Preparación de Inmunógenos y Antígenos

8/9/2019 Preparacin de Inmungenos y Antgenos

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I. EXTRACTO DE TEJIDO MUSCULAR O PROTEINAS PLASMTICAS DEORIGEN HUMANO, EQUINO, BOVINO, PORCINO, DE POLLO, DEPERRO, ETC.

MARCO TERICOLos extractos de tejidos o las protenas plasmticas de animales son excelentesinmungenos cuando son inyectados en otro individuo taxonmicamente alejado,por lo que son utilizados en la inmunizacin de animales de laboratorio paraobtener sueros inmunes denominados antiespecieque pueden ser aplicados enel campo del control de alimentos para determinar de que especie proceden lascarnes y sus derivados, en Qumica Forense para establecer el origen de unamancha de sangre, en diagnstico para el anlisis de protenas o bien en laspruebas de identidad de sueros de uso teraputico.

En el presente ejercicio se van a preparar extractos de tejido muscular o biensuero, estriles que posteriormente sern utilizados en la inmunizacin de conejospara obtener el correspondiente suero antiespecie.

I.1.1 PREPARACIN DE UN EXTRACTO DE TEJIDO

MATERIAL1 Embudo de 6 cm de dimetro con tres capas de gasa.2 Pipetas de 10 mL (1/10)1 Disco de papel filtro de poro grueso (10 cm dim.)1 Tijeras de punta recta.1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL.1 Bistur.1 Balanza granataria.1 Licuadora con vaso de 250-500 mL.

40 g Tejido muscular de equino, pollo, perro, bovino, etc.60 mL Solucin salina isotnica (SSI).

TCNICA1. Eliminar toda la grasa y aponeurosis del trozo de tejido muscular y cortarlo

en fragmentos de 0.5 a 1.0 cm.2. Pesar el tejido y pasarlo al vaso de la licuadora. Agregar SSI a tener una

proporcin de 1:2 (p/v) y triturar hasta que el tejido est perfectamentehomogeneizado.

3. Pasar el tejido triturado al matraz Erlenmeyer y dejarlo en refrigeracindurante toda la noche para extraer la mayor cantidad de protenas.

4. Filtrar a travs de tres capas de gasa para eliminar las partculas gruesasy en seguida por papel de poro grueso.

5. Determinar la concentracin de protenas por el mtodo de Biuret.6. Esterilizar por filtracin. (Ver I.2, pag. 4).


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I.1.2 PREPARACIN DE UN SUERO HETERLOGO

MATERIAL1 Jeringa de 20 mL estril.1 Aguja hipodrmica del No. 17 de 3 estril.

1 Aplicador de madera2 Tubos de centrfuga de 50 mL de plstico.1 Matraz Erlenmeyer de 100 mL.1 Pipeta de 10 mL (1/10) con bulbo (propipeta).

40 mL Sangre de humano, equino, bovino, porcino, etc.60 mL Solucin salina isotnica (SSI).

TCNICA1. Tomar por puncin venosa 40 mL de sangre ya sea de perro, caballo,

burro, cerdo, etc. y colocar 20 mL en cada uno de los tubos de centrfuga.2. Dejar coagular la sangre y con un aplicador de madera separar el cogulo

de las paredes del tubo. Centrifugar 30 minutos a 3000 r.p.m.3. Mediante la pipeta con bulbo, separar cuidadosamente el sobrenadante y

pasarlo al matraz Erlenmeyer.4. Determinar la concentracin de protenas por el mtodo de Biuret.5. Esterilizar por filtracin. (Ver I.2, pag. 7).

NOTA:Si en lugar de suero se utiliza plasma, es necesario coagularlo conCaCl2como se describe en el anexo I.A, para evitar la formacin de redesde fibrina que interfieran durante la filtracin.

I.2 ESTERILIZACIN DEL EXTRACTO DE TEJIDO O DEL SUERO

MATERIAL1 Equipo para filtracin estril. Constituido por: Filtro Seitz, matraz Kitasato

de 500 mL, manguera para vaco de 50 cm, material filtrante EKS-1 ymanguera de ltex de 10 cm.

2 Tubos de 16 x 150 mm con tioglicolato fluido.2 Tubos de 16 x 150 mm con agar Sabouraud inclinados.2 Pipetas de 10 mL (1/10) estriles.2 Pipetas de 1.0 mL (1/10) estriles.2 Frascos tipo vial de 10 mL con tapn estriles.2 Mecheros

9 mL Solucin salina isotnica (SSI) estril.

