FACULTADDEFARMACIA

UNIVERSIDADCOMPLUTENSE

POTENCIALTERAPÉUTICODELASCÉLULASMADRE

ENLAENFERMEDADCRÓNICAHEPÁTICA

Autor:

D.N.I.:

Tutor:AránzazuSánchez

Convocatoria:JUNIO2016

1

ÍNDICE

1.-RESUMEN.......................................................................................................................................................................22.-INTRODUCCIÓN..........................................................................................................................................................23.-MATERIALYMETODOS...........................................................................................................................................44.-RESULTADOS................................................................................................................................................................54.1.-REPROGRAMACIÓNCELULARYDIFERENCIACIÓNDEiPSCsAHEPATOCITOS.......................54.2.- REGENERACIÓN HEPÁTICA TRAS EL TRASPLANTE DE HEPATOCITOS PROCEDENTES DE iPSC........................................................................................................................................................................................74.3.-APLICACIÓNTERAPÉUTICADELASiPSCENTERAPIAGÉNICADEENFERMEDADESHEPÁTICAS...................................................................................................................................................................................................94.4.-HÍGADOSBIOARTIFICIALESEHÍGADOSINVITRO...............................................................................104.4.1.-HÍGADOSBIOARTIFICIALES.........................................................................................................11

4.4.2.-INGENIERÍADETEJIDOS:HÍGADOSINVITRO……………………………………………………11

4.5.-CÉLULASMADREMESENQUIMALESENCARCINOMAHEPÁTICO................................................126.-DISCUSIÓN.................................................................................................................................................................147.-CONCLUSIÓN………………………………………………………………………………………………………………….16

8.-BIBLIOGRAFÍA...........................................................................................................................................................16

2

1.-RESUMEN

En la búsquedade alternativas frente al trasplante hepático como solución a determinadas

enfermedadeshepáticascrónicas,encontramosque lascélulasmadre, sobre todo lasMSCy

lasiPSC,estánsiendoampliamenteestudiadas.

Las iPSC sirven como fuente para generar hepatocitos que posteriormente podrán ser

trasplantadosdirectamente al hígadooutilizados en la generacióndeórganos invitroode

órganosbioartificiales(BAL).Estolespermiteserusadastantoenregeneraciónhepáticatras

infeccionesolesionescomoenenfermedadesdeorigengenético.

LasMSChansidosuperadasenmuchosaspectosporlasiPSC,perocontinúasiendoestudiado

supapelenrelaciónalcarcinomahepático,dondepodríandesarrollarunimportantepapelen

lainmunomodulación.

2.-INTRODUCCIÓN

Las enfermedades hepáticas suponen una importante causa de muerte a nivel mundial,

resaltandolacirrosis(duodécimacausademuerte,)yelhepatocarcinoma(decimosextacausa

de muerte), siendo la mayoría de los casos debidos a enfermedades infecciosas,

principalmenteenpaísesenvíasdedesarrollo(1)(2).Adíadehoylaúnicasoluciónefectivaen

estadosavanzadosdeestostrastornoseseltrasplantehepático.Estetratamientoconllevauna

elevadamorbilidad y un elevado coste económico para los sistemas sanitarios, resultando

además insuficiente para curar a todos los enfermos debido a la escasez de donantes y al

posiblerechazo(3).

Desde losaños60seempezaronaprobarnuevasestrategiascentradasenel trasplante de

hepatocitos, tantoautólogos(loshepatocitos trasplantadosseobtienendelpropiopaciente)

comoxenotrasplantes(loshepatocitos trasplantadosenestecasoseobtienende individuos

deotrasespecies)(4).Estasnuevastécnicascelularesseenfrentaronadiversosproblemas,por

un lado, los hepatocitos porcinos (xenotrasplantes) daban lugar al desarrollo de una

respuesta inmunitaria y no eran capaces de mimetizar totalmente las funciones de un

hepatocito humano. Por otra parte, el uso de cultivos de hepatocitos in vitro demostró

dificultades,comounadifícilconservaciónenfrío(criogenización)(5),aloquesesumaba,en

3

aquelloshepatocitosprocedentesdecélulastumorales,undéficitdefuncionalidadpuestode

manifiesto en la incapacidad de llevar a cabo el ciclo de la urea(6). Estas dificultades en la

generación de hepatocitos viables se resolvieron parcialmente mediante el uso de células

madre como posible terapia alternativa, al resultarmenos invasiva,más barata y ser poco

inmunogénica,debidoestoúltimoaquelafuentedeestascélulaseraelpropiopaciente.Las

másestudiadashastaelmomentosonlascélulasmadrehematopoyéticas(HSC)ylascélulas

madremesenquimales(MSC).Ambashandemostradociertaeficaciaenmodelosanimalescon

daño hepático, tanto agudo como crónico, presentando capacidad regeneradora e

inmunomoduladora(7)(8).Por otro lado tenemos las células madre embrionarias, aunque las

implicacioneséticasdesuusocomplicansuaplicaciónmásalládelcampoinvestigador(9).

Enrelaciónal carcinomahepático los resultadosobtenidossonmuyvariables,nopudiendo

confirmarsesilaterapiacelularconMSCsuponeunamejoraotienepotencialparaagravarun

posible hepatocarcinoma, en parte debido a la dificultad para dirigir eficazmente a estas

célulashaciaunalocalizaciónconcreta(10).

Frenteaestoslinajescelularessehacomenzadoainvestigarrecientementeelposiblepapel

de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), que presentan una mejor capacidad

proliferativa y se pueden obtener desde una gran variedad de tipos celulares mediante

técnicasde reprogramación génica(11). Sehademostradoque las iPSC retienen información

génica de sus células de procedencia, lo que sugiere que dependiendo de sus células de

procedencialasiPSCtendránunacapacidaddediferenciaciónuotra(12).

