PRACTICA 3. II Sustrato e Inhibidor Equipo 3 Yalisto

8/18/2019 PRACTICA 3. II Sustrato e Inhibidor Equipo 3 Yalisto

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FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS

CINÉTICA ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA ALCALINA.

Casas Hernández María Fernanda; Hernández Pando Daniel Alejandro; LagarQuinto Frida; López Huerta Eric

Departa!ento de "io#uí!ica E$peri!ental; %rupo &; E#uipo' &( ) de a*ril de+,-.

Resumen

En esta práctica se determinaron las

constantes cinéticas, Km y Vmax, de la

enzima fosfatasa alcalina, para la reacción de

desfosforilación, manteniendo constante laconcentración de enzima, el pH y la

temperatura previamente determinados para

tener condiciones óptimas de reacción.

También se aadió un in!ibidor "#olibdato de

$odio% y se determinaron las constantes

cinéticas aparentes para as& poder determinar el tipo de in!ibición.

1. Introdu!"n

El término cinética enzimática implica el

estudio de la velocidad de una reacción

catalizada por una enzima y los efectos 'ue

pueden tener varios factores como los

in!ibidores. (no de los principales estudios

'ue se realizan en una enzima es medir el

efecto en la velocidad de la reacción cuandose modifican las concentraciones del sustrato

de la enzima y se mantienen constantes la

concentración de enzima, el pH, la fuerza

iónica del medio, la temperatura, entre otros.

Tanto en una reacción catalizada por una

enzima como en una reacción 'u&mica, se

espera 'ue la velocidad de la reacción de

conversión de sustratos a productos, sea

directamente proporcional a la concentración

de los reactantes 'ue participan en la

reacción, es decir si se duplica la

concentración de cual'uiera de los sustratosla velocidad de la reacción también se

duplica.

) una reacción as& se denomina reacción de

se*undo orden y se representa como una

l&nea recta con pendiente positiva y diferente

de cero. +ero en una reacción 'ue es

catalizada por una enzima, sólo a

concentraciones baas del o los sustratos se

obtiene una reacción de se*undo orden. )

concentraciones altas de sustrato la

velocidad es independiente de la

concentración de sustrato, debido a 'ue no

!ay más enzima 'ue lleve a cabo la reacción.

-a reacción a concentraciones altas de

sustrato se llama reacción de orden cero ytambién se representa como una l&nea recta,

pero con pendiente casi i*ual a cero.

En resumen, en una reacción catalizada por

una enzima la variación en la concentración

del o los sustratos presenta diferentes

órdenes de reacción. +ara un *ran nmero

de enzimas la *ráfica 'ue se produce se

puede describir mediante la expresión

matemática de una !ipérbola rectan*ular.

/omo en cual'uier expresión matemática se

expresan en ella la relación entre las

variables unto a 0 o más constantes. El

trabao pionero de #ic!aelis y #enten y

1rin**s y Haldane llevó a describir la

ecuación de la !ipérbola rectan*ular, a!ora

conocida como ecuación de #ic!aelis2

#enten, con ella es posible predecir el

comportamiento de la enzima en condiciones


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experimentales diferentes. Entonces, la

ecuación se describe as&, las dos variables

de la ecuación son la velocidad "v% y la

concentración de sustrato "s%. #ientras 'ue

las dos constantes son la Km y la Vmax. -a

Km es llamada la constante de #ic!aelis2

#enten. El valor de Km de una enzima paraun sustrato espec&fico es la concentración del

sustrato a la cual la velocidad de la reacción

es la mitad de la velocidad máxima. -a Vmax

es la velocidad teórica máxima de una

reacción. ) concentraciones muy altas de

sustrato el valor de la velocidad se aproxima

al de la velocidad máxima de la reacción,

pero nunca se lle*a a ésta. -os valores de

Km y Vmax son caracter&sticos de una

enzima, aun'ue dependen de las

condiciones en las 'ue se llevó a cabo la

reacción, ya 'ue !ay 'ue recordar 'ue la

enzima es una prote&na 'ue responde

modificando su estructura y car*a eléctrica

cuando los componentes de la solución

cambian.

