PRESENCIA DE ALCALOIDES EN DENDROBATES TRUNCATUS …

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PRESENCIA DE ALCALOIDES EN DENDROBATES TRUNCATUS (AMPHIBIA:

DENDROBATIDAE) CRIADAS EN CAUTIVERIO Y ALIMENTADAS

CON HORMIGAS Y MOSCA DE LA FRUTA

Jorge Eduardo Gualdrón Duarte

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar título de

Biólogo

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BIOLOGIA

Bogotá, D. C.

Noviembre 23 de 2005

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NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por los alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

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Jorge Eduardo Gualdrón Duarte

APROBADO

_________________________

Inge Armbrecht, Bióloga Ph.D.

Director

_________________________ _________________________

James Montoya, Biólogo Ph.D. Andrés Acosta, Biólogo B.Sc.

Codirector Codirector

_____________________________ ____________________________

Julio Mario Hoyos, Biólogo Ph. D. Julio Pedrozo, Químico

Jurado Jurado

5




JORGE EDUARDO GUALDRÓN DUARTE

APROBADO

__________________________ ________________________

Ángela Umaña, M.Phil Biología Cecilia Espíndola, M.Sc

Decana Académica Directora de Carrera

8

A mis padres.

9

AGRADECIMIENTOS

Deseo agradecer a todas las personas que de alguna u otra manera me colaboraron

durante todo el proceso del desarrollo de este trabajo, especialmente a los profesores

Inge Armbrecht, James Montoya y Andrés Acosta por su apoyo y guía en la

elaboración de este trabajo.

También un especial agradecimiento a Vladimir Corredor por ser el gestor de realizar

este trabajo y por compartir sus conocimientos y consejos.

A Germán Corredor y la Fundación Zoológica de Cali quienes hicieron posible

realizar los experimentos, a los estudiantes del Laboratorio de Entomología de la

Universidad del Valle por ayudarme en la colecta y la cría en cautiverio de las

hormigas, y a Angela Minas por haberme suministrado las cepas de Drosophila

melanogaster.

A Santiago Castaño y Helberg Asencio del Laboratorio de Biofísica de la

Universidad del Valle por su ayuda en la extracción de los alcaloides y valiosos

comentarios del manuscrito, al Departamento de Química de la Universidad Javeriana

en especial al profesor Jorge Robles por su ayuda en las pruebas químicas para la

detección de alcaloides e interpretación de los resultados.

A Julia Calderón y Luis Ospina por haberme acogido en su casa y brindado una

buena compañía durante mi estancia en Cali.

A mis amigos del Laboratorio de Herpetología de la Universidad Javeriana y otros

laboratorios de la misma universidad por su compañía y colaboración durante todo el

transcurso de la carrera.

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A mis padres y hermanos por que siempre apoyarme y brindarme ese apoyo

incondicional en todo momento.

Noviembre 23 de 2005

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RESUMEN

“Presencia de alcaloides en Dendrobates truncatus (Amphibia: Dendrobatidae)

criadas en cautiverio y alimentadas con hormigas y mosca de la fruta”.

En un gran número de ranas neotropicales de la familia Dendrobatidae una amplia

variedad de alcaloides con únicas propiedades fisicoquimicas ha sido encontrada en

sus pieles. Se ha sugerido que el recurso de estos alcaloides viene del medio de la

rana, específicamente de su dieta. El propósito de este trabajo fue establecer la

relación entre el tipo de alimento y la presencia de alcaloides en la piel de

Dendrobates truncatus, manteniendo grupos en cautiverio por ocho semanas

alimentados con Paratrechina steinheili, Wasmannia auropunctata (Formicidae) o

Drosophila melanogaster (Drosophilidae). D. truncatus mostró una selección positiva

para D. melanogaster y W.auropunctata, mientras que mostró una selección negativa

para P. steinheili. El reactivo de Mayer y la Cromatografía de Capa Delgada

indicaron que no se encontraron alcaloides en las pieles de D. truncatus mantenidas

en cautiverio, sin embargo se encontraron alcaloides en los extractos de los

artrópodos aunque estos no fueron tomados por las ranas. Los resultados sugieren,

que en cautiverio, hay una relación entre la dieta y la presencia de alcaloides en D.

truncatus, ya que si la función metabólica para la presencia de alcaloides fuera

determinada solo por la constitución genética de la especie, entonces la rana,

independientemente de la dieta produciría alcaloides.