TCNICA1. Esterilizar el extracto de tejido o el suero por filtracin en filtro Seitz,

aplicando vaco ligero para que no se forme espuma.2. En condiciones de esterilidad, pasar 1.0 mL del filtrado a uno de los

frascos vial y el resto en el segundo frasco.


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3. Adicionar al primer frasco 9.0 mL de SSI estril y mezclar (dilucin 1:10).4. Realizar la prueba de esterilidad mictica y bacteriana a cada producto

sembrando 0.1 mL en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando losprimeros a 32-35C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lomenos una semana.

5. Etiquetar y guardar el extracto o suero diluido y el concentrado enrefrigeracin hasta su empleo. Desechar cuando se observe turbidez, yaque esto indica que hay desarrollo de contaminantes bacterianos.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infecciososeguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.


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II. PREPARACIN DE PROTEINAS PURIFICADASALBMINA SRICA HUMANA GLOBULINA HUMANA

MARCO TERICO

La mayora de las protenas animales y vegetales cumplen con los requisitos deinmunogenicidad y por tanto se pueden utilizar como inmungenos en su formanativa, pero si se desea tener mayor especificidad en la respuesta inmunolgica,es necesario purificarlas.

Los mtodos de purificacin dependen de las propiedades fisicoqumicas de cadauna de las protenas tales como su solubilidad, peso molecular, tamao, cargaelctrica, pI, etc., en la siguiente tabla se ejemplifican algunos de ellos:

BASADOS EN: M TODO

Diferencias de solubilidad:

Precipitacin con sales neutras

Precipitacin con metales pesados Precipitacin con solventes orgnicos

Precipitacin con cidos o bases (pI)

Diferencias en cargaelctrica:

Electroforesis

Cromatografa de intercambio inico

Diferencias en PM ytamao:

Permeacin molecular

Ultracentrifugacin en gradiente

Estas prcticas se llevarn a cabo a partir de protenas purificadas comerciales yel ejercicio consistir en la preparacin de soluciones estriles de stas con laconcentracin necesaria para la inmunizacin de conejos, para obtener los

correspondientes anticuerpos.

MATERIAL2 Tubos de 16 X 150 estriles2 Pipetas de 10 mL (1/10) estriles4 Pipetas de 1 mL (1/10) estriles2 Frascos tipo vial de 12 mL c/tapn estriles2 Tubos de 16 x 150 mm con tioglicolato fluido.2 Tubos de 16 x 150 mm con agar Sabouraud inclinados.

0.3 mL Albmina srica humana (ASH) comercial de 25% globulina humana

al 1% estriles.25 mL Solucin salina isotnica (SSI) estril

TCNICATODO EL PROCESO SE REALIZA EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD1. A partir de una solucin comercial estril de albmina srica humana

(ASH) de globulina humana purificadas cuya concentracin es de 25


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g/100 mL 1 g/100 mL preparar dos diluciones con solucin salinaisotnica estril:Para ASH:

1:50 para tener una concentracin de 5 mg/mL1:250 para tener una concentracin de 1 mg/mL

Para globulina humana:1:2 para tener una concentracin de 5 mg/mL1:10 para tener una concentracin de 1 mg/mL

2. Determinar la concentracin de protenas por el mtodo de Biuret.3. Realizar la prueba de esterilidad mictica y bacterianasembrando 0.1

mL en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los primeros a 32-35C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo menos unasemana.

4. Etiquetar y guardar en refrigeracin hasta su empleo. Desechar cuando seobserve turbidez, ya que esto indica que hay desarrollo de contaminantesbacterianos.


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III. PREPARACIN DE ANTGENOS E INMUNGENOS CELULARESGLBULOS ROJOS DE CARNERO

MARCO TERICO

Las clulas de origen animal o vegetal constituyen verdaderos mosaicosantignicos debido a la compleja composicin de sus organelos.

La preparacin de antgenos e inmungenos celulares tiene varias aplicaciones,entre las que se puede mencionar la produccin de anticuerpos especficosusados como reactivos para la identificacin de alguna poblacin especfica declulas como en el caso de la tipificacin sangunea y la determinacin demolculas de histocompatibilidad HLA (antgenos de los leucocitos humanos),pero tambin se han utilizado para la investigacin de marcadores y receptorescelulares. Para estas aplicaciones, la elaboracin de anticuerpos monoclonales hacobrado mayor importancia.En esta seccin se ejemplifica la preparacin de antgenos celulares con laobtencin de eritrocitos de carnero lavados para su utilizacin inmediata en lainmunizacin de conejos para as obtener el correspondiente suero inmune.

