UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS III

PRÁCTICA N° 4: MÉTODO COLORIMÉTRICO PARA LA

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES Y ALBÚMINA.

I. INTRODUCCIÓN

Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en la naturaleza y esenciales para la vida. Actúan como elementos estructurales y de transporte y aparecen bajo la forma de enzimas, hormonas, anticuerpos, factores de coagulación, etc.

Una manera de evaluar la eficiencia de los métodos de extracción de proteínas es determinando el contenido de proteína solubles que se obtienen después de la etapa de extracción.

II. OBJETIVOS.-Determinar el contenido de proteínas totales.-Determinar el contenido de albúmina.

III. MARCO TEÓRICO.FUNDAMENTO DEL MÉTODO:Determinación de Proteínas totales: Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico, en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra.

Determinación de Albúmina: La albúmina reacciona específicamente – sin separación previa- con la forma aniónica de la 3,3’,5,5‘- tetrabromo cresolsulfon ftaleína (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del blanco de reactivo, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra.

IV. MATERIALES Y MÉTODOS.

REACTIVOS PROVISTOS: -Reactivos EDTA/Cu: Complejo EDTA /Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril poliéster (AAP).-Reactivo BCF: solución de 3,3’,5,5‘- tetrabromo cresolsulfon ftaleína (en polioxietilén lauril éter)-Suero patrón: Solución de albúmina y globulinas en estado nativo con título conocido de proteínas (Biuret o Kjeldhal) y albúmina. MATERIAL REQUERIDO

-Espectrofotómetro o fotocolorímetro.-Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. -Tubos de Fotocolorimetro o cubetas espectrofotométricas.-Baño de agua a 37°C-Reloj o timer.Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: Si la muestra no procesa inmediatamente la muestra puede conservarse hasta 3 días en refrigerador (2 -10°C) o una semana en congelador.

1.- DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES.CONDICIONES DE REACCIÓN-longitud de onda: 540 nm de espectrofotómetro o fotocolorímetro con filtro verde (520 -560 nm).-Temperatura de reacción: 37°C-Tiempo de reacción: 15 minutos.-Volumen de muestra: 50 ul-Volumen de reactivo EDTA/Cu: 3.5 ml-Volumen final de reacción:3.55 mlPROCEDIMIENTOEn tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), colocar:

B S DAgua destilada 50 ul - -Suero patrón - 50 ul -Muestra - - 50 ulReactivo EDTA/Cu 3.5 ml 3.5 ml 3.5 ml

Mezclar con varilla. Incubar 15 minutos a 37°C. Leer en espectrofotómetro a 540 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520-560 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo.

Estabilidad de la mezcla de reacción final.El color de la reacción es estable durante 12 horas por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.

DETERMINACIÓN DE ALBUMINA:Condiciones de reacción:-Longitud de onda: 625 nm en espectrofotómetro o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm).-Temperatura de reacción: 15-28°C.-Tiempo de reacción: 10 min.-Volumen de muestra: 10 ul.

-Volumen de reactivo BCF: 3,5 ml.-Volumen final de reacción: 3,51 ml.

PROCEDIMIENTOEn tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), colocar:

B S D

Suero patrón - 10 ul -

Muestra - - 10 ul

Reactivo BCF 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml

Mezclar con una varilla. Mantener los tubos entre 15 y 28 °C durante 10 minutos. Leer en espectrofotómetro a 625 nm o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo.Estabilidad de la mezcla de reacción final.El color es estable 20 minutos por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.

CALCULO DE LOS RESULTADOS

Proteínas totales (g/dl) = D x f

Donde: f = P.T (g/dl) / S

Albúmina (g/dl) = D x fDonde: Alb. (g/dl)/S

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES.VI. CONCLUSIONES.VII. REFERENCIAS BIBLIOGÁFICAS.

ANEXOS

DETERMINACION DE PROTEINAS SOLUBLES POR METODO DE

BIURET

A. PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE BIURET

Para 0.5 L de reactivo de Biuret y 0.5 L de Blanco de Biuret:

1. NaOH 6 mol/L: Disolver 24 g de NaOH en agua recién destilada

(para minimizar CO2), enfriar y diluir a 0.1 L. Guardar en botella de

polietileno muy bien cerrada a temperatura ambiente.

