuerpo policlonal (anti-L Y) dirigido contra proteína de
membrana de fitoplasma, evaluando su funcionalidad y especificidad . Para lo cual se
extrajeron proteínas y se obtuvieron perfiles proteicos de tejido de hoja de cocotero sano y
enfermo y mediante el empleo del método de western blot, el anticuerpo anti-L Y reconoció
una proteína con el tamaño esperado de 16 kDa. Estos resultados podrían indicar que el
anticuerpo es funcional y sería una herramienta importante para futuros estudios de esta
enfermedad.
ABSTRACT
ABSTRACT
Lethal yellowing (L Y) is a pandemic disease that affect coconut palm, and other palms, is
caused by phytoplasma 'Candidatus Phytoplasma palmae' the insect vector is known as
"chicharrita" (Haplaxius crudus). To date there is no effective control of the L Y, and the
phytoplasmas have to not been able to grow in vitro, so that their characterizations is
limited. Various methods have been reported for detecting phytoplasmas, electron
miscroscopy, molecular probes, direct PCR, nested PCR and real time PCR, however the
generation of antibodies which is an important tool for the detection of pathogens has been
little used phytoplasma. The use of antibodies has been reported in sorne types of
phytoplasmas as ·candidatus Phyotoplasma asteris' , ' Candidatus Phytoplasma
aurantifolia ', however a antibody against L Y phytoplasma had not yet obtained until now.
Therefore the aim of this work was to characterize a polyclonal antibody (anti-L Y) directed
against phytoplasma membrane protein, assessing their functionality and specificity.
Therefore proteins were extracted and protein profiles were obtained from different tissues
of healthy and disease coconut palms and by using the Western blot method, the anti-L Y
recognized a protein of approximately 16 kDa expected size. These results may indicate
than antibody is functional and would be an important tool for future studies of this
disease.
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
El cocotero es una planta ampliamente distribuida en las regiones tropicales alrededor del
mundo es llamada el árbol de la vida o el árbol de los mil usos, es imprescindible como
parte del paisaje, como cultivo es muy importante desde el punto de vista económico y de
subsistencia. Su importancia radica en que se pueden aprovechar cada una de sus
partes. Sin embargo, es el fruto y los diferentes materiales que se pueden obtener de él ,
lo que permite la mayor diversidad de usos (Lao 2008; 2009). México es el séptimo país
productor de cocotero en el mundo (CONACOCO, 201 O) , en los últimos años la
producción del cultivo del cocotero en nuestro país ha visto disminuido, esto se debe
principalmente a una baja en la productividad así como a una disminución en la superficie
de cultivo. Los factores que han influido en la baja de su productividad son principalmente
el aumento en la incidencia de plagas y enfermedades, bajo rendimiento de las
poblaciones y el uso extensivo de plantas poco productivas, entre otras (CONACOCO,
201 O; Harrison et al., 1999; Seemuller et al., 1998).
Una de las enfermedades más devastadoras ha sido la del amarillamiento letal (AL), ha
matado a millones de palmas de Jamaica, Cuba, Islas Caimán, Estados Unidos, México,
Belice, Honduras, Guatemala y Republica Dominicana (Harrison y Oropeza, 2008).
Haplaxius crudus es el insecto que hasta la fecha se conoce como único vector (Howard
et al. , 1984), es un insecto que se alimenta de la savia del follaje de las palmas, al
alimentarse de una palma infectada ingiere al fitoplasma que posteriormente puede ser
trasmitido a una palma sana (Suzuki et al., 2006). El fitoplasma es un microorganismo
procariota endocelular fitopatogénico sin pared celular y habita en las células del floema.
Hasta el momento no se ha podido cultivar in vitro, por lo que su caracterización es
limitada (Lee et al. , 2000) . Howard y Harrison en 1999, mencionan que fitoplasmas
causantes del amarillamiento letal (AL), infectan a por lo menos 40 palmas de importancia
ornamental o comercial , de modo especial y fatal a Cocos nucifera L. Se han reportado
diversos métodos para detectar y estudiar a los fitoplasmas como es la microscopía
electrónica, sondas moleculares, PCR directo, PCR en su modalidad anidado, el último
avance ha sido la utilización de la técnica de PCR en tiempo real utilizando sondas
1
INTRODUCCIÓN
TaqMan. El uso de anticuerpos para el estudio de fitoplasmas se ha reportado solo en
algunos casos como ·Gandida tus Phytoplasma aurantifolia, (Shahriyari et al. , 2011 ),
·candidatus Phytoplasma asteris · (Suzuki et al. , 2006). Sin embargo en relación al
fitoplasma del AL que afecta al cocotero no se había obtenido un anticuerpo.
Recientemente el Dr. Nigel Harrison de la universidad de Florida ha generado un
anticuerpo policlonal dirigido contra proteínas de membrana del fitoplasma del AL, no
obstante este anticuerpo no se ha caracterizado en cuanto a funcionalidad y especificidad.
Las ventajas de tener un anticuerpo contra el fitoplasma del AL son varias, desde tener un
método de detección sensible que podría utilizarse en el campo hasta poder realizar
estudios básicos sobre proteínas relacionadas a la patogénesis de estos
microorganismos, localización in situ del fitoplasma en diferentes tejidos, etc. , lo que
podría llevar a entender la enfermedad de una manera más precisa. Por lo tanto en el
presente trabajo se pretende determinar si el anticuerpo policlonal es funcional y si
reconoce de manera específica proteínas del fitoplasma del AL.
2
CAPITULO 1
CAPÍTULO 1
ANTECEDENTES GENERALES
1.1. Descripción del cocotero
La palma de coco es una planta polimórfica no ramificada , que en su etapa adulta puede
alcanzar hasta 30 metros de alto, el tallo o tronco es una columna, recto ligeramente
curveado un poco más grueso en la base, marcando en forma irregular por las cicatrices
que dejan las hojas viejas al caer, el tronco termina en un penacho de hojas agrupadas
densamente en el ápice y en cada axila de las mismas existen inflorescencias y racimos
de coco en diferentes fases de desarrollo (Domínguez et al., 1999).
Figura 1.1. Morfología de la palma de cocotero A) palma de cocotero, B)
inflorescencia y C) fruto .
En cuanto a su Taxonomía y descripción botánica según Lizano (2000), el cocotero
(Cocos nucifera L.) se clasifica botánicamente como:
• Clase: Monocotiledónea
• Orden : Palmales
• Familia: Palmae
• Subfamilia: Cocoidea
3
CAPiTULO 1
• Género: Cocos
• Especie: Cocos nucifera
El cocotero (Cocos nucifera L.) es una planta monocotiledónea de la familia palmae,
subfamilia Cocoidea y es la única especie del género Cocos, de la cual se han
desarrollado diferentes variedades y ecotipos. Es una especie diploide, por ser
monocotiledonea, en términos botánicos, el cocotero no es un árbol , ya que su tallo no
tiene una autentica corteza, ramas, tejido vascular ni desarrollo secundario,
características distintivas de las dicotiledóneas
1.1.1 Importancia del cocotero
México contribuye con aproximadamente el 7% de la producción mundial de copra. Los
derivados del coco tienen una demanda creciente en los mercados internacionales
especialmente en las regiones comerciales de América del Norte y de la Republica
Federativa de Brasil, en el periodo de 1996 y 1998 las exportaciones de la pulpa y coco
deshidratado tuvieron un crecimiento del 28% fibra y polvillo 47%. México actualmente
cubre solo una mínima parte pero se tienen buenas expectativas para las siguientes
décadas (CONACOCO, 2011 ). En el país el cocotero tiene un fuerte impacto en el empleo
y la economía regional en los estados de Guerrero, Colima, Tabasco y Oaxaca,
principalmente.
Los usos más recientes de importancia económica incluyen productos a base de fibra
para la industria automotriz, carbón activado, aceite virgen y aceite para la producción de
biodiesel de coco (Lao, 2008).
4
CAPITULO 1
Sub-Productos del Cocotero
Figura 1.2. Productos derivados de la palma de cocotero (árbol de la vida),
(Lao, 2008; http://www.conacoco.com .mx), modificado de CONACOCO, 2011.
1.1.2. Problemática del cocotero
A nivel mundial , México ocupa el séptimo lugar en la producción de copra y el primero en
América, detrás de los grandes productores asiáticos como Indonesia, Filipinas y la India
(FAO, 1998). Sin embargo, esta palma está sujeta al ataque por diversos agentes que
producen enfermedades, como el virus causante de la decadencia foliar del cocotero
(Rohde et al. , 1990), viroides causantes de la enfermedad de tinangaja en la isla de Guam
y el causante de la enfermedad de cadang-cadang en Filipinas (Hanold y Randles, 1991 ),
protozoos causantes de la marchitez letal de las palmas (Parthasarathy et al. , 1978),
hongos como Phytophthora palmivora el cual ocasiona la pudrición del cogollo (Joseph y
Radha, 1975), el nematodo Radinaphelenchus cocophilus causante de la enfermedad del
Anillo Rojo (Griffith, 1987) y molicutes como los fitoplasmas entre los que se encuentra el
causante del amarillamiento letal (Howard y Barrant, 1989).
5
CAPÍTULO 1
En los últimos años el amarillamiento letal del cocotero se convirtió en la más severa
enfermedad que afecta a C. nucifera matando a millones de palmas en las regiones del
Caribe y el Golfo de México , lo que ha tenido como resultado severas pérdidas de
producción (Arellano y Oropeza, 1995; Zizumbo, 1998) (www.conacoco.com.mx, 201 0).
Se ha reportado que el amarillamiento letal afecta a más de 40 especies de la familia
palmae además de cocotero (Haward y McCoy, 1980; Howarda et al., 1981 ; Tsai y Mead,
1982), en el cuadro 1 se en lista algunas de las especies de palmas.
Cuadro 1. Palmas susceptibles al fitoplasma Candidatus ' Phytoplasma palmae causante
del amarillamiento letal.
Nombre común Nombre c.ientífico Palma de la costa A/lagopterél arenaría
Arenga engleríi Palma arikuri Arikyroo<J schizophilla Palma palmira Borassus ffabe/fifer Palma cabada Choysolidocarpus cabadae Palma cola de pescado Caryota mitis Palma de coco Cocos nucifera Palma gebang Corypha elata Palma gaussia de Puerto Rico Gaussla atenuata Palma pacífica Palma abanico de Fiji Pritchardia pacific;,¡
Prichardia remota Palma Thurstom Pritchardia thurstonii
Pritchardia spp Ravenea hifdebrandtii
Palma molino de viento Trachycarpus fortuner Palma manila Veitchia merriiH Otras especies Vetichia spp Palma centinela Howea belmoreana Palma caracol Hyophorbe verschaffeltii Palma latania La-tania spp Palma abanico Uvístona chinensis Palma mazar Nannorrhops ritchiana
Neodyppsis decaryi Palma canaria Phoen;x canarlensis Palma dati lera Phoenix dactylifero Palma datilera del Senegal Phoenix reclinata Palma dati lera silvestre Phoenix silvestris Palma Kona Pritchardia affinis
6
CAPÍTULO 1
Ya se han mencionado las especies de palmas susceptibles a la enfermedad del AL. Así
como se han reportando las palmas susceptibles también se han reportado ecotipos de
cocotero que presentan un grado de resistencia ante esta enfermedad.
1.1.3. Ecotipos de cocotero con cierto grado de resistencia
La palma de coco fue introducida a México durante el siglo XVI. Las poblaciones en la
costa del Golfo de México tienen características similares al tipo silvestre (Niu kafa) y en
la costa del Pacífico presentan características similares al tipo doméstico (Niu vat)
(Zizumbo, 1996; Zizumbo y piñero, 1998; Zizumbo et al., 2005a).
En México se han identificado 5 ecotipos de cocotero: alto del Atlántico (AA}, alto del
Pacífico 1 (AP1 }, alto del Pacífico 2 (AP2) , alto del Pacífico 3 (AP) y enano malayo
amarillo (EMA). Se ha reportado que los ecotipos antes mencionados presentan diferente
porcentaje de mortalidad ante la enfermedad del amarillamiento letal , los porcentajes van
desde, AA con un 79 %, AP1 con un 37 %, AP2 con un 23% AP3 con un 56 % y EMA con
un 6%, siendo el EMA y el AP2 los que exhiben una alta resistencia al AL., importantes
características morfológicas que los hace útiles como progenitores en los programas de
hibridación (Zizumbo y Colunga, 2001 ).
Se ha señalado las especies resistentes y especies susceptibles al AL , pero es de
importancia conocer la sintomatología de las palmas de cocotero cuando están siendo
afectadas por esta enfermedad por lo tanto enseguida se señala los síntomas que se
presentan en las palmas de cocotero.
1.2.1 Sintomatología del Amarillamiento letal (AL)
En los últimos años la enfermedad del AL, ha destruido millones de palmas en Jamaica,
Florida, Belice y Honduras (Harrison et al. , 1999). En cuanto a México, el AL ha eliminado
virtualmente al cocotero alto del Atlántico en toda la costa de Quintana Roo, Yucatán y
Campeche (Domínguez et al., 1999) y se estima que ha devastado aproximadamente
unas 13 mil hectáreas de plantaciones de coco (Doyle, 1998) quedando actualmente una
7
CAPITULO 1
superficie cultivada cercana a 100 mil hectáreas (CONACOCO, 2008).
Durante el desarrollo del AL, las palmas exhiben varios síntomas visuales (figura 1.3) tal
como la caída prematura de los frutos (estadio 1 ), inflorescencia necrótica (estadios 2 y
3) , clorosis y senescencia de hojas (estadios 4-6), (Matus et al., 2003) . Las hojas
adquieren después color marrón , se desecan y mueren , permanecen colgando por
algunos días y finalmente caen, quedando únicamente el tronco desnudo (McCoy et al.,
1982).
8
Figura 1.3. Cronología de síntomas del AL en la palma de coco. A). Caída
prematura de los frutos ; 8) . Inflorescencia necrótica; C) . Clorosis y senescencia
de las hojas más viejas; 0). Clorosis de las hojas jóvenes y necrosis de la
espata; E) . Estado avanzado, caída de la corona de hojas quedando el tronco
desnudo (Harrison y Oropeza, 2008) .
CAPÍTULO 1
Aunque los síntomas de la enfermedad en la palma se pueden revertir temporalmente por
medio de la aplicación de antibióticos de la familia de las tetraciclinas, el costo, los efectos
ecológicos y de salud colaterales por el uso de antibióticos limitan su aplicación en
plantaciones comerciales (McCoy, 1974; Harrison , 2007) .
Hasta el momento la forma más eficaz para enfrentar el AL es el uso de germoplasma
resistente (Been , 1981).
1.2.2 Agente y forma de transmisión del AL
La chicharrita Pálida (Haplaxius crudus) fue descrita en Jamaica en 1907, ha sido
reportada y es nativa del sur de Florida, Cuba, Islas Caimán , Jamaica, Trinidad y en áreas
meridionales de América Tropical desde México, América Central hasta la parte norte de
América del Sur. Haplaxius crudus, un insecto que se alimenta del floema de las palmas.
Su participación en la transmisión del AL., es apoyada por otras líneas de evidencia. La
población de H. crudus puede ser cerca de 40 veces mayor en áreas afectadas por el AL
que en áreas libres de la enfermedad (Howard, 1980). También se observó que la
velocidad aparente de dispersión de la enfermedad se redujo en áreas donde H. crudus
se controlo con insecticida (Howard y McCoy, 1980). En condiciones controladas H.
crudus ha podido transmitir el AL a palmas de diferentes especies (Howard et al. , 1994).
La dispersión del AL ocurre a través de dos mecanismos (McCoy et al. , 1983). Uno es
mediante un centro localizado de infección, es decir la enfermedad aparece en una o dos
plantas y de ahí se extiende localmente al azar a palmas contiguas. El segundo
mecanismo es por saltos, seguidos por dispersión localizada.