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ABSTRACT

“Alkaloids presence in frogs Dendrobates truncatus (Amphibia: Dendrobatidae)

raised in captivity and fed with ants and fruit flies.”

A wide number of alkaloids with unique physicochemical proprieties have been

found in the skins of netropical frogs from the Dendrobatidae family. It has been

suggested that the source of these alkaloids comes from the frog’s environment,

specifically from their diet. The purpose of this work was to establish a relation

between the type of food and the presence of alkaloids in the skin of Dendrobates

truncatus by keeping three groups of frogs in captivity for eight weeks. The frogs

were fed with Paratrechina steinheili, Wasmannia auropunctata (Formicidae) or

Drosophila melanogaster (Drosophilidae). It was found that D. truncatus has a

positive selection for D. melanogaster and Wasmannia auropunctata and a negative

selection for P. steinheili. The Mayer Reagent and the Thin Layer Chromatography

indicated that no alkaloids were found in the skin of D. truncatus while raised in

captivity, although alkaloids were found on the arthropods extracts however these can

not take for the frogs. These results suggest, that in captivity, there is a relation

between the diet and the presence of alkaloids in D. truncates, if the metabolic

function for the presence of the alkaloids was determined only by the genetic

constitution of the species, then the frog, independently of the diet, would produce

alkaloids.

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TABLA DE CONTENIDO

Pág.

1. Introducción……………………………………………………………. 16

2. Marco Teórico…………………………………………………………. 18

2.1. Alcaloides Mayores…………………………………………………… 19

2.1.1. Batracotoxinas……………………………………………………… 19

2.1.2. Pumiliotoxinas……………………………………………………… 20

2.1.3. Histrionicotoxinas………………………………………………….. 21

2.1.4. Indolizidinas……………………………………………………….. 22

2.1.5. Decahidroquinolinas………………………………………………. 22

2.1.6. Epibatidina……………………………………………………….... 22

2.2. Alcaloides Menores…………………………………………………… 23

2.2.1. Gephyrotoxinas……………………………………………………… 23

2.2.2. 2,6 disustituido piperidinas…………………………………………. 23

2.2.3. Pirrolidinas………………………………………………………….. 23

2.2.4. Piridil-piperidinas…………………………………………………... 23

2.2.5. Indol alcaloides……………………………………………………... 23

2.2.6. Azatricyclododecenas………………………………………………. 24

2.2.7. Alcaloides de amidina………………………………………………. 24

2.3. Presencia de alcaloides y variabilidad en sus perfiles………………… 24

2.4. Fuentes de origen……………………………………………………… 25

2.5. Capacidad de acumulación de alcaloides……………………………... 27

3. Antecedentes específicos………………………………………………... 29

3.1. Dendrobates truncatus (Cope 1861)………………………………….. 29

3.1.1. Alcaloides encontrados en Dendrobates truncatus…………………. 31

3.2. Especies de Hormigas…………………………………………………. 32

3.2.1. Paratrechina steinheili (Forel 1893)………………………………... 32

3.2.2. Wasmannia auropunctata (Roger 1863)……………………………. 33

3.3.3. Drosophila melanogaster Meigel, 1830……………………………. 34

4. Justificación……………………………………………………………... 35

14

Pág.

5. Hipótesis……………………………………………………………….... 35

6. Objetivos………………………………………………………………… 36

6.1. General………………………………………………………………… 36

6.2. Específicos…………………………………………………………….. 36

7. Metodología……………………………………………………………... 36

7.1. Cría y mantenimiento en cautiverio de ranas………………………….. 37

7.2. Colecta, establecimiento y mantenimiento de colonias de hormigas….. 37

7.3. Bioensayos……………………………………………………………... 38

7.4. Extracción y análisis de las muestras…………………………………... 40

7.4.1. Insectos………………………………………………………………. 40

7.4.2. Anfibios……………………………………………………………… 41

8. Métodos analíticos………………………………………………………. 42

8.1. Reactivo de Mayer…………………………………………………….. 42

8.2. Cromatografía de Capa Delgada (CCD)………………………………. 42

9. Resultados……………………………………………………………….. 43

9.1. Consumo de las dietas…………………………………………………. 43

9.2. Detección de alcaloides………………………………………………... 44

9.2.1. Reactivo de Mayer…………………………………………………... 44

9.2.2. Cromatografía de Capa Delgada…………………………………….. 46

10. Discusión……………………………………………………………….. 46

10.1. Consumo de las dietas………………………………………………... 46

10.2. Relación de la dieta con la producción de toxinas…………………… 47

11. Consideraciones finales y conclusiones………………………………… 51

12. Recomendaciones………………………………………………………. 53

13. Bibliografía……………………………………………………………... 54

15

LISTA DE TABLAS Pág.

