Practicas de microbilogia para el estudio de microorganismos

UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Microbiología General y Aplicada

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PRACTICA Nº 4

I. COMPORTAMIENTO CULTURAL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

II. INTRODUCCION

Los estudios de microorganismos en el laboratorio se realizan con cultivos puros, es

decir con una sola especie de microorganismos el cual es inoculado en medios

sólidos y líquidos estériles que aseguren la pureza del cultivo.

Las muestras desde las cuales se les quiere aislar los microorganismos son complejas

presentan una gran variedad, es de aquí donde se toma una alícuota o inóculo y se

transfiere a un medio estéril que generalmente es un medio líquido siempre bajo

condiciones asépticas.

Para obtener cultivos puros de microorganismos se requiere de pasajes sucesivos de

medios líquidos a sólidos o viceversa hasta lograr UFC los suficientemente aisladas

que permitan su pureza.

La pureza de estos cultivos permite estudiar sus características que presentan en los

diferentes medios en los cuales se les cultiva, que pueden ser sólidos o líquidos.

Siguiendo el orden de los estudios microbianos in vitro de morfología celular y de colonias

como caracteres de especies o grupos bacterianos, el alumno observará en esta práctica

las características culturales de 4 cepas con comportamiento característico diferencial en

caldo nutricio, agar en plano inclinado y agar en columna. Cada carácter varía según las

necesidades metabólicas y de multiplicación de las especies o grupos bacterianos y en

parte ayuda a la identificación.

OBJETIVO

- Estudiar el comportamiento de los microorganismos aislados previamente en

medios de cultivo y comprobar la pureza de los mismos.

III. MATERIALES

1.- Cepas puras de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus, Pseudomonas,

Saccharomyces, Aspergillus y Penicillium codificadas de 24 a 48 horas de incubación.

2.- Tubos de ensayo con caldo nutritivo.

3.- Placas con agar nutritivo y agar sabouraud.

4.- Placas con agar papa dextrosa.

5.- Tubos con agar nutritivo semisólido en columna.

6.- Asa de siembra, gradilla, plumón.

7.- Batería Gram: cristal violeta, lugol, alcohol-acetona, fucsina fenicada de Ziehl. Láminas

portaobjetos, cubreobjetos limpias, papel lente.

8.- Microscopio, aceite de inmersión y alcohol 70º.


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IV. PROCEDIMIENTO:

1. Replicación de líquido a líquido

1. Tomar el cultivo de bacterias con la mano izquierda y destapar con el dedo meñique de

la mano derecha a la altura del mechero.

2. Con el asa de Kohle previamente flameada al fuego extraer una alícuota del

inóculo.

3. Tapar el tubo y colocarlo en la gradilla

4. Depositar el inóculo en el nuevo tubo de caldo nutritivo agitando, flamear la boca

del tubo al mechero y taponar.

5. Esterilizar el asa al mechero

6. Rotular e incubar a 28 – 30º.

2. Replicación de líquido a sólido

1. Repetir los pasos (1), (2) y (3) de la técnica anterior.

2. Tomar con la mano izquierda la placa con agar, destapar la placa a la altura del

mechero, introducir el asa y realizar estrías en zigzag con el inóculo en la superficie del

medio.

3. Cerrar la placa y flamear el asa de siembra.

4. Rotular e incubar a 28 – 30º.

V. CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS

1. COMPORTAMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO:

Mediante el siguiente cuadro se sintetizarán los caracteres de comportamiento macroscópico en un medio líquido.

CUADRO I

CANTIDAD DE TURBIEDAD DESARROLLO EN OLOR DESARROLLO SUPERFICIE

Abundante Homogénea - Formación de película, ninguno De naturaleza: Gomosa, lisa, Corrugada, escamosa Membranosa, Costrosa Moderado En grumos finos - Sin película: desarrollo Fecaloide, en anillo Escaso En grumos gruesos Aromático Nulo Algodonoso Parecido a.


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2. COMPORTAMIENTO EN MEDIO SÓLIDO:

La lectura se hará en base a un desarrollo masivo en capa sobre la superficie del medio. Los

caracteres diferenciales son idénticos a los de las colonias.

CUADRO II

CANTIDAD DE FORMA TEXTURA DE CONSISTENCIA

DESARROLLO SUPERFICIE

Abundante Filiforme Lisa Cremosa

Moderado Difusa o Confluente Granular Butirosa

Escaso Arborescente Escamosa Viscosa o vidriosa

Nulo Rizoide Membranosa Gomosa o mucosa

Perlada Papulosa Membranosa

Toruloide Corrugada Algodonosa

Costrosa

Verrucosa

Lacerada

BRILLO TRANSPARENCIA CROMOGENESIS ASPECTO DEL MEDIO OLOR

Vivo Opaca Amarillo limón Inalterado Ninguno

Apagado Opalescente Amarillo oro Grisáceo Fecaloide

Opaco Transparente Amarillo pálido Negruzco Sui generis

Anaranjado Enrojecido Aromático

Azulado Verdoso

Verde amarillento Fluorescente

Verde azulado Lechosa

Rojizo Opalescente

Anotar y realizar la discusión de los resultados obtenidos.