La distancia cubierta por estos saltos es de hasta varias decenas de kilómetros y son
favorecidos por vientos fuertes como los huracanes. Por lo tanto, la enfermedad se puede
mover hasta 100 Km cada año, como ha ocurrido en América Central.
9
CAPITULO 1
Figura 1.4. Fitoplasma (1), vector-Haplaxius crudus (2), palma enferma con AL
(3) .
1.2.3 Agente causal de la enfermedad del AL.
El género fitoplasma comprende un grupo de fitopatógenos bacterianos en la clase
molicutes los cuales representan un grupo filogenéticamente coherente de patógenos que
colonizan un amplio espectro de hospedantes y vectores. El fitoplasma se transmite de
planta a planta por la savia de alimentación del insecto vector, infecta más de 700
especies de plantas (Suzuki et al. , 2006).
El uso de las secuencias de la región ribosomal 16S han hecho posible clasificar a los
fitoplasmas. Recientes investigaciones, particularmente el análisis de secuencias del gen
ribosómico 16S han revelado que los fitoplasmas constituyen un taxón coherente a nivel
de género. En el ciado monofilético de fitoplasma, se han delineado grupos y subgrupos,
muchos de ellos están siendo considerados como especies putativas bajo el estatus
provisional de 'Candidatus' para procariontes incompletamente descritos (Lee et al. ,
2000).
1.2.4 Características generales de los fitoplasmas
Los fitoplasmas son parásitos estrictos del hábitat intracelular de plantas e insectos
vectores. Su tamaño y desarrollo depende del grado de desarrollo de los tubos cribosos
donde se localizan, con capacidad de pasar lentamente a través de los poros de las
células cribosas del floema. La célula del fitoplasma está rodeada por una membrana
plasmática trilaminar, de unos 1 O nm de grosor, compuesta, de dos tercios de proteínas y
10
CAPÍTULO 1
un tercio de lípidos, (Nishigawa et al., 2001). Su citoplasma contiene ribosomas para la
síntesis proteica, y una molécula de ADN extracromosómico (Nakashima y Hayashi, 1995;
Nishigawa et al. , 2001).
Figura 1.5. Micrografías electrónicas de fitoplasmas en tubos cribases.
Secciones transversales que muestran el polimorfismo en la forma y
dimensiones de fitoplasma que infecta a las plantas (Bertacini y Duduk, 2009) .
El genoma es pequeño con un alto contenido de genes, presenta un único gen de rRNA
isoleucina común en todos los fitoplasmas. Por estudios serológicos y moleculares
también se ha visto que los fitoplasmas contienen un gen que codifica para una proteína
de membrana y ésta es única para cada especie.
Estas proteínas son abundantes en la superficie externa de la célula , y de su estudio se
podría explicar la posible interacción fitoplasma-huésped (Kirkpatrick et al., 1994, Lee et al., 2000).
11
CAPÍTULO 1
1.2.5 Translocación en plantas
Los fitoplasmas son transportados por insectos de planta a planta, se extienden en la
planta sistémicamente utilizando el sistema de tubos cribosos, pero nunca se asientan en
los meristemos (Christesen et al. , 2004). Los fitoplasmas son pleomorficos y pequeños lo
suficientemente pequeños para pasar libremente a través de los poros, por lo que podrían
ser arrastrados junto con el flujo de las hojas a asimilar órganos de las plantas donde
consumen el azúcar, como los virus sistémicos. En consecuencia los fitoplasmas han sido
encontrados en tejidos como hojas inmaduras y raíces , mientras que las hojas maduras
pueden permanecer no infectadas (Siddique et al., 1998). Por el contrario, una
concentración alta de fitoplasma y una colonización en el tejido fueron reportados por
otros investigadores (Christensen et al. , 2004). Los estudios centrados en la translocación
de fitoplasmas localizados después de la inoculación (Wei et al. , 2004b) o la
recolonización de los árboles (García-Chapa et al., 2003) proporcionan evidencias de que
la trasladación de los fitoplasmas no se pueden explicar solo por el flujo de los conductos.
El movimiento activo por los fitoplasmas parece muy poco probable teniendo en cuenta la
falta de genes que codifican para los elementos del citoesqueleto o flagelos (Christensen
et al. , 2005).
1.2.6 La interacción de los fitoplasmas con sus hospedantes
Es así que mediante el estudio de las interacciones microorganismos hospedantes se han
descrito una serie de reacciones que conllevan a la planta a reconocer al microorganismo
patogénico que la ataca, pero en el caso de cocotero es poco estudiada por lo tanto
conocer la diversidad de patrones involucradas en estas interacciones es de suma
importancia.
Los fitoplasmas en palmas conllevan una serie de reacciones, se ha hipotetizado que las
proteína de su membrana tienen una estrecha relación con la interacción de sus
hospedantes es por eso que es de gran importancia conocer la función que realizan y así
poder entender el mecanismo de acción de este patógeno hacia las palmas de cocotero.
12
CAPÍTULO 1
1.2.7 Diversidad y función de las proteínas de membrana de fitoplasmas
Los fitoplasmas hasta el momento no han podido ser cultivados in vitro, esto ha generado
que sea escaso el conocimiento de la fisiología , bioquímica, biológica molecular así como
de su interacción con sus hospedantes (García-Chapa et al., 2004). Los estudios
serológicos se han llevado a cabo dando lugar al reconocimiento de proteínas
inmunodominantes (proteínas antigénicas de membrana en la superficie de los
fitoplasmas) con dominios transmembranales.
Las principales proteínas de la superficie que pueden desempeñar funciones en el
reconocimiento de los molicutes, la adherencia a células de insectos o plantas huésped
(un requisito previo para la colonización e infección) la patógenicidad y la activación de la
respuesta de resistencia del hospedante (Christesen et al., 2005).
La presencia de epítopes principalmente en la superficie, único para cada especie de
fitoplasmas sugiere que estas proteínas pueden ser participantes clave en las
interacciones específicas con las células del huésped. Son varias las proteínas que están
presentes en la membrana de los fitoplasmas y de manera genérica se les designa como
inmunodominante a la que se encuentra en mayor cantidad (Berg et al., 1999, Barbará et
al., 2002) .
Los genes que codifican para las proteínas de membrana inmunodominante se aislaron
de varios grupos de fitoplasmas. Estos son clasificados en tres distintos tipos. (1)
Proteínas de membrana inmunodominante (lmp) el cual se ha identificado en: sweet
patato witches' broom (SPWB) (Yu et al., 1998), proliferación de la manzana (AP) (Berg et
al., 1999), Europea Stone fruit yellows (ESFY) (Morton et al., 2003), pear decline (PO)
(Morton et al., 2003); (2) Proteína de membrana inmunodominante A (ldpA) Western X
disease (WX) Phytoplasma (Biomquist et al. , 2001); y (3) proteína de membrana
antigénica (Amp): aster yellows (AY) (Barbara et al. , 2001 , 2002), clover phyllody (CPh)
(Barbara et al., 2002), y onion yellows (OY) fitoplasmas (Kakizawa et al., 2004). Son
ortólogos de uno a otro (Barbara et al., 2002 ; Kakizawa et al., 2006); proteínas no
homólogas que juegan un papel de inmunodominante, la mayor porción del total de
proteínas de membrana celular, en diversos fitoplasmas.
13
CAPÍTULO 1
Un nivel de expresión de la proteína Amp fue confirmada en AY, CPh, y fitoplasmas del
OY (Kakizawa et al. , 2004; Barbara et al., 2002), y proteína Amp que puede ser exportado
en el sistema de secreción vía Sec, acompañada por la escisión de la secuencia de la
señal N-Terminal. (Kakizawa et al., 2004).
La clonación y amplificación de genes en varias cepas del grupo de fitoplasmas AY
mostró que las proteínas Amp están bajo selección positiva y los seleccionados
positivamente codifican en el dominio central hidrófilo de la Amp (Kakizawa et al. , 2006a).
Recientemente, se informo que el OY de fitoplasmas forma un complejo con
microfilamentos de insectos. Además, la formación de complejos de microfilamentos Amp
se correlacionó con la capacidad de la transmisión de las chicharritas lo que sugiere que
la interacción entre la Amp y la formación de complejos de microfilamentos juegan un
papel importante en la determinación de la transmisibilidad de fitoplasmas (Suzuki et al. ,
2006).
También se han realizado análisis de otros tipos de proteínas de membrana
inmunodominante. Morton et al., 2003 aislaron genes que codifican para lmp de varias
cepas de fitoplasmas, encontraron que las identidades de secuencias de las lmp en varios
fitoplasmas no correlacionan con el gen 16S rRNA, este resultado sugiere que la
variabilidad de las proteínas de membrana inmunodominante reflejan factores de tiempo
evolutivo.
Sin embargo, como la información sobre otros tipos de proteína de membrana
inmunodominante es limitada, los análisis de varios tipos de proteínas de membrana
inmunodominante podrían arrojar buenos resultados sobre la diversidad biológica y la
evolución de los fitoplasmas (Kakizawa et al., 2009) .
Liefting y Kirkpatrick (2003) reportaron que un gen homólogo de la lmp codifica en el
fragmento genómico de WX. Sin embargo, no se sabe si la lmp se expresó y se encontró
en la superficie del fitoplasma. Estas observaciones condujeron a una búsqueda en
BLAST y no se detectó similitud entre los genes de diferentes grupos de Imp. Sin
embargo, las organizaciones de genes de tipo lmp están bien conservadas en la mayoría
de los fitoplasmas, y todos los lmps tienen una región transmembranal N-terminal. Por lo
tanto, no obstante la diferencia de identidades en las secuencias, los genes lmp
14
CAPITULO 1
estudiados hasta ahora serían ortólogos debido a la organización que mantiene el gen
similar y la estructura transmembranal conservada (Kakizawa et al., 2009).
A diferencia, del ortólogo de la ldpA, que es la proteína de membrana inmunodominante
WX, en las secuencias genómicas completas de OY-M (Oshima et al., 2004), AY-WB (Bai
et al., 2006), Ca. Fitoplasma Autraliense (Tran-Nguyen et al., 2008), o Ca. P. mali (Kube
et al., 2008) . Se sugirió que el tipo ancestral de proteína de membrana inmundominante
había sido lmp y posteriormente, los niveles de expresión de Ampo IDPA en el grupo AY
y grupo WX, respectivamente, se incremento (Kakizawa et al. , 2009). Aumentar el análisis
de secuencias de genes de proteínas de membrana inmunodominantes de muchas cepas
de fitoplasmas contribuiría a una mejor comprensión de las funciones biológicas y
evolutivas de proteínas de membrana inmunodominantes.
Se sugirió que la lmp juega un papel importante en la interacción del huésped con el
fitoplasma, al igual que otras proteínas seleccionadas previamente (Hughes y Nei, 1988;
Nielsen y Yang , 1998; Bishop et al., 2000; Jiggins et al., 2002; Urwin et al. , 2002;
Andrews y Gojobori , 2004).
La acumulación de Amp se calculó como aproximadamente 1 O veces mayor que el de la
Imp. Este resultado fue consistente con las características del AY -Amp inmunodominante
del grupo de fitoplasmas.
Sin embargo, la detección de lmps de fitoplasmas en plantas infectadas también es
posible y por lo tanto la cantidad de proteína de lmp también posiblemente sea alta. Los
análisis de transferencia de lmp de OY-W sugirió que su secuencia señal se escindió y la
lmp se mantuvo en la membrana celular del fitoplasma. Este resultado está de acuerdo
con los informes anteriores de que la proteína de membrana inmunodominante es una
lmp y se encuentra en varios fitoplasmas incluyendo AP y SPWB (Yu et al. , 1998; Berg et
al., 1999). Por lo tanto para la predicción de proteínas secretoras de fitoplasmas podría
ser importante considerar la longitud de aminoácidos entre reg iones transmembranal y
motivos de división .
Los resultados de la clonación lmp de varios grupos de fitoplasmas sugieren que el lmp
tiene funciones muy importantes en los fitoplasmas. Previamente se describió que la Amp
15
CAPÍTULO 1
forma un complejo con microfilamentos de insectos vectores y que este complejo es
importante para la transmisibilidad de fitoplasmas (Suzuki et al. , 2006). La elucidación de
la función de la lmp es importante para comprender la biología de los fitoplasmas.
Además, es interesante para determinar si tienen la misma función en los diferentes
grupos de fitoplasmas.
Como la lmp está presente en todos los fitoplasmas, debe ser posible obtener la lmp del
fitoplasma del AL. Además la clonación , la secuenciación y comparación de lmp de un
número amplio de fitoplasmas extendería nuestro conocimiento de la evolución del
fitoplasma. Los anticuerpos contra la lmp podrían ser útiles para la detección de
fitoplasmas en general. Es por eso que el Dr. Harrison generó un anticuerpo contra lmp y
es posible que sea una buena herramienta para detectar fitoplasmas (Kakizawa et al. ,
2009) como lo fue recientemente para la Amp (Arashida et al. , 2008).
En reportes de Neriya et al., 2011 se menciona que tres proteínas Amp, lmp y ldpA, se
util izan a menudo para la producción de anticuerpos monoclonales y pol iclonales,
util izados en la detección de fitoplasmas (Ciark et al., 1989., Yu et al., 1998., Berg et al. ,
1999., Blomquist et al 2001 ., Barbara et al., 2002. , Morton et al. , 2003., Kakizawa et al.,
2004, 2009). La caracterización molecular de genes conservados ha proporcionado una
solución parcial al problema permitiendo la construcción de un esquema de clasificación
independiente de los caracteres fenotípicos (Mugno y Filgueira, 2008).
En la siguiente figura se presenta el esquema de los tres genes que codifican para las
proteínas más abundantes en la membrana de los fitoplasmas así mismo se esquematiza
la proteína y su estructura.
16
CAPITULO 1
e)
(b)
(e) cimplasrna celular del hospedante
'Membrana
Citoplas-ma del fitoplasma
Tvpe 1: lmp Type 3: Amp
Figura 1.6. Proteínas de membrana inmunodominantes (IDPs) de fitoplasma (a)
organización de genes que codifican para los tres tipos de IDPs. La
organización de los tipos de genes 1, 2 y 3 fueron descritos usando la
secuencia de SPWB (U155224), WX (AF533231) y OY-W (AB124806) ,
respectivamente . (b) Representación esquemática de los productos putativos de
translocación de tres IDPs. Las regiones transmembranales son las coloreadas
en azul ; las regiones no transmembranales están coloreadas en rosa. La región
N-terminal transmembranal de la Amp (tipo 3) es clave durante la localización
de la proteína (Kakizawa et al., 2004) y el sitio de escisión. Abreviaturas
empleadas en la imagen: C, C terminal , N, N terminal , aa: aminoácidos. (C)
Representación esquemática de las estructuras transmembranales hipotéticas
de tres tipos de IDPs. (Modificado de Hogenhout et al., 2008) .
La importancia de estudio del grupo de fitoplasmas causantes del amarillamiento letal es
fundamental , por lo tanto conocer la interacción con su hospedante es de vital importancia
ya que al conocer el papel que están jugando las proteínas de su membrana sería crucial
para poder entender el mecanismo de acción hacia su hospedante.
1.2.8 Técnicas tradicionales para el estudio de fitoplasmas.
Regularmente los fitoplasmas en plantas infectadas se presentan en cantidades muy
bajas y su distribución en el hospedero no es uniforme, por tal motivo, su identificación y
clasificación es complicada.
Los métodos tradicionales de detección de fitoplasmas usan la sintomatología conocida
17
CAPITULO 1
asociada a la cepa en cuestión , y la microscopía para localizar los organismos, la
microcopia electrónica de barrido es una herramienta excepcional para el diagnostico de
fitoplasmas en el floema de las plantas infectadas, esto es debido a su alta resolución , la
capacidad de mostrar las estructuras en tres dimensiones y ser una técn ica rápida y
precisa.
