Preparación de medios de cultivo y su esterilización. Por Oscar Omar

¿Para que se necesita esterilizar el material?

Aquí una sencilla respuesta, es imprescindible trabajar con material y soluciones estériles con objeto de que los resultados que se obtengan correspondan al microorganismo o microorganismos que están presentes en la muestra que se estudia y no a contaminantes procedentes del medio o materiales que puedan desarrollarse y falsear las pruebas. Para ella, antes de empezar el trabajo práctico se esterilizará, junto con los medios de cultivo, el material que posteriormente se utilizará.

Desde hace mucho tiempo…

Es un reto el control de enfermedades infecciosas por destrucción, disminución de su número o inhibición de microorganismos. Se puede llevar a cabo con diferentes métodos en función del lugar a aplicar y el grado de erradicación microbiana que se pretende conseguir.

Es por eso que veremos algunos conceptos básicos.

Esterilización, este es un proceso físico o químico que destruye toda forma de vida microbiana incluidas las esporas.

Desinfección tiene por objetivo la destrucción de microorganismos mediante agentes de la naturaleza química, con el fin de disminuir el número de formas vegetativas a niveles mínimos.

Desinfectante, esta es una sustancia química que inhibe o destruye microorganismos al aplicarla sobre material inerte sin alterarlo significativamente

Asepsia, es un término que se aplica a los procedimientos utilizados para prevenir que los microorganismos progresen en un medio determinado.

Antimicrobianas: Son sustancias químicos producidas por microorganismos o sintetizadas químicamente que a bajas concentraciones son capaces de inhibir e incluso de destruir microorganismos sin producir efectos tóxico en el huésped.

Antimicrobianas

Esterilización Agt

es. Físicos

Calor seco

Flameado

Incineración

Estufa

Calor húmedo

Autoclave

Tindalización

Filtración

Radiaciones

U.V

Rayos X

Agtes. Químicos

Óxido de etileno

Formol o formaldehído

Glutaraldehído

Desinfección Compuestos inorgánicos

Nitrato de plata y derivados argéncos

Derivados mercuriales

Agua oxigenada

Permanganato de potasio

Derivados clorados

Derivados yodados

Compuestos orgánicos

Alcoholes y fenoles

Clorohexidina

Detergentes aniónicos y catiónicos

Esterilización

Flameado: es un procedimiento simple y eficaz, consiste en la exposición de un objeto a efecto de la llama hasta la incandescencia. Se esteriliza de esta forma, p. ej. ansas de cultivo de siembra.

Incineración: es el mejor sistema para esterilizar todas aquellos productos en los que no importe su destrucción, p. ej. material biológico

Estufa: calor seco a alta temperatura, 20 minutos durante 180º, 60 minutos a 160º, siendo suficiente la esterilización durante 60 minutos a 100-140º, se lo utiliza para esterilizar material de vidrio debidamente envuelto en papel, metal. etc.

Calor húmedo

La esterilización con calor húmedo (vapor d agua) es mucho más rápida y eficaz que el calor seco debido a que las moléculas de agua desnaturalizan las proteínas de forma irreversible mediante rotura de los uniones H entre los grupos peptídicos a temperaturas relativamente bajas.

Autoclave: horno a presión, consiste en una cámara en la que el aire puede ser sustituído por vapor de agua sometida a presión. Se opera a 121ºC y 1 atm. de presión durante 20 minutos. De esta forma se consigue destruir todas las formas vegetativas y esporas. Se lo utiliza para esterilizar todo material resistente a esa temperatura y es muy utilizado para la esterilización de medios de cultivos

Tindalización: (esterilización intermitente) consiste en someter el producto a calentamientos intermitentes entre 56 y 100ºC durante 30 minutos con lo que se asegura destruir las formas vegetativas. En los intervalos se mantiene a temperatura ambiente o a 37ºC, las esporas germinan y las bacterias resultantes se hacen más sensibles al calentamiento posterior.

Radiaciones

Luz UV: es absorbida a una longitud de onda de 240 a 280 nm por ácidos nucleicos causando daños genéticos alterando las bases. Se la utiliza en la preparación de vacunas, cabinas de seguridad biológica, lugares de trabajo como mesadas de laboratorios, est.

Radiaciones ionizantes: actúan lesionando ácidos nucleicos. Se la utiliza sobre todo en procesos industriales para esterilizar dispositivos quirúrgicos, guantes, jeringas, etc.

Agentes químicos

Los agentes químicos como el óxido e etileno, formaldehído o glutaraldehído reaccionan con gran facilidad con diferentes grupos funcionales de los ácidos nucleicos y proteínas alquilando estos radicales esenciales.

a) Óxido de etileno.

Es un gas inflamable y potencialmente explosivo, muy penetrante que incativa microorganismos sustituyendo átomos de hidrógeno lábiles por otros grupos como hidroxilos, carboxilos, etc.

El material se expone a esterilizar a un 5-10% de óxido de etileno en dióxido de carbono a 50-60º en condiciones de humedad controlada durante 4 a 6 horas. Es necesario someterlo después a un período de aireación debido a su carácter mutegénico. Es un agente efectivo en la esterilización de material termolábil como prótesis, catéteres, etc

b) Formol o formaldehído.

Es un gas fácilmente soluble en agua que se utiliza al 40% (formalina). Usado en forma gaseosa y en cámara cerrada se emplea en la esterilización hospitalaria y en la industria farmacéutica. También es muy utilizado como desinfectante ambiental de salas altamente contaminadas que una vez tratadas deben airearse.

c) Glutaraldehído.

S emplea sumergiendo el material limpio en una solución al 2%, se emplea sobre todo en la esterilización de instrumentos ópticos y los utilizados en terapia respiratoria.