3. COMPORTAMIENTO EN MEDIO SEMISÓLIDO (B. EN COLUMNA)

El crecimiento semisólido se define a lo largo del trazo de siembra por puntura y también

de acuerdo al tipo de multiplicación celular en la profundidad del medio. Permite además la

lectura de la MOTILIDAD MACROSCOPICA de la bacteria a las 24 ó 48 horas. De

incubación.

1. Repetir los pasos (1), (2) y (3) de la técnica N°1.

2. Tomar con la mano izquierda el tubo con agar semisólido, destapar el tubo con el

dedo meñique de la mano derecha a la altura del mechero, e inocular en el agar la

muestra introduciendo el asa (usando alambre de micrón en punta) hasta la zona

media del tubo.


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3. Flamear la boca del tubo, flamear el asa y colocar el tubo en la gradilla.

4. Rotular e incubar a 28 – 30º por 48 horas.

CUADRO III

DESARROLLO EN PUNTURA ASPECTO DEL MEDIO MOTILIDAD

Filiforme Inalterado Crecimiento difuso

Parcial o total del

Microorganismo por

Toda la columna de

Agar: BACTERIA MOVIL

Granular Grisáceo Crecimiento

Circunscrito al trazo

De siembra: BACTERIA

NO MOVIL

Perlado Negruzco

Claviforme Enrojecido

Rizoide Verduzco

En pino invertido Lechoso

Arborescente Fluorescente

Velloso Opalescente

VI. COLORACIÓN GRAM DE LAS CEPAS

Hacer tinción de cada cepa, sea de caldo o de agar.

Hacer esquemas de las observaciones.

VII. PRESENTACIÓN DE INFORME

Con los resultados obtenidos de la caracterización morfológica de las colonias, movilidad

bacteriana, respiración celular, tinción gram y morfología celular además del uso de

bibliografía adecuada e identificar el nombre correspondiente (género y especie o solo

género) de cada una de las cepas estudiadas de las cepas puras Bacillus, Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Sacharomyces presentadas en la práctica. Presentar su discusión de

resultado.


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VIII. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la razón de utilizar cultivos puros para el estudio morfológico?

2. ¿La morfología de los microorganismos varia con el medio de cultivo. Por qué?

3. ¿Cuál es el fundamento de la cromogénesis?

4. ¿Cuál es el fundamento de la fluorescencia en los microorganismos?

Tabla I

Comportamiento Cultural de Bacterias en Medio Sólido

M.O.

Características

Escherichia

coli

Staphylococcus

aureus

Pseudomonas

sp

Salmonella

sp

Bacillus sp

Cantidad de

desarrollo

Abundante Abundante Abundante Moderado Abundante

Forma Difusa Difusa Difusa Filiforme Filiforme

Textura Lisa Lisa Lisa Lisa Corrugada

Consistencia Cremosa Gomosa Cremosa Cremosa Cremosa

Brillo Mate Brillante Opaca Mate Brillante

Adherencia Moderada Moderada Moderada Debil Moderada

Cromogénesis Ausente Amarillo

dorado

Azul verdoso Ausente Ausente

Aspecto del medio Opalescente Opalescente Fluorescente Opalescente Opalescente

Olor Fecaloide Sui generis Fruta podrida Fecaloide Descompuesto

Coloración gram (-) (+) (-) (-) (+)

Comportamiento Cultural de Bacterias en Medio Líquido

M.O.

Características

Escherichia

coli

Staphylococcus

aureus

Pseudomonas

sp

Salmonella

sp

Bacillus sp

Cantidad de

desarrollo

Abundante Homogénea Abundante Moderado Abundante

Turbidez Homogénea Homogénea Homogénea Homogénea Homgénea

Desarrollo

superficie

Sin película Sin película Anillo verde Sin película Sin película

Olor Fecaloide Sui generis Fruta podrida Fecaloide Descompuesto

Sedimento Moderado Moderado Abundante Escaso Ausente

Naturaleza

sedimento

Mucoide Mucoide Grumoso Granular Ausente


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Comportamiento Cultural de Bacterias en medio semi sólido

M.O.

Características

Escherichia coli Staphylococcus

aureus

Pseudomonas

sp

Salmonella

sp

Bacillus sp

Aspecto del medio Opalescente Opalescente Fluorescente Opalescente Opalescente

Motilidad (+) (-) (+) (+) (+)

Comportamiento Cultural de Hongos en medio sólido

M.O.

Características

Saccharomyces

cerevisiae

Candida sp Aspergillus sp Penicillium sp

Cantidad de

desarrollo

Abundante Abundante Moderado Moderado

Forma Perlada Perlada Arborescente Arborescente

Textura Lisa Lisa Corrugadas Corrugada

Consistencia Mucosa Cremosa Algodonosa Algodonosa

Brillo Brillante Brillante Opaca Opaca

Adherencia Débilmente Débilmente Fuerte Fuerte

Cromogénesis Ausente Ausente Azul verdoso Azul negruzca

Aspecto del medio Opalescente Opalescente Opalescente Opalescente

Olor Frutas Frutas Sui generis Sui generis

Comportamiento Cultural de Hongos en Medio Líquido

M.O.