2. Reactivo de Biuret (CuSO4 12 mmol/L, Tartrato de sodio y potasio 32

mmol/L, KI 30 mmol/L, NaOH 0.60 mol/L): Disolver 1.5 g de sulfato

de cobre (CuSO4.H2O) en 250 ml de agua recién destilada. Añadir 4.5

g de tartrato de sodio y potasio y 2.5 g de ioduro de potasio. Después

que se hayan disuelto los sólidos, añadir 50 ml de 6.0 mol/L NaOH y

diluir a 0.5L con agua destilada.

3. Blanco de Biuret: Preparar igual que el reactivo de Biuret pero

omitir el sulfato de cobre.

4. Estándar de proteína (albúmina, 60 – 70 g/L): Use una solución de

albúmina bovina pura que haya sido analizada por otros medios. El

estándar puede ser preparado mediante la adición de 12 ml de una

solución de azida de sodio 1.5 mmol/L (0.1 g/L) a 1 g de albúmina de

suero bovino en polvo en un beaker pequeño y agitando para

disolver.

Si se cuenta con un espectrofotómetro ultravioleta con un ancho de

banda de 2 nm o menos, añadir 100 ul de la solución a 10 ml de agua

y leer la absorbancia a 280 nm en una cubeta de 1 cm. Dividir la

absorbancia por 0.661 y multiplicarla por 101 (factor de dilución)

para obtener la concentración de albúmina bovina (g/L).

B. PROCEDIMIENTO

1. Pipeterar 5 ml del reactivo de Biuret en una serie “prueba” de tubos

y 5 ml del blanco de Biuret en una serie “blanco”.

2. Pipetear 100 ul de espécimen (suero o proteína estándar) en cada

tubo de la serie. Mezclar bien con vortex o por inversión repetida

después de cubrir los tubos con parafilm. Preparar un blanco de

muestra, mediante la adición de 100 ul de agua a 5 ml del reactivo

de Biuret.

3. Incubar los tubos a temperatura ambiente por 30 minutos o a 37°C

por 10 minutos.

4. Fijar la absorbancia en cero a 540 nm con el blanco del reactivo de

Biuret. Leer las absorbancias de la serie “blanco”, luego leer las

absorbancias del blanco de muestra y la serie “prueba”.

5. Calcular de la siguiente manera:

a. Sustraer tanto los blancos de reactivo y el blanco de muestra de

las absorbancias (A) obtenidas para la serie “prueba”.

Aneta = Aprueba – Ablanco reactivo – Ablanco muestra

El blanco de muestra con el reactivo de Biuret deberá leer 0.095 –

0.105 para un tubo de 1 cm de paso de luz para el reactivo

descrito.

Los blancos para especímenes usualmente leen menos de 0.010 si

el suero es claro.

b. Calcular:

(Aneta muestra / Aneta estándar) * [estándar] = [muestra]

Donde:

A = absorbancia

[estándar] = concentración del estándar (g/L)

[muestra] = concentración de la muestra (g/L)

Si el resultado excede los 120 g/L repetir el ensayo diluyendo el

espécimen con un volumen igual de 0.15 mol/L de NaCl y

multiplicar el resultado por 2.

6. Preparar una curva estándar para verificar que la reacción es lineal

desde 10 a 120 g/L con el reactivo usado. Si la concentración de la

muestra no cae dentro del rango de linealidad, el valor calculado no

es correcto.

Use 100 ul de las diluciones apropiadas en NaCl 0.15 mol/L del

estándar (60 – 70 g/L) para producir valores en el rango de 10 – 60

g/L y cantidades incrementadas de estándar no diluido (150 y 200 ul)

para dar valores de 60 a 120 g/L. Las cantidades incrementadas

subirán el volumen total ligeramente; corregir las absorbancias

netas observadas multiplicándolas por (volumen total / 5.1) antes de

plotear.