Para obtener iPSC humanas, las células adultas que mejores resultados han dado son los

fibroblastosde lapiel.Estorepresentaungranavancealnorequerirseunmétodo invasivo

paralaobtencióndelascélulas,siendosuficienteconunabiopsiadelapiel.Unavezobtenidos

los fibroblastos, estos son tratados acorde a los protocolos establecidos para conseguir su

reprogramaciónacélulaspluripotentes,ysuposteriordiferenciaciónhaciahepatocitos(13).Se

aplicaron para su reprogramación diferentes factores de transcripción, resaltando Oct4

(octamer-binding transcription factor 4), Sox2 (sex-determining region Y box 2), Klf4

(Kruppel-like factor4)y c-Myc. (OSKM).Para sudiferenciación, seutilizaron losprotocolos

que previamente se habían aplicado en la diferenciación de células madre del endodermo

(ESC).Adíadehoyaúnseestánperfeccionandolastécnicasdediferenciación,puesaúnnose

ha establecido ninguna capaz de generar células completamente equivalentes a los

hepatocitos primarios(14). En los métodos empleados actualmente, se intenta imitar el

4

desarrolloembriológiconatural,recreandolasseñalesmolecularesycelularesquesedanen

cadafasedeesteproceso.

Unavezfinalizadoelprocesodediferenciación,paraasegurarqueloshepatocitosderivados

de iPSC obtenidos sean los deseados, se comprueba la presencia de marcadores de

diferenciaciónespecíficosdeloshepatocitos,comosonlacapacidaddesecrecióndealbumina

(ALB),dealfa-fetoproteína(AFP),dealfa1-antitripsina(AAT),deurea, también laexpresión

dedeterminadasproteínasyladelCYP450ensusisoformasCYP3A4yCYP3A7.

Los hepatocitos producidos podrán ser trasplantados directamente en el organismo para

promover la regeneración hepática, así como utilizarse en la creación de hígados

bioartificiales (BAL), suponiendo ambas técnicas una alternativa al tratamiento habitual de

trasplantehepático(15).

En resumen y teniendo en cuenta los últimos avances en el campo de la terapia celular,

recogeremos el posible papel futuro de las célulasmadre, especialmente de las iPSC, en el

tratamiento de las enfermedades crónicas hepáticas, resaltando la cirrosis y el carcinoma

hepático.

3.-MATERIALYMETODOS

Se realizó una búsqueda sistemática de revisiones bibliográficas así como de estudios

científicos. Se llevó a cabo esta búsqueda en inglés a través de Pubmed utilizando como

palabras o expresiones clave: iPSC, “induced pluripotent stem cells”, “liver”, “hepatocyte

differentiation”,“iPSCderivedhepatocytes”“reprogramming”.Pubmedesunaherramientade

búsqueda de libre acceso a la base de datos MEDLINE dónde encontramos citaciones,

resúmenes y artículos de investigación biomédica. En cuanto a los criterios de inclusión,

hemos tratado de seleccionar artículos con investigaciones del 2010 en adelante, que se

centren en el estudio de células humanas como fuente de producción de iPSC, así como su

estudioenmodelosanimalescondañohepáticocrónico,principalmenteenratones.

5

4.-RESULTADOSYDISCUSIÓN

Las iPSC representan una innovadora fuente de células útiles enmedicina regenerativa, ya

que pueden reprogramarse y posteriormente diferenciarse hacia cualquier tipo de célula

adultamadura,comoeselcasodeloshepatocitos,pudiendoserutilizadosenterapiacelular,

ingenieríadetejidosycreacióndehígadosbioartificiales(16).

4.1.-REPROGRAMACIÓNCELULARYDIFERENCIACIÓNDEiPSCsAHEPATOCITOS

Los factores de transcripción requeridos según el grupo de Takahashy et al para la

reprogramacióncelularhaciacélulaspluripotenteseran4(OKSM):Oct4,Sox2,Klf4yc-Myc.

Actualmentesehandejadodeusarlosfactoresdetranscripciónc-MycyKlf4,queapesarde

estarpresentesenlaembriogénesis,elevabanelriesgodeproduciruntumorsegúnThomson

etal,yporellohansidosustituidosporNanogyLin28(17).Enrelaciónaminimizarelriesgode

desarrollo tumoral derivado del uso de vectores virales se está investigando el empleo de

microRNA(18).

UnavezobtenidaslasiPSCsonsometidasaunaseriedepruebasconelfindecaracterizarlasy

garantizar el éxitodelprocesode reprogramación. Se llevaa caboun testdepluripotencia,

quecomprendeel testde la fosfatasaalcalinaasí comoun testdedeteccióndemarcadores

(como mínimo Oct4, Nanog, Sox2, SSEA3, SSEA4, Tra-1- 60, Tra-1-81), un test de

diferenciación in vitro, con el fin de detectar las tres capas germinales mediante

inmunocitoquímica,uncariotipoyuntestconelfindeidentificarlahuellagenéticamediante

elanálisisdemicrosatélites(19).

Figura1:Esquemadeobtencióndehepatocitosdesdefibroblastos.SubbaRaoMetal(2013)

6

LosprimerosprotocoloscreadosparadiferenciarESCinvitrohaciadistintostiposcelulares,

tambiénaplicablesaladiferenciacióndeiPSC,estabanbasadosenobservacioneshechaspor

biólogos durante el estudio del desarrollo embriológico natural y del mismo modo se

definieron lascondicionesdecultivo.Enestosmanualesserecogen4estadios: inducciónal

endodermo,especificaciónhepática,expansiónhepatoblásticaymaduraciónhepática;aestas

fases llegamos mediante la administración de varios factores de crecimiento en un orden

determinadoyconelusodefactoresdetranscripción(20).