Características

Saccharomyces

cerevisiae

Candida sp Aspergillus sp Penicillium sp

Cantidad de

desarrollo

Abundante Abundante Escaso Escaso

Turbidez Homogénea Homogénea Escaso Escaso

Desarrollo superficie Sin película Sin película Costrosa Costrosa

Olor Frutas Frutas Sui generis Sui generis

Sedimento Moderado Moderado Nulo Nulo

Naturaleza

sedimento

Mucoide Mucoide Nulo Nulo


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Comportamiento Cultural de Hongos en medio semi sólido

M.O.

Características

Saccharomyces

cerevisiae

Candida sp Aspergillus sp Penicillium

sp

Aspecto del medio Opalescente Opalescente Opalescente Opalescente

Motilidad (-) (-) (-) (-)

II. DETERMINACION DEL NUMERO DE MICROORGANISMOS

I. INTRODUCCION

En muchas fases de la microbiología se hace necesario cuantificar el número de

microorganismos que se encuentran en un cultivo o determinar su número en alimentos,

aguas y otros productos.

Los métodos que miden el número de células son importantes para contar el número de

organismos unicelulares como bacterias y levaduras. En la determinación de la masa de

células pueden emplearse para todo tipo de microorganismo.

Existen métodos directos e indirectos:

A) Métodos Directos

1.- Determinación del número de microorganismos

- Recuento microscópico directo

- Recuento en placas

- Número más probable

- Conteo electrónico

- Electrodos de Pt, inmersos en un electrolito. Tamaño de partícula 1- 3 um

1. Contador coulter

2.- Determinación de la masa celular

- Peso seco

- Turbidimetría

- Volumen empacado

B) Estimación indirecta de masa celular

- Cuando el cultivo contiene sólidos no celulares


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Básicamente son valoraciones químicas de los componentes celulares como por ejemplo

nitrógeno, CO2, proteínas, ADN, lípidos, carbohidratos.

Todos los métodos poseen ventajas y desventajas, se hace necesaria la combinación de

varios métodos para tener valores que muestren el número original de microorganismos.

OBJETIVO

• Adiestrar al alumno en los métodos usados en la determinación del número de

microorganismos.

• La cuantificación permitirá determinar la cinética en el caso de los Bioprocesos o el

grado de contaminación de un producto determinado.

II. MATERIALES

• 1 muestra de alimento de expendio público no cocinado (hamburguesa de carne y/o

pollo no cocinada, salsa de ají, cremas, etc.)

• Frascos con 90 ml con agua destilada estéril.

• Placas Petri.

• Tubos con 9 ml de solución salina estéril de 0.85%

• Tubos con 9 ml de caldo lactosa

• Pipetas de 1 y 10 ml

• Tubos con 1 ml de agua destilada estéril

• Gradillas

• Plumón indeleble.

• Mechero

• Encendedor

III. PROCEDIMIENTO

1. Tomar 1 ml ó 1 gr de la muestra problema según sea líquida o sólida y transferir a un

tubo de ensayo con 9 ml de agua destilada estéril, ésta constituirá la dilución 10-1.

2. Realizar diluciones seriadas 10-2, 10-3, 10-4 en los tubos de agua destilada estéril.

3. Proceder al aislamiento por los métodos descritos abajo.

A) RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR EL METODO DE PLACAS:

1. Tomar 1 ml de la dilución de la muestra en condiciones estériles.

2. Destapar con la mano izquierda la placa Petri lo necesario y depositar el inóculo.

3. Colocar la cubierta de la placa Petri.

4. Incorporar 10 a 15 ml del agar respectivo mantenidos a 45° C tapar y describir

movimientos rotatorios a fin de distribuir homogéneamente el inóculo.


63

5. Rotular e incubar a 28° C.

6. Contar el número de colonias que aparecen al final de la incubación.

7. Realizar los cálculos pertinentes.

UFC/gr o ml = (N° de colonias contadas x FDD) / (volumen de siembra)

FDD: Factor decimal de dilución = 1 / Dilución realizada

8. Realizar la discusión de los resultados obtenidos.

B) RECUENTO DE MICROORGANISMOS COLIFORMES POR EL METODO DEL NUMERO

MAS PROBABLE ( NMP)

1. Tomar 1 ml de la muestra problema y transferir a un tubo con 9 ml de agua destilada

estéril, ésta constituirá la dilución 10-1.

2. Realizar diluciones seriadas 10-2, 10-3 en los tubos de agua destilada estéril.

3. Tomar 3 tubos con caldo lactosa e inocular 1 ml de la dilución seleccionada a cada

uno, repetir el procedimiento con las otras diluciones tomando siempre 3 tubos para

cada dilución, empezando siempre con la menor dilución.