Compuestos Inorgánicos

La actividad de los compuestos derivados de metales pesados (como plata, mercurio, etc.,) se debe a la formación de sales que se disocian con dificultad de los grupos sulfidrilos de las proteínas.

Son buenos bactericidas. El nitrato de plata se ha utilizado en el tratamiento de quemaduras en soluciones al 0,5% y en la profilaxis de la oftalmia neonatorum por Neisseria gonorrhoeae.

Nitrato de plata y derivados agenticos, el más utilizado como desinfectante de la piel es el mercuriocromo, no es tóxico y sigue siendo activo en presencia de materia orgánica.

Derivados mercuriales, es un agente oxidante de efecto fugaz por ser descompuesto por las catalasas de los tejidos.

Agua oxigenada (peróxido de hidrógeno)Agente oxidante que se inactiva en presencia de materia orgánica. Es poco utilizado. En dermatología es utilizado por su propiedad antifúngica.

Permanganato de potasio, se inactivan en presencia de materia orgánica. El cloro y derivados son agentes oxidantes muy usados en la potabilización del agua en forma de cloro gaseoso en grandes establecimientos, y en forma de hipoclorito es utilizado para descartar material biológico (sangre, suero, etc.)

La cloramina es un antiséptico menos potente que el hipoclorito, de acción más lenta pero mejor tolerada en la aplicación tópica.

Derivados clorados.

Derivados yodados.

Compuestos Orgánicos

Actúan desnaturalizando proteínas. Su acción es rápida pero se evaporan con facilidad. El alcohol etílico se utiliza en antisepcia a una concentración del 70%, a esta concentración se reduce más la tensión superficial de la célula bacteriana facilitando el proceso de desnaturalización.

Alcoholes. Actúan precipitando proteínas. El hexaclorofeno y el fenol no se emplean por su toxicidad. Otros derivados fenólicos son los cresoles, los que unidos a jabones originan compuestos estables.

Fenoles. Es un derivado fenólico que actúa alterando la permeabilidad de la membrana celular bacteriana. Tiene inactivación rápida y es bien tolerado por la piel. Se emplea mucho en hospitales en el lavado de la superficie cutánea en forma de solución (acuosa o alcohólica) o asociada a detergentes no iónicos.

Clorohexidina. Actúan desorganizando las membranas citoplasmáticas. Tienen escaso poder bacteriostático. Se pueden mejorar combinándolos con desinfectantes u otras sustancias tensoactivas como laurilsulfato.

Detergentes anionicos. Tienen acción antiséptica, se inactivan en contacto con jabón, algodón y materia orgánica. Son poco usados.

Detergentes cationicos.

Glicoles.

Medios de cultivo ¿Qué es?

El medio de cultivo consta de un gel o una solución que cuenta con todos los nutrientes necesarios para permitir condiciones favorables de pH y temperatura, así como para permitir también el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo que se desea hacer, se requerirá ciertas condiciones. Algunas veces se presentan desecados en forma de polvo o granular antes de ser preparados, una vez preparados estos se encuentran en estado sólido, semi sólido o líquido. Los objetivos aquí suelen ser variados, tales como la antibograma, la identificación o la multiplicación, entre otros.

Clasificación

Dependiendo sus cualidades físicas, se distinguen en:

Sólidos

Semisólidos

Líquidos

Según su origen

Naturales: Estos son preparados a partir de sustancias naturales de origen vegetal o animal, pudiendo ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.

Sintéticos: Los medios que tienen una composición química definida cualitativamente y cuantitativamente. Estos son utilizados comúnmente para obtener resultados reproducibles.

Semisintéticos, son a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

¿Qué se necesita para preparar un medio de cultivo?

Antes que nada se debe de saber que tipo de cultivo se desea preparar. Ya que la composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, por que las necesidades nutricionales variaran considerablemente, hay microorganismos muy poco exigentes que crecen en medios de laboratorio normales y microorganismos exigentes que necesitan sustancias determinadas como vitaminas, sueros o sangre para crecer.

Algunos medios dependiendo su composición ayudan al crecimiento de

1.- un gran numero de especies

El agar nutritivo siendo este un medio de cultivo usado comúnmente para la mayor parte de las bacterias. Es muy útil por que permanece sólido incluso a relativas altas temperaturas. Este tipo de agar contiene normalmente:

0.5 % de peptona

0.3 % de extracto de carne/extracto de levadura

1.5 % de agar

0.5 % de cloruro de sodio

Agua destilada

pH casi neutro (6, 8) a 25 °C

Este tipo de medio de cultivo selectivo contiene peptonas. Este es utilizado para cultivar hongos, especialmente dermatofitos, aunque también pueden desarrollarse en un cierto tipo de bacterias filamentosas tales como la nocardia.Se utilizo en 1892 por Raymond Sabouraud y más tarde Chester W. Emmons lo mejoro.

40 g/L glucosa

10 g/L pluripeptona 15 g/L agar

15 g/L agar

0.05 g/L [cloranfenicol]

pH 5, 6

Determinados microorganismos, a estos se les denomina medio de cultivo.

Un medio selectivo es un medio de cultivo en el que sólo puede crecer un tipo de microorganismo (hongo, bacterias entéricas, protozoos…). Un ejemplo de medio selectivo sería usar un medio rico en un antibiótico para permitir únicamente el crecimiento de las bacterias resistentes a éste.

Otros en cambio se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiológicas o test bioquímicos

Nota

La siguiente información fue sacada desde el sitio:

https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/preparacion-de-medios-de-cultivo

¡Lo que esperaban desde el principio:! Un fin:

Preparación de medios de cultivo

Julissa Montoya LópezRosa Angélica Salvador

Mario Alberto Rosales García

Ana Luisa Morales SalinasAlexis Castillo Castillo

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