UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANNTACNA

Microbiologa General

Dr. Csar Cevallos Columbus

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN TACNA

FACULTAD DE CIENCIAS: E.A.P DE BIOLOGA MICROBIOLOGACURSO: MICROBIOLOGA GENERALPRCTICA DE LABORATORIO N 08METABOLISMO BACTERIANOINTRODUCCIN

Se entiende por metabolismo al conjunto de reacciones qumicas de mantenimiento celular. Este proceso involucra reacciones productoras y consumidoras de energa, y procesos biosintticos que permite el recambio de materia del organismo con su medio. Las distintas reacciones qumicas del metabolismo se denominan vas metablicas y las molculas que en ellas intervienen se llaman metabolitos. Todos estos procesos estn regulados por enzimas. El estudio de las reacciones del metabolismo ha sido posible gracias al uso de istopos radiactivos.Las bacterias, en conjunto, utilizan un nmero enormemente elevado de fuentes de energa. Algunos captan la luz, otras de productos qumicos orgnicos e inorgnicos: Por fortuna, hay algunas reglas fundamentales para el proceso de transformacin de energa, desde su fuente a una forma qumica que puede ser utilizada para los procesos celulares que requieren energa. Se ha comprobado que todas las vas de generacin energtica terminan en trifosfato de adenosina (ATP) y nucletidos reducidos de piridina (PNH).

OBJETIVOS.

1. Caracterizar el funcionalismo bacteriano

2. Ilustrar el metabolismo bacteriano

3. Reconocer la utilidad del estudio metablico como criterio importante para la identificacin y clasificacin de las bacterias. MATERIALES.

Microscopios Mecheros

Asas bacteriolgicas

Gradilla porta tubos

Agua destilada

Cultivo de bacterias Pipetas Pasteu Set de colorantes Gram Reactivo de Kovacs

Solucin de rojo de metilo

Solucin de -naftol al 6% en alcohol amlico

Solucin de hidrxido de potasio 16%

Aceite de cedro y xilol

Tiras reactivas de nitrato de plomo

Medios de cultivos: Agar almidn, agar citrato de Simmons, agar TSI, Agar LIA, agua peptonada, Caldo lactosado, Caldo MR-VP

ACTIVIDADES.1. HIDRLISIS DEL ALMIDN.

Algunos microorganismos elaboran enzimas extracelulares capaces de hidrolizar macromolculas como los polisacridos. El almidn es un polisacrido simple y puede ser degradado por bacterias que presentan enzimas amilasas. Se evidencia la utilizacin del almidn por los microorganismos, haciendo uso del lugol como indicador. El almidn con el iodo producen color azulado; si el germen ha hidrolizado el almidn, el color azul no se presenta. Procedimiento: Demarcar la base de una placa Petri, con agar almidn, en 4 partes. Numerar y Sembrar. Incubar a 35-37C por 24 horas.

Resultados: inundar la superficie del medio con lugol y observar la reaccin que se presenta.

2. FERMENTACIN DE AZCARES.

Una gran variedad de carbohidratos son fermentados por las bacterias, y el modelo de fermentacin es caracterstico para ciertas especies, gneros o familias de organismos.

Procedimientos. Inocular cada juego de tubos con cada una de las bacterias indicadas. Mantener un tubo sin inocular como testigo. Incubar a 35-37C por 24-48 horas.

Resultado. Despus del periodo de incubacin, comparar cada uno de los tubos sembrados con el tubo control. Anotar los resultados en un cuadro en la forma siguientes.

A/G = cido y gas; A = cido; O = no fermentado.

3. PRUEBA DEL ROJO DE METILO.

La prueba del rojo de metilo se emplea para identificar el tipo de fermentacin que realiza un microorganismo. Esta prueba, se lleva a cabo aadiendo una gota de este indicador de pH a un cultivo en caldo peptona glucosado.

Procedimiento.

Rotule los dos tubos con el nombre de cada microorganismo. Inocule cada cepa en su tubo correspondiente. Incubar a 35-37C por 24 horas.

Agregar 4 o 5 gotas del indicador a cada tubo.

Observar e interpretar los resultados.

4. REACCIN DE VOGES PROSKAUER.

El compuesto causante de esta reaccin es la ACETOINA, que se forma como intermediario en la produccin de butilenglicol.

Procedimiento.

1. Rotule los tubos con el nombre del microorganismo.

2. Inocule cada cepa en su tubo correspondiente. Incube a 37C por 24 horas.

A cada tubo agregue 8 a 10 gotas de la solucin de -naftol y 4 gotas de la solucin de hidrxido de potasio. Agite despus de agregar cada solucin. La reaccin es positiva si aparece una coloracin rosada que nos indica la presencia de acetilmetil carbinol. Anotar los resultados obtenidos.

5. Produccin de Indol.

Ciertos microorganismos son capaces de degradar el aminocido TRIPTOFANO, formando un producto final de hidrlisis conocido como Indol.Procedimiento.

Rotule cada uno de los tubos con el nombre de cada uno de los microorganismos.

Inocular cada cepa en los tubos correspondientes. Incubar a 35-37C por 24 horas.

Agregue 4-5 gotas de reactivo de Kovacs a cada tubo. Agite suavemente.

