INSTITUTO POLITECNICO NACIONALEscuela Nacional de Ciencias de BiolgicasLaboratorio de Bioqumica y Biloga Molecular Profesora: Gabriela Edith Olgun Ruiz 3IM1 Seccin IIICrdova Flix Juan Manuel, Espejel Rivera Sergio Arturo, Karla Mitzy Prez Sndoval

Prctica 5.5 y 5.6: Efecto de la Concentracin del Sustrato sobre la Velocidad de Reaccin e Inhibicin Enzimtica. Introduccin:El trmino cintica enzimtica implica el estudio de la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores como los inhibidores.En las reacciones no catalizadas por enzimas la formacin de producto depende linealmente de la concentracin de sustrato aadido. A concentraciones relativamente bajas de sustrato, la velocidad de la reaccin aumenta en forma proporcional a la concentracin de sustrato, obtenindose una relacin de tipo lineal. Sin embargo, a concentraciones ms altas de sustrato, la relacin proporcional no se cumple ya que al aumentar la concentracin de sustrato, la velocidad no aumenta considerablemente.

Una de las formas de regulacin de la actividad de una enzima es a travs de molculas que disminuyen su velocidad de reaccin, llamadas inhibidores. Los inhibidores pueden encontrarse de manera natural en las clulas para controlar la velocidad de una reaccin metablica, o bien pueden ser compuestos sintticos que se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las reacciones enzimticas.

Objetivos:Observar el efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de la reaccin enzimtica y determinar la constante de Michaelis-Menten por los mtodos conocidos, as como su aplicacin.Determinar el tipo de inhibicin producido por la anilina sobre la actividad de la invertasa.Resultados:

Reaccin del 3,5 Dinitrosaliclico (DNS) con Azcares Reductores

1.- Efecto de Concentracin del Sustrato:Lecturas de Absorbancia obtenidas en el espectrofotmetro a 540 nm con diferentes concentraciones de sacarosa 0.2 M en presencia de enzima: Invertasa 10 ug/mL. Con las lecturas de absorbancia obtenidas en efecto de [sustrato] interpolando y usando la ecuacin de la recta:Abs = 0.0645 [Az. Red.] + 0.0031, estos valores en la curva tipo de azucares reductores para tener la [Azcares Reductores] en cada tubo.

Tubo No.BlancoProblemas

T123456

Sacarosa 0.2 M (ml)0.50.10.20.30.50.81.0

Absorban-cia00.3230.5850.6370.6550.6800.707

Azcar Reductor(moles)/2.0 mL0

4.95969.02179.827910.106910.494510.9131

Velocidad (unidades de invertasa)00.49590.90210.98271.01071.04941.0913

Concentracin de Sustrato(moles/L) = M)

0

0.01

0.02

0.03

0.05

0.08

0.1

De esta forma la ecuacin de Michaelis- Menten: V0 , tomando los recprocos de ambos miembros se transforma a la ecuacin de Lineweaver-Burk, la cual es: Que es la ecuacin que representa la tendencia lineal de la Grfica de Dobles Recprocos, que al ser de la forma: y= mx + b nos permite calcular el valor de la Km (Constante de Michaelis) y la Vmax. Siendo: y = 1/Vo, m = Km/Vmax, x=1/ [S] y b= 1/Vmax

De esta forma pudimos calcular la Vmax:1/Vmax= 0.3604, Entonces Vmax= 1/0.3604= Vmax= 2.7746 U.ICon este valor de Vmax calculamos la Km:Km/Vmax =0.0059Entonces sustituyendo: Km= 0.0059* 2.7746Km= 0.0163Gg2.- Inhibicin Enzimtica: Resultados con InhibidorTubo No.BlancoProblemas

T123456

Sacarosa 0.2 M (ml)0.50.10.20.30.50.81.0

Absorban-cia00.1920.3210.4010.4350.5520.211

Azcar Reductor(moles)/2.0 mL0

2.92864.92866.16896.69618.5103.2232

Velocidad (unidades de invertasa)00.29280.49280.61690.66960.85100.3223

Concentracin de Sustrato(moles/L) = M)