MATERIAL1 Jeringa de 10 mL con aguja No. 20 estril2 Tubos de centrfuga cnicos de 15 mL c/tapn estriles1 Pipeta de 1 mL (1/10) estril1 Pipeta de 5 mL (1/10) estril2 Pipeta de 10 mL (1/10) estril1 Equipo de succin constituido por: Matraz Kitasato de 500 mL adaptado

con tapn de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2tramos de manguera para vaco de 30 cm.

1 Bulbo para pipeta1 Frasco tipo vial de 10 mL con tapn estriles 2 Mecheros

Centrfuga con cabezal para tubos de 15 mL

3 mL Solucin de Alsever estril100 mL Solucin salina isotnica (SSI) estril

TCNICA

TODO EL PROCESO SE REALIZA EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD

1. Llenar la jeringa con 3 mL de la solucin de Alsever estril y puncionar lavena yugular de un carnero y tomar 3 mL de sangre.

2. Quitar la aguja de la jeringa y vaciar la mezcla sangre-Alsever a un tubode centrfuga cnico de 15 mL estril dejndola resbalar por las paredes.Tapar el tubo.

3. Centrifugar durante 15 min a 2500 rpm.


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4. Eliminar el sobrenadante utilizando el equipo de succin y la pipeta de 10mL estril.

5. Lavar el paquete de eritrocitos 5 veces de la siguiente manera: Agregar 10mL de SSI estril, resuspender los glbulos rojos perfectamente con unapipeta estril adaptada con un bulbo. Tapar y centrifugar 10 min a 2500

rpm. Eliminar completamente el sobrenadante mediante el equipo desuccin.6. Al trmino de los lavados, tomar 1.5 mL de paquete de eritrocitos con una

pipeta estril y pasarlos al frasco vial estril.7. Agregar 13.5 mL de SSI estril para tener una suspensin al 10%, que es

como se va a utilizar para la inmunizacin del conejo. Tapar el frasco.8. Esta suspensin deber conservarse en refrigeracin, entre 4 y 6 C hasta

el momento de emplearse y solo puede usarse durante 4 das, ya que elenvejecimiento desnaturaliza a los antgenos presentes en los eritrocitos.


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animales de laboratorio para la obtencin de sueros inmunes cuya aplicacin esamplia en la identificacin de bacterias, tanto en muestras biolgicas de origenhumano para diagnstico, como en el control microbiolgico de alimentos yproductos farmacuticos.

Durante la preparacin de antgenos bacterianos es importante conocer elfenmeno llamado variacin antignicael cual implica la prdida de antgenos ocambios en la especificidad debido a envejecimiento del cultivo, infeccin porbacterifagos o a otros factores que son lesivos para las bacterias.

Adems, cuando se trabaja con bacterias y en general con microorganismos sedebe tener en cuenta que existe antigenicidad cruzadaentre especies diferentes,hecho que cobra importancia cuando se hace tipificacin bacteriana o cuando seobtienen sueros antibacterianos que obliga a someterlos a procesos depurificacin para aumentar su especificidad.

Brevemente, los procedimientos ms relevantes para la obtencin de estospreparados bacterianos involucran:

Contar con una cepa pura de la bacteria, propagarla en medios de cultivoadecuados, que permitan la expresin de los componentes antignicos de inters,atenuarla(disminucin de la virulencia) o inactivarla(perdida de viabilidad) segnsea el caso, mediante mtodos que eviten la desnaturalizacin de loscomponentes antignicos y, finalmente ajustar a una concentracin determinada,que est en relacin a su uso.

La atenuacin de las bacterias puede llevarse a cabo mediante resiembrassucesivas en condiciones poco favorables, aislamiento de los microorganismos decasos de infecciones leves, etc.;mientras que para la inactivacinse cuenta conmtodos fsicos (exposicin al calor), qumicos (tratamiento con formol o timerosal)o combinaciones de estos; en el caso de las toxinas, son convertidas a toxoides(pierden toxicidad pero no su composicin antignica tratndolas conformaldehdo).

Durante la produccin de un antgeno o inmungeno bacteriano se deben llevar acabo una serie de controlesque son ms o menos rigurosos segn sea el destinodel biolgico preparado, as una vacuna (principalmente de uso humano) requierede un mayor nmero y ms estrictas pruebas de control, muchas de ellasreglamentadas o bien definidas en las farmacopeas.