(na manera para obtener los valores de Km

y Vmax de una enzima también llamados

parámetros cinéticos de una enzima, es

*raficando los valores de velocidad contra la

concentración de sustrato. Este método tiene

la desventaa de 'ue se *rafica una curva y

no una l&nea recta por lo 'ue la interpolación

es dif&cil. 3tra manera, es la de utilizar al*unade las expresiones matemáticas 'ue

producen una l&nea recta como son la de

Eadie2Hosftie, la de Hanes o la más popular

la de -inea4eaver21ur5. -as formas lineales

de la ecuación de #ic!aelis2#enten son

expresiones matemáticas simples y aun'ue

cada una tiene sus problemas de

interpretación son tiles para obtener los

valores de Km y Vmax.

(na de las formas de re*ulación de la

actividad de una enzima es a través de

moléculas 'ue disminuyen su velocidad dereacción, in!ibidores. -os in!ibidores pueden

encontrarse de manera natural en las células

para controlar la velocidad de una reacción

metabólica, o bien pueden ser compuestos

sintéticos 'ue se utilizan como !erramientas

experimentales para el estudio de las

reacciones enzimáticas. #uc!os compuestos

tóxicos como antibióticos, pesticidas o

!erbicidas son in!ibidores de enzimas 'ue

son responsables de reacciones vitales para

la célula.

-a interacción de un in!ibidor y la enzima no

es siempre la misma, ya 'ue depende de la

naturaleza 'u&mica del in!ibidor, as& como de

la reacción 'u&mica 'ue cataliza la enzima.

+ara dilucidar el tipo de interacción entre

ambas moléculas se recurre a determinar el

efecto del in!ibidor en las constantes

cinéticas de la enzima.

6n!ibidores competitivos. $on moléculas 'ue

tienen una similitud estructural y 'u&mica al

sustrato de la enzima. 7ebido a lo anterior el

in!ibidor se puede unir al sitio activo de la

enzima. +ero como el in!ibidor no es idéntico

al sustrato, la enzima no es capaz de

convertir el in!ibidor a producto. El in!ibidor simplemente blo'uea el sitio activo, por re*la

no es posible 'ue tanto el in!ibidor como el

sustrato se encuentren al mismo tiempo en el

sitio activo. $i se adiciona más sustrato y el

in!ibidor es reversible, el aumento en la

concentración de sustrato reduce la

in!ibición. El in!ibidor afecta exclusivamente

el valor de la Km de la reacción catalizada

por la enzima.

6n!ibidor no competitivo. El in!ibidor no se

une al sitio activo de la enzima sino a un sitio

aleado del sitio activo y ocasiona un cambioconformacional en el sitio activo de la

enzima. (n in!ibidor no competitivo puro es

a'uel en el 'ue sólo se altera la capacidad

de unir al sustrato. -a mayor parte de los

in!ibidores son in!ibidores mixtos es decir no

sólo se afecta la unión del sustrato sino

también la conversión del sustrato a

producto. 7ebido a lo anterior, los in!ibidores

mixtos alteran tanto el valor de la Vmax como

el de la Km de la enzima.

6n!ibidor acompetitivo. Es un in!ibidor 'ue no

es capaz de unirse a la enzima libre, es decir

sólo se une al compleo Enzima2$ustrato. -o

anterior puede deberse a 'ue la unión del

sustrato expone o crea sitios de acceso o

unión para el in!ibidor, en el o fuera del sitio

activo. (na vez 'ue el in!ibidor se une la

enzima se previene la formación de producto.


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Prepararcur/a

patrón

Leer a 0-1n!

%ra2car

Prepararseg3n ta*la

Leer a 0-1n!

4*tener eltie!po ópti!o

5na /ez 2jado eltie!po( pro*ar con

distintos pHMedir a 0-1 n!

4*tener el pHópti!o en el #ueopera la enzi!a

El in!ibidor acompetitivo altera tanto la Km

como la Vmax de la enzima. $in embar*o, a

diferencia de la *ráfica 'ue se produce con

un in!ibidor de tipo no competitivo mixto, las

curvas a diferentes concentraciones de

in!ibidor son paralelas en este ltimo.

El #olibdato de $odio "8a9#o3:;9H93%. El

ión #olibdato unto con el vanadato son

potentes in!ibidores frecuentemente

utilizados en la caracterización de


4/12

Prepara ensa6ospara encontrar la

te!peratura ópti!aleer a 0-1 n!