La primera aproximación a la producción de hepatocitos funcionales fue la producción de

célulasdelendodermo,quesonlascélulasembrionariasapartirdelascualessedesarrollan

loshepatocitos.EnestafasedeinducciónalendodermoserequierelaexpresióndeactivinaA,

que solo se expresa cuando la fosfatidil inositol 3-quinasa (PI3K) está suprimida. También

requierelaseñalizacióndelaproteínaWnt3a(Wingless-TypeMMTVIntegrationSiteFamily,

Member 3), así como la de FGF (Fibroblast Growth Factor)(21). Ha sido demostrado que la

inhibicióndelaglucógenosintasa3-quinasa(GSK-3)estambiénimportanteenlaformación

definitivadelendodermo.Ademáshaypequeñasmoléculascuyapresenciaesdefinitivapara

el desarrollo del endodermo, las dos más eficientes son el ácido benzoico y el

oxoheptanoico(14).EnestafaselascélulasexpresanSOX17(SRY(SexDeterminingRegionY)-

Box17)yFOXA2(ForkheadBoxA2),quesonmarcadoresdelendodermo,delmismomodo

aúnquedancélulasqueexpresanelmarcadordepluripotenciaOct4(22).

Se ha postulado que la inhibición de la ruta de señalización de p53 previene la apoptosis,

senescencia y la detención del ciclo celular incrementando por tanto la eficiencia de la

reprogramación,favoreciendolafasedeespecificaciónhepatoblástica(14).Ademásenestafase

lascélulassontratadasconHGF(HepatocyteGrowthFactor)yconDMSO(dimetilsulfoxido),

lo que produce un aumento de la proliferación y contribuye a su vez en la expansión

hepatoblástica(22).

Finalmente la fasedemaduraciónhepática se alcanza conel tratamientode las células con

dexametasona,traslocualcomenzamosaapreciarmarcadoreshepáticoscomoALB,AFPy

AAT22).

Por otro lado la matriz extracelular (ECM) se considera otro importante factor para la

diferenciación de las iPSC a hepatocitos. A su vez la ECM es órgano- específica, es decir es

diferente en cada órgano o tejido, por ello se la considera un importante órgano-

7

modulador(23). Elmecanismoa travésdel cual laECM intervieneen ladiferenciaciónde las

iPSCesaununmisterio,soloseconocequeesatravésdelainteracciónconlasintegrinasα-6

yβ-1,porloqueesuncampodeestudioabiertotodavía(14).

4.2.- REGENERACIÓN HEPÁTICA TRAS EL TRASPLANTE DE HEPATOCITOS

PROCEDENTES DE iPSC

Lasenfermedadescrónicashepáticasasícomoelfallohepáticoagudosuponenunamermade

las funciones hepáticas que en un alto porcentaje sólo puede ser revertida mediante el

trasplantedeunnuevohígado(24).Esporelloquesehaninvestigadoy desarrolladonuevas

técnicas para tratar esta patología, como es el trasplante de hepatocitos de diversas

procedencias,especialmentelosgeneradosapartirdeiPSChumanas(hiPSC).

Uno de los últimos estudios realizados con hiPSC en roedores, ha demostrado una buena

capacidaddeéstasparaserintegradasenunhígadodañado,desarrollandomicrovasculatura

y siendo capaces de segregar factores como el HGF, en una cantidad similar a la de los

hepatocitos derivados de BMSC (Bone Marrow Stem Cell), que permiten promover la

regeneración hepática y su funcionalidad(25). Esto ha quedado demostrado con el

sometimiento a diversas pruebas de estrés con CCL4, habiéndose observándose una

disminucióndelaletalidadencomparaciónahígadosdañadosquenorecibieronhiPSC(26).

Figura2:Papeldelascélulasmadreensituacionesdedañohepático.ZhangZetal(2013)

Zheng Zhang, Fu-Sheng Wang*Research Center for Biological Therapy, The Institute of Translational Hepatology,

Beijing 302 Hospital, Beijing 100039, China *Corresponding author. Address: Research Center for Biological Therapy, The Institute of Translational Hepatology, Beijing 302 Hospital, China.

Tel: + 86 10 63879735; fax: + 86 10 63879735. *E-mail addresses: fswang@public.bta.net.cn or fswang302@163.com

Stem cell therapies for liver failuresand cirrhosis

Keywords: Mesenchymal stem cells; Liver failure; Liver cirrhosisReceived 16 November 2012; received in revised form 11 January 2013; accepted 17 January 2013

Liver failure Liver cirrhosis

Liver failure Liver cirrhosis

Support of growth of liver residual

hepatocytes

Hepatocyte regeneration

Fibrosis/cirrhosis development

Anti-scaring Apoptosis

Fibrotic reconstitution

NK

Replace hepatocyte

Activin KGFHGF

iPS ES

ES-iPS

TregHGF PGE2

IDO

+

A

B

M-CSFSDF-1

SCFLIF

MSCs

MSCs

HGF bFGF IL-10

Fas/FasL

DC CD4 CD8 B cell

Inflammation

Hepatocyte loss

Increasing functional hepatocytes Improving liver microenvironment

1 1

2

35

4

Hepatocytes

Hepatic stellate cellsExtracellular

matrix

Large-scale cohortrandomized controlled

The infused stem cells:type, number, route,

timing and end-points

Journal of Hepatology 2013 vol. 59 | 183-185

Hepatology Snapshot

Open access under CC BY-NC-ND license.