4. Rotular los datos en los tubos e incubar a 28° C por 48 horas.

5. Verificar este resultado en la tabla II para determinar el número más probable.

IV. PRESENTACIÓN DEL INFORME

Realizar la discusión de los resultados de acuerdo a la procedencia de la muestra problema.

V. CUESTIONARIO

1.- ¿Puede Ud. Medir el crecimiento de hongos por turbidimetría?

2.- ¿En qué casos se emplea la Escala de Mac Farland?

2.- ¿Cuál es la desventaja que presentan los contadores electrónicos?

3.- ¿Cuál es el inconveniente que presenta el recuento directo al microscopio?

UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General

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TABLA II

Tabla 1. Índice del NMP para varias combinaciones de resultados positivos y negativos para 1g de muestra cuando se usan 3 tubos con alícuotas de 0.1; 0.01 y 0.001g.

Referencia: Official Methods of Analysis of AOAC International, 18 ed. 2005. Chapter 17.3, pag. 5


65

PRACTICA Nº 5

ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS

Es bien conocido que las actividades vitales de los organismos están condicionadas por su

ambiente. Modificando fundamentalmente estos factores, el organismo bien se adapta a las

nuevas condiciones o en todo caso muere; en esto está implicado la magnitud y el tipo de

cambio operado. Este es el aspecto en el que los microorganismos difieren de las células de

plantas superiores y animales.

El conocimiento de los factores físicos que controlan la supervivencia y multiplicación de los

microorganismos nos sirven como instrumento de control de la actividad bacteriana para

ser esta incrementada, disminuida o destruida completamente.

El tipo de muerte bacteriana por agentes físicos está relacionado al número de bacterias

sobrevivientes, lo que significa que el proceso de desinfección no es repentino sino gradual,

en el que el número de microorganismos muertos por unidad de tiempo es mayor al

principio y mucho menor cuando la acción continúa.

I. EFECTO DE LA TEMPERATURA

Las bacterias son capaces de una capacidad de sobrevivencia amplia con límites de

temperatura variable, su rango de crecer y ejercer sus actividades está entre los 0 y 90°C.

CONDICIONES QUE VARIAN LA MUERTE TÉRMICA:

1. Contenido DE AGUA DEL MEDIO: La muerte bacteriana se genera por coagulación de

las proteínas del protoplasma. Cuanto mayor es el porcentaje de agua en el medio,

menor será la temperatura requerida para matar la bacteria.

2. Contenido de agua de los organismos: A menor cantidad de agua, los

microorganismos se secan y se produce mayor resistencia a la temperatura.

3. Concentración de hidrogeniones: Lo microorganismos mueren fácilmente en

condiciones ácidas o alcalinas, requiriéndose temperaturas menores que en medios

neutros.

4. Composición del medio: Los medios que contienen alta concentración de proteínas

incrementan la temperatura requerida para destruir bacterias, ya que las proteínas

forman una película alrededor de los microorganismos como medio de protección

indirecta ante situaciones desfavorables.

5. Edad de las células: Las células viejas son más resistentes que las células jóvenes a

las condiciones adversas.


66

Objetivo:

- Determinar la temperatura de muerte térmica de los microorganismos estudiados

tratados a 40° C y 65° C durante diferentes intervalos de tiempo.

- Determinar el número de microorganismos supervivientes resistentes al tratamiento

térmico.

Materiales:

Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

Procedimiento:

1. Dos cultivos de 24 horas de edad de E. coli y S. aureus crecidos en Caldo Nutritivo se

someterán a 40° C y 65° C.

2. Cada 0, 40, 80 y 100 minutos se cogerá 1 ml de cada uno los tubos que contienen las

cepas microbianas en ambas temperaturas y se sembrará por el método de difusión en el

medio de cultivo Agar Nutritivo. Realizar diluciones seriadas.

3. Rotular correctamente las placas Petri indicando el tratamiento y la cepa microbiana.

4. Incubar a 28° C por 48 horas en posición invertida.

5. Realizar el recuento de microorganismos en cada uno de los tratamientos.

6. Resultados: Anotar los resultados en el siguiente cuadro:

Temperatura Tiempo (min) Crecimiento microbiano (UFC/ml)

Escherichia coli Staphylococcus aureus

40° C

0

40

80

100

65° C

0

40

80

100

7. Con los resultados obtenidos elaborar la curva de supervivencia de microorganismos en

papel milimetrado comparando el tiempo de exposición (eje X) y las UFC/ml (eje Y) para

cada una de las temperaturas evaluadas por microorganismos evaluado.

8. Con los resultados obtenidos halle el Tiempo de Reducción decimal o valor D en ambas

temperaturas utilizando la siguiente fórmula:

Donde:


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Dt: Tiempo en minutos para reducir el 90% el número de microorganismos de una

población a una temperatura dada.

x: Minutos a una determinada temperatura

No: n° de células al inicio del tratamiento térmico

Nx: n° de células supervivientes después de un tratamiento

9. Interpretación y Discusión de resultados. A partir de las curvas graficadas indique los

resultados obtenidos para cada una de las variables estudiadas y explique los resultados

obtenidos utilizando bibliografía adecuada (artículos científicos, libros).