Tabla 1. Presencia de alcaloides lipofílicos en anfibios……………………. 17

Tabla 2. Detección de alcaloides. Resultado de las muestras con el reactivo de

Mayer……………………………………………………………………….. 44

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Color en vivo de Dendrobates truncatus. A) vista lateral. B) vista

ventral……………………………………………………………………….. 29

Figura 2. Mapa de distribución de la especie Dendrobates truncatus…….... 30

Figura 3. Paratrechina steinheili, vista lateral…………………………….... 32

Figura 4. Wasmannia auropunctata…………………………………………. 33

Figura 5. Drosophila melanogaster, vista lateral…………………………….. 34

Figura 6. A) cajas colonias de hormigas. B) vista interna de la caja………... 38

Figura 7. Caja para los grupos de D. truncatus alimentadas con hormigas. A)

vista lateral. B) vista interna………………………………………………….. 39

Figura 8. Caja para los grupos de D. truncatus alimentadas con moscas de la

fruta. A) vista lateral. B) vista interna…………………………………………39

Figura 9. Revelado de la cromatografía de capa delgada con reactivo de sulfato

de cerio…………………………………………………………………........... 45

16

1. INTRODUCCION

En las últimas décadas los anfibios, en especial los anuros, han despertado el interés

de la comunidad científica, ya que en las pieles de algunas especies se han encontrado

una gran variedad de compuestos biológicos activos (más de 500 alcaloides) los

cuales son usados por estos individuos como defensa química contra depredadores

y/o microorganismos (Cevikbas 1978, Daly et al. 2003). Por sus características

químicas y actividades fisiológicas que presentan, éstos alcaloides han venido siendo

parte importante de numerosos estudios e investigaciones tanto en el área de la

biología como en el de la medicina (Albuquerque et al. 1971, Daly et al. 1987, Daly

2003, Badio et al. 1994).

El grupo de anfibios que posee la mayor variedad de alcaloides con actividades

tóxicas más potentes es el de las ranas neotropicales de la familia Dendrobatidae; los

alcaloides que han sido aislados de las pieles de los individuos de esta familia

conforman cuatro grandes grupos: Las Batracotoxinas (BTXs), presentes sólo en el

género Phyllobates; las Pumiliotoxinas (PTXs), presentes en Phyllobates,

Dendrobates y Epipedobates; las Histrionocotoxinas (HTXs) presentes en todos los

géneros anteriores, y la Epibatidina, que ha sido hallada únicamente en Epipedobates

(Mensah-Dwumah & Daly 1978, Myers & Daly 1976, Daly et al. 1987, Daly 2003)

(Tabla 1).

Aunque el descubrimiento de diferentes tipos de alcaloides ha aumentado en los

últimos treinta años, todavía no se tiene claro de dónde provienen estos compuestos

orgánicos. En un principio se pensó que las ranas sintetizaban los alcaloides de novo,

pero se encontró que individuos mantenidos en cautiverio disminuyen

considerablemente la concentración de los alcaloides y en algunos casos los llegan a

perder (Daly et al. 1980, Daly et al. 1992, Daly et al. 1997a). Sin embargo, aunque

se disminuye los niveles de concentración de los alcaloides estos pueden permanecer

17

Tabla No. 1. Presencia de alcaloides lipofílicos en anfibios. SAM, samandarinas; BTX, batracotoxinas; HTX, histrionicotoxinas; PTX, pumiliotoxinas; aPTX, alopumiliotoxinas; hPTX, homopumiliotoxinas; DHQ, 2,5-disustituido decahidroquinolas; 3,5-P, 3,5-disustituido pirrolizidinas; 3,5-I y 5,8-I, disustituido indolizidinas; 1,4-Q, 1,4- disustituido quinolizidinas; Epi, epibatidina; Pseudophrynaminas (Daly 1995).