Hibridaciones de tipo Dot blot y sourthern blot, usando sondas de ADN permitieron el
estudio de relaciones genéticas entre estos patógenos, dando como resultado el
reconocimiento de varios grupos y subgrupos (Martínez-Soriano et al., 2007).
Actualmente, los sistemas de clasificación basados en técnicas moleculares han
reemplazado a la taxonomía tradicional. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
es una herramienta que permite una detección rápida y sencilla con alto nivel de
sensibilidad para el diagnóstico de plantas e insectos vectores (Lee et al., 1998;
Seemuller et al., 1998).
Se tiene en cuenta que las técnicas antes mencionadas son de suma importancia para la
detección de los fitoplasmas pero generar un anticuerpo que sea específico para un tipo
de fitoplasma es de gran importancia. Se tiene conocimiento que en la década de los 80s,
el desarrollo de anticuerpos mono y policlonales, dio un gran impulso al diagnóstico de las
enfermedades ocasionadas por fitoplasmas (Kuboyama et al., 1998; Lee et al. , 1998).
Pruebas serológicas como ELISA y microscopia de inmunofluorescencia, permitieron la
detección e identificación de cepas de fitoplasmas específicos.
Por lo tanto en el grupo de fitoplasmas causantes de la enfermedad del AL, se han
empleado cada una de las herramientas antes mencionadas con excepción del empleo de
un anticuerpo.
Debido a esto se pretende emplear un anticuerpo policlonal para la detección temprana
del grupo de fitoplasmas causantes de la enfermedad del AL en plantas de cocotero, la
información obtenida con el uso de un anticuerpo específicos para el grupo de fitoplasmas
causante del AL, sería de gran utilidad para tener un mejor entendimiento de la
enfermedad.
18
CAPITULO 1
1.2.9 Importancia de anticuerpos
Los anticuerpos son moléculas de peso molecular aproximadamente de 150 kDa,
pertenecientes al grupo de las inmunoglobulinas (lgG). Son moléculas capaces de
reconocer a otras moléculas llamadas antígenos.
La capacidad de reconocimiento de un anticuerpo radica en las secuencias variables de
sus cadenas proteicas generadas por recombinación de una serie de casetes de genes,
en el proceso de producción de los linfocitos B, durante el desarrollo embrionario. La
combinación de estas secuencias puede producir más de un billón de secuencias
diferentes. Esta información es almacenada en una fuente de linfocitos B presente en los
tejidos linfáticos. La estructura básica de un anticuerpo se esquematiza en la figura 1.7,
está formado por dos cadenas proteicas pesadas y dos ligeras, unidas por puentes
disulfuro. Se dividen en varias clases que se identifican según el tipo de cadena pesada
en lgG, lgM, lgA, lgD e lgE.
(A)
Sitio de unión al anúgeno
Sitio de u nión al anúgeno
cadena pesada
Figura 1. 7. Estructura de un anticuerpo. lgG. (A) Los anticuerpos tipo lgG
consisten de cuatro cadenas, dos cadenas pesadas (en azul) y dos ligeras (en
rojo) , unidas por puentes disulfuro. La cadena ligera y pesada se une para
formar los dominios Fab que tiene los centros de unión al antígeno en sus
extremos. Las dos cadenas pesadas forman el dominio Fe, los dominios Fab se
unen al dominio Fe mediante conexiones flexibles. (B) representación
esquemática de una molécula de lgG (Mocarulla, 2007) .
19
CAPÍTULO 1
La lgG es un tetrámero formado por dos heterodímeros, la cadena más larga se denomina
cadena pesada o cadena H, está formada de aproximadamente 470 aminoácidos. La
cadena más corta se denomina ligera y está formada por unos 215 aminoácidos. Las
cadenas pesadas y las ligeras del mismo anticuerpo son idénticas entre sí. La cadena
ligera está unida a una cadena pesada a través de un puente disulfuro entre dos
aminoácidos cisteínas presentes en ambas cadenas, (Margni , 1996).
A su vez, las cadenas pesadas están unidas entre cisteínas presentes en la región
bisagra ubicada en la parte media de cada una de esas cadenas pesadas.
La cadena ligera se divide en dos dominios, los dominios estructurales cilíndricos
formados por alrededor de 11 O aminoácidos que si bien son parte de la misma proteína,
están separadas en el espacio, división que se asocia con una función diferente.
La importancia de generar anticuerpos a base de un gen que codifica una proteína de
membrana es de gran importancia para la detección de microorganismos patogénicos por
otra parte, la detección serológica utilizando, un anticuerpo es un método económico y
que permite análisis de muchas muestras en un tiempo corto, por lo tanto varios reportes
mencionan que se han generado anticuerpos capaces de detectar proteína de membrana
de fitoplasmas (Margni , 1996).
1.2.1 O Anticuerpos generados contra fitoplasma
Hasta el momento, se han aislado genes que codifican para proteínas de diferentes
fitoplasmas, a partir de los cuales se han desarrollado anticuerpos monoclonales y
policlonales (Yu et al. , 1998; Berg et al., 1999; Blomquist et al., 2001 ; Mergenthaler et al.,
2001 ; Morton et al., 2003) . Estas proteínas de membrana, al igual que en otros Molicutes,
podrían estar implicadas en el reconocimiento específico del huésped y de la patogénesis
(Wise et al. , 1992; Y e et al., 1997; Berg et al., 2000).
Estudios ya realizados sobre la producción de anticuerpos contra fitoplasmas tiene gran
impacto, las estrategias convencionales para el tratamiento de enfermedades causado por
fitoplasmas ha demostrado tener poco éxito y nuevos enfoques basados en la ingeniería
20
CAPÍTULO 1
genética han sido y siguen siendo considerados. La falta de resistencia natural contra
enfermedades de fitoplasmas ha puesto de relieve la importancia de los enfoques
alternativos y la generación de anticuerpos específicos es beneficioso para el diagnostico
de las enfermedades causado por los microorganismos patogénicos llamado fitoplasmas.
La generación de anticuerpos por medio de diferentes técnicas, han sido de gran
importancia para una gran variedad de especies de plantas, algunos de los trabajos se
describen en el cuadro 2, y son referentes a los anticuerpos generados para la detección
de los microorganismos patogénicos llamados fitoplasmas.
Cuadro 2. Reportes enfocados a la generación de anticuerpos para detección de Fitoplasmas.
Calhanlnlhusroseus · Candídalusfitoplasma Policlonal Siampur etal. , 2013
auratifolia '
Cilrus allllllllifDiia • Candidalusfitoplasma Policlonal Shahryarieta/., 2013
auratifolia '
Calhanlnlhusroseus · Candidalusfitoplasma Policlonal Suzuki et al., 2006
asteris '
Ma/ussyltleslris ·candidatusfrtoplasma Monoclonal Loi etal., 2002
mali '
CalhBranlhusroseus · Candidatusfitoplasma Monoclonal Blomquist et al., 2001
asteris '
Cathanlnlhusroseus · Candídalusfrtoplasma Monoclonal y Berg etal., 1999
mali' pollclonal
La generación de un anticuerpo policlonal ofrece ventajas que van desde las más simples
hasta las más complejas, por ejemplo; localización in situ , determinación de las proteínas
de plantas e insectos que interacciona con este, o de igual forma implementar un método
de detección in situ. Por lo tanto muy recientemente el Dr. Nigel Harrison se dio a la tarea
21
CAPITULO 1
de generar un anticuerpo dirigido contra la proteína del IMP del fitoplasma causante del
AL. Sin embargo la caracterización de este anticuerpo no se ha realizado. Es por ello que
este trabajo tuvo como objetivo determinar si este anticuerpo podría reconocer proteínas
del fitoplasma del AL. Los detalles de la generación del anticuerpo se presenta en los
anexos de este trabajo.
22
CAPITULO 1
1.3 HIPÓTESIS
Reportes en la literatura se han mostrado que se pueden generar anticuerpos funcionales
y específicos contra algunos tipos de fitoplasmas, por lo tanto un anticuerpo dirigido
contra el fitoplasma del AL puede reconocer de manera específica proteínas de la
membrana del fitoplasma causante del AL.
23
CAPITULO 1
1.4 OBJETIVOS
1.4.1 OBJETIVO GENERAL
Caracterizar inmunológicamente un anticuerpo policlonal dirigido contra proteínas de
membrana del fitoplasma causante del amarillamiento letal.
1.4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
Establecer un protocolo de extracción de proteínas de tejido de palmas de cocotero
infectadas con el AL. , y que sea adecuado para la inmunodetección de proteínas de
membrana del fitoplasma causante del amarillamiento letal.
Desarrollar un protocolo para la detección del fitoplasma del AL con un anticuerpo que
reconoce a la proteína lmp de dicho fitoplasma.
24
CAPITULO 1
1.5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
La estrategia experimental para llevar a cabo este trabajo se puede visualizar en siguiente
esquema.
Colecta de material Análisis bioinformatico de la San Crisanto y Caridad de cobre secuencia de la proteína putativa
IMP
t 1 Hoja 1
Evaluación de la funcionalidad 1 Detección de fttoplasmas 1
PorqRT.PCR del Anticuerpo (Anti-L Y)
Métodos probados Optimización del uso del anticuerpo primario y secundario
A: Cho et al., 2006 y Swery et al., 1995 B: Islas-Flores., 1999 C: Arashida et al., 2008
1 1 Análisis cuantitativo de cantidad de
1 ~ondició~. de 1 1 Dil~ción opti~a d~l 11 D~lución optima del_ l mcubac1on anticuerpo pnmano anticuerpo secundano
proteína
Evaluación de la especificidad Evaluación de perfiles del Anticuerpo (Anti-L Y)
proteicos
25
CAPITULO 1
1.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Audergon J. , Castelain C., Morvan G. y Chastelliere M.G. (1989) . Apricot varietal
susceptibility and genetic variability to apricot cholorotic leafroll disease. Acta
Horticulturae, 235: 205-213.
Alma A. , Sosco D., Danielli A. , Bertaccini A. , Vibio M. y Arzone A. (1997) . lndentification of
phytoplasmas in eggs, nypmphs and adults of Scaphoideus titanus Ball reare
don healthy plants. lnsect Molecular Biology. 6:115-121.
Arashida R. Kakizawa S. , lshii Y. , Hoshi A. , Y.Jung H., Kagiwada S, Yamaji Y., Oshima
K.y Namba S. (2008). Cloning and characterization of the Antigenic Membrana
Protein (Amp) gene and in situ detection of Amp from malformed flowers infected
whit Japanese Hydrangea phyllody phytoplasma. Bacteriology 98: 769-765.
Barbara D. , Morton A. , Michel F. Clark y Davies D, (2002). lnmunodominant
membrane proteins from two phytoplasmas in the aster yellows clade
(Cholorante aster yellows and clover phyllody) are highly divergent in the major
hydrophikic region). Microbiology. 149:157-167.
Barbara D.J ., Morton A. , Clark M.F., y Davies D.L,. (2002). lmmunodominant membrane
proteins from two phytoplasmas in the aster yellows clade (chlorante aster
yellows and clover phyllody) are highly divergent in the major hydrophilic region .
Microbiology, 148:157-167.
Berg M., Davies L., Clark M. , Vetten H. , Maier G., Marconen C. y Seemuller E. (1999).
lsolation of gene encoding an inmmunodominant membrane protein of the apple
proliferation phyotoplasma, and expression and characterization of the gene
product. Microbiology. 145:1937-1943.
Bertaccini A. y Duduk B. (2009). Phytoplasma and phytoplasma diseases: a review of
recent reserch . Phytopathol. Mediterr. Vol 48, pp. 355-378.
26
CAPITULO 1
Berges R. , Rott M. y Seemüller E. (2000). Range of phytoplasma concentration in various
plant hosts as determined by competitive polymerase chain reaction .
Phytopathology, 90:1145-1152.
Bisognin C., Schneider B., Salm H., Grando M.S., Jarausch W. , Moll E, y Seemüller E.
(2008). Apple proliferation resistance in apodictic rootstocks and its relationship to
phytoplasma concentration and simple sequence repeat genotypes.
Phytopathology, 98(2): 153-158.
CONACOCO 2008. Consejo Nacional del cocotero , www.conacoco.com.mx
CONACOCO 2011 . Consejo Nacional del cocotero , www.Conacoco.com.mx.
Christensen N.M., Axelsen K.B., Nicolaisen M. y Schultz A. (2005). Phytoplasmas
and their interactions with their hosts. Trend in Plant Science, 1 O: 526-535.
Domínguez, E., López, J., y Ruiz P, (1999). El Cocotero Cocos nucifera L. Manual
para la Producción en México INFAP, CIRGOC. Campo Experimental
Huimanguillo Libro Técnico.-No. 6, Tabasco, México D. F. p 132
Errea P., Aguelo V. , y Hormaza J, (2002). Seasonal variations in detection and
transmission of pear decline phytoplasma. Journal of Phytopathology, 150: 439-
443.
Fuente-González A. , Rodríguez-Lozano J. y Fonseca-Capdevila E. (2007). Análisis de
proteínas mediante electroforesis e inmunotransferencia (Western blot) . Piel
252-258.
Garcia-Chapa M., Batlle D. , Rekab M. , Ruiz-Rosquete y Firrao G. (2004). PCR-mediated
whole genome amplification of phytoplasmas. Microbio!. 56:231-242 .
Garcia-Chapa M., Medina V., Viruel M.A. , Lavina A. y Battle A. (2003) . Seasonal detection
of pear decline phytoplasma by nested-PCR in different pear cultivars. Plant
Patholology, 52: 513-520.
27
CAPITULO 1
Griffith R. (1987). Redring disease of coconut palm. Plant Disease, 71 , 193-196.
Harrison N. y Oropeza C, (2008) . Coconut lethal yellowing, in characterization,
diagnosis and management of phytoplasma. Pp 219-248.
Herrera G., y Madariaga M. (2001 ). lnmunological , microscopical and molecular evidence
of phytoplasma in grapes. Agric. Téc. 63:1-11
Harrizon N. y Oropeza C, (1999). Phytoplasmas Associated with Coconut Lethal
Yellowing .
Howard F. y Barrant C. (1989) . Question and answers about lethal yellowing disease.
Príncipes, 33: 163-171 .
Howard, F. W . (1990). Evaluation of grasses for cultural control of Myndus crudus, a
vector of Lethal Yellowing of palms. Entomologia Experimentalis et Applicata ,
56(2), 131-137.
Hanold , D. y Randles, J . (1991 ). Coconut cadang-cadang disease and its viroid agent.
Plant Dis, 75, 330-335.
Howard F. y Barrant C. (1989) . Question and answers about lethal yellowing disease.
Principies, 33, 163-171.
Harrison N. y Oropeza C. (2008) . Coconut lethal yellowing . In: NA Harrison , GP Rao y
C. Marcone (Eds.) . Characterization, Diagnosis and Management of
Phytoplasmas. Studium Press LLC, Houston, USA pp 219-248.
Harrison, N. A. y Elliot M. L .. (2007). Lethal Yellowing (L Y) of palm. lnstitute of Food
and Agricultura! Sciences (IFAS), Fact Scheet PP-222 , 9pp.
Howard , F. W., Kramer J. P. y Teliz-Ortiz M. (1984) . Myndus crudus (Homptera : Cixiidae)
in Cancún, México. Florida Entomologist, 67 (4) , 577-579.
Howard , F. W. , R. C. Norris y Thomas D. C. (1983) . Evidence of transmission of palm
lethal yellowing agent by a plant-hopper Myndus crudus (Homoptera Cixiidae).
Tropical Agricultura (Trinidad), 60, 168-171 .
28
CAPITULO 1
Hogenhount S., Oshima K., Ammar D., Kakizawa S. , Kingdom H. y Namba S. (2008).
Phytoplasmas: bacteria that manipulate plants and insects. Molecular plant
pathology. 9:403-423.