68

II. ACCIÓN DE LA PRESIÓN OSMÓTICA

Este factor viene a ser la presión desbalanceada que da lugar a los fenómenos de difusión y

ósmosis, en una solución donde hay diferencia de concentraciones.

Si un organismo está inmerso en una solución que tenga alta presión osmótica, el agua

saldrá de la célula hasta que establezca un equilibrio entre el interior y exterior celular lo

que ocasionará que la membrana citoplasmática y el protoplasma se contraigan hacia el

centro de la célula; es entonces que la célula ha entrado en el proceso de crenación.

Lo contrario ocurre cuando una célula está en un medio con baja presión osmótica, el agua

ingresará a la célula hasta establecer equilibrio en el exterior celular, y si la diferencia de

presión es grande la membrana tenderá a explotar y se dirá que la célula ha entrado en

estado de plasmólisis.

Objetivo:

- Determinar la concentración de NaCl que afecta el crecimiento microbiano.

Material

- Cepa de Escherichia coli de 24 horas de edad crecida en caldo nutritivo

- 4 Placas con concentraciones crecientes de NaCl al 5%, 10%, 20% y 40% en medio

base Agar Nutritivo.

- 1 placa con Agar Nutritivo.

- Asa de siembra

- Encendedor

Procedimiento

1. En las placas con diferentes concentraciones de NaCl, sembrar la cepa de E. coli por

el método del estriado.

2. Repetir el paso anterior utilizando una placa con Agar Nutritivo que contiene

concentración normal de NaCl.

3. Rotular las placas Petri con la cepa microbiana utilizada.

4. Incubar a 28°C por 48Hrs.

5. Comparar el crecimiento microbiano entre las placas que contienen las diferentes

concentraciones de NaCl y la placa con Agar Nutritivo que contiene concentración

normal de NaCl.

6. Interpretación y Discusión de resultados.


69

ACCIÓN DE AGENTES QUÍMICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS

I. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE IONES HIDRÓGENO (pH) EN LOS

MICROORGANISMOS.

El efecto de distintas concentraciones de iones hidrógeno es considerado con respecto a su

capacidad para suprimir el crecimiento microbiano. Los microorganismos se inocularán en

un medio que es capaz de mantener el crecimiento siempre y cuando el pH sea tolerable. La

única diferencia entre las distintas probetas de medio de cultivo radica en el pH de los

caldos en cuestión. Se observará el crecimiento y se tendrá conclusiones. Para que estos

resultados sean válidos es preciso la observación de todas las probetas en un mismo

tiempo.

Objetivo:

- Determinar el efecto del pH en el crecimiento y desarrollo microbiano.

Materiales

- Cultivos de 24 horas de edad de Escherichia coli.

- Tubos con caldo nutritivo estéril previamente ajustados con HCl 1.0N y NaOH 1.0N a

valores de pH de 3.0, 5.0, 7.0, 9.0 y 11.0 (1 de cada una)

Procedimiento.

1. Inocule con una azada el cultivo de E. coli en cada uno de los tubos de caldo nutritivo con

distintos valores de pH.

2. Incube a 28° C y anote sus observaciones en términos de la cantidad de crecimiento al

segundo y cuarto día. Emplee la siguiente escala:

+ = Poco crecimiento

++ = Regular Crecimiento

+++ = Crecimiento moderado

++++ = Abundante crecimiento

3. Anote sus resultados utilizando la siguiente tabla:

TABLA DE RESULTADOS

pH 3.0 pH 5.0 pH 7.0 pH 9.0 pH 11.0

E. coli



70

II. ACCIÓN DE LOS DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS.

Objetivo

- Observar y comparar el efecto de los desinfectantes y antisépticos en el desarrollo

microbiano.

Materiales

- Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

- Medio de cultivo: Agar nutritivo

- Desinfectantes: Lejía al 10%, cresol al 5%, Pinesol.

- Antisépticos: Alcohol al 70%, agua oxigenada, merthiolate, jabón medicado (Protex)

- Discos de papel filtro, pinzas.

- Plumón indeleble.

Procedimiento

Agentes desinfectantes

1. Dividir la placa de Agar Nutritivo en 3 mitades utilizando plumón indeleble.

2. A partir de un cultivo de 24 horas de edad de la cepa de E. coli coger con un asa de kohle

el inóculo necesario y sembrarlo sobre la superficie de cada parte de la placa de Agar

Nutritivo.

3. Utilizando una pinza estéril colocar un disco de papel filtro de 1.5 cm de diámetro

embebido en la solución del desinfectante.

4. Realizar el mismo procedimiento para la cepa microbiana de S. aureus

5. Incubar las placas a 28°C por 48 horas en posición invertida.

Agentes Antisépticos

1. Dividir la placa de Agar Nutritivo en 4 mitades.

2. Realizar el mismo procedimiento descrito para los agentes desinfectantes y probar las

cepas de E. coli y S. aureus.