Presencia de alcaloides lipofílicos en anfibios Clases PTX-A Alcaloides de Izidina Familia y

Género SAM BTX HTXPTX aPTX hPTX

DHQ 3,5-P 3,5-I 5,8-I 1,4-Q

Epi Pseudophry

Salamandridae Salamandra + - - - - - - - - - - - - Dendrobatidae Phyllobates - + + + - - + - + - - - - Dendrobates - - + + + + + + + + + - - Epipedobates - - + + + - + - - + + + - Myniobates - - - + + - + - - + + - - Mantellidae Mantella - - - + + + + + + + + - - Myobatrachidae Pseudophryne - - - + + - - - - - - - + Bufonidae Melanophryniscus - - - + + + + + + + + - -

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durante varios años en ranas mantenidas en cautiverio (e.g. Phyllobates). Lo anterior

apunta a que probablemente la fuente de estos alcaloides proviene del medio donde

viven las ranas y que son obtenidos a partir de la alimentación, en este caso el

consumo de pequeños artrópodos estaría sirviendo como fuente de alcaloides

maduros o de precursores que son almacenados en sus pieles.

Siguiendo esta idea, se han realizado trabajos (Jones et al. 1999, Spande et al. 1999,

Saporito et al. 2004) con el fin de hallar los posibles organismos que proporcionan

los alcaloides maduros o sus precursores. Aunque se han encontrado en artrópodos

(principalmente hormigas, escarabajos y milpiés) algunos alcaloides también

presentes en dendrobátidos, la gran mayoría de estos alcaloides sólo han sido

encontrados en los extractos de pieles de ranas (Daly et al. 2003, Saporito et al.

2004).

Zambrano (2000) realizó un estudio sobre la dieta de poblaciones de Dendrobates.

truncatus y su relación con los niveles de toxicidad, en el que muestra que el

componente principal de la dieta de esta especie esta constituido por hormigas de la

familia Myrmicinae, y que los efectos tóxicos de la rana se mantenían aún después de

mantener los individuos en cautiverio durante cuatro meses, bajo una dieta artificial

con Drosophila melanogaster.

El propósito de este trabajo fue examinar si existe una relación directa entre el

consumo de alimento y la presencia de alcaloides en la especie de rana Dendrobates

truncatus criadas en cautiverio.

2. MARCO TEORICO

Los alcaloides presentes en ranas de la familia Dendrobatidae son alcaloides

lipofílicos que poseen un anillo de piperidina, a excepción del alcaloide batracotoxina

19

que es un alcaloide esteroidal y alcaloides con grupos indol, alcaloides constituidos

por pirrolidinas y los alcaloides constituidos por amidinas.

Por la gran cantidad y variedad de alcaloides encontrados en los extractos de los

dendrobátidos se ha desarrollado un código nomenclatural, el cual emplea el peso

molecular del alcaloide seguido con una letra (en negrilla) para distinguir alcaloides

con el mismo peso molecular (e.g. 223A y 223B). Sin embargo, algunos se pueden

presentar como simples compuestos o en mezclas difícilmente separables (e.g.

239CD). En el caso de la caracterización de los isómeros (e.g. cis, trans, epi, iso) se

ha implementado el uso de primas (A´, A´´), por ejemplo, los diastómeros 307A´ y

307A´´ fueron aislados del alcaloide 307A (Daly et al.1993).

Los alcaloides lipofílicos de la familia Dendrobatidae los podemos clasificar en dos

grandes grupos, así:

2.1. Alcaloides mayores

Agrupan una gran variedad y número de alcaloides. Algunos miembros ocurren en

varias especies de anfibios.

2.1.1. Batracotoxinas (BTXs): Son alcaloides complejos, estos difieren de los otros

alcaloides por la estructura esteroidal del anillo la cual es idéntica en todas las

batracotoxinas, y se catalogan entre los venenos más tóxicos no protéicos. Dentro de

este grupo se encuentran los siguientes compuestos: Las batracotoxinas (BTX),

homobatracotoxinas (hBTX), Batracotoxina A (BTX A), y un cuarto compuesto, la

Pseudobatracotoxina, la cual se ha observado que durante su aislamiento se convierte

en BTX A (Myers & Daly 1976, Daly et al. 1987).