Jarausch W., Lansac M. y Dosba F. (1999b) . Seasonal colonization pattern of European
stone fruit yellows phytoplasma in different Prunus species detected by specific
PCR. Journal of Phytopathology, 147: 47-54.
Joseph, T. y Radha K, (1975) . Role of Phytophthora palmivora in but rot of coconut.
Plant Dis Reptr, 59, 1014-1017.
Kakizawa S. , Oshima K., Nishigawa H. , Jung H.Y., Wei W., Suzuki S., Tanaka M.,
Miyata S., Ugaki M. , y Namba S. (2004) . Secretion oimmunodominant
membrane protein from onionyellows phytoplasma through the Sec protein
translocation system in Escherichia coli. Microbiology, 150: 135-142.
Kartte S. y Seemüller E. (1991 ). Susceptibility of grafted Malus taxa and hybrids to
apple proliferation disease. Journal of Phytopathology, 131 : 137-148.
Kirkpatrick B., Smart C., Blonquist C., Guerra L., Harrison N. , Ahrens U., Lorenz K. ,
Schinider B. , y Seemuller E. (1994). ldentication of MLO-specific PCR primers
obtained from 16s/23s rRNA spacer sequences. Proceedings of the 1 oa internacional congressof the internacional organization for mycoplasmology.
261-262.
Kuboyoma T. , Huang C. , Lu X., Sawayanagi T. , Kanazawa T., Kagami T. , Matsuda 1. ,
Tsuchizaki T., y Namba S (1998). A plasmid isolation from phytopathogenic
onion yellows phytoplasma and its heterogeneity in the pathogenic phytoplasma
mutant. Molecular plant Microbe interaction. 11 :1031-1037.
Lao D. (2008). Coco-biodiesel more than a diese! replacement. Bioenergy fórum 2008,
Bangkok, abril2008.
Lee 1. , Gundersen-Ridal D., Davis R. y Bartoszk l. (1998). Revised classification scheme
of phytoplasmas bases on RFLP analyses of 16S rRNA and ribosomal protein
gene sequences. 1 nternational Journal of systematic Microbiology 48:1153-1169.
29
CAPITULO 1
Lee 1. , Davis E. , y Gundersen D. (2000). Fitoplasma: Phytopathoegenic Mollicutes.
Annual Review of microbiology. 54:221-55.
Lee 1. , Brottner J., Munyanesa G., Secor A. , y Gudmestad N. (2004). Clover
proliferation group (16SrVI ), subgrup a (16SrVI-A) phytoplasma is probable
causal agent of potato purple top disease in Washington and Oregon. Plant
Disease 88:429.
Lizano M. (2000) Guía Técnica del Cultivo de Coco, Programa Nacional de Frutas de El
Salvador, Ministerio de Agricultura y Ganadería. MAG El Salvador. p 52
Loi N., Ermacora P., Carraro L. , Osler R. y T. (2002) . Production of monoclonal
antibodies against Apple proliferation phytoplasma and their use in serological
detection. Europan Journal of Plant Pathology. 108:81-86.
Liefting L.W. y Kirkpatrick B.C. (2003). Cosmid cloning and sample sequencing of the
genome of the uncultivable mollicute, Western X-disease phytoplasma,
using DNA purified by pulsed-field gel electrophoresis. FEMS Microbiology
Letters, 221 : 203-211 .
Ma Z. , Cooper C. , Kim H.J. y Buckner Janick D. (2009). A study of rubisco through
western blotting and tissue printing techniques.
Margni R. (1996). lnmunogía e inmunoquimica. 5 edición. Editorial Médica
Panamericana. 335 p.
Macarulla J. (2008). Bioquímica. 6 edición . Editorial Reverté, S.A. 786 p.
Martínez-Soriano J. , Leyva-Lopéz M., Zavala-Soto M. y Leai-Kievesas D. (1999).
Detección molecular del agente causal del síndrome "Bola de hilo" de la papa
en semillas infectadas asintomáticas. Biotecnología aplicada 16:93-96.
Madriz Ordeñana K. (2002). Mecanismos de defensa en interacción planta-patógeno.
Manejo integrado de plagas. 63:22-32.
30
CAPÍTULO 1
McCoy, R. E. (1974). Techniques for treatment of palm trees with antibiotics. Proceedings
of the Florida State Horticultura! Society, 87, 537-540.
McCoy R. , Norris R. , Vieyra G., y Delgado S. (1982). México: lethal yellowing disease of
coconut palm. FAO Plant Protection Bulletin. 30: 79-80.
Mugno Ramírez P. y Filgueira Duarte J. (2008) . Extraction of whole chromosome from
phytoplasma of "urapanes" (fraxinus sp.) by pulsed field gel electrophoresis
(PFGE).
Morton A., Davies D.L., Blomquist C.L. y Barbara D.J. (2003) . Characterization of
homologues of the apple proliferation immunodominant membrane protein
gene from three related phytoplasmas. Molecular Plant Pathology, 4:109-114.
Nishigawa H. , Miyata S., Oshima K., Sawayanagi T., Komoto A., Kuboyama T. , Matsuda
1. , Tsuchizaki T., y Namba S. (2001 ). In planta expression of a protein encoded
by the extrachromosomal DNA of a phytoplasma and related to
geminivirusreplication proteins. Microbiology. 14 7:507-513.
Peroni L. , Dos R. , Coletta H., Alves A. , Machado M. y Stach D. (2008) . Assessment of
the diagnostic potential of immunocapture-PCR and immune-PCR for Citrus
variegated chlorosis. Journal of Microbiological Methods. 75:302-307.
Reyes-Martinez C., Morales-Angeles D. , Cab-Narvaez M., Osuna-Castro J. , Zizumbo
Villarreal D., Oropeza-Salin C. , y Peña-Beltrán Elpidio (2007) . Protein
extraction for Cocos nucifera whit and without lethal yellowing phytoplasma:
gel-based proteomics. Bulletin of insectiology 60:231-232.
Rohde W ., Randles J., Langridge P. y Hanold D. (1990) . Nucleotide sequence of a
circular single-stranded DNA associated with coconut foliar decay virus, Virol ,
5:176-648.
Seemuller E. , Marcene C., Lauer U., Ragozzino A., y Goschl M. (1998) . Currents
estatus of molecular clasification of the phytoplasmas. Journal of plant
pathology 80:805-81 O.
31
CAPÍTULO 1
Suzuki S. , Oshima K. , Kakizawa S., Arashida R. , Jung H. y Yamaji Y. (2006). lnteraction
between the membrane protein of a pathogen and insect microfilament complex.
PNAS. 11:4252-4257.
Shahiriyari F., Reza M., y Shamsbakhsh M. (2011 ). Generation of specific
momoclonal recombinant antibody against Candidatus Phytoplasma aurantifolia
using phage display technology. Bolletin of insectology 64 (supplement): S75-
S76.
Seemüller, E., Stolz, E. y Kison , H. (1998b). Persistence of European stone fruit yellows
phytoplasma in aerial parts of Prunus taxa during the dormant season. Journal of
Phytopathology, 146: 407-410.
Sinclair W.A. y Griffiths H. M. (2000). Variation in aggressiveness of ash yellows
phytoplasmas. Plant Disease, 84: 282-288.
Skoric D., Saric A. , Vibio M. , Murari E. , Krajacié M. y Bertaccini A. (1998). Molecular
identification and seasonal monitoring of phytoplasmas infecting Croatian
grapevines. Vitis, 37: 171-175.
Siddique A.B.M., Guthrie J.N ., Walsh K.B. , White D.T. y Scott P.T. (1998). Histopathology
and within-plant distribution of the phytoplasma associated with Australian
papaya dieback.
Wei W., Kakizawa S., Suzuki S., Jung H. Y., Nishigawa H., Miyata S. , Oshima K., Ugaki
M., Hibi T. y Namba S. (2004b). In planta dynamic analysis of onion yellows
phytoplasma using localized inoculation by insect transmission. Phytopathology,
94(3): 244-250.
Yeh Y., Kai Y., y Chan L. (1998). An antigenic protein gene of a phytoplasma
associated with sweet patato withches 'broom. Microbiology. 144:1257-1262.
Zizumbo-Villarreal , D. (1996). History of coconut (Cocos nucifera L.) in México. Gene.
Resour. Crop. Evol. 43:505-515.
32
CAPITULO 1
Zizumbo-Villarreal , D. , y Piñero D. (1998). Pattern of morphological variation and diversity
of Cocos nucifera (Arecaceae) in México. Am. J. Bot. 85:855-865.
Zizumbo-Villarreal , D. , y Colunga-García M. ( 2001 ). Morpho-physiological variation
and phenotypic plasticity in Mexican populations of coconut (Cocos nucifera
L.). Gene. Resour. Crop. Evol. 48:547-554.
Zizumbo-Villarreal , D., M. Fernández-Barrera, N. Torres-Hernández, y P. Colunga
García M. (2005). Morphological variation of fruit in Mexican populations of
Cocos nucifera L. (Arecaceae) under in situ and ex situ conditions. Genet. Resour.
Crop. Evol. 52:419-432.
33
CAPITULO 11
CAPÍTULO 11
ANÁLISIS BIOINFORMATICO DE LA SECUENCIA DE LA PROTEÍNA DE MEMBRANA INMUNODOMINANTE (I'MP) DEL FITOPLASMA DEL AMARILLAMIENTO LETAL
2.11NTRODUCCIÓN.
En América y el Caribe la producción del cocotero contribuye con cerca del 10% a la
producción mundial , siendo México y Brasil los países productores más importantes. En
México, el cocotero es uno de los cultivos de mayor importancia económica, con una
superficie sembrada de 100 mil ha, de las cuales dependen cerca de aproximadamente
50 mil familias que viven directamente del cultivo (CONACOCO, 2008).
Desafortunadamente, la palma de cocotero está sujeta al ataque de diversos agentes que
producen diversas enfermedades que afectan su producción, entre estos se encuentran;
los virus, viroides, protozoos, hongos, nematodos y molicutes, como el fitoplasma el
causante del amarillamiento letal, (Rohde et al. , 1990; Hanold y Randles, 1991 ;
Parthasarathy et al., 1978; Joseph y radha, 1975; Griffith , 1987; Howard y Barrant, 1989).
La coexistencia de lmp con otros tipos de genes inmunodominantes en algunos
fitoplasmas sugiere a la proteína lmp como un ancestro común. Análisis de la diversidad
genética ha demostrado que los genes lmp en diferentes fitoplasmas son mas variables
que los genes circundantes (Kakizawa at al. , 2009). Además, la capacidad de la proteína
lmp de Ca. phytoplasma mali , es de importancia para el fitoplasma en la planta, se ha
sugerido que participa en la movilidad del fitoplasma dentro de la célula infectada.
(Boonrod et al., 2012). Sin embargo, es de suma importancia obtener más información de
la secuencia para describir mejor la variabilidad de la lmp y comprender el papel de la
proteína en diferentes grupos de fitoplasmas.
En este capítulo, nuestro objetivo principal , fue la caracterización e identificación de las
secuencias obtenidas por medio de diferentes programas bioinformáticos. Para lo cual , se
evaluarán los porcentajes de identidad de las secuencias con proteínas lmp descritas de
otros grupos de fitoplasmas, y se identificaran los motivos característicos de las proteínas.
35
CAPITULO 11
2.2 MATERIALES Y MÉTODOS.
2.2.1 Porcentaje de identidad con las accesiones del Gen Bank
La secuencia deducida de aminoácidos proporcionado por el Dr. Nigel Harrison fue
analizada por medio del programa BLASTX para determinar su porcentaje de identidad
con proteínas de lmps, descritas en otras cepas de fitoplasmas en base a las accesiones
del Gen Bank (www.ncbi.nlm.nih.gov) , así como también los valores de E (probabilidad de
alineamiento que no haya ocurrido al azar). La homología de la secuencia con las
proteínas lmp, fue hecha a base de comprobar que si existe un grado de similitud
suficiente alto entre las secuencias comparadas.
2.2.2 Obtención de los marcos de lectura abierta e identificación de los motivos característicos de las proteínas de resistencia
Se obtuvieron todas las secuencias que presentaron homología a proteínas lmp, las
secuencias fueron alineadas por medio del software ClustaiX (Larkin et al., 2007) y el
sombreado de los aminoácidos conservados se realizó utilizando el programa Boxshade
v.3.21. De esta manera se pudo identificar la presencia de los motivos característicos de
las proteínas Imp.
2.2.3. Clasificación de las secuencias en base a su porcentaje de identidad
Una vez identificados los motivos característicos, se realizó una comparación entre las
secuencias obtenidas por medio del programa BLASTP y las que presentaron más del
90% de identidad fueron clasificados dentro de un mismo grupo. Posteriormente se realizó
un alineamiento usando el software Mega versión 5.0 (Saitou y Nei, 1987).
36
CAPITULO 11
2.3 RESULTADOS.
2.3.1. Análisis bioinformatico de la secuencia de la proteina de membrana inmunodominate (lmp)
Para determinar que la secuencia de la cual se generó el anticuerpo era una proteína del
tipo lmp y para determinar la probabilidad de que éste reconociera de manera específica
proteínas de membrana de fitoplasmas y no de plantas, la secuencia con la cual se
generó el anticuerpo, fue analizada por medio del programa BLASTX. También se
determino el porcentaje de identidad con otras proteínas descritas en otras especies de
microorganismos y plantas en base a las accesiones del Gen Bank
(www.ncbi.nlm.nih.gov), así como también los valores de E (probabilidad de que el
alineamiento BLAST no haya ocurrido al azar). La homología de nuestra secuencia con
otras proteínas, fue hecha en base al porcentaje de identidad de las accesiones del Gen
Bank. Los resultados se pueden ver en el cuadro 3, donde se muestra que la secuencia
deducida de aminoácidos usada para generar nuestro anticuerpo presenta un grado de
similitud relativamente alto entre proteínas inmunodominantes de membrana de otros
fitoplasmas.
37
CAPITULO 11
Cuadro 3. Resultados de la identidad encontrada entre la secuencia deducida de aminoácidos de la lmp del fitoplasma del AL y las secuencia del Gen Bank por medio de BlastX.
\layor imilitud % lo;, 1a:~. .
idéntidad ,.,aluado Scon· -Putallv m mbran PfOI n 100 2 ·102 301
Palm lethal yellowlng Phytoplasma
35 2 ·12 69.7 lmmunodomonant m mbr n prot Candldatus Phytoptasrna oryzae.
36 0009 42.7 In rnunodommant "' rnbrr o prot n
K orean potato witchn • ·broom phytoplasma
30 00 5 42 4 lmmunodom1n 1m mbron prot n Crotalaria phytlody phytoplasma
30 0032 lmmunodomma t m mb n prot n
Candidatus Phytoplasma mall
31 39.7 tmmunodomlnant m rnbran prot r
Witches · -broorn phytoplasma
lmp 39 020 39 3 tmmunodomu1a 1 mombrano prol n
Candidatus Phytoplasrna rnalí
37 20 37 hypothetu:al prototn Kpol_1048p62 (Vandorwaltozyml!
polyspora DSM 70294) >gb(ED018631 .1(
43 2. 358 lmmunodominant membrone pro n, parti 1
Poar declino phytoplasma (Talwan 11)
42 37 36. Pro m SMC-4 (Ca 001h bdtll
leg ns)>s Q20060.11SMC4_CAEEL Rec ame: Fuii•Structural malntonanco of chromosomes
protoin oi&; Short•SMC
85 354 hypothe cal pro1e1n '" Ptasmod1um sp
[Piasmodlum knowlosl straln H) "tmb(CAQ38803.1( hypothotlcaJ protoln, conservod in Plasmodium
spocies (Piasrnodium knowles l str In H)
95 35 4 tmmuGK 17135 Orosoptul
willlstoni:.gbiEDW7268-4.1/GK1713S.