3. Incube a 28° C por 48 horas y anote sus observaciones en términos de la cantidad de

crecimiento. Emplee la siguiente escala:

+ = Poco crecimiento

++ = Regular Crecimiento

+++ = Crecimiento moderado

++++ = Abundante crecimiento

4. Resultados: Anote sus resultados utilizando la siguiente tabla:


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Antiséptico E. coli S.aureus

Alcohol al 70%

H2O2

Merthiolate

Jabón Protex

Desinfectante E. coli S.aureus

Lejía

Cresol

Pinesol


72

PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA

El metabolismo es el conjunto de reacciones que ocurren en los seres vivos, que incluye

procesos de obtención de energía, tales como, descomposición de moléculas orgánicas en

los quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los fotótrofos.

Asimismo, se encuentran las de síntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales

(anabolismo).

Todas las reacciones metabólicas son catalizadas por enzimas que en su mayoría son

intracelulares aunque hay también extracelulares, sobre todo hidrolíticas, que son liberadas

por la célula para catalizar reacciones fuera de esta.

Es posible conocer las características metabólicas de los microorganismos por su

inoculación en medios de cultivo con diversos sustratos que puedan ser utilizados como

fuentes de energía, carbono, donadores de electrones, así como de otros nutrientes

esenciales necesarios para su crecimiento.

Existen numerosas pruebas bioquímicas con medios de cultivo adicionados de indicadores

de pH para detectar la producción de ácido o álcali, con inhibidores selectivos como bilis,

cianuro o con colorantes, sulfuros, etc. que facilitan la determinación de diferentes

actividades metabólicas. La actividad que se evalúa con mayor frecuencia es: capacidad

para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, etc.).

El desarrollo de pruebas bioquímicas es importante para la identificación de especies

bacterianas que proliferan en el área de alimentos, clínica y ambiental capaces de crecer

utilizando diferentes sustratos y por lo tanto su potencial deterioro.

Objetivo

- Caracterizar a los microorganismos en función de su capacidad fermentativa de

diferentes carbohidratos.

Materiales

- Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

- Caldo Base Rojo de Fenol

- Carbohidratos: Glucosa, Sacarosa y Lactosa

- Pipetas estériles

- Plumón indeleble.

Procedimiento

1. Inocular 0.5 ml de cada cepa en una serie de tubos de caldo rojo fenol con glucosa,

lactosa, y sacarosa.

2. Incubar los tubos a 28°C durante 48 horas.

3. Resultados: Determinar si hay crecimiento y cambios en el color del indicador Criterios de evaluación: Producción de ácido Prueba positiva (+): color amarillo Prueba negativa (-): color rojo


73

4. Interpretación de resultados y Discusión.

CUESTIONARIO 1. De los microorganismos estudiados ¿qué estructuras bacterianas le confieren resistencia

térmica? ¿Por qué?

2. ¿Cuál es el rango de temperatura en el cuál los microorganismos crecen y se multiplican

rápidamente y en función de esto cuál sería la temperatura recomendada para la

conservación de los alimentos? ¿Por qué?

3. ¿Qué cuidados debemos practicar frente a la cantidad de agua extra o intra celular en

posibles productos frescos a temperatura ambiente?

4. ¿Qué ejemplos de aplicación están basados en la fisiología de la presión osmótica?

5. ¿Cuál es la razón de usar alcohol de 70°? 6. En un proceso productivo de derivados de frutas, ¿Cuál sería el agente contaminante

principal? ¿Cuál sería su agente químico de control? ¿Qué función cumpliría este agente?

Proponga un ejemplo.

7. Explique el efecto de los desinfectantes y antisépticos en el desarrollo microbiano.

8. De acuerdo a la capacidad fermentativa de los carbohidratos por las bacterias estudiadas

indique los alimentos que pueden ser potencialmente deteriorados por esta actividad

metabólica. ¿Por qué?

Defina:

Desinfectante Antiséptico Bactericida Bacteriostático Plasmólisis


74

PRACTICA Nº 6

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MOHOS POST COSECHA, CARACTERÍSTICAS DE LOS PRINCIPALES GRUPOS DE HONGOS

La mayoría de los hongos viven libres en el suelo o en el agua y obtienen su energía por

respiración o fermentación de materiales orgánicos solubles presentes en estos ambientes.

El aire no es un medio en el que pueden desarrollarse los microorganismos pero es el

portador de aerosoles biológicos como polvo, gotitas de agua y otros, que pueden estar

cargados de los diversos grupos de microorganismos.

De las capas de aire se han encontrado esporas de hongos que proceden principalmente del

suelo, de la vegetación y del mar. Algunos de los géneros más comúnmente aislados del aire

son Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Mucor y Cladosporium entre otros.