4*tener te!peraturaópti!a a un ti!epo

6 pH especí2cos

Con los pará!etrosópti!os de pH( tie!po6 te!peratura prepara

ensa6o para /er ele7ecto del sustrato

leer a 0-1 n!%ra2cár e7ecto del

sustrato

Por 3tli!o adicionarin8i*idor adi7erentes

concentraciones desustrato

leer a 0-1 n!4*tener constantes6 tipo de in8i*ición


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Resu%t$dos(

Determinación de t, T y pH

)r$*!$ 1A /urva patrón del producto 'ue seformará en las pruebas posteriores

, , , , , , , ,

,

,+

,0

,.

,)

79$: ; .? ; -

Cur+$ ,$tr"n de ,-n!tro*eno%

Concentración p-nitrofenol

Abssorbencia

)r$*!$ #A 7eterminación del tiempoapropiado para realizar pruebas posteriores.

, 1 -, -1 +, +1 &

,

,-

,+

,&

,0

79$: ,,-$ = ,,>? ,


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+@, +), +


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Determinación de Km y Vmax

=raficando la velocidad contra la

concentración de sustrato se obtiene una

*ráfica de tipo #ic!aeliana cuya función

se describe mediante la ecuaciónA

V =Vmax∗S

S+ Km

)r$*!$ 5A Efecto de la concentración desustrato sobre la velocidad.

, , , , , , , ,,

,

,

,

,

,

,

Bepresentacion de #ic!aelis2#enten

Sustrato (M)

Velocidad (M/min)

/on la *ráfica C es dif&cil y poco exacto

determinar tanto la Vmax como Km, por

esta razón se recurrirá a la

representación de -ine4eaver 1ur5 'ue

sirve para linealizar la ecuación de

#ic!aelis2#enten, 'uedando de la

si*uiente maneraA

1

V =

Km

Vmax∗1

S +

1

Vmax

?

+osteriormente podrán calcularse los

parámetros Vmax y Km con las

si*uientes ecuacionesA

Vmax=1

b ? Km=b∗m=

Km

Vmax∗b

La /elocidad au!enta con7or!e au!enta la

concentración de sustrato pero 8asta cierto puntocuando la /elocidad se e!pieza a !antenerconstante( indicando el lí!ite de capacidad de la


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)r$*!$ 6A Bepresentación lineal de laecuación de #ic!aelis2#enten

, +,,, 0,,, .,,,

,

+

0

.

)

-,

-+

79$: >? ,

Representación de ine!ea"er #

%/S (%/M)

%/V (min/M)

7espués de evaluar el in!ibidor se

obtuvo lo si*uienteA

)r$*!$ 7A /omparación de la velocidad cony sin in!ibidor

, , , , , , ,,

,

,

,

,

,

,

E*eto de !n8!3!dor mo%!3d$to de sod!o

S (M)

Velocidad (M/min)

+ara calcular 5m y Vmax aparentes se

usará el modelo de line4eaver bur5 y

para determinar el tipo de in!ibidor del'ue se trata.

)r$*!$ 9A Evaluación del tipo de in!ibidor utilizado

1,,, , 1,,,

,

-,,,,,

+,,,,,

&,,,,,

0,,,,,

1,,,,,

.,,,,,

@,,,,,

79$: +.-&$ = 0,@.,00@

>? ,)

79$: >? ,

E*eto de !n8!3!dor

%/S (%/M)

%/V (min/M)

e eli!inaron puntos de a!*as gra2cas #uea7ecta*an la correlación lineal de los datos asi co!o

la pendiente con la cual resulta*an /alores de-I!a$ ne ati/os

Línea naranja' sustrato sin in8i*idor Línea azul'sustrato = in8i*idor( se o!itió una !edición #ue

salía de la tendencia

e o*ser/a clara dis!inución de la /elocidad dereacción enzi!ática( sin e!*argo es di7ícildeter!inar si se trata de in8i*idor co! etiti/o o

5sando los /alores o*tenidos de la regresión se o*tu/o #ue

!a$ 2.14 x10−6

MI!in; Km=9.28 x 10−3 M


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T$3%$ 1( Evaluación y comparación de Km yVmax al a*re*ar in!ibidor

8o !ubo variación si*nificativa de la

Vmax, sin embar*o, parece 'ue Km tuvo

una mayor

modificación, lo

cual indica 'ue

podr&a tratarse

de una

in!ibición de

tipo competitiva.