Actividad tóxica: La actividad tóxica de las BTXs genera una despolarización del

nervio y el músculo por su capacidad de incrementar la permeabilidad de los iones

sodio sobre la mebrana excitable. Las batracotoxinas actúan directamente sobre los

20

canales de sodio modificando la selectividad iónica y la sensibilidad al voltaje. La

toxicidad se debe al bloqueo de la transmisión nerviosa hacia el músculo (Daly 1995,

1998).

Presencia: Las BTXs solo se han encontrado en cinco especies de Phyllobates, lo cual

hace pensar que la capacidad de almacenamiento de este tipo de alcaloides en ranas

sea una característica monofilética (Myers & Daly 1976, Daly 1995). Este tipo de

alcaloides también se ha encontrado en otros grupos de vertebrados no anfibios, aves

passeriformes del género Pitohui (Dumbacher et al. 1992) e Ifrita (Dumbacher et al.

2000).

Origen: La fuente de batracotoxina en aves de Nueva Guinea se encontró en especies

de escarabajos del género Choresine (familia Melyridae) (Dumbacher et al. 2005).

2.1.2. Pumiliotoxinas: Se conocen más de cien tipos de toxinas conocidas como

pumiliotoxinas y que se agrupan en Pumiliotoxinas A, B, and C. (PTX A, B, C).

Entre sus estructuras hay piperidinas 2,6-disustituidas, indolizidines 3,5-disustituidas,

derivados de la perhidroquinolina etc. Las PTX A y B son alcaloides complejos que

poseen un sistema de anillos bicíclicos esteroidales que contienen nitrógeno

difiriendo solo en una porción terminal de un lado de la cadena (Myers & Daly

1976). La Pumiliotoxina C (PMT-C), es una simple cis-decahydroquinolina. Este tipo

de componentes se presentan en varias especies de géneros de anfibios que poseen

alcaloides lipofílicos con la excepción del género Salamandra que sólo posee

samandarinas (SAM) (Schöpf 1961).

Actividad tóxica: Miembros de la PTX-A poseen actividad tóxica con efectos sobre

los canales de sodio y posiblemente sobre los canales calcio. La PTX-B tiene efectos

cardiotóxicos y miotóxicos mediados por la interacción con el canal de sodio así

como por sus efectos antagonísticos con el receptor nicotínico de acetilcolina (Daly

1995).

21

Origen: Se encontró que las hormigas Brachymyrmex longirostris, B. cf. depilis y

Paratrechina steinheili eran la fuente para las PTXs de la especie Dendrobates

pumilio (Saporito et al. 2004). También se ha encontrado PTX 251D en la especie

de ácaro Scheloribates azumaensis (Takada et al. 2005)

2.1.3. Histrionicotoxinas (HTX): Son una clase de alcaloides caracterizados por

tener una estructura con un anillo de espiropiperidina (las sustituciones alélicas y

acetilénicas de algunas histrionicotoxinas también se han encontrado en las

pumiliotoxinas-C y gefirotoxina) e incluye los alcaloides C19 y los homólogos de

menor peso 235A y 259 (Daly et al. 1978). Existe más de una docena de alcaloides

clasificados como histrionicotoxinas que no han sido detectadas en cantidades

suficientes para determinar sin ambigüedades su estructura. (Lapa et al. 1975, Daly

et al. 1987).

Actividad tóxica: son relativamente poco tóxicas (menos que las PTX-A) y causan

dificultades motoras y postración después de administración subcutánea (Daly et al.

1971). Las histrionicotoxinas han sido muy útiles como reactivos farmacológicos por

su capacidad para antagonizar los cambios de conductancia que normalmente ocurren

después de la activación de los receptores nicotínicos por la acetilcolina en el

músculo. Adicionalmente las histrionicotoxinas antagonizan los cambios de

conductancia de potasio asociados con los potenciales de acción en el nervio y el

músculo (Daly, 1978).

Presencia: Detectados en varias especies y poblaciones de Dendrobates,

Epipedobates, Phyllobates y también en la rana de Madagascar, Mantella

madagascarensis. Estas no se presentan en todas las especies de estos géneros, o en

todas las poblaciones de ranas donde se ha encontrado (Daly et al. 1984; Daly et al.

1987, Daly 1995).

Origen: Hasta el momento no se conoce ningún precursor o fuente de este alcaloide.