8

Una de las claves de este estudio reside en elmétodo de implantación celular, habiéndose

empleadounaláminadehepatocitos,quefuedepositadaenlasuperficiehepática,envezdel

habitual método intraesplénico (consistente en la inyección de una suspensión celular a

travésdelbazo).Encomparaciónconésteseobservóunamejorimplantación(monitorizada

porlaintensidadenlaexpresióndeluciferasa,inducidamediantelaintroduccióndeunvector

deexpresión)yunaausenciadehepatocitosenlocalizacionesextrahepáticas,queesunode

los principales inconvenientes de la administración de células esplénicamente. La

monitorización de la ausencia de hepatocitos se realizó mediante el análisis de DNA de

diferentes localizaciones, amplificándose los fragmentos c-mos (ratón) y Alu (humano),

localizándoseesteúltimoúnicamenteenelhígado.

El método de implantación también resultó clave en la supervivencia demostrada tras las

pruebasdeletalidadconCCl4.Losresultadosdeestaspruebasseñalaronunamayortasade

supervivenciaenlosratonesquerecibieronlascélulasenlámina(63,2%),frentealosratones

que las recibieron por vía intraesplénica (33,3%) y los controles (16,7%). Además, tras un

análisis histológico de los diferentes hígados según el proceso de implantación seguido, se

observó unamayor incidencia de necrosis en los animales que recibieron el trasplante vía

esplénica.Estosindudaconfirmalaimportanciadelmétododeadministraciónenrelacióna

losresultadosderegeneraciónobtenidosyalaprevencióndeposiblesefectosadversos.

Figura3:Técnicadecultivoenláminaparaposteriortrasplante.NagamotoYetal(2016)

LacapacidadregeneradorapresentadaporlasiPSCpuedeversepotenciadasiseaplicanjunto

a células madre mesenquimales en enfermedad crónica hepática. En esta patología,

caracterizadaporunprocesoinflamatorioenelquelaarquitecturahepáticaesdistorsionada

y se produce muerte celular, es de vital importancia acompañar a los procesos de

regeneracióndeprocesosdeinmunomodulación.EsahídondelasMSChandemostradouna

gran eficacia al inhibir los linfocitos NK, B y T, así como impidiendo la maduración y

diferenciación de las células dendríticas (presentadoras de antígenos)(27)(28). Para la

Figure 1

2 days

monolayer culture on thin Matrigel 3D culture on Nanopillar platemonolayer culture on

TRCD

definitive hepatoblasts hepatocytemesendoderm hepatocytehuman 2 days 3 days 3 days4 days 13 days 10 days

A day 0 day 11 day 35 day 37

Ad-FOXA2(3,000 VP/cell)

Ad-FOXA2, Ad-HNF1α(1,500 + 1,500 VP/cell)

definitive endoderm cells

hepatoblasts hepatocyte-like cells

mesendodermcells

hepatocyte-sheet

human iPSCs

90100

B C F

10-1100101

αAT

rela

tive

gene

expr

essi

on

P=0.515

10-1100101

ALB

rela

tive

gene

expr

essi

on

* *P=0.004

2030405060708090

ALBASGR1

% o

f pos

itive

cel

ls

D E

10-1

100

101

CYP3A4

rela

tive

gene

expr

essi

on

P=0.056

10-1100101

CYP1A2

gene

expr

essi

onP=0.520

10-510-410-310-210

iPSCs iPS-HLCs PHH48hr

rela

tive

expr

essi

on

10-510-410-310-210

iPSCs iPS-HLCs PHH48hr

rela

tive

gene

expr

essi

on

CK18 αATG H I

01020

iPSCs iPS-HLCs10-3

10-2

10-1

iPSCs iPS-HLCs PHH48hr

rela

tive

expr

essi

on

10-410-310-2

10-1

iPSCs iPS-HLCs PHH48hr

rela

tive

gene

expr

essi

on

K

Liver Liver Liver

Human iPS-HLCs on a TRCD

CellShifter

1st transplantaion 2nd transplantaion

J

bilayeredhuman iPS-HLC sheets

with CellShifter

Liver Liver Liver

bilayeredhuman iPS-HLC sheets

9

aplicación humana, se han construido bibliotecas de líneas celulares con genotipos

seleccionados conocidos, proporcionando a los pacientes con MHC (Complejo Mayor de

Histocompatibilidad) cercano o similar, que puedan minimizar la necesidad de

inmunosupresiónparalograrelinjertodelascélulas(15).

Recientemente,sehademostradoquelasiPSCderivadasdehepatocitospuedenrestaurarla

función hepática en modelos animales con insuficiencia hepática (inducida mediante

hepatectomía)(26).Estosresultadosindicanunaalternativadetratamientoparalospacientes

conenfermedadhepáticaenfaseterminal.

Enelcasodelacirrosislaestrategiaterapéuticatambiénpuedebasarseenlasustituciónde

hepatocitos dañados o la regeneración de estos junto con la corrección de la fibrogénesis

desequilibrada que se produce en esta patología. Los informes sugieren que hepatocitos

diferenciados a partir de iPSC hanmejorado la regeneración del hígado en ratones(27), han

reducidolafibrosishepáticaenunmodeloderatón(28),yfavorecieronlaestabilizacióndela

cirrosis(porefectosderivadosdelarepoblacióndelhígadoporhepatocitos)(29).

LasprincipaleslimitacionesenelusodelasiPSCenmedicinaregenerativaradicanenelbajo

rendimientodelprocesode reprogramacióngenética(30), laduracióndeesteproceso (entre

12-20días)(31), lasdificultades en lapurificación(32) así comoen la integración específica al

lugar indicado y no en localizaciones no deseadas(33). Esto, unido a la posibilidad de una

desdiferenciación previa al trasplante y a la necesidad de más estudios sobre la memoria

genéticade las iPSC suponeun frenopara su aplicación clínica en el campode lamedicina

regenerativa(34)(35).