+ara el cálculo

de la Ener*&a de

activación "Ea%

se utilizaron los resultadoscorrespondientes a la evaluación del

efecto de la temperatura y la ecuación de

)rr!enius, la cual se presenta a

continuaciónA

ln K =− Ea

R

1

T + ln A

7ondeA

5A constante de velocidad de la reacción.

)A factor de frecuencia o factor

preexponencial. Es un &ndice relacionado

con la frecuencia de las colisiones entre

las moléculas de reactivos y sus

unidades dependerán de las de 5.

EaA ener*&a de activación de la reacción,

normalmente dada en 5Dmol20

BA constante de los *ases ideales. $i Ea

viene dada en 5Dmol20, su valor es

F,G00@2G 5Dmol20K

TA temperatura, en 5elvin

T$3%$ ( Valores usados para la Ecuación de )rr!eTem,er$tur$:;<

+e%o!d$d:M=se/<

LN ; 1=T

9.0C F.C0:ICE20@ [email protected]:@I9 @.@@GI@F0C:

9>G.0C 9.0I9@>E2@F 20.I:>I@F @.@@G:0099G

[email protected] 9.G9>9E2@F 20.CC0CF @.@@G9>FI>

[email protected] G.@:CGFE2@F 20.G@@CC @.@@G99:9:I

G0F.0C 0.>00E2@F 20.:9@FF @.@@G0:G00

G9G.0C :.CC0IE2@> 20>.9@C9 @.@@G@>:CGF

Sustr$to>!n8!3!do

r

Sustr$tos!n

!n8!3!dor m :9G.@0 m :9,GI

3 :CC:F b :@@0IVm$?

:M=m!n<9.0>:9x0@J2

@I

Vmax ap

"#min%

9,:>CCGx0@J

2@I@m :M< @.@@@>9F0I

I

5m ap "#% @.@@@0@CG


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$e calculó primero la concentración y la

cantidad de producto por cada

temperatura evaluada, utilizando la curva

de calibraciónA

T$3%$ #( /oncentración y cantidad de

producto.

$e calculó la velocidad dividiendo la

concentración entre 9@ minutos "09@@

se*undos%, se calculó el lo*aritmo natural

de esta velocidad y se *raficó contra el

inverso de la temperatura.

, , , , , , , , , ,

+1

+,

-1

-,

1

,

79$: ? ,)1

Ecuacion de )rr!enius

-I

Ln G

)r$*!$ ( Ecuación de )rr!enius

) partir de la ecuación obtenida con el *ráfico de

las temperaturas en las 'ue es activa la enzima se

calculó la Ea, 'ue resultó ser de .F 5Dmol.

Absorbancia

Concentración (M)

Cantidad(mol)

,,-& -,[email protected],. +1100E-,

,-)@ +1


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T$3%$ 4( Besultados *rupales

&'

t(mi

n)

p

H

T(

C)

&a

(K*/mol)

Vma+

(M/min)

Km

(M)

Vma+

ap(M/min

)

$m ap

(M)

% +, -,(0

01 -11< +(&&E,&

,,,,0)

&(


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experimental o de la forma en 'ue se

calculó este parámetro. )l final de la

práctica, todos los e'uipos concluyeron

en 'ue no !ay diferencia si*nificativa

entre las Vmax y Vmax ap y si la !ay

entre Km y Km ap, por lo 'ue se trata de

una in!ibición competitiva.

CONCLUSIONES(

) pesar de pe'ueas variaciones

obtenidas por otros e'uipos, podemos

concluir 'ue el in!ibidor molibdato de

sodio es un in!ibidor de tipo competitivo.

REFERENCIAS(

• #d!ealt!.com"9@0C% Lactate

Dehydrogenase (LDH) Bevisado

el G de octubre de 9@0C M(B-A

!ttpA444.md2

!ealt!.com-7H.!tmlN• $tuart 6ra,

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