Estas pruebas de control pueden ser biolgicasen donde se incluye: identidad,pureza, inactivacin, toxicidad, atoxicidad, esterilidad bacteriana y mictica,inocuidad, potencia, etc.; o bien qumicas como: pH, determinacin deadyuvantes y conservadores, protenas totales, cloruros, slidos totales, humedadresidual, solubilidad, etc.


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En los siguientes ejercicios se describe la preparacin de inmungenos a partir decepas de, E. co l i, Sh. dysenteriae,B. abortusy S. typhique sern utilizados enla inoculacin de conejos para la obtencin de sueros inmunes antibacterianos.

E. co l i: Tiene Ag O que han servido para identificar ms de 150 serotipos,

adems presenta Ag K que de acuerdo con su termorresistencia han sidoclasificados en: Ag A (estables a ms de 120C), Ag B (a 100C pierden suinmunogenicidad pero no su antigenicidad) y Ag L (son destruidos a 100 C).

Sh. dys enteriae: No presenta flagelos, por lo tanto no tiene antgenos H, sinembargo sus antgenos somticos O tienen un alto poder antignico y en base aellos se han descrito varios serotipos de los 4 grupos de Shigella.

Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi): Inicialmente el gnero Salmonella fueclasificado por Kauffman-White en 5 grupos en base a sus antgenos somticosO, que difieren qumicamente en cuanto a su composicin de azcares,presencia de grupos acetilo sustituidos y enlaces glicosdicos alfa y beta.

Actualmente esta clasificacin se ha completado y se describen 9 gruposdenominados A, B, C, D, E, F ,G, H e I en donde se encuentran incluidos ms de1020 serotipos diferentes. Adems, algunas cepas de Salmonella son mviles ypresentan flagelos y en base a sus antgenos flagelares o H se puede hacer unaclasificacin ms precisa de estos microorganismos.

B. abortus: Las seis especies del gnero Brucel la son antignicamente similares,siendo su lipopolisacrido y sus protenas de membrana externa (PME) losantgenos ms importantes. Las PME estn clasificadas en tres grupos,considerndose a las del grupo II como porinas.


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IV.1 PROPAGACIN DE LAS CEPAS

CEPAS:B. abortusE. col i

Sh. dysen teriaeSalmonel la9,12,d,Vi (serotipo Typhi)Salmonel la 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) de gran movilidad para obtencinde Ag H

MEDIOS DE CULTIVO:1 Medio para el desarrollo de la cepa: Tubo de 16 x 150 mm con 7 mL de

medio.1 Medio de propagacin: matraz Erlenmeyer de 1000 mL conteniendo 350

mL de medio.

CEPA MEDIO PARA ELDESARROLLO DE LA

CEPA

MEDIO DEPROPAGACION

B. abortusCaldo triptosa Agar triptosa

E. col i Agar BHI inclinado Agar BHI

Sh. dysenteriae Agar BHI inclinado Agar BHI

Salmonella9,12,d,Vi(serotipo Typhi)Ag O

Veal-infusion Agar Veal-infusion

Salmonella9,12,d,Vi

(serotipo Typhi) Ag H

Veal-infusion Veal-infusion

MATERIAL1 Asa bacteriolgica2 Mecheros1 Juego de colorantes para Gram.2 Portaobjetos.

Microscopio.15 mL Solucin salina isotnica (SSI) estril (Exclusivo para E. col i y Sh.

dysenter iae).500 mL Solucin salina isotnica (SSI) formolada al 0.6% estril. (Exclusivo para

Ag H de Salmonel la9,12,d,Vi (serotipo Typhi)).

TCNICAIV.1.1 ANTIGENOS OK-L DE Escher ichia col i.IV.1.2 ANTIGENOS DE Shigel la dysenteriae.

1. Sembrar el tubo del medio para desarrollo de la cepacon un cultivo purode E. col io de Sh. dysenteriaee incubar 24-48 h a 37C.


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2. Con la pipeta adaptada con un bulbo de hule agregar 8 mL de SSI estrilal cultivo anterior y levantar el desarrollo, expeliendo y absorbiendo variasveces.

3. Verificar la purezadel cultivo mediante tincin de Gram. Debe observarseslo bacilos Gram negativos. Si la prueba es satisfactoria continuar con el

paso No.4, de lo contrario desechar el cultivo.4. Pasar la suspensin bacteriana al matraz que contiene el medio depropagacin, extender el inculo por toda la superficie e incubar elmatraz 18-24 horas a 37C.