0

0.01

0.02

0.03

0.05

0.08

0.1

As mediante la obtencin de las dos ecuaciones de tendencia lineal de la forma: y= mx + bCalculamos la ordenada al origen y, y la abscisa al origen xPara as conocer el tipo de Inhibidor que era la ANILINA con la actividad de la INVERTASA.XCI= -0.8017/0.0258 =-31.0736XSI=-0.3604/0.0059 = -61.0847YSI= 0.3604, YCI= 0.8017De esta forma al observar que las rectas no son paralelas (Inhibidor Acompetitivo), y que tampoco se cortan entre s en el eje de las ordenadas 1/V (Inhibidor Competitiva), entonces observamos que las rectas si se cortan entre s pero en un punto en el segundo cuadrante pero que no es sobre ninguno de los ejes por lo que la Anilina es un Inhibidor No Competitivo.Discusin: Como en la prctica de Inhibidores el ultimo valor de absorbancia obtenida fue menor que el anterior a este, los valores calculados a partir de este fueron mucho menores debido a esto concluimos que la enzima se saturo en este caso de glucosa al tener demasiada cantidad de este azcar reductor por lo cual en ese momento ya no dejo que la Invertasa trabajara. Por lo que decidimos descartar el ltimo valor, en la Grfica de Dobles Recprocos.

A partir de estas dos prcticas logramos observar cual es el efecto que tiene la concentracin del sustrato y la accin de los inhibidores en la Velocidad de Reaccin a la que llamamos Actividad EnzimticaDe los cuales observamos que al cambiar la concentracin del sustrato la enzima (Invertasa) acta cada vez ms rpido mientras ms sustrato tenga para trabajar en este caso Sacarosa y que si graficamos Velocidad de la enzima en U.I contra [sustrato] se observa un comportamiento lineal solo al inicio de la grfica por lo cual se podra a decir que este comportamiento solo se da en un inicio a bajas concentraciones de sustrato ya que conforme aumenta la [sustrato] la grafica de velocidad adquiere el comportamiento de una parbola rectangular es decir cada vez la velocidad se incrementa menos, llegando incluso a ser independiente en cierto punto al aumento de [sustrato], debido a que la enzima tiene mucho sustrato (sacarosa) con el cual trabajar teniendo alrededor de 5 millones ms de molculas de sacarosa que de Invertasa por lo cual incluso puede llegar a saturarse la enzima de la glucosa obtenida por la ruptura de sacarosa y bloquear su sitio activo y hacer que la grfica se caiga como sucedi en nuestro caso.Por otro lado al elaborar la grfica de Doble Recprocos o Lineweaver-Burk logramos obtener la constante de Michaelis-Menten Km con un valor de 0.0163 la cual relaciona la [sustrato] con la velocidad de reaccin y la velocidad mxima que se alcanza, del mismo modo con la ecuacin de Lineweaver-Burk obtuvimos la Vmax=2.7746 U.IRespecto a la prctica de Inhibidores en esta prctica utilizamos como Inhibidor a la Anilina realizando el mismo proceso de hidrlisis de la Sacarosa con la enzima Invertasa obteniendo Glucosa y Fructosa, que al dar color reaccionando con el 3,5 DNS deteniendo la Act. Enzimtica por el medio Bsico. Logramos observar como es que los Inhibidores disminuyen la Actividad Enzimtica al unirse ya sea a la enzima en su sitio activo, al complejo ES, o a la enzima pero en un lugar que no es su sitio activo, teniendo como funcin retrasar la velocidad de reaccin enzimtica, al graficar los dobles recprocos con y sin inhibidor llegamos a la conclusin de que la Anilina es un Inhibidor No Competitivo por el comportamiento observado al graficar.

Conclusin: Comprobamos que al aumentar la concentracin del sustrato la velocidad aumenta hasta llegar a un valor mximo Calculamos la Vmax y encontramos su valor que es de 2.7 U.I. Encontramos el valor de la Km (constante de michaelis) el cual es de 0.0163 en este caso Comprobamos que los inhibidores reducen la actividad enzimtica al comparar las graficas de velocidad vs concentracin. Identificamos que el inhibidor que usamos (anilina) es un inhibidor no competitivo debido a la grafica realizada.

BibliografaNelson D.L y Cox M.M, Lehninger: Principios de Bioqumica, 4ta Edicin, Ed.: Omega, 2006, pgs.: 202-211http://bioquimexperimental.files.wordpress.com/2009/08/seccic3b3n3-sustrato-e-inhibidor-final.pdf