38
CAPÍTULO 11
2.3.2 Identificación de los motivos característicos
Siampour et al. , 2013 reporta una lista de secuencias de genes de lmps (cuadro 4) de
fitoplasmas que afectan a cultivos de interés comercial , mediante este reporte se obtuvo
de la base de datos del Gen Bank, las secuencias deducida de aminoácidos del grupo
16Sr-ll .
Cuadro 4. Lista de aislados de fitoplasmas del grupo 16Sr-ll (Siampour et al., 2013)
Con esta información se realizo un alineamiento con las secuencias de los lmps
reportados y la secuencia de la lmp donada por el Dr. Nigel Harrison de la Universidad de
Florida que pertenece 16Sr-IV, esto se llevo a cabo, utilizando el programa ClustaiX
(Thompson et al., 1997) y el programa Boxshade v.3.2 para sombrear las regiones.
39
CAPITULO 11
:;.J.\5:19~ . 1
ADC3892l . l AF.K64760 . 1 J\FK64 '157 . 1 AFK64756,1 ;A K 4761 . l\FK6476 . l AFK6.;,75 . AFK 476<; . 1 AFK6476!> . 1 A0059 0 . .1 AAC46382 . 1 AD059 07 . 1 J\l''K6.;,'166 . 1 AF.K6475 · . 1 AFK647 !> . l AFK6 7 7 . 1 t<AH?.4;:! 1.1
Figura 2.1. Alineamientos de las secuencias de aminoácidos de lmps aisladas
de ·candidatus fitoplasma aurantifolia y la accesión ACJ45993.1 del fitoplasma
de ·candidatus fitoplasma palmae.
Los resultados de la alineación (fig . 2.1) indica que la secuencia deducida de aminoácidos
del lmp del fitoplasma del AL es diferentes al del lmp de las cepas evaluadas del
fitoplasma Candidatus Fitoplasma aurantifolia '
40
CAPÍTULO 11
2.4 DISCUSIÓN
Las proteínas inmunodominantes, las cuales son los blancos de la mayoría de los
anticuerpos dirigidos contra fitoplasmas, están localizados en la superficie de las células
del fitoplasmas y son las proteínas más abundantes de la membrana plasmática (Shen y
Lin, 1993). Las proteínas inmunodominantes han sido clasificadas de la siguiente manera
(Kakizawa et al., 2006): i) proteínas inmunodominantes de membrana (lmp); ii) proteína
inmunodominante tipo A (ldPA) y proteína antigénica de membrana (Amp). En nuestro
caso la proteína contra la cual se generó el anticuerpo es del tipo de proteína
inmunodominante de membrana.
El análisis bioinformático de secuencias que es una herramienta valiosa para determinar
si es la proteína objeto de estudio tiene homología con otras proteínas similares. En el
presente estudio los resultados mostraron que la secuencia de la cual se genero el
anticuerpo presentó homología con genes de lmp de fitoplasmas diferentes al AL, sin
embargo cuando se comparó con genes lmp pertenecientes a diferentes tipo de
fitoplasmas perteneciente al grupo de 'Candididatus Phytoplasma aurentifolia' (16Sr-ll)
obtenidas de diferentes partes de Asia , Africa y Australia (Siampour et al., 2013) presentó
motivos diferentes factor que favorece la selectividad del anticuerpo generado. Las
diferencias no son raras encontrarlas en los lmps, ya que dichas proteínas están bajo la
presión de fuerzas de selección y que incluso entre aislados del mismo grupo de
fitoplasmas estas proteínas muestran la acumulación de mutaciones no-sinónimas, con
valores de hasta del 77% (Siampour et al., 2013). La mayoría de las mutaciones o
diferencias se encontraron en los dominios extracelulares, en cambio el dominio
transmembranal fue mucho más conservado.
Los resultados encontrados con el análisis bioinformático mostraron que la secuencia de
aminoácidos con la cual se generó el anticuerpo es una proteína del tipo lmp ya que
presentó una alta homología con proteínas lmp de otros fitoplasmas y no presentó
homología con proteínas de plantas.
41
CAPÍTULO 11
2.5 CONCLUSJON
Al llevar a cabo el análisis de la secuencia de la proteína lmp del fitoplasma del AL, por
medio de diferentes tipos de análisis bioinformáticos se determino que la secuencia es
especifica, por lo tanto el anticuerpo policlonal con el que se cuenta tiene una alta
probabilidad de detectar el inmunógeno Imp.
42
CAPITULO 11
2.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Berg M., Davies L., Clark M., Vetten H., Maier G., Marconen C. y Seemuller E. (1999).
lsolation of gene encoding an inmmunodominant membrane protein of the apple
proliferation phyotoplasma, and expression and characterization of the gene
product. Microbiology. 145:1937-1943.
Boonrod K., Munteanu B., Jarausch B. , Jaurausch W. y Krczal G. (2012). An
lmmunodominant Membrane Protein (lmp) of ·candidatus Phytoplasma mali'
Binds to Plant Actin. Molecular Plant-Microbe lnteractions 25:889-895
CONACOCO (2008). Consejo Nacional del cocotero, www.conacoco.com.mx
Griffith R. (1987). Redring disease ofcoconut palm. Plant Dis, 71 , 193-196. Harrison N. y
Oropeza C. (2008). Coconut lethal yellowing , in characterization , diagnosis and
management of phytoplasma. Pp 219-248.
Hanold, D. y Randles, J (1991 ). Coconut cadang-cadang disease and its viroid agent.
Plant Dis, 75, 330-335.
Howard F. y Barrant C. (1989). Question and answers about lethal yellowing disease.
Príncipes, 33: 163-171.
Joseph, T. y Radha K (1975). Role of Phytophthora pa/mivora in but rot of coconut.
Plant Dis Reptr, 59, 1014-1017.
Kakizawa S., OshimaK., lshii Y., Hoshi A. , Maejima K., Jung H. , Yamaji Y. y Namba S.
(2009). Cloning of lmmunodominant membrane protein genes of phytoplasmas
and their in planta expression. FEMS Microbio! Lett 293:92-101.
Liefting , W. L. , Andersen , M. , Beever, E. R. , Gardner, C. R. , y Forster, R. L. S. (1996).
Sequence heterogeneity in the two 16S rRNA genes of Phormium Yellow Leaf
phytoplasma. Applied and Environmental Microbiology, 3133-3139.
43
CAPÍTULO 11
Morton A. , Davies D.L. , Blomquist C.L., y Barbara D.J. (2003) . Characterization of
homologues of the apple proliferation immunodominant membrane protein
gene from three related phytoplasmas. Molecular Plant Pathology, 4: 109-
114.
Rohde W ., Randles J., Langridge P., y Hanold D. (1990). Nucleotide sequence of a
circular single-stranded DNA associated with coconut foliar decay virus, Virol ,
5:176-648.
Siampour M. , lzadpanah K. , Galetto L. , Salehi M. , y Marzachi C. (2013) . Molecular
characterization , phylogenetic comparison and serological relationship of the lmp
protein of several ·candidatus Phytoplasma aurantifolia ' strains. Plant Pathology
62 :425-459
44
CAPITULO 111
CAPÍTULO 111
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA DETECCIÓN DE FITOPLASMA DEL AL CON UN ANTICUERPO QUE RECONOCE A LA PROTEÍNA IMP DE DICHO FITOPLASMA
3.1 INTRODUCCIÓN
La palma de coco (Cocos nucifera L.) es uno de los cultivos tropicales más importantes
económicamente (Parrota, 1993; Meléndez-Ramírez et a/. , 2004). Debido a sus múltiples
usos en beneficio de millones de personas y en la conservación del ambiente (Mpunami et
a/., 2000), es llamado el árbol de la vida (Harries et a/., 2004; Chan y Elevitch , 2006). Sin
embargo, es susceptible a diversas plagas y enfermedades. Entre las enfermedades más
severas y devastadoras se encuentra el amarillamiento letal (AL), el cual ha eliminado
millones de palmas de coco en Florida, el Caribe y México en los últimos 40 años
(Oropeza et al., 1997; Brown et a/. , 2006). Un fitoplasma es conocido como el agente
etiológico del AL. estudios serológicos y moleculares han mostrado que los fitoplasmas
contienen un gen que codifica para una proteína de membrana y ésta es única para cada
especie. Tres tipos de proteínas de membranas inmunodominantes (IDPs) , no homólogas
pero altamente abundantes han sido identificadas en los fitoplasmas, siendo estas; Amp,
ldpA y lmp (Boonrod et a/., 2012; no publicado) . Estas proteínas son abundantes en la
superficie externa de la célula, y de su estudio se podría explicar la posible interacción
fitoplasma-huésped (Camarena y De la Torre, 2008). Los genes que codifican IDPs han
sido aislados de algunos fitoplasmas, los cuales han mostrado ser muy diferentes en la
composición de aminoácidos y antigenicidad. Estas proteínas de membrana están en
contacto directo con sus hospederos y juegan un papel crucial en la dispersión del
fitoplasmas dentro de la planta, así como en el insecto vector.
En este capítulo nuestro objetivo principal desarrollar un protocolo para la detección de
fitoplasma del AL con un anticuerpo que reconoce a la proteína lmp de dicho fitoplasma.
45
CAPiTULO 111
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS
3.2.1 Obtención del extracto proteico
Se colectaron tejidos de hojas de 14 palmas de cocotero (Cocos nucifera L. ) que
presentaban síntomas típicos de AL (según la escala de Me Coy, 1983) y 1 O
asintomáticas, en distintas localidades del estado de Yucatán ; el material biológico se
colocó en bolsas de nylon con sus respectivas etiquetas y se transportó al laboratorio.
3.2.2 Anticuerpos empleados
Se empleo una anticuerpo policlonal anti-LY (lgG, PAC 5377/5378, 2.7 mg/mL 0.1%
NaN03), desarrollado con la proteína de membrana lmp del fitoplasma implicado en la
enfermedad del amarillamiento letal, dicho anticuerpo fue donado por el Dr. Nigel Harrison
del laboratorio de Patología Vegetal de la Universidad de Florida. Igualmente se empleo el
anticuerpo secundario goat anti rabbit de la casa comercial Millipore rM marcado con
fosfatasa alcal ina, (Sigma-Aidrich).
3.2.3 Extracción de ADN para la detección del fitoplasma del AL
Se utilizó un protocolo descrito por Harrison et al., (1994) con modificación menores para
extraer el ADN de 100 mg de muestras de tej ido de palma. Brevemente, cada muestra
(excepto para muestras de tallo) se pulverizó en nitrógeno líquido, se mezcló con 500 ¡JI
de 2% CTAB y luego se incubaron a 65°C durante 30 min . Después las muestras se
dejaron enfriar a temperatura ambiente, los extractos resultantes se emulsificaron con un
volumen igual de fenal : cloroformo: alcohol isoamílico (25:24: 1 v 1 v 1 v) y se centrifugó a
14.000 g durante 5 min . Los ácidos nucleicos totales se obtuvieron por centrifugación al
mezclar la fase acuosa con isopropanol frío. La pastilla de ácido nucleico se secó
brevemente y se resuspendió en 100-200 ¡JL de tampón TE (1 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH
8) y se incubaron con ARNasa durante 1 hora a 37 oc.
46
CAPITULO 111
3.2.4 Detección del fitoplasma de AL
Para la detección del fitoplasma del AL se utilizó la técnica de PCR tiempo real y el
empleo de una sonda Taqman que reconoce de manera específica una región especifica
de este. Se emplearon los siguientes cebadores (5'-GCT AAAGTCCCCACCAT AACGT -3')/
LY16LSR (5'-CGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGT-3') y la sonda (FAM
CCCCTGTCGTT AA TTG-NFQ) para la detección especifica del grupo del fitoplasma
16SriV. Las reacciones se realizaron en un volumen de 20 IJL conteniendo 1 O iJL de
TaqMan de PCR universal master mix con AmpErase UNG (Uracil N-Giycolasa) (Applied
Biosystems) 1 iJL de la mezcla de los cebadores conteniendo 900 nM de cada cebador,
sonda 250 nM y 50 ng de ADN. La amplificación se realizó con un sistema de PCR tiempo
real (Bio-Rad) CFX96. La PCR se realizó en dos pasos 2 min a 50°C para activar la
AmpErase UNG, 10 minutos a 95°C para activar AmpliTaq Gold ADN polimerasa seguido
de 40 ciclos a 95°C durante 15s y 1 minuto a 61 °C. Todas las muestras de ADN, incluidos
los controles se evaluaron por duplicado. El ciclo umbral (Ct) los valores de cada reacción
se ajustaron manualmente para interceptar la fase exponencial de las curvas de
amplificación.
3.2.5 Métodos evaluados para el aislamiento de proteínas.
En los siguientes apartados se describen los procesos empleados para determinar el
método adecuado para los extractos proteicos de los diferentes tejidos de cocotero.
Método A: Método reportado por Islas Flores, 1998, con algunas modificaciones, se
pesó 1 g del tejido pulverizado (hoja), se transfirió a tubos eppendorf de 2 mL, luego se
agregó el amortiguador de extracción (Tris-HCI 50 mM PH 7.4, pirofosfato de sodio 10
mM, NaCI 50 mM, sacarosa 250 mM, glicerol al 10% EGTA 1 mM, PMSF 0.2 mM, 13.
mercaptanol 1 mM, leupeptina y aprotinina 1 ¡.Jg/mL) se mezcló en vortex por 30 s para
después centrifugar a 14,000 g por 30 minutos a 4°C, el sobrenadante obtenido se
centrifuga nuevamente a 14,000 g durante 20 minutos a 4°C, se recuperó el sobrenadante
y las muestras se sometieron a liofilización con la finalidad de concentrar la cantidad de
proteína. Las muestras se conservaron a -80 oc hasta su uso.
47
CAPÍTULO 111
Método 8: Método reportado por Cho et al., 2006 y Swery et al., 1995 con algunas
modificaciones. Se pesaron 0.5 g de tejido (hoja) , se maceró en presencia de nitrógeno
liquido, hasta obtener un polvo bien fino, el macerado se transfirió a tubos eppendorf, para
ser suspendidos en 1.2 mL de ácido tricloroacético al1 O% (p/v) en acetona fría con 0.07%
de 2-mercaptoetanol, la suspensión se mezcló con la mano y luego en vórtex por 1m in,
posteriormente, se incubó por mínimo 2h a -30°C.
El homogenizado se centrifugó a 14000 rpm por 20min a 4°C. La pastilla obtenida se lavó
en 1 mL de acetona fría con 0.07% de 2-mercaptoetanol (-30°C), la resuspensión fue
centrifugada a 14,000 rpm por 5 min a 4°C. Esta operación fue repetida hasta que la
pastilla se tornó transparente o incolora. La pastilla resultante fue secada a temperatura
ambiente por máximo 10 min .
Las proteínas del tejido tratado fueron extraídas en 0.5 mL de buffer de homogenización
(0.1 M Tris-HCI pH 8.0, 5 mM EOTA pH 8.0, 2% SOS (p/v) , 18% sacarosa (p/v) , 1% PVP-
40 (p/v) y 40mM 2-mercaptoetanol) y un mismo volumen de fenal absoluto. La suspensión
fue mezclada vigorosamente durante 1 minuto, hasta lograr una homogenización de la
mezcla, el extracto de lisado fue centrifugado a 12,000 rpm por 5 min a temperatura
ambiente. El sobrenadante (0.3 mL), que contiene las proteínas, se transfirió a un tubo
eppendorf, evitando destruir la interface constituida por el SOS. Por consiguiente, se le
adicionó 1 mL de 0.1 M acetato de amonio en metanol frío (-30 °C). La solución se dejó
precipitando a -30 oc por 2h o durante toda la noche.