Todos los hongos se reproducen por esporulación. Cuando la espora se encuentra en un

medio nutritivo adecuado, se hincha y germina emitiendo uno o más tubos germinativos

que se alargan distalmente hasta constituir filamentos delgados y largos que se denominan

HIFAS, las cuales pueden ramificarse después. En algunas especies se forman septas a lo

largo de la hifa, quedando entonces dividida en pequeños compartimentos como una caña

de bambú llamándose entonces HIFA SEPTADA, otras veces no hay septación y el

protoplasma fluye continuamente a lo largo de la hifa, describiéndose entonces como HIFA

NO SEPTADA ó CENOCITICA. En la mayoría de los hongos las hifas son septadas. A medida

que las hifas se siguen dividiendo se forma un crecimiento algodonoso o filamentoso de

hifas entrelazadas llamado MICELIO. El conjunto de micelio se conoce como TALO. En

algunas formas superiores las hifas se unen formando cuerpos fructíferos grandes y de

estructura compleja como es el caso de las setas. La parte del micelio que penetra en el

substrato y absorbe substancias nutritivas se llama MICELIO VEGETATIVO, la parte que se

proyecta sobre la superficie del substrato origina el MICELIO AEREO, que a su vez da origen

a esporas asexuales llamadas CONIDIAS, cuya misión es la de dispersar el hongo a nuevos

hábitats.

Algunos hongos también producen esporas sexuales formadas como resultado de la

reproducción sexual. Las que están encerradas en una especie de saco (Asca) se llaman

ASCOSPORAS y las que se forman en el extremo de un basidio se denominan

BASIDIOSPORAS. Las propiedades de las esporas sexuales son un criterio importante en la

clasificación e identificación de los hongos.

Aunque los hongos constituyen un grupo grande y diverso, prácticamente hay tres grupos

importantes: Los mohos, las levaduras y las setas. Los mohos son hongos filamentosos que

están ampliamente distribuidos en la naturaleza y son habituales en pan viejo, queso, frutas

o cualquier tipo de alimento. Presentan una gran variedad de formas y tamaños. Las

levaduras son hongos unicelulares y la mayoría son Ascomicetos. Normalmente tienen

forma oval o cilíndrica y su principal forma de reproducción es la gemación, se desarrollan

bien en hábitats con abundante azúcar tales como frutas, flores, e incluso la corteza de los

árboles. Las levaduras tienen gran importancia biotecnológica en la industria cervecera y de


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la panificación y en la producción de proteína de origen unicelular (Biomasa). El principal

agente de la fermentación alcohólica es Sacharomyces cerevisiae. Las setas son hongos

filamentosos pertenecientes a los Basidiomycetes que forman cuerpos fructíferos

denominados “setas” y que producen basidiosporas como esporas sexuales. Una actividad

ecológica muy importante de los Basidiomycetes, es la descomposición de la madera, papel,

ropa y otros derivados de productos naturales. Estos Basidiomycetes, por tanto, son

capaces de producir Celulasas con actividades degradantes de lignina que utilizarán como

fuente de carbono y energía. Debido a que muchas setas como Pleurotus ostreatus, son

comestibles, su producción en gran escala es una actividad económicamente importante,

aunque las hay también venenosas como Amanita virosa y Amanita phalloides.

Cada hongo tiene ciertas características macro (morfología colonial, pigmentación) y

microscópicas (tipos de hifas, de conidias, etc.) que permiten clasificarlo.

Característica macro y microscópicas de los principales géneros de hongos ambientales

1. Aspergillus

Características Macroscópicas: El color es la principal característica macroscópica para la

identificación de los grupos de aspergilos. Poseen distintos tonos de verde, pardo, amarillo,

blanco, gris y negro.

Características Microscópicas: Presenta un conidióforo erecto septado en cuya parte apical se

encuentran las cabezuelas conidiales que presentan bajo el microscopio cuatro formas

básicas: globosa, radiada, columnar o claviforme. Los conidios constituyen cadenas

alrededor de la cabezuela y que se originan a partir de las fiálides.

Cabezuela globosa

Cabezuela hemisférica

Fiálides

Cadena de conidias

Cabezuela claviforme Hifa septada

Fig. 1. Género Aspergillus


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2. Penicillium

Características Macroscópicas: Las colonias del género Penicillium son circulares si no hay impedimento alguno para su crecimiento. Éste es generalmente blanco, pero en algunas especies es amarillo, anaranjado, púrpura o pardo claro. La superficie de la colonia madura, o sea con sus conidios formados, puede ser: aterciopelada, ligeramente algodonosa o con pequeños haces (fascículos) de conidióforos. Características Microscópicas: Este género se caracteriza por formar conidias en una

estructura ramificada semejante a un pincel. Los filamentos o hifas alcanzan un diámetro

entre dos o tres micrómetros y tienen septos. Presenta conidióforo erecto en cuya parte

aplica se encuentras las fiálides distribuidas en varias ramificaciones. Los conidios son

esféricos o elipsoidales, unicelulares, hialinos que en masa se ven de color verde, verde

azulado, verde aceituna o gris. La pared de los conidios es lisa o rugosa según las especies.

Conidióforo

Fiálides muy ramificadas o sin ramificación

Cadena de conidias

Fig. 2. Género Penicillium


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3. Rhizopus

Características macroscópicas: Colonias algodonosas laxas, que cubre completamente la

caja de Petri y logra empujar la tapa hacia arriba. Inicia de color blanco y se torna gris con

puntos negros que corresponden a los esporangios.