22

2.1.4. Indolizidinas (I): Indolizidinas bicíclicas que incluyen las gefirotoxinas (Daly

et al. 1978). Son series simples de alcaloides bicíclicos, estos incluyen 3,5

disustituida pirrolizidinas (3,5-P), 3,5 Y 5,8 disustituida indolizidinas (3,5-I y 5,8-I),

y el 1,4 disustituida quinolizidinas (1,4-Q). Alcaloides como los 223A, B; 239A, B,

C, D han aparecido como trazas en algunos extractos de pieles de dendrobátidos

(Daly 1995).

2.1.5. Decahidroquinolinas (DHQ): Son aminas secundarias bicíclicas. Cerca de

treinta alcaloides extraídos de ranas han sido asignados a esta clase (Spande et al.

1999). Las PTX-C fue el primer miembro aislado de esta clase, estos tienen

respectivamente un hidrógeno, un etil o un propil sustituido en lugar del grupo 5-

metil de la PTX-C. La antigua terminología “PTX-C” no ha sido muy utilizada por la

probabilidad de confusión con la estructura disimilar de la PTX-A por consiguiente

“DHQ” es usado para describir a PTX-C y los alcaloides relacionados

estructuralmente (Daly et al. 1987).

2.1.6. Epibatidina (E): Hasta el momento es el más relevante descubrimiento clínico

de todos los alcaloides encontrados en la pieles de los anfibios, ya que es un potente

analgésico doscientas veces más potente que la morfina (Daly et al. 2000a). La

epibatidina provee una actividad agonística selectiva hacia receptores neuronales y

ganglionares. Esta actividad puede ser la base de la potente actividad analgésica y

representa un instrumento importante para el estudio de los receptores nicotínicos y

su función (Badio et al.1994, Daly et al. 1997b).

Presencia: La epibatidina ha sido detectada sólo en ranas del género Epipedobates. En

diferentes poblaciones de E. tricolor la epibatidina se presenta en cantidades

variables. Esta también se ha encontrado en una población de E. anthony, pero no en

todas las poblaciones de esta rana, y en bajas concentraciones en algunas poblaciones

de E. epinosai y E. pictus (Daly et al. 1993). Hasta el momento, no se conoce la

fuente primaria de la epibatidina, esta se considera semejante a la nicotina, y sería

23

lógico pensar que la epibatidina de la rana podría derivar de una planta común vía

artrópodo en la cadena alimenticia (Daly et al. 1997b).

2.2. Alcaloides menores

Son considerados menores al contenerlos pocas especies y también porque se

presentan principalmente como alcaloides en minoría o como trazas.

2.2.1. Gephyrotoxinas (GTX): Son alcaloides tricíclitos conocidos sólo para las

poblaciones de Dendrobates histrionicus; son los siguientes: 287C, 289B, 239AB,

239CD (Daly 1978, Daly et al. 1987).

2.2.2. 2,6 disustituido piperidinas: Parece ser el precursor de las HTX, GTX, DQH

e I, estas piperidinas han sido encontradas solo en algunas poblaciones de D.

histrionicus y D. trivittatus.

2.2.3. Pirrolidinas: Encontrado en las poblaciones de D. histrionicus y D. pumilio.

La determinación estructural del 197B es idéntica a un alcaloide previamente

identificado en hormigas africanas Solenopsis punctaticeps y la Monomorium

pharaonis (Jones et al. 1982).

2.2.4. Piridil-piperidinas: Este es un alcaloide menor de piperidina

(noranabasamina), de un constituyente menor de Phyllobates terribilis y en trazas

menores en P. aurotaenia y P. bicolor (Daly et al. 1987).

2.2.5. Indol alcaloides: Dos isómeros alcaloides calycanthina y chimonanthina

fueron extraídos de P. terribilis y P. bicolor. Aunque como enantiómeros fueron

previamente conocidos en una planta del género Calycanthus (Calycantheaceae)

(Daly et al. 1987).

24

2.2.6. Azatricyclododecenas: Es un alcaloide triciclito. El 205B, aislado de D.

pumilio, también se encuentra presente en escarabajos (conocidos como

“mariquitas”) de la familia Coccinelidae (Daly et al. 1987).

2.2.7. Alcaloides de amidina: tres alcaloides (222, 236 y 252) con amidina fueron

detectados en extractos de pieles de D. pumilio, pero también se han encontrado en D.

tricolor, y posiblemente se presentan en D. espinosai y D. pictus. Estas trazas de

alcaloides presentan una actividad analgésica según algunas pruebas de laboratorio

(Daly et al. 1987).