Las proteínas precipitadas se recuperaron por centrifugación a 12,000 rpm durante 5 min
a 4°C y el sobrenadante fue descartado. La pastilla obtenida se lavó dos veces con 1 mL
de acetona fría al100% (-30°C} . La pastilla fue secada en vacío a temperatura ambiente
durante 1 O a 15 m in. y conservada a -80°C en un congelador hasta su uso.
Método C: Método reportado por Arashida et al., 2008 con algunas modificaciones se
maceró 1g de tejido fresco congelado en nitrógeno liquido en un mortero, posterior se le
agregó el amortiguador de extracción (Tris-HCI 30 mM pH 6.8, SOS 2% y 6% de
mercaptoetanol) , enseguida se incubó a 95°C durante 5 minutos se centrifugó a 14,000g
por 15 minutos, el sobrenadante se recuperó y se conserva a -80°C hasta su uso.
48
CAPITULO 111
La separación de proteínas a partir de tejido de planta a menudo se complica , debido a
esto es necesario modificar protocolos, dependiendo del tipo de tejido y la presencia de
diferentes compuestos de interferencia como los fenolicos, en este trabajo se ha
establecido un procedimiento de rutina para la aplicación de análisis proteomico para
estudiar la interacción entre la palma de coco y el fitoplasma del amarillamiento letal. Es
por eso que se planteo evaluar los métodos antes mencionados. Seleccionando el método
A, ya que cumplió con los requerimientos para nuestros análisis. Más detalles en el
apartado de resultados.
3.2.6 Método de Dot-Biot
El método de Dot-Biot se realizó de acuerdo al protocolo descrito por Islas Flores, 1998,
con algunas modificaciones, se aplicaron 15¡Jg de extractos de proteínas en membrana de
nitrocelulosa Hybond-P, cada muestra aplicada en la membrana se fijo con la ayuda de
una secadora de cabello convencional. Posteriormente la membrana fue bloqueada, con
TBSMT (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7.5 con 5% (p/v) de leche libre de grasas
(Svelty) y 0.05 % de Tween-20) durante 1 h a temperatura ambiente, posteriormente, a las
membranas se lavaron con amortiguador TBS-T (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7.5,
0.05% Tween-20) por 15 minutos cada vez a temperatura ambiente y agitación constante
(65 rpm) . Tras los lavados. Las membranas fueron incubadas con el anticuerpo primario
(anti-L Y) en dilución (1 : 1 000) con el amortiguador TBST durante 1 h en agitación
constante (65 rpm). Enseguida, las membranas fueron lavadas dos veces con el
amortiguador TBST durante 15 minutos en agitación constante (65 rpm). Una vez lavada
la membrana finalmente se incubó con el anticuerpo secundario de cabra contra conejo
de la casa comercial (Millipore ™) marcado con fosfatasa alcalina, (Sigma-Aidrich) en una
dilución (1 :5000) con amortiguador TBST durante 1 h en agitación constante (65 rpm) .
Finalmente la reacción de inmunodetección se reveló en la membrana con 0.4 mg/mL y
0.19 mg/mL del sustrato BCIP/NBT respectivamente, durante 30 minutos en agitación
constante (65 rpm) , bajo oscuridad . La reacción fue detenida con agua destilada estéril.
49
CAPÍTULO 111
3.2.6 lnmunodetección de la proteína inmunodominante de membrana (lmp)
Se prepararon geles de poliacrilamida al 12% (SDS-PAGE), en los cuales se resolvieron
el perfil de proteínas (1 00 ¡Jg de proteínas totales). Después de la separación de las
proteínas, éstas fueron electrotransferidas a una membrana de nitrocelulosa (810-RAD).
Posteriormente la membrana fue bloqueada, TBSMT (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI , pH
7.5 con 5 % (p/v) de leche libre de grasas (Svelty) y 0.05 % de Tween-20) durante 1 h a
temperatura ambiente después a las membranas se realizaron lavados con amortiguador
TBS-T (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI , pH 7.5, 0.05% Tween-20) por 15 minutos cada
vez a temperatura ambiente y agitación constante (65 rpm) . Tras los lavados. Las
membranas fueron incubadas con el anticuerpo primario (anti-L Y) en dilución (1: 1 000) con
el amortiguador TBST durante 1 h en agitación constante (65 rpm) . Enseguida, las
membranas fueron lavadas dos veces con el amortiguador TBST durante 15 minutos en
agitación constante (65 rpm). Una vez lavada la membrana finalmente se incubó con el
anticuerpo secundario goat anti rabbit de la casa comercial Millipore rM marcado con
fosfatasa alcalina, (Sigma-Aidrich) en una dilución (1 :5000) con amortiguador TBST
durante 1 h en agitación constante (65 rpm) . Finalmente .la inmunodetección se rebeló con
con 0.4 mg/mL y 0.19 mg/mL del sustrato BCIP/NBT respectivamente , durante 30 minutos
en agitación constante (65 rpm), bajo oscuridad . La reacción fue detenida con agua
destilada estéril.
50
CAPITULO 111
3.3RESULTADOS
3.3.1 Colecta de tejido vegetal
Para llevar a cabo la colecta del material vegetal , se tomó en cuenta los síntomas típicos
del AL en las palmas, las muestras se colectaron en distintas localidades del estado de
Yucatán, el material biológico se colocó en bolsas de nylon etiquetados y se transportó
hasta el laboratorio.
Figura 3.1. Palmas de cocotero (Cocos nucifera) imágenes tomadas en
Chicxulub puerto. Donde A: Cocos nucifera sano y B: Cocos nucifera con
síntomas de AL (Fotos tomadas de distintas localidades de Yucatán).
51
CAPÍTULO 111
Figura 3.2. Palmas de Cocotero (Cocos nucifera) de diferentes partes de la
península , palmas con síntomas de amarillamiento letal (Fotos tomadas de
distintas localidades de Yucatán) .
3.3.2 Optimización del método de extracción de proteínas
El método de western blot es una de las herramientas para separar e identificar la
expresión génica a nivel proteomica , una vez obtenidos las muestras fueron separadas en
base a su peso molecular en un gel desnaturalizante (SDS-PAGE) al 12 %. En la figura
3.4 , se muestra las proteínas extraídas por los distintos métodos, dónde se observa que
aun cuando las proteínas fueron cuantificadas por el mismo método y se cargó en el gel la
misma cantidad no se observan homogéneas respecto a la cantidad . Pero en general las
proteínas se separaron de manera correcta (Fig. 3.4) . Comparando los métodos A , By C,
el método A , presento el mejor patrón electroforético homogéneo, con bandas legibles de
buena calidad y se pueden observar proteínas de todos los pesos moleculares, lo cual
nos indica que el extracto es una mezcla compleja de proteínas, lo que no se observa en
el método By C.
52
CAPÍTULO 111
Obtener proteínas de 10-30 k Da en el método de extracción es de suma importancia por
lo tanto el método seleccionado fue el A.
Cho et al. , 2006 y Swery et al., 1995
(B) (C) Islas-Flores., 1999 Arashida et al .. 2008
Figura 3.3. Comparación de perfiles proteicos, entre los distintos métodos de
extracción. Gel de poliacrilamida al 12%. Carriles del 1-6 corresponden a las
variaciones de los métodos de extracción , 1 O ¡.JL de cada muestra fueron
cargados, M: corresponde al marcador de peso molecular.
3.3.3 Evaluación de funcionalidad del anticuerpo mediante Dot-Biot
Una vez elegido el método adecuado para la extracción de proteínas se establecieron las
condiciones para evaluar el anticuerpo Anti-L Y.
Como primera evaluación del anticuerpo Anti-L Y se realizaron pruebas preliminares de
inmunodotección En la figura 3.5 se puede apreciar los resultados en los diferentes
extractos, (1) Cocos nucifera infectado (2) Pritchardia pacifica infectada, (3) Cocothrinax
readdi infectada, (4) Pritchardia pacifica sana, (5) Cocos nucifera sano (6) Haplaxius
crudus. Se puede apreciar la reacción de los diferentes extractos proteicos con los tejidos
53
CAPÍTULO 111
con síntomas del AL y los tejidos asintomáticos se aprecian una mínima o nula reacción .
) 1
./
Figura 3.4. lnmunodetección en membrana de nitrocelulosa de extractos de
proteínas de plantas e insectos infectados con fitoplasmas asociados al
amarillamiento letal (AL) . (1) Cocos nucifera Infectado, (2) Pritchardia pacifica
infectada, (3) Cocothrinax readdi infectada, (4) Pritchardia pacifica sana, (5)
Cocos nucifera , (6) Myndus crudus.
Debido a los resultados obtenidos se prosiguió a realizar una evaluación de reacción
inespecífica evaluando el anticuerpo secundario , con el fin de verificar si existía alguna
reacción inespecífica del anticuerpo secundario se decidió probar extracto de proteínas de
tejidos de palmas de cocotero. En la figura 3.6 se puede apreciar los resultados
obtenidos, mediante la evaluación del anticuerpo secundario , se llevo a cabo el análisis
del anticuerpo secundario, (goat anti rabbit conjugado a fosfatasa alcalina) en ausencia
del anticuerpo primario (Anti-L Y) , en la figura 3.6A se puede apreciar que no hubo alguna
reacción inespecífica, tanto en extracto de tejido sano, (fig. 3.6A 1-2) así como en extracto
de tejido infectado (fig 3.6A 3-4). Estos resultados fueron alentadores debido que todo
parecía indicar que el anticuerpo primario (Anti-LY), está siendo funcional ante extracto
proteico de palmas de cocotero infectados (fig . 3.68 3-4) y ningún tipo de reacción en
sanos. Cabe mencionar que al llevarse a cabo este experimento previamente se cuantifico
el extracto proteico para cargar la misma cantidad de proteína de cada muestra analizada.
54
CAPITULO 111
A B
1 0 20 10 20 '~
¡
30 40 0 4 0 Figura 3.5. lnmunodetección de extractos de proteína de palmas de cocotero
sanas e infectadas con fitoplasmas, donde A 1-2 y B 1-2 tejido de hoja sana, y
A3-4 y 83-4 tejido de hoja infectado. 15 IJ9 del extracto se cargaron en una
determinada área de la membrana.
Obteniendo estos resultados, lo siguiente fue evaluar la dilución optima del anticuerpo,
empleando extractos proteicos sanas (fig3.7 A-1 ,3, 8-1,3 y C-1 ,3) y extractos proteicos
infectados (figura 3.7 A-2,4 , 8-2,4 y C-2,4). Inicialmente se manejaron diluciones del
anticuerpo primario 1:1,000 y anticuerpo secundario 1:5,000 (Fig. 3.7 A) , se decidieron
probar otras diluciones mayores, 1:1500 y 1:10000 (Fig . 3.78) y 1:10,000 y 1:15000 (Fig.
3. 7C), Como se puede apreciar la dilución más adecuada fue 1:1000 de anticuerpo
primario y 1 :5000 de anticuerpo secundario, debido a que se tuvo una reacción más
consistente en cuanto a la intensidad de la coloración , seleccionado esta dilución para las
evaluaciones posteriores (Fig. 3.7 A).
55
CAPÍTULO 111
o Dilución {1)
Anti-LY= 1:1,000 Anti-rabit= 1 :5,000
B
o 2
o Dilución {2)
Anti-LY= 1:5,000 Anti-rabit= 1:10,000
e
o 3 o
D b
Dilución (3) Anti·LY= 1:10,000
Anti-rabit= 1:15,000
Figura 3.6. Evaluación de las tres diferentes diluciones del anticuerpo primario
(Anti-L Y) y anticuerpo secundario (Anti-rabit) . Panel A: dot blot de extractos
proteicos de tejidos de cocotero infectado incubados con una dilución 1: 1 000 el
anticuerpo primario y 1 :5000 anticuerpo secundario . Panel B: dot blot de
extractos proteicos de tejidos de cocotero infectado incubados con una dilución
1:5000 del anticuerpo primario y 1 :10000 anticuerpo secundario. Panel C: dot
blot de extractos proteicos de tejidos de cocotero infectado incubados con una
dilución 1: 1 0000 del anticuerpo primario y 1:15000 anticuerpo secundario.
3.3.4 Detección de fitoplasmas por PCR tiempo real
Para determinar sí el anticuerpo reconocía proteínas del fitoplasma un primer paso fue
obtener muestras de diferentes palmas de Cocos nucifera infectadas con el fitoplasma del
AL y la obtención de ADN de buena integridad, posteriormente se llevo a cabo el análisis
por medio de la técnica de PCR tiempo real utilizando una sonda TaqMan que tiene como
blanco al gen 16S ribosomal del fitoplasma del AL (Puch-Hau, 2010). Los resultados se
muestran en la tabla 1.
56
CAPÍTULO 111
Cuadro 5. Resultados de análisis de detección del fitoplasma del AL por la técnica de
PCR tiempo real.
Lote1 -- ---~-- -----
Clave de muestra
P1 asintomática (-)
P2 asintomática N/ A (-)
P3 asintomática N/ A (-)
P4 asintomática N/ A (-)
P5 asintomática N/ A (-)
P6 sintomática 19.54 (+)
P7 sintomática 19.39 (+)
P8 sintomática 20.34 (+)
P9 sintomática 24.99 (+)
P10 sintomática 26.73 (+)
P11 sintomática 28.51 (+)
P12 sintomática 28.32 (+)
Control positivo Enferma 17.02 (+)
Control negativo Sana N/ A (-)
N/A: no amplificado
57
CAPÍTULO 111
lote2 Clave de muestra
1
Sintomatología Detección
P1 asintomática N/ A (-)
P2 asintomática N/ A (-)
P3 asintomática N/ A (-)
P4 asintomática N/ A (-)
P5 a sintomática N/ A (-)
P6 sintomática 15.5 (+) P7 sintomática 17.4 (+)
P6 sintomática 21 .65 (+) P9 sintomática 22.13 (+)
P10 sintomática 25.76 (+)
P11 sintomática 29.73 (+)
P12 sintomática N/ A (+) Control positivo Enferma 17.05 (+)
Control negativo Sana N/ A (-)
N/A: no amplificado
Los resultados de la tabla 5 muestran que la mayoría de las plantas con síntomas típicos
de AL fueron positivas, ya que mostraron un valor de ciclo umbral (ciclo el cual inicia la
amplificación logarítmica del ADN) entre 15-30, corroborando de esta manera que las
plantas estaban infectadas con el fitoplasma causante del AL. Valores de Ct mayores a 30
son negativos a esta prueba.
58
CAPITULO 111
3.3.5 Evaluación de funcionalidad del anticuerpo mediante Dot-Biot en diferentes palmas de cocotero (Cocos nucifera L.) infectadas con AL
Para determinar la funcionalidad del anticuerpo Anti-L Y y la reproducibilidad de la técnica
de Dot-blot, se realizaron pruebas de inmunodetección usando extractos de proteínas
totales obtenidos de plantas con y sin síntomas de amarillamiento letal (AL). Se analizaron
un lote de 12 palmas colectadas en diferentes lugares de la península siendo 5 de estas
sanas (Fig. 3.8A) y 7 infectadas por AL (Fig. 3.88) los resultados mostraron que los
extractos proteicos de las palmas sanas nos mostraron reacción cuando fueron incubados
con el anticuerpo anti-L Y y anticuerpo secundario. Por el contrario los extractos proteicos
de las palmas infectados fueron reconocidos por el anticuerpo anti-L Y en las palmas
analizadas utilizando dos diferentes concentraciones de proteínas totales: 50 ¡.Jg (Fig. 3.8)
y 75 ¡.Jg (Fig . 3.9). De igual manera en la figura 3.88 se puede apreciar, la señal de
reacción concuerda con los Cts que se obtuvo en el análisis de qPCR, mientras menor
sea el valor del Ct la señal de reacción del anticuerpo y por consiguiente, si el Ct es mayor
la señal de reacción disminuye.