4.3.-APLICACIÓNTERAPÉUTICADELAS iPSCENTERAPIAGÉNICADEENFERMEDADES

HEPÁTICAS.

DiferentesestudiossehancentradoenelpotencialusodeloshepatocitosderivadosdehiPSC

en enfermedades hepáticas innatas como pueden ser la deficiencia de α1-antitripsina, la

hipercolesterolemia familiar, la enfermedad de almacenamiento de glucógeno Tipo 1a, la

tirosinemia hereditaria, el síndrome de Crigler-Najjar y el déficit en el factor VII(36). Estas

enfermedades,cuyaúnicaposibilidaddecuraciónpasaporunamodificacióndelaexpresión

génica,suponenuncampoatractivoparaelempleodeiPSC.

En este caso las iPSC tendrían que sermodificadas genéticamente para soslayar el defecto

heredado,empleandotecnologíasdeedicióngenómicamediantenucleasasdezinc(37).Unavez

10

que, a partir de células del paciente conseguimos hepatocitos sanos, estos podrían ser

empleados en la generación de órganos in vitro para un posterior trasplante(38), en su

implantación directa en el hígado o en la creación de hígados bioartificiales

extracorpóreos(39). Diferentes estudios han demostrado resultados prometedores en

roedores, consiguiendomejorar laactividaddeaquellosprocesoscelularesafectadospor la

patologíaheredada.

Unodelosestudiosanalizadosrealizóunacomparaciónentreelusodehepatocitosnormales

yhepatocitosobtenidosa travésde iPSCenel tratamientode lahemofiliaBen ratones. La

obtención de los hepatocitos a partir de iPSC se hizo a partir de protocolos establecidos,

validándose a su vez la implantaciónde estos en el hígado. La efectividadde losdiferentes

tratamientos se valoró en función de la mejora de los tiempos de protrombina, medidos

mediante tromboelastrografía Los tiemposobtenidos fueron significativamentemejores en

ratonestratadosconiPSC,observándoseunaumentodelaactividaddelfactorIXdeentreun

2yun3%alas4semanastrasla implantación.Encomparaciónalostratamientosactuales

paralahemofiliaB,comopuedeserlaterapiadereemplazamientodelfactorIX,elempleode

hepatocitosdeiPSCsuponeunmenorcoste,unamenorincidenciadeeventoshemorrágicos

futurosyunmenorriesgodeanafilaxis(40).

4.4.-HÍGADOSBIOARTIFICIALESEHÍGADOSINVITRO

Denominamos hígado bioartificial (BAL) a un dispositivo extracorpóreo, compuesto por

células hepáticas, que es utilizado en casos de insuficiencia hepática aguda a fin de suplir

parcialmente las funciones del hígado dañado(41). Estos dispositivos no son capaces de

sustituirtotalmentelafunciónhepática,ysesuelenusarcomomedidapaliativaenesperaa

untrasplante.

Es importante diferenciar los diferentes BAL de lo que sería un hígado invitro. El término

hígado invitro hace referencia auna líneade investigaciónactual, encuadradadentrode la

ingeniería de tejidos, en la que se busca desarrollar hígados a partir de célulasmadre del

paciente,normalmentesobreunamatrizdecelularizada,conel findepoderusarlosparaun

trasplanteposterioroparaelestudiodeunapatologíadeterminada.

11

4.4.1.-HÍGADOSBIOARTIFICIALES

Ante un daño hepático agudo, se produce una insuficiencia metabólica. Esta situación se

caracterizaporunaumentode la concentraciónde sustanciasdedesecho, así comodeuna

incapacidad progresiva del organismo para mantener una homeostasis adecuada. La

acumulacióndedeshechosfuesolucionadaenunprincipiomediantelautilizacióndesoportes

extrahepáticos no biológicos, que recibían el nombre de “diálisis extrahepática”. Estos

métodos presentaban una cierta eficacia en la eliminación de sustancias tóxicas, pero eran

incapaces de restaurar las funciones metabólicas perdidas, entre las que resaltan la

ureogénesis, detoxificación enzimática, síntesis proteica, gluconeogénesis y la

inmunomodulación.

AnteestaproblemáticasurgieronlosBAL.Estosdispositivosestáncompuestosporunaserie

decartuchosconfibrashuecasdondesesitúanloshepatocitos.Loscartuchosestándiseñados

paramaximizar la superficie de células expuestas al plasma del paciente, permitiendo una

disposiciónen3Dquefacilitaelcrecimientodeloshepatocitos.Estossistemasbioartificiales

se encuentran actualmente en uso clínico, usando diferentes fuentes celulares, desde

hepatocitosporcinosa líneascelulares.ElprincipalsistemausadoeselHepatAssist(Alliqua

Inc.,Langhorne,PA,USA),formadoporcélulasporcinascriopreservadaspuestasencontacto

con el plasma a través de unamembranamicroporosa, impidiendo de estamanera que se

produzcanreaccionesinmunitarias.OtrosdispositivosusadosseríanelELAD(VitalTherapies

Inc., San Diego, USA), que usa células de hepatoblastoma C3A, y con eficacia probada

reduciendo los niveles de amonio y bilirrubina en casos de encefalopatía hepática. Otros

dispositivosmenosusadossonelAMC-BAL(AcademicMedicalCenter,Amsterdam,NL)yel

MELS(Charité,Berlin,GE)(42).