Características microscópicas: Hifas gruesas y aseptadas, abundantes rizoides prominentes

de color café, de los que salen esporangióforos largos, no ramificados, de color café, cada

uno con un esporangio café con esporangiosporas espiculadas. Dependiendo de la especie

puede poseer estolones o puentes de comunicación entre los rizoides.

4. Mucor

Características macroscópicas: Colonias algodonosas laxas, que cubre completamente la

caja de Petri y logra empujar la tapa hacia arriba. Presenta colonias Amarillo marrón pálido.

Características microscópicas: Presenta esporangióforos largos sin ramificar o cortos

ramificados que en ocasiones se curvan hacia abajo. Los esporangios son de color marrón

pálido. Las esporangiosporas son de de forma elipsoidales y de pared lisa. Se distingue de

Rhizopus por la ausencia de rizoides.

Esporangiosporas

Esporangióforo

Estolón

Esporangio

Esporangiosporas

Esporangióforo

Estolón

Rizoides

Esporangio

Esporangiosporas

Fig. 3. Género Rhizopus

Fig. 4. Género Mucor


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Objetivo:

- Aislar e identificar los principales hongos ambientales causantes del deterioro de los

alimentos de acuerdo a sus características macro y microscópicas.

Materiales y sustancias

- Placas Petri conteniendo medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (APD).

- Asa de Kohle

- Alambre de nicrón en punta

- Láminas portaobjetos

- Papel lente

- Alcohol 70°

- Agua destilada estéril.

- Colorante Azul algodón de Lacto-fenol

- Cinta scotch

- Mechero Bunsen

- Encendedor

- Microscopio

- Plumón marcador

- Diversos tipos de alimentos con visible desarrollo fúngico en la superficie: frutos,

cereales, granos, hortalizas, pan, etc.

Procedimiento

I. Observación directa de las estructuras vegetativas y reproductivas asexuales de los

hongos

1. A partir de las muestras de alimentos con desarrollo fúngico sobre su superficie colocar

la parte adherente de un trozo de cinta scotch y presionar con cuidado para favorecer la

adhesión de las estructuras.

2. Colocar una gota del colorante azul de algodón de lacto-fenol sobre una lámina

portaobjeto.

3. Colocar sobre la gota del colorante el trozo de cinta scotch adhiriendo con cuidado las

estructuras fúngicas previamente tomadas del alimento deteriorado.

4. Examinar al microscopio con objetivo de menor aumento para buscar estructuras

reproductivas representativas y posteriormente cambiar a un objetivo de mayor

aumento para observar con mejor detalle las características de las estructuras

seleccionadas procurando que éstas presenten la arquitectura completa del hongo para

facilitar su identificación.

5. Reconocer la morfología que conforman parte del talo vegetativo: tipo de hifa septada o

cenocítica, estolón, rizoide, etc. y, del talo reproductivo asexuales: esporangióforo,

conidióforo, fiálides, esporangio, esporas, vesícula o cabezuela, etc.

6. Realizar la Identificación preliminar del género del hongo

7. Dibujar las observaciones realizadas


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II. Aislamiento en medio de cultivo de hongos a partir de los alimentos deteriorados

1. Seleccionar en el alimento deteriorado una zona con el desarrollo de un solo tipo de

hongo: pigmentación, tipo de crecimiento del micelio (algodonoso, velloso, pulverulento,

etc.), etc.

2. Coger un pequeño trozo del micelio seleccionado con la ayuda del asa de kohle y

depositarlo en el centro de una placa Petri conteniendo APD. Realizar este proceso a la

altura del mechero bajo condiciones estrictas de esterilidad.

3. Rotular la placa Petri indicando el tipo de alimento utilizado.

4. Incubar por 7 días a temperatura ambiente.

5. Observar la presencia de colonias filamentosas de diversos tipos y colores por muestra

de alimento utilizado.

6. Anotar las características de las colonias: Forma, aspecto del micelio (algodonoso,

velloso, pulverulento u otro), pigmentación, elevación, consistencia, etc.

7. Realizar la relación con las estructuras reproductivas asexuales observadas al

microscopio para la identificación del género del hongo observado.

8. Dibujar las observaciones realizadas.

9. Indicar el género del hongo observado.

Recomendaciones

Antes y después del trabajo en el microscopio limpie los lentes de los objetivos y oculares

utilizando papel lente y alcohol de 70°.

Cuestionario

1. Explicar cuál es el mecanismo de acción de los géneros Aspergillus, Penicillium y Rhizopus

para causar el deterioro de los alimentos y mencionar ejemplos de alimentos que son

comúnmente atacados por estos hongos.

2. Dibujar las estructuras vegetativas y reproductivas asexuales y/o sexuales de 3 hongos de

diferente género de importancia agroindustrial, diferentes a lo visto en la práctica.

3. Describir otra técnica de aislamiento de hongos.

4. Mencionar la importancia de los hongos en Microbiología Agroindustrial.

5. ¿A qué se denomina micosis? Mencione dos de las más importantes y haga hincapié en la prevención y el tratamiento.

Practicas de microbilogia para el estudio de microorganismos

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