(A)
(B)
1 2 3 S
7
Figura 3. 7. lnmunodetección en membrana de nitrocelulosa de extractos
proteicos, tejido de hoja de 5 palmas de cocotero sanas (A) y 7 palmas de
cocotero infectadas con AL y los valores de Cts representado en los recuadros
(B) . 50 iJ9 de proteína.
59
CAPÍTULO 111
(A)
(B)
1 2 3 5
Figura 3.8. lnmunodetección en membrana de nitrocelulosa de extractos
proteicos, tejido de hoja de 5 palmas de cocotero sanas (A) y 7 palmas de
cocotero infectadas con AL. , valores de Cts representado en los recuadros (B).
75 ¡.Jg de proteína.
Los resultados obtenidos son alentadores y bien fundamentados ya que como se
menciono con anterioridad el anticuerpo estaría reaccionando de manera específica.
Estos resultados se analizaron con más precisión con el método de Western blot en la
siguiente sección.
3.3.6. Evaluación del anticuerpo Anti-L Y por Western blot.
Una vez establecido el método de extracción , las condiciones de incubación y con tanto
con los extractos proteicos se procedió a separar las muestras en base a su peso
molecular en un gel desnaturalizante de (SDS-PAGE) al 12%. En la figura 3.1 O, se
muestra las proteínas extraídas por el método A, donde se observa que aun cuando las
proteínas fueron cuantificadas por el mismo método y se cargo la misma cantidad en el
gel no se observan homogéneas respecto a la cantidad, esto puede deberse a varios
factores en la cual se encuentra la palma.
60
CAPÍTULO 111
P1 P2 P3 P4 P5
Figura 3.9 Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE (12% a 100 volts
por 1.30 horas) del extracto proteico de hoja de cinco palmas de cocotero sanas
(50 ¡..~g) . Donde: M marcador de peso molecular en kDa. Siendo P1-P5 extracto
proteico de hoja de palmas de cocotero sanas.
Una vez realizado la separación proteica mediante SDS-PAGE, se llevo a cabo la
transferencia, de los respectivos duplicados de los geles previamente corridos. Las
palmas sanas resultaron ser negativas tanto en PCR tiempo real así como en la
evaluación del anticuerpo. Esto nos da una idea de que el anticuerpo es posible que sea
específico para la proteína de la membrana del fitoplasma. Hasta el momento los
resultados son alentadores.
61
CAPITULO 111
Figura 3.1 O. Análisis de Western blot, de proteínas de la membrana del
fitoplasma del AL. Donde: M marcador de peso molecular en kDa. Siendo P1-
P5 extracto proteico de tejido de hoja de cinco palmas de cocotero sanas.
Para llevar a cabo la evaluación del anticuerpo se decidió analizar 7 palmas de cocotero
detectadas previamente con el método de PCR tiempo real , siendo estas positivas para el
fitoplasma del AL. Se obtuvo el extracto proteico y previo a su cuantificación se llevo a
cabo la electroforesis con su respectivo duplicado figura (3.12). Se puede visualizar
proteínas de varios tamaños de peso molecular obteniendo así una electroforesis
adecuada para llevar a cabo la transferencia, una vez analizado los resultados en el
mismo memento se llevo a cabo la transferencia transcurrido el tiempo se realizo el
revelado de la membrana y por consiguiente el análisis de los resultados. En la figura
(3.13) se puede observar que en el extracto de las palmas P1 , PS y P6 una banda de
aproximadamente 16 kDa la cual concuerda con el peso de la proteína con la cual fue
generada dicho anticuerpo, por lo tanto es posible que la banda observada sea una lmp
perteneciente a una proteína de membrana del fitoplasma del AL.
62
CAPÍTULO 111
Figura 3.11. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE (12% a 100
volts por 1.30 horas) del extracto proteico de hoja de siete palmas de cocotero
infectadas con AL (50 IJg) . Donde: M marcador de peso molecular en kDa.
Siendo P1-P7 extracto proteico de hoja de palmas de cocotero infectadas con
AL.
63
CAPÍTULO 111
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7
Figura 3.12. Análisis de Western blot, de proteínas de la membrana del
fitoplasma del AL. Donde: M marcador de peso molecular en kDa. Siendo P1-
P7, extracto proteico de hoja de siete palmas de cocotero infectadas con AL.
En el experimento anteriormente descrito se utilizo una cantidad de proteína de 50 ¡Jg , sin
embargo como se pudo observar en los resultados del western blot las intensidades de
las bandas que se presentaron fueron relativamente débiles por lo tanto se decidió
evaluar una concentración más alta de proteína, 75 ¡Jg , es por eso que se repitió de nuevo
la electroforesis de las palmas sanas y enfermas, así mismo la transferencia de las
mismas los resultados se presentan a continuación.
Primeramente se evaluaron las palmas sanas llevando a cabo la electroforesis figura 3.14,
se observo un patrón electroforético bien definido, por lo que se realizo la transferencia
(Fig. 3.15) en donde no se puede apreciar la presencia de alguna banda.
64
CAPITULO 111
Figura 3.13. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE (12% a 100
volts por 1.30 horas) del extracto proteico de hoja de cinco palmas de cocotero
sanas (75 IJQ) . Donde: M marcador de peso molecular en kDa. Siendo P1-P5
extracto proteico de hoja de palmas de cocotero sanas.
65
CAPITULO 111
(kOa) P1 P2 P3 P4 P5
Figura 3.14. Análisis de Western blot, de proteínas de la membrana del
fitoplasma del AL. Membrana de nitrocelulosa Donde: M marcador de peso
molecular en kDa. Siendo P1-P5 extracto proteico de tejido de hoja de cinco
palmas de cocotero sanas.
Se prosiguió con la evaluación de las palmas infectadas, en el apartado siguiente se
muestran los resultados obtenidos. En la figura 3.16 se puede apreciar el resultado de la
electroforesis de los extractos proteicos de palmas infectadas, posterior a este resultado
se puede apreciar en la figura 3.17, el resultado de la transferencia evaluando una
cantidad de proteína de 75 ¡Jg .
66
CAPITULO 111
Figura 3.15. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE (12% a 100
volts por 1.30 horas) del extracto proteico de hoja de siete palmas de cocotero
infectadas con AL (75 IJQ) . Donde: M marcador de peso molecular en kDa.
Siendo P1-P7 extracto proteico de hoja de palmas de cocotero infectadas con
AL.
Los resultados de Western blot utilizando 75 IJ9 de extracto proteico presentaron bandas
con mayor intensidad , principalmente en las palmas 4 y 5. Evaluando la cantidad
previamente señalada, los resultados que se obtuvieron resultaron ser comparativas con
los Cts, obtenidos en los resultados en qPCR la señal que se aprecia en la fig. 3.18 se
puede observar en la figura que el extracto proteico de la palma 5 obtuvo mayor
intensidad en la señal y en el análisis de qPCR obtuvo un Ct de 19.54 por lo tanto se
relaciona con un buen titulo del fitoplasma en el tejido analizado.
67
CAPÍTULO 111
Figura 3.16. Análisis de Western blot, de proteínas de la membrana del
fitoplasma del AL. Membrana de nitrocelulosa, Donde: M marcador de peso
molecular en kDa. Siendo P1 -P7 extracto proteico de hoja de siete palmas de
cocotero sintomáticas.
Teniendo en cuenta estos resultados se procedió a utilizar una concentración mayor de
extracto proteico, esta vez 100 IJg , por lo que, se llevo una nueva colecta de palmas de
cotero siendo estas 5 asintomáticas y 7 sintomáticas evaluadas previamente por qPCR y
el posterior análisis inmunológico empleando el anticuerpo Anti-L Y, los resultados del
patrón electroforético se puede observar en la figura 3.19, el perfil de proteínas se ve bien
definido pero muchas de las bandas se observan gruesas, lo que indica un exceso de
proteínas.
68
CAPITULO 111
Figura 3.17. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE (12% a 100
volts por 1.30 horas) del extracto proteico de hoja de siete palmas de cocotero
infectadas con AL (1 00 IJ9) . Donde: M marcador de peso molecular en kDa .
Siendo P1-P6 extracto proteico de hoja de palmas de cocotero infectadas con
AL.
Los resultados del western blot a esta concentración de proteínas muestran la presencia
de una banda bien definida de proteínas de aproximadamente 16 kDa en todas las
palmas analizadas infectadas. Sin embargo también se presenta una banda de mayor
peso molecular de aproximadamente 60 kDa en todas las palmas analizadas.
69
CAPITULO 111
Figura 3.18. Análisis de Western blot, de proteínas de la membrana del
fitoplasma del AL Membrana de nitrocelulosa , Donde: M marcador de peso
molecular en kDa. Siendo P1-P6 extracto proteico de hoja de 6 palmas de
cocotero infectadas.
En la figura 3.21 se presenta la comparación de los resultados del Western blot de las
palmas infectadas con tres concentraciones diferentes de proteínas 50 75 y 100 IJQ. Los
resultados indican que las concentración de 75 IJ9 de proteína para ser la más adecuada
para la inmunodetección de proteínas de membrana de fitoplasma del AL.
70
CAPÍTULO 111
A B e
Figura 3.19. Análisis de Western blot, de proteínas de la membrana del
fitoplasma del AL. Membrana de nitrocelulosa, Donde: M marcador de peso
molecular en kDa. Comparación de las tres cantidades de proteína A: 50 ¡.Jg , 8:
75 IJ9 y C: 100 IJQ. Siendo la de 8: 75 IJ9 la cantidad optima.
En el cuadro 6 se presenta una comparación entre los resultados obtenidos para la
detección del fitoplasma del Al utilizando la técnica de PCR tiempo real y la
inmunodetección utilizando el anticuerpo anti-L Y. En general se puede observar que en
todas las muestras tanto negativas como positivas con PCR tiempo real correlacionan con
los resultados obtenidos con la inmunodetección.
71
CAPÍTULO 111
Cuadro 6. Detección de fitoplasmas de diferentes palmas de cocotero, por PCR tiempo
real y métodos inmunológicos. Empleando la sonda TaqMan (503 F) y el anticuerpo (Anti
LY).
Palma 11 Palma 12 Palma 13
4
72
CAPITULO 111
3.4 DISCUSIÓN
Los fitoplasmas son un grupo monofilético de molicutes que son patógenos de plantas y
que son transmitidos de forma natural por insectos chupadores de savia. Son patógenos
intracelulares que colonizan tanto plantas como insectos y son responsables de causar
enfermedades en al menos 700 especies de plantas (Hogenhout et al., 2008).
Las proteínas inmunodominantes, que son el banco de la mayoría de los anticuerpos
dirigidos contra las células de los fitoplasmas, están localizados en la superficie externa
de la célula y son las más abundantes de la membrana celular (Shen y Lin , 1993; Milne et
al., 1995), usando un anticuerpo poli y monoclonal se ha demostrado que los fitoplasmas
tienen una (Ciark et al. , 1989) o dos (Saeed et al. , 1992) proteínas inmundominantes en
su superficie con peso molecular entre 15-36 kDa.
La utilización de anticuerpos para la detección de fitoplasmas se ha reportado desde hace
algún tiempo como el caso de la detección del fitoplasma de la proliferación de la
manzana (Apple Proliferation Phytoplasma) utilizando la técnica de inmunocaptura (Rajan
y Clark, 1995}, el fitoplasma que ocasiona la escoba de bruja en papa (sweet patato
witches' broom) (Shen y Lin, 1993). Sin embargo en estos primeros estudios, la obtención
de anticuerpo se obtenía al inmunizar con extractos proteicos enriquecidos con
fitoplasmas. Reportes más recientes han mostrado la generación de anticuerpos
utilizando proteínas inmunodominantes de membrana del tipo Amp de fitoplasmas como
el que causa la filodia en la hydrangea japonesa (Arashida et al., 2008); y el de
'Candidatus Phytoplasma asteris' (Galetto et al., 2008). Se ha reportado un estudio para
generación de anticuerpo contra proteína del tipo lmp para el fitoplasma de la proliferación
de la manzana (Berg et al., 1999) y el 'Candidatus Phytoplasma aurantifolia' (Siampur et
al. , 2013). En este último trabajo se realizo una caracterización de los lmps de 18
aislados de este fitoplasmas de diversas regiones de Asia, África y Australia mostrando
una gran variabilidad en sus secuencias.
En nuestro caso el anticuerpo se generó a partir de la secuencia de nucleótidos que se
introdujo, se plasmidico y cuyo producto es una proteína inmunodominante de
aproximadamente 16 kDa (Harrison comunicación personal) . En el caso del estudio de
obtención de anticuerpos contra proteína lmp del fitoplasma de la proliferación de la
73
CAPITULO 111
manzana el anticuerpo generado reconoció proteínas de 19 y 25 kDa (Berg et al., 1999),
en el caso del 'Candidatus Phytoplasma aurantifolia' el anticuerpo reconoció proteínas
de 19 y 21 kDa (Siampour et al., 2013). En el presente estudio Los resultados tanto de
dot-blot como de Western-blot mostraron que el anticuerpo anti-L Y reconoció una proteína
que provenía de palmas infectadas. Los resultados específicos de Western blot mostraron
que el anticuerpo reconocía una proteína de aproximadamente 16 kDa. El anticuerpo no
reconoció ninguna banda en palmas sanas. Estos datos indican que el anticuerpo
reconoce una proteína del tamaño esperado y que podría ser la proteína inmundominante
del fitoplasma del AL.
Cuando se comparo la detección del fitoplasma por PCR en tiempo real y el anticuerpo
Anti-L Y, se pudo observar que se presentaron los mismos resultados con las 1 O palmas
analizadas sanas (S/S) y las catorce analizadas infectadas con el fitoplasma del AL (C/S),
lo que indica que la técnica de inmunodetección se puede utilizar como una alternativa
para la detección del fitoplasma del AL. Sin embargo hay que tener en cuenta que es una
técnica mucho más laboriosa que la técnica de detección por PCR en tiempo real. No
obstante podría ser una herramienta importante para entender la enfermedad ya que este
anticuerpo se puede utilizar para la detección in situ del fitoplasma y de esta manera
obtener mayor información sobre el modo de acción del fitoplasma tal como se ha hecho
con el fitoplasma que causa la filodia en la hydrangea japonesa (Arashida et al., 2008).
74
CAPÍTULO 111
3.5 CONCLUSIÓN
De los tres métodos evaluados, el método más adecuado para la extracción de proteínas
de los diferentes tejidos de cocotero es el reportado por Cho et al. , 2006 y Swery et al.,
1995 (método A).
Se establecieron las condiciones para la detección inmunológica de proteínas de palmas
infectadas con el fitoplasma del AL.
Hasta el momento los resultados muestran la funcionalidad del anticuerpo y el
reconocimiento de una proteína de aproximadamente 16 kDa, esta es especifica de
palmas infectadas con AL y concuerda con el tamaño de la proteína de la cual se genero
el anticuerpo.
75
CAPITULO 111
3.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
Berg M., Davies L. , Clark M. , Vetten H., Maier G., Marconen C. y Seemuller E. (1999) .
lsolation of gene encoding an inmmunodominant membrane protein of the apple
proliferation phyotoplasma, and expression and characterization of the gene
product. Microbiology. 145:1937-1943.
Bertolini, E. , Torres, E., Olmos, A. , Martín , M. P., Bertaccini , A. y Cambra, M. (2007).
Co-operational PCR coupled with dot blot hybridization for detection and 16SrX
grouping of phytoplasmas. Plant Pathology 56, 677-682.
Sosco, D., Minucci, C., Boccardo, G. , y Conti , M. (1997). Differential acquisition of
chrysanthemum yellows phytoplasma by three leafhopper species. Entomologia
Experimentalist et Applicata 83. 219-224.
Christensen, N. M., Axelsen , K. B., Nicolaisen, M. y Schulz, A. (2005) . Phytoplasmas and
their interactions with hosts. TRENOS in Plant Science 1 O (11 ),526- 535 .