4.4.2.-INGENIERÍADETEJIDOS:HÍGADOSINVITRO

Las principales investigaciones dirigidas a la producción de órganos in vitro para ser

trasplantadossecentranenlaimplantacióndediferentestiposcelularessobreunamatrizque

permitaunadisposiciónlomássimilarposiblea laqueencontramosenunorganismo.Para

obtener estas matrices se aplican técnicas de descelularización o de impresión 3D

(bioprinting).

En las técnicas de descelularización, las células del órgano (en este caso el hígado) son

eliminadas mediante la perfusión de una mezcla de detergentes alcalinos y agentes

enzimáticos, que eliminan cualquier resto celular que pueda provocar una respuesta

12

inmunitaria.Estoesdesumaimportanciaparainiciarposteriormenteelcultivodediferentes

tipos celulares sobre lamatriz(43). Una vez obtenida lamatriz extracelular, normalmente a

partirdehígadodecerdo,seprocedeainiciarlarecelularización.

Figura4:Generacióndehígadosinvitro.HandaKetal(2014)

La importancia de las iPSC radica en su capacidad para diferenciarse en diferentes células

hepáticas según sea sometido a la acción de diferentes precursores. Es por esto que son

utilizadasparagenerarhepatocitos,célulasendoteliales,célulasepitelialesdelductobiliary

célulasestrelladas.Estascélulassonimplantadasenlamatriz,dentrodeunbiorreactorenel

medio adecuado, y tras un tiempo se obtiene una estructura tisular en tres dimensiones.

Actualmentelasmayorescomplicacionessecentranenestepunto,debidoaladificultadpara

conseguirórganosinvitrodemaneraestandarizadayquealcancenunosnivelesmínimosde

actividadbioquímica,comoparasupliraunhígadonormal(44).

4.5.-CÉLULASMADREMESENQUIMALESENCARCINOMAHEPÁTICO

LasiPSChandemostradotenerunfuturoprometedoreneltratamientodelasenfermedades

crónicas hepáticas, desplazando a lasMSC enmultitud de aplicaciones. Sin embargo, en el

tratamiento de una de las complicaciones más frecuentes de las enfermedades hepáticas,

comoeselhepatocarcinoma,lasMSCsiguenrepresentandounafuturaopciónterapéutica,a

pesardelapolémicaalrespecto.

Currently, themain challengewith determining the suitabilityand relevance of the various types of existing organotypic he-patic culture systems for different types of toxicological appli-cations has been the lack of consensus on the standardization ofsuch systems, namelydefinitions and criteria for the following: i)biological and toxicological parameters, ii) quality controlmeasures, iii) minimum acceptable levels of basic hepaticfunctions (protein synthesis, basal phase 1 and 2 enzyme acti-vitydespecially if pluripotent stem cellederived liver cells willbe used), and iv) concentration ranges for importantmediators ofchemical-induced stress, such as mitochondria activity andadenosine-triphosphate production. These criteria would alsoneed to be compared with those observed in vivo.

Significance and Future Perspectives

Beyond the potential clinical implications of assemblingwhole livers for transplantation, organ assembly for use inpreclinical models has the potential to make an immediateand substantial impact on a wide variety of therapeutic andtechnological developments (Figure 3). These models canoffer complex 3D configurations in a controlled and scalablesetting, addressing scientific and ethical concerns associatedwith forms of in vivo testing. Future work involvingcell-cell, cell-ECM biological features, and therapeutic ap-plications of assembled livers will have to incorporatehuman cell types into the organoids, as well as develop

technical consistency and comparable validation with otherknown standards for testing therapeutic strategies (Figure 3).The liver ECM presents an ideal scaffold for stem cell

differentiation into hepatocytes, as well as cell trans-plantation. Whole organ assembly could provide models tostudy liver development and hepatic maturation processes,as well as models to study the complex interactions betweenparenchymal and nonparenchymal liver cells. Finally, wholeorgan liver assembly could be used as an in vitro tool toaccurately predict drug metabolism and toxicity in humanliver grafts, potentially resulting in reduced costs and time indrug development, as well as reduced exposure to harmfulagents by patients during clinical trials.Organ-engineering approaches to stem celleniche in-

teractions in decellularized organs may also provide novel in-sights into the distinct roles of juxtacrine and paracrinesignaling in stem cell fate decisions, because co-cultures inorgan-specific structures allow for greater control overinteractions between cell types from the same organ. Further-more, it may be possible to generate entirely autologous organsrequiring little to no immune suppression, given that protocolsfor the directed differentiation of human pluripotent stem cellsinto liver nonparenchymal cells are available (Figure 3).Finally, organotypic ex vivo systems, although minimal-

istic, are likely to be of particular importance in the analysisof liver disease (eg, hepatocarcinoma and NASH), becausemouse models do not always recapitulate the pathophysio-logical characteristics seen in humans, and hepatocytes

Figure 3 Schematic representation of the regenerative medicine paradigm of whole liver assembly using human-induced pluripotent stem (iPS) celltechnology, cell differentiation, cell therapy principles, and natural liver matrix scaffolds to construct multicellular 3D tissue for biological research andtransplantation. Drawings are not to scale.

Handa et al

354 ajp.amjpathol.org - The American Journal of Pathology

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El microambiente tisular hepático tiene una amplia influencia en el desarrollo tumoral,

favoreciendoespecialmentelametástasisdetumorescolorrectales,pancreáticosoesofágicos.

ElpapeldelasMSCfrenteauncarcinomaradicaensucapacidadparamigrar.Lamigración

hacia lazonaafectadaporel tumorhasidodescritadebidoa lapresenciade receptoresde

citoquinas y TLR en la superficie de las células madres mesenquimales. Estos receptores

interactuarían con diferentes sustancias secretadas por el tumor, resaltando HGF, SDF-

1(Steroidogenic factor-1),b-FGF,VEGF-A (VascularEndothelialGrowthFactor-A)yVCAM-1

(VascularCellAdhesionProtein1).