NOTA. El reactivo de indol de Kovacs debe ser fresco, pues con el tiempo cambia el color de amarillo a castao y pierde sensibilidad. Puede conservarse en nevera a 4-10C algunos das, en frascos hermticos y de color mbar.

Resultados: la reaccin es positiva si se forma un anillo de color violeta rojizo en la zona de la interface lquido-aire.

6. Prueba del Citrato

Algunos microorganismos utilizan el citrato como fuente de carbono. El medio debe contener, adems de citrato, sales de amonio inorgnico como fuente de nitrgeno. El resultado es la alcalinizacin del medio debido a la formacin de amonaco a partir de las sales de amonio, y la formacin de carbonatos y bicarbonatos que se deben a la degradacin del citrato.

Procedimiento.

1. En 2 tubos de cada tipo de medio inocular los microorganismos en estudio. El tubo restante de cada tipo de medio queda como control. El inculo debe ser representativo para evitar falsos resultados positivos.

2. Incubar 35-37C por 48 a 72 horas, dejando los tubos destapados para que se desprenda el anhdrido carbnico.

Resultados.

Citrato Positivo: color azul intenso en la superficie del medio y crecimiento.

Citrato negativo: no hay cambio de color ni crecimiento.

7. PRUEBA DEL AGAR TSIEl agar TSI (agar hierro tres azcares), es un medio de cultivo diferencial basado en la capacidad de los bacilos gramnegativos, de fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa), producir H2S y gas. En este medio la fermentacin de los azcares, que da lugar a la produccin de cidos, se detecta mediante el indicador de rojo fenol: amarillo (cido) y rojo (alcalinizacin).La degradacin de la lactosa ocurre en la parte superior (pico de flauta), de la sacarosa en la parte intermedia y la glucosa es fermentada en la parte profunda y en condiciones anaerbicas.

Procedimiento.

1. Etiquetar 4 tubos de agar TSI con los nombres de cada uno de los microorganismos.

2. El quinto tubo ser de control. Inocular los tubos rotulados con los respectivos microorganismos. La inoculacin es por puncin profunda y estra en la superficie. El asa bacteriolgica debe estar en aguja o en punta.

3. Incubar a 35-37C por 24 horas. Hacer lecturas de cada uno de los tubos cumplidas las 24 horas.

Resultados.

La lectura comprende tres parmetros: cambios de pH, produccin de gas y produccin de sulfuro de hidrgeno.

Cambio de pH. Se produce por la fermentacin de uno o ms azcares.

Fermentacin de azcares.

La degradacin de la glucosa ocurre en el fondo del tubo y en condiciones anaerbicas, la degradacin de la lactosa, ocurre en la parte superior (pico de flauta), de la sacarosa en la parte intermedia. Si no fermentan ningn azcar ni degradan peptona el medio no sufre cambio de color.

Produccin de gas. Aparecen cavidades en el medio o desplazamiento del medio del fondo del tubo, debido a la formacin de hidrgeno y de anhdrido carbnico.

Produccin de H2S. Se manifiesta por un color negro en la parte profunda del medio, o bien un anillo negro cerca de la parte superior de la capa profunda, as como un precipitado negro en la zona profunda.

8. PRUEBA DE LA DESCARBOXILACIN DE LA LISINA O LIALIA: Es un medio que sirve para demostrar la produccin de dos enzimas: la lisina descarboxilasa y la lisina desaminasa, adems la presencia de sales de hierro sirve para detectar la produccin de H2S por algunos microorganismos.

La descarboxilacion de la lisina ocurre en ambiente anaerbico o sea en el fondo del tubo y se pone de manifiesto por la alcalinizacin del medio produciendo un viraje del indicador prpura de bromocresol. La presencia de glucosa en los componentes del LIA determina primero una reaccin de fermentacin, produciendo acidificacin y cambio de color del medio a amarillo y el pH favorable para la reaccin de descarboxilacin que ocurre despus, volviendo a su color violeta original la parte del fondo del tubo.

La desanimacin de la lisina que se puede producir por los gneros Proteus y Providencia, tiene lugar en la parte superior del tubo produciendo acido a cetocarbnico que, al combinarse con la sal de hierro y en presencia de oxgeno, forma un color violeta rojizo. La produccin de H2S se evidencia por la presencia de un precipitado negro por utilizacin de las sales de hierro.

Procedimiento.

Inocular realizando siembra mixta con doble picadura a partir de una colonia del cultivo del microorganismo en estudio e incubar 24 horas a 37C

Resultados e Interpretacin.

A: Reaccin acida. Color amarillo

K: Reaccin alcalina. Color violeta

R: Reaccin alcalina: color rojo

K/K: Descarboxilacin lisina

K/A: Fermentacin glucosa. Descarboxilacin lisina

R/A: Desaminacin lisina. Fermentacin glucosa

CUESTIONARIO

1. En el agar TSI la alcalinizacin a qu se debe? 2. Qu fraccin del almidn es hidrolizado por la amilasa de una bacteria? Ejemplos de bacterias amilasas positivas.3. En el agar LIA qu azcar ha sido eliminado para incorporar Lisina? En qu partes del agar se descarboxila y desamina la lisina? Qu tipo de respiracin se da en cada caso? 4. En la prueba Voges Proskauer la produccin de acetona a qu tipo de proceso fermentativo se debe? 5. Esquematice y explique brevemente cada una de los diferentes tipos de fermentacin.

JUNIO -2014