Camarena-Gutiérrez, G. y De la Torre A. (2008). Fitoplasmas: síntomas y
características moleculares. Revista Chapingo, Serie Ciencias Forestales y del
ambiente 14 (2). 81 - 87.
Harrison N. y Oropeza C. (2008). Coconut lethal yellowing . In: NA Harrison, GP Rao y
C. Marcone (Eds.). Characterization , Diagnosis and Management of
Phytoplasmas. Studium Press LLC, Houston, USA pp 219-248.
Islas-Flores l. (1998). Caracterización bioquímica e histológica del desarrollo del embrión
cigótico de cocotero (Cocos nucifera L.) Tesis de doctorado, realizado en el
Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C. 98-99.
Kakizawa S., OshimaK., lshii Y., Hoshi A. , Maejima K., Jung H., Yamaji Y. and Namba S.
(2009). Cloning of lmmunodominant membrane protein genes of phytoplasmas and
their in planta expression. FEMS Microbio! Lett 293:92-101 .
76
CAPITULO 111
Shahryari F., Shames-Bakhsh M., Reza-Safarnejad M., Safaje N. y Ataei-Kachoiee
S. (2013). Preparation of antibody against inmunodominant membrane protein
(IMP) of 'Cadidatus Phytoplasma aurantifolia.
Siampour M., lzadpanah K., Galetto L., Salehi M., y Marzachi C. (2013) . Molecular
characterization , phylogenetic comparison and serological relationship of the lmp
protein of several ' Candidatus Phytoplasma aurantifolia ' strains. Plant Pathology
62:425-459
Mugno Ramírez P. y Filgueira Duarte J. (2008). Extraction of whole chromosome from
phytoplasma of "urapanes" (fraxinus sp.) by pulsed field gel electrophoresis
(PFGE).
Thompson , J., Gibson, T. , Plewniak, F., Jeanmougin, F. y Higgins, D. (1997) . The
clustaiX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment
aided by quality analysis tools. Nucleic acids Res 24: 4876-4882.
Morton A , Davies D.L. , Blomquist C.L. y Barbara D.J. (2003) . Characterization of
homologues of the apple proliferation immunodominant membrane protein
gene from three related phytoplasmas. Molecular Plant Pathology, 4: 109-
114.
Ji , X. , Gai , Y. , Lu, B. , Zheng , C. y Mu Z. (2010) . Shotgun proteomic analysis of mulberry
dwarf phytoplasma. Proteome Science 8: 20.
Liefting, W . L. , Andersen, M., Beever, E. R., Gardner, C. R. y Forster, R. L. S. (1996) .
Sequence heterogeneity in the two 16S rRNA genes of Phormium Yellow Leaf
phytoplasma. Applied and Environmental Microbiology, 3133-3139.
Lee 1. , Gundersen-Ridal D., Davis R. , y Bartoszk l. (1998). Revised classification scheme
of phytoplasmas bases on RFLP analyses of 16S rRNA and ribosomal protein
gene sequences. lnternational Journal of systematic. Microbiology 48:1153-1169.
77
CAPÍTULO 111
Reyes-Martinez C. , Morales-Angeles D., Cab-Narvaez M., Osuna-Castro J., Zizumbo
Villarreal D., Oropeza-Salin C., y Peña-Beltrán E. (2007). Protein extraction for
Cocos nucifera whit and whithout lethal yellowing phytoplasma: gel-based
proteomics. Bulletin of insectiology 60:231-232.
78
CAPITULO IV
CAPÍTULO IV
4.1 DISCUSIÓN GENERAL
Los fitoplasmas pertenecen al grupo de los molicutes los cuales representan un grupo
filogenéticamente coherente de patógenos que colonizan un amplio espectro de
hospederos y vectores. Son organismos autoreplicativos carentes de los peptidoglucanos
que forman la pared celular de las bacterias, rodeados únicamente por una membrana
plasmática (Hagenout et al. , 2008). Están relacionados filogenéticamente con las
eubacterias Gram-positivas de las cuales evolucionaron retrógradamente por una drástica
reducción de su genoma, resultando en la pérdida de muchas de sus habilidades
biosintéticas, incluyendo aquellas rutas más comunes y consideradas esenciales para
cualquier organismo vivo, como consecuencia de su vida parasítica. Los fitoplasmas se
encuentran restringidos en las células del floema y son transmitidos de planta en planta
por inoculación por insectos vectores pertenecientes a las familias Cicadellidea y
Fulgoridea (Hagenout et al. , 2008). Un tipo de fitoplasma es el que causa el
amarillamiento letal (AL) en el cocotero, denominado 'Candidatus Phytoplasma palmae',
cuyo único vector conocido es el homóptero Haplaxius (Myndus) crudus Van Duzee
(Harrison y Oropeza, 2008).
La generación de anticuerpos contra fitoplasmas se ha reportado relativamente poco
debido a la limitación de que los fitoplasmas no han podido cultivarse in vitro , por lo tanto
la obtención de proteínas puras con lo cual generar anticuerpos es muy difícil. Sin
embargo los primeros estudios en regeneración de anticuerpos se basaron en la
inoculación de extractos proteicos provenientes de plantas infectadas (Shen y Lin , 1993,
Rajan y Clark, 1995). No obstante cuando los genomas de cuatro tipos de fitoplasmas
fueron secuenciados se pudo obtener la secuencia nucleotidica de los genes que
codifican para proteínas inmunodominantes de membrana las cuales son abundantes y
antigénicas. Con esta información se generaron anticuerpos contra el fitoplasma que
ocasiona la enfermedad de filodia en la hydrangea de Japón (Arashida et al. , 2008); el
fitoplasma de la proliferación de la manzana (Berg et al. , 1999); 'Gandida tus Phytoplasma
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CAPÍTULO IV
asteris' (Galetto et al. , 2008) y 'Candidatus Phytoplasma aurantifolia' (Siampur et al.,
2013).
En el presente estudio se caracterizó un anticuerpo que fue generado con proteína de
membrana de fitoplasma 'Candidatus Phytoplasma palmae', causante de la enfermedad
del amarillamiento letal en cocotero. El anticuerpo se generó utilizando la secuencia que
codifica para una proteína lmp del fitoplasma del AL. Esta secuencia se obtuvo de la
secuenciación parcial del genoma del fitoplasma del amarillamiento letal realizado por el
Dr. Nigel Harrison de la Universidad de Florida. En el presente trabajo se evaluó su
funcionalidad analizando extractos proteicos de tejido de hoja de palmas de cocotero
asintomáticas y sintomáticas, mediante técnicas inmunológicas lo que se lo logró hasta el
momento mediante la técnica de dot blot y Western blot fue que ambas técnicas aquí
probadas permitieron determinar que en los extractos proteicos de las palmas infectadas
hubo un reconocimiento por parte del anticuerpo anti-L Y hacia proteína o proteínas del
peso molecular aproximado de 16 kDa. Este tamaño de peso molecular coincide con el
peso molecular de la proteína de la cual se generó el anticuerpo. En general en los
estudios recientes sobre generación de anticuerpo contra fitoplasmas el rango de las
proteínas detectadas es de una masa molecular de 15 a 32 kDa (Kakizawa et al., 2004;
Blomquist et al. , 2001 ; Berg et al., 1999; Garnier et al., 1991 ; Chang et al., 1995; Jiang et
al. , 1988;).
En cocotero es la primera vez que se genera un anticuerpo contra el fitoplasma 'Ca
Phytoplasma palmae' , por lo tanto los resultados logrados abre las puertas para futuros
estudios ya sea como un método alternativo de detección o como una herramienta de
estudio para profundizar en el modo de acción del fitoplasma causante del AL. El uso de
este anticuerpo podría contribuir al entendimiento proteomico planta-patógeno, poco
conocido en este cultivo y el desarrollo de nuevas estrategias para el control de la
enfermedad del AL, una de las principales enfermedades que afecta la productividad del
cocotero y que actualmente se encuentra presente la mayor parte del territorio mexicano.
80
CAPITULO IV
4.2CONCLUSIONES GENERALES
1. Evaluando tres protocolos reportados, se llego a la finalidad que el protocolo
adecuando para la extracción de proteínas de tejido de cocotero es el reportado
por Cho et al., 2006 y Swery et al., 1995, con algunas modificaciones.
2. Se implementaron las condiciones de los métodos inmunológicos que permiten
utilizar el anticuerpo anti-L Y de forma optima, en las técnicas del Dot-blot y el
Western blot.
3. El anticuerpo anti-L Y reconoció una proteína de 16 kDa en tejidos de palmas
infectadas con amarillamiento letal, que coincide con el peso molecular de la
proteína con la cual se genero el anticuerpo.
81
CAPÍTULO IV
4.3 PERSPECTIVAS
Hasta ahora se ha logrado establecer el protocolo de extracción de proteínas en tejido de
cocotero, sin embargo faltaría establecer un protocolo de ultracentrifugación para la
extracción de proteína de membrana, que podrían permitirnos purificar y concentrar las
proteínas lmp del fitoplasma del AL, lo cual podría hacer el método de inmunodetección
más sensible.
Es de suma importancia llevar a cabo el aislamiento, purificación y secuenciación de la
proteína (s) que reconoce el anticuerpo para comprobar de manera inequívoca que el
anticuerpo Anti-L Y está reconociendo una proteína antigénica (lmp) del fitoplama del AL,
'Gandida tus Phytoplasma palmae'.
El anticuerpo anti-L Y podría ser una herramienta valiosa para estudios de
inmunodetección in situ del fitoplasma del AL. Así mismo podría ser utilizado para
determinar qué tipo de proteínas de la planta o de los insectos esta interaccionando con
las proteínas inmunodominantes del fitoplasma del AL.
Separar mediante electroforesis bidimensional proteínas tanto de palmas sanas de
cocotero como enfermas para determinar sus perfiles diferenciales, empleando el
anticuerpo Anti-L Y.
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CAPITULO IV
4.4 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Arashida R. , Kakizawa S., lshii Y., Hoshi A , Y.Jung H. , Kagiwada S, Yamaji Y. , Oshima
K. y Namba S. (2008). Cloning and characterization of the Antigenic Membrana
Protein (Amp) gene and in situ detection of Amp from malformed flowers infected
whit Japanese Hydrangea phyllody phytoplasma. Bacteriology 98: 769-765.
Berg M., Davies L. , Clark M. , Vetten H. , Maier G., Marcenen C. y Seemuller E. (1999).
lsolation of gene encoding an inmmunodominant membrane protein of the apple
proliferation phyotoplasma, and expression and characterization of the gene
product. Microbiology. 145:1937-1943
Blomquist C. , Barbara D., Davies D., Clark M. , y Kirkpatrick B. (2001) . An
lmmunodominant membrane protein gene from the western X-disease
phytoplasma is distinct from those of other phytoplasmas. Microbiology 147:571-80
Chang F. , Chen C.C., y Lin C.P. (1995). Monoclonal antibody for the detection and
identification of a phytoplasma associated with rice yellow dwarf. European Journal
of Plant Pathology. 101 :511-518.
Garnier M., Zreik L. , y Bové J.M. (1999). Witches 'broom, a letha mycoplasmal disease of
lime in the Sultanate of Oman and the United Arab Emirates. Plant Disease
75:546-551.
Harrison N. y Oropeza C. 2008. Coconut lethal yellowing . In: NA Harrison, GP Rao y
C. Marcene (Eds.) Characterization , Diagnosis and Management of
Phytoplasmas. Studium Press LLC, Houston, USA pp 219-248.
Jiang Y. , Lei J. y Chen T. (1988). Purification of aster yellows agent from diseased
lettuce using affinity chromatography, Phytopathology 78:828-31 .
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CAPITULO IV
Kakizawa S., Oshima K. , Nishigawa H., Jung H.Y., Wei W. , Suzuki S., Tanaka M. ,
Miyata S., Ugaki M. y Namba S. (2004). Secretion oimmunodominant
membrane protein from onionyellows phytoplasma through the Sec protein
translocation system in Escherichia co/i. Microbiology, 150: 135-142.
Siampour M. , lzadpanah K., Galetto L. , Salehi M., y Marzachi C. (2013) . Molecular
characterization , phylogenetic comparison and serological relationship of the lmp
protein of severa! ' Candidatus Phytoplasma aurantifolia ' strains. Plant Pathology
62:425-459
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CAPÍTULO IV
5 ANEXOS
5.1 Obtención del anticuerpo generado con proteína de membrana del fitoplasmas causante de la enfermedad del AL
El anticuerpo policlonal fue generado por el Dr. Nigel Harrison en la Universidad de
Florida. Brevemente, se extrajo ADN de palmas de cocotero con síntomas indicativos de
la enfermedad del amarillamiento letal, se obtuvo una biblioteca de ADN genómico de
fitoplasma del AL, la cual se estudio con detalle, se llevo a cabo diferentes amplificaciones
mediante la técnica de PCR anidado utilizando cebadores específicos y universales, los
productos de la PCR fueron purificados en columnas Spin , se eluyo en agua ultra pura
estéril , y se ligo al vector PGEM-T (Promega) para llevar a cabo la propagación en 1 O
células de Eschericha coli (lnvitrogen). Las células transformadas fueron seleccionadas.
Los plásmidos recombinantes de minipreparaciones de las clonas seleccionadas se
purificaron en columnas Spin y se eluyó con agua ultra pura estéril. Los insertos de los
plásmidos fueron secuenciados en el laboratorio UF Core Sequencing Service Laboratory.
Las secuencias fueron editadas, ensambladas alineadas y las secuencias consenso
generado mediante el software SeqMan.
La clonación y la expresión del gen L Y de la proteína de membrana, para la clonación se
llevo a cabo de acuerdo al protocolo de Lucigen ® Corp., Middleton, Wl. Siete fragmentos
en combinaciones de pares de cebadores fueron identificados por diagnostico visual de
una secuencia del gen putativo de la proteína de membrana del fitoplasma y fueron
evaluados por PCR, utilizando ADN de las palmas con L Y como molde. Con los tres pares
de cebadores se obtuvieron los productos más importantes de genes que fueron los más
investigados. Cada par de cebadores flanqueaba la secuencia correspondiente. Los
productos resultantes fueron purificados en columnas Spin antes de la fusión con el
prelinealizado, vector pETite C-His y la propagación de E. co/i como control Hl-1 OG.
Los insertos se clonaron, las colonias con el inserto fueron amplificados por PCR usando
los oligonucleótidos pETite-Forward-Reverse, los productos de PCR fueron purificados y
la integridad del inserto fue validada por secuenciación en un equipo automático de la
universidad de Florida, los constructos insertaron en E. coli. Las transformantes fueron
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CAPITULO IV
seleccionados por crecimiento sobre medio de agar y LB.
En los experimentos piloto la expresión de la proteína fue inducida en cultivo LBA
adicionando IPTG. Las células se recuperaron antes y después de la inducción se
centrifugaron y se resuspendieron en amortiguador SDS-PAGE. Para evaluar la
solubilidad de la proteína diana, las células residuales fueron incubadas sobre hielo en un
buffer de lisis conteniendo lisozima. El lisado fue centrifugado, se recupero el
sobrenadante y se adiciono en un volumen de amortiguador de lisis equivalente al lisado
original. Las proteínas se fraccionaron y fueron evaluados por SDS-PAGE al 12%.
La proteína de fusión se purifico mediante en Ni-NTA. La proteína eluida se dializo con un
amortiguador de fosfato salino, en un Slide-A-Lyzer, la concentración de proteína se
estimo con el reactivo de Bradford 1976. La proteína de fusión fue usado para inmunizar
dos conejos, cada uno de los animales recibieron un total de cuatro inyecciones,
alrededor de 0.5 mg administrados a intervalos de 3 semanas. Los lgG fueron purificados
por afinidad a partir de sueros policlonales en una columna de proteína-G y se dializó. La
secuencia del gen fue analizado por TMHMM, (Harrison , 2012 en proceso).
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