Figura5:AccionesdelasMSCentumoreshepáticos.HernandaPYetal(2014)

Diferentes corrientes científicas defienden actualmente un papel dual de las MSC en el

carcinoma hepático, promoviendo o inhibiendo el crecimiento tumoral. Por un lado fueron

clasificadas según la expresión de TLR4 (Toll-like Receptor 4, proinflamatorio, atenúa el

crecimientotumoralydisminuyelasmetástasis)oTLR3(inmunosupresivo,incrementandoel

crecimiento tumoral y la metástasis). Otra corriente defiende que las MSC favorecen el

crecimiento tumoral al ser co-inyectadas junto a las células tumorales, o inhiben el

crecimientotumoralalseradministradasentumoresestablecidos(45).

joined the immune cell club, they are well-recognized for their potentimmunomodulatory capacity.

6.2. Immunomodulation by MSCs

MSCs canmodulate the function of several cell types of the immunesystem including those from innate immunity including natural killer(NK) cells [57] and macrophages [58]. MSCs are also capable of modu-lating the differentiation, activation and function of dendritic cells(DCs) [59], the most efficient antigen presenting cells. The key functionof dendritic cells (DCs) is translating innate to adaptive immunity andthese cells are thought to have important link with HCC progression[60]. T cells are the main components of adaptive immune system andare crucial in controllingmalignant disease, mediating both cytotoxicityof cancer cell themselves and release of anti-oncogenic cytokines [61,62]. MSCs can effectively inhibit T cell function through multiple path-ways [63,64].

Regulatory T cells (Tregs) are a specialized subset of T cells that sup-press activation of the immune system tomaintain homeostasis and tol-erance to self-antigens. In patient HCC tumor, increased frequencies ofhighly activated Tregs are infiltrating the tumor milieu and they aremainly localized in the stroma compartment of the tumors [55]. Fur-thermore, the frequency of Tregs in HCC has been associated withpoor prognosis [65–67]. In contrast to suppress cytotoxic T cells, MSCscan induce the generation and expansion of Tregs [68]. Additionally,MSCs have been reported to induce the production of IL-10 byplamacytoid dendritic cells (pDCs), which in turn triggered the genera-tion of Tregs [63]. However, potential interactions between these

immune cells with MSCs or tumor stroma in general, have been poorlystudied in the context of liver cancer, which certainly deserve moreattention for further research.

7. Therapeutic application of MSCs in liver cancer: call for caution

7.1. Potential therapeutic application

Evidence from various preclinical models showing that MSCs canmigrate into certain types of tumors has inspired the use of MSCs as ve-hicle for anticancer drug/gene delivery [11]. This notion was furthersupported by the fact that several studies have demonstrated potentialanti-cancer effects of MSCs [31,35,45,69]. In experimental HCC models,genetically modified MSCs have been used to deliver anti-cancer geneand inhibition of HCC cell proliferation was demonstrated in vitro andin vivo [70,71]. Another approach is to deliver oncolytic viruses(e.g. measles virus) by MSCs into the tumor, in order to avoid pre-existing immunity against the virus [72]. These observations encourageclinical investigators to design trials for treating HCC, which remains anunusually deadly disease, using MSCs as a vector.

MSCs have been extensively investigated in clinical trials to treatvarious diseases [73,74]. For treating cancer, trials have also been initiat-ed to treat ovarian cancer (NCT02068794), head and neck cancer(NCT02079324) and prostate cancer (NCT01983709). Although MSCshave not been used for treating liver cancer yet (to our knowledge),over 30 trials have been registered at ClinicalTrials.gov for treatingvarious liver diseases (Table 2).

Fig. 2. Proposedmechanisms for the tumor-suppressive and tumor-promoting effects ofMSCs. The properties ofMSCs and the particular tumormicroenvironmentmay result in dual rolesof MSCs that can suppress or promote tumor progression. The tumor-suppressive mechanisms are mainly due to secreted factors and downregulation of Wnt and NF-kB pathway. Thetumor-promoting mechanisms are mainly attributed to both secreted factors and direct effects via 1) supporting tumor vasculature, 2) EMT transition and 3) ECM remodeling. Theimmunosuppressive effects of MSCs (inhibit NK cells, macrophages, dendritic cells, T cells and support regeneration of Tregs) conceivably lead to tumor-promoting effect.

443P.Y. Hernanda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1846 (2014) 439–445

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Entrelosmecanismosimplicadosenlainhibicióntumoralsehandescritolaregulacióndela

vía de señalizaciónWnt, favoreciendo la apoptosis, la regulación de la vía NF-kB (Nuclear

factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), clave en el inicio de procesos

tumorales y la secreción de microvesículas con capacidad para detener el ciclo celular y

producirapoptosisenlascélulastumorales.

PorotrapartenosencontramosconquelasMSCpuedenfavorecerenciertoscasoselavance

de los tumores, favoreciendo la creación de vasculatura en el tumor (implicando

principalmentealasproteasasSERPINE)ylaremodelacióndelamatrizextracelular.

Estadualidaden lasposiblesaccionesde lasMSChacemuydifícilestablecerunaindicación

terapéutica clara para su uso en un futuro cercano, siendo necesarias nuevas

investigaciones(46).

6.-DISCUSIÓN

Las terapias celulares tiene un enorme potencial como tratamiento de patologías

tradicionalmentecrónicasyconungrannúmerodecomplicaciones,comosonlasprincipales

hepatopatías, ya sea empleándolas directamente (en forma de trasplante) o de manera

indirecta(enlaobtencióndeórganosodispositivosbioartificiales).