5. Adicionar 15 mL de SSI estril y desprender todo el desarrollo bacterianodando al matraz movimientos de rotacin suaves.

6. Comprobar lapurezadel cultivo realizando una tincin de Gram.7. Si hay algn tipo de contaminante desechar el cultivo y si la prueba es

satisfactoria continuar con el paso No. 1a.del PROCEDIMIENTO COMNPARA LA PREPARACIN DE ANTGENOS BACTERIANOS, (IV.2, pag.18).

IV.1.3 ANTGENOS TOTALES DE B. abortus.IV.1.4 ANTGENO SOMATICO (O) DE Salmonella9,12,d,Vi (serotipo Typhi).IV.1.5 ANTIGENO FLAGELAR (H) DE Salmonel la9,12,d,Vi (serotipo Typhi).

1. Sembrar el tubo del medio para desarrollo de la cepa con un inculoabundante de la cepa de B. abortus o Salmonel la 9,12,d,Vi (serotipoTyphi) e incubar 24-48 h 18-24 h, respectivamente a 37C.

2. Verificar la pureza del cultivo mediante una tincin de Gram. Debernobservarse nicamente cocos Gram negativos en el caso de Brucella ybacilos Gram negativos en el caso de Salmonella. Si hay algn tipo decontaminante desechar la cepa y si la prueba es satisfactoria continuarcon el paso No. 3.

3. Pasar 8-10 mL del cultivo al matraz del medio de propagacin, extenderel inculo en toda la superficie en el caso de tratarse de medio slido, oagitar el matraz para incorporar perfectamente si el medio es lquido.Incubar el matraz 18-24 h a 37C.

4. Comprobar lapurezadel cultivo realizando una tincin de Gram. Para loscultivos en medio slido primero adicionar 15 mL de SSI estril ydesprender todo el desarrollo bacteriano dando al matraz movimientos derotacin suaves.

5. Si hay algn tipo de contaminante desechar el cultivo y si la prueba essatisfactoria continuar en el caso de B. abortusy Ag O de Salmonel la9,12,d,Vi (serotipo Typhi) desde el paso No. 1a.del PROCEDIMIENTOCOMN PARA LA PREPARACIN DE ANTGENOS BACTERIANOS,(IV.2, pag. 18) y para el Ag H de Salmonel la9,12,d,Vi (serotipo Typhi)a partir del paso 1b.


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IV.2 PROCEDIMIENTO COMUN PARA TODOS LOS ANTIGENOS

BACTERIANOS.

MEDIOS DE CULTIVO:1 Medios para prueba de esterilidad bacteriana: Tubos de 16 x 150 mm

con 12 mL de tioglicolato fluido.1 Medios para prueba de esterilidad mictica: Tubos de 16 x 150 mm con

7 mL de agar Sabouraud inclinados.1 Medios para prueba de viabilidad: Tubos de 16 x 150 mm con 7 mL de

medio.

ANTIGENO MEDIO PARA PRUEBA DEVIABILIDAD

B. abortusAgar triptosa inclinado

E. coli Agar BHI inclinado

Sh. dysen teriae Agar BHI inclinado

Salmonella9,12,d,Vi(serotipo Typhi) Ag O

Agar Veal-infusion inclinado

Salmonel la9,12,d,Vi(serotipo Typhi) Ag H

Agar Veal-infusion inclinado

MATERIAL1 Equipo de succin estril. Constituido por: Frasco de centrfuga de 250

mL, tapn del No. 6 bihoradado, tubo de vidrio de 10 cm con filtro degasa, tubo de vidrio de 12 cm en ngulo de 90 con trampa de aire, tubode vidrio de 35 cm con un extremo angosto, tres perlas de vidrio y tramode manguera para vaco de 50 cm.

2 Frascos tipo vial de 50 mL con tapn estriles.2 Pipetas de 1 mL (1/10) estriles.3 Pipetas de 10 mL (1/10) estriles.1 Bulbo de hule para pipetas de 10 mL (propipeta).1 Tapn de hule del No. 6 estril.1 Asa bacteriolgica.2 Mecheros.

1 Juego de colorantes para Gram.1 Termmetro de 0 a 100C.1 Charola de peltre para desechar material contaminado.4 Portaobjetos.

Microscopio.Centrfuga con cabezal para frascos de 250 mL.Nefelmetro Klett Summerson con filtro verde y celdas.Incubadora a 37 C.


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Bao de agua de temperatura controlada.25 mL Solucin salina isotnica (SSI) estril.100 mL SSI fenolada o SSI formolada: Es SSI estril, adicionada de fenol al 0.5%

de formol al 0.3%.

TCNICA1a. Antgenos de E. col i, Sh. dysenteriae, B. abortus y Ag O deSalmonella9,12,d,Vi (serotipo Typhi):Cosecha: Por medio del equipo de succin y empleando un vaco leveextraer la suspensin bacteriana.Sustituir el sistema de succin por un tapn de hule sin horadar y procedera llevar a cabo la inactivacin.

Inactivacin:Colocar el frasco de centrfuga en el bao de agua a: 55-56C, 2 h para B. abortus , E. col i ySh. dys enteriae y bao de aguahirviente, 2.5 h para el antgeno O de Salmonel la 9,12,d,Vi (serotipoTyphi); agitando de vez en cuando.

Prueba de viabilidad:Sembrar 0.2 mL de la suspensin calentada en elmedio de cultivo indicado para cada bacteria, extendiendo el inculoperfectamente en toda la superficie e incubar a 37C, 48-72 h. Al cabo deeste tiempo no debe haber desarrollo de colonias, en caso contrariodeber hacerse un tincin de Gram y observar si no se trata decontaminacin y si no es as , calentar por 1 hora ms ya que losmicroorganismos estn todava vivos. Despus del segundo calentamientorepetir la prueba de viabilidad.Continuar con el paso No. 2.

1b. Antgeno H de Salmonel la9,12,d,Vi (serotipo Typhi):Inactivacin: Adicionar un volumen igual al que ocupa el cultivo de SSIformolada al 0.6% y dejar a temperatura ambiente durante varios das.

Prueba de viabilidad: Para el 4 5 da probar si ya se destruy laviabilidad de los microorganismos, sembrando 0.2 mL de la suspensinperfectamente agitada en un tubo con agar Veal-infusion inclinado,extendiendo el inculo perfectamente en toda la superficie del medio eincubar a 37C, 24-48 h. Si todava hay crecimiento deber hacerse untincin de Gram y observar si no se trata de contaminacin, y si no es as,se dejar transcurrir 3 a 4 das ms y se repite la prueba de viabilidad. Laprueba es satisfactoria cuando ya no se obtiene desarrollo.

Cosecha: dejar reposar la mezcla de un da para otro y evitando que seresuspenda, eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante utilizandoun sifn estril y decantar el sedimento a 1 2 frascos de centrfuga de

250 mL, estriles.


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2. Centrifugar la suspensin 30 min a 3000 r.p.m., eliminar el sobrenadante yresuspender el paquete celular en aproximadamente. 20-25 mL de SSIfenolada al 0.5% estril (para B. abortus, E. col iySh. dy senteriae) SSIformolada al 0.3% estril (para los antgenos O y H de Salmonella9,12,d,Vi (serotipo Typhi)).

3. Preparar una dilucin 1:10 de la suspensin directamente en la celda delnefelmetro y determinar las unidades Klett en el aparato, leyendo contraSSI fenolada o formolada como blanco. Tomando en cuenta el factor dedilucin e interpolando en la curva de Mc Farland (ver anexo I.C)determinar la concentracin de bacterias/mL. La lectura tambin se puederealizar en un colormetro, leyendo a 540 nm, en donde 0.3 unidades deabsorbancia equivalen a 1 X 109microorganismos/mL.

4. Ajustar la concentracin de una alcuota de la suspensin a 109microorganismos/mL adicionando la cantidad necesaria de SSI fenolada oformolada, para obtener el volumen suficiente para realizar el esquema deinmunizacin (15 mL aprox.). Aplicar la siguiente frmula:

Concentracin que se tiene - 1 = Volumen de diluyente que se debe agregarConcentracin que se desea por cada mL de la suspensin concentrada

5. Envasar en frascos vial tanto la suspensin concentrada como la diluiday rotular adecuadamente.

6. Realizar la prueba de esterilidad mictica y bacterianaa cada productosembrando 0.1 mL de las suspensiones en los tubos de tioglicolato ySabouraud, incubando los primeros a 32-35C, 48 h y los segundos atemperatura ambiente por lo menos una semana. Si el resultado de laprueba es satisfactorio, las suspensiones se conservan en refrigeracinhasta su uso.

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