Unade lasprincipales fuentesde célulasmadrehepáticas, así comodehepatocitos, son las

denominadasiPSC.Estascélulas,quepuedenserobtenidasdeformapocoinvasivayque,al

provenir del propio paciente no presentan inmunogenicidad, centran hoy en día un gran

número de estudios acerca de su posible viabilidad en aplicaciones clínicas. Comoposibles

inconvenientes, las iPSCpresentanunamayorposibilidadde tumorogénesisprincipalmente

debido a los vectores, normalmente víricos, empleados en su obtención, estudiándose así

mismoposiblesalteracionesgenómicasenestascélulasquepuedanllevaraalteracionesenla

memoriaepigenética.

Frenteaestetipocelular,encontramosalasMSC,quehansidoestudiadasmásextensamente

e incluso probadas en diferentes ensayos clínicos, obteniéndose resultados contradictorios.

Sinembargo, lasprincipalesventajasde las iPSCfrentea lascélulasmadresmesenquimales

radican en su mayor capacidad para diferenciarse en diferentes linajes celulares y en su

utilidadcomomodeloparaelestudiodediferentesenfermedades(principalmentegenéticas)

yelpotencialtóxicodelosmedicamentos.Estosestudiosserealizansobrecultivoscelularesu

15

órganos in vitro cuyas características genéticas son idénticas a los del paciente y que son

obtenidosapartirdeiPSC.

La aplicación de células iPSC en el tratamiento de patologías hepáticas mediante

administración directa en el lugar de la lesión ha demostrado un mayor porcentaje de

implantaciónysupervivenciarespectoalaintroducciónporvíaintraesplénica,reduciendoel

número de células que proliferan en localizaciones extrahepáticas. Aún así, sigue siendo

necesarioeldesarrollodeunmétodoquepermitaquelascélulastrasplantadasseancapaces

de actuar en el foco de la lesión de manera específica, sobre todo cuando se trata de

localizacionesdedifícilaccesoquirúrgico,enlasquelaimplantaciónpuedenoserposible.En

elcampodelaregeneraciónsiguensiendonecesariolarealizacióndeestudiosalargoplazo,

quepermitandeterminardemanerafiablelaposibilidaddedesarrollodetumores,yaqueen

el proceso de reprogramación se emplean factores de transcripción relacionados con

mecanismosderegulacióntantodelcrecimientocomodelaproliferación.

UnodeloscamposdondemásestudiossehanrealizadoacercadelposiblepapeldelasiPSCes

en el de las enfermedadesmetabólicas de origen genético. En estas enfermedades, debidas

normalmentealaactividaddisminuidaoausenciadeunaenzima,lascélulasmadrespueden

jugar un importante papel, ya que no es necesaria la implantación de un gran número de

células. Esto se debe a que enmuchas de estas patologías una pequeña recuperación de la

actividad enzimática produce un cambio significativo en la sintomatología, como quedó

demostradoenunestudiollevadoacaboporlaUniversidaddeLovainaenelaño2014,enel

que se procedió al tratamiento con MSC de niños con la enfermedad de Crygler-Najjar,

caracterizada por un mal funcionamiento del ciclo de la urea, obteniéndose resultados

prometedores.

Enpacientesconundeterioroavanzadoenlafunciónhepáticayqueseencuentranenespera

para un trasplante se suelen utilizar los denominados BAL, o hígados bioartificiales. Estos

dispositivos compuestos de células hepáticas que suplen de manera parcial la actividad

metabólica del hígado dañado pueden ser de diferente naturaleza. Inicialmente los más

usados fueron los compuestosporhepatocitosporcinos,pero laposibilidaddel contagiode

zoonosisylasdiferenciasmetabólicasexistentesentreespecieshacequenoseanlasideales.

Actualmente se investigan dispositivos compuestos por células procedentes de líneas

tumorales o de células madre. El principal problema de las líneas celulares radica en su

incapacidadparaeldesarrollodetodaslasfuncionesmetabólicas,mientrasquelasderivadas

16

de célulasmadres tras su diferenciación alcanzanunmayor gradode funcionalidad, lo que

suponeunaventajaalahoradeserusadasenterapiasdesustituciónhepática.

Unavezllegadosaunestadioavanzadoenelquesóloesposibleeltrasplante,lageneración

de órganos invitro supone un campo prometedor. La obtención dematrices extracelulares

(ECM),yaseamediantetécnicasdedescelurizaciónobioprinting(procesodeimpresiónque

permitelacreacióndeestructurasbiológicasdesoporte,similaresalamatrizextracelular)y

la posterior implantación de tipos celulares en sus localizaciones permite la creación de

órganosartificiales.En lageneraciónde losdiferentes tiposcelulares jueganun importante

papel las iPSC, ya que al ser pluripotenciales permiten la obtención de la mayorías de los

linajes celulares implicados. En este caso, el principal inconveniente se encuentra en la

dificultadparasituar lascélulasenelmismo lugarqueenelórganooriginal,asícomopara

garantizarsucorrectodesarrolloyfuncionalidad.

7.-CONCLUSIÓN

Las enfermedades crónicas hepáticas suponen un problema sanitario global, causando una

elevadamorbilidadymortalidad.EnestecontextolasiPSCsemuestrancomounaalternativa

a las terapias tradicionales, con potencial para revolucionar el abordaje actual de estas

patologías.Sinembargo,debemosserprudentesconestasnuevasterapiasdebidoaqueaún

se encuentran en un estado de investigación inicial, presentando un amplio abanico de

inconvenientesqueaúnquedanporresolver.Endefinitiva, consideramosnecesarioapostar

de manera decidida por la investigación y el desarrollo de nuevas terapias celulares que

puedan reducir a la mínima expresión el importante impacto de las patologías crónicas

hepáticas.

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