2.3. Presencia de alcaloides y variabilidad en sus perfiles:

Se ha visto que los perfiles de los alcaloides pueden variar entre individuos de una

misma población, pero esta variación es poca comparada con la observada entre

poblaciones de una misma especie. Por ejemplo, las poblaciones de Dendrobates

leucomelas de dos localidades diferentes en Venezuela poseen como alcaloides

principales PTX 251D y aPTX 267A. La aPTX 267A se presentó como alcaloide

mayor en una población y como menor en la otra población (Daly et al. 1987). De

igual forma Daly et al. (1992) detectaron que la presencia de alcaloides varia en tres

poblaciones de D. auratus dependiendo de su ubicación geográfica. La primera

población en la Isla Taboga (Panamá) presento HTX, PTX-A y DQH, la segunda de

las montañas centrales de Panamá contenía principalmente HTX, PTX-A y una I; y

la tercera, de la Costa Caribe de Costa Rica, presentó HTX, hPTX, un DHQ, una

variedad de I, quinolizidinas y pirrolizidinas. También, en el mismo trabajo se

observó que los descendientes de una población de D. auratus de Panamá que fue

introducida en la isla de Manoa (Hawaii) no presentaron HTX, pero si se encontró un

nuevo alcaloide triciclito (193), el cual no fue detectado en los parentales de Panamá,

demostrando con esto que debe existir un control genético de las vías biosintéticas

sumado a una interacción con factores ambientales, en este caso la dieta, que juegan

un papel importante en la producción de alcaloides (Daly et al.1992).

25

Otros individuos de D. auratus, de la población de Manoa, tomados de vida silvestre

y mantenidas en laboratorio con grillos y moscas de la fruta, presentaron niveles de

aPTX semejantes a las ranas silvestres, mientras que los niveles de PTX 251D fue

reducido al 50%, y los de 195A (DQH) y 195B (I) se redujeron cerca del 80% (Daly

et al. 1992), lo cual estaría mostrando una dependencia de recursos alimenticios

específicos para la formación de alcaloides.

2.4. Fuentes y origen

En la mayoría de los casos, los alcaloides detectados en los extractos de las pieles de

las ranas no se han encontrado en otro tipo de organismo. No obstante, se ha

comprobado que las hormigas, cucarrones y ciempiés son fuente de DHQ, algunas

Indolizidinas, coccinelinas, pirrolizidinas, PTXs y aPTX. En algunos casos estos

alcaloides se han encontrado en especies de artrópodos específicos, o en varias

mezclas de estos (Daly et al.1994a, Daly et al. 2002) sin establecer cuáles especies

en concreto son la fuente de origen de los alcaloides. También se ha planteado la idea

que microorganismos simbióticos o artrópodos microscópicos que produzcan los

alcaloides puedan estar usando más de un taxón como hospedero (Daly et al. 2002).

Un ejemplo de esto lo muestran las hormigas del género Tetraponera que poseen un

alcaloide llamado tetraponerina sintetizado por una bacteria fijadora de nitrógeno

ubicada en el tracto digestivo de la hormiga (Smith & Jones 2004).

Por lo anterior se han desarrollado experimentos en laboratorio para comprobar la

relación que tiene el recurso alimenticio en estado silvestre versus la toxicidad.

Individuos de la especie de rana D. auratus mantenidos en terrarios y alimentados

con termitas (Kalotermes sp. y Neoternes connexis) y Drosophila sp., presentaron en

sus pieles PTX 251D, aPTX 267A y DHQ 195A, los mismos que presentan sus

parentales silvestres, pero en menores cantidades (Daly et al. 1992). Otro trabajo

realizado con la misma especie en Panamá mostró que artrópodos silvestres dados de

26

comer a estas ranas en cautiverio, generaban perfiles de alcaloides muy parecidos a

los que presenta esta especie en la naturaleza, además, se encontraron alcaloides

como la precoccinelina (193C), un alcaloide encontrado previamente en escarabajos y

la nitropolizonamina, encontrado en los ciempiés (Daly et al.1994a).

Del grupo de los artrópodos las hormigas son consideradas como la principal fuente

de alcaloides para las especies de Dendrobatidae. La mayoría de los siguientes

alcaloides se ha encontrado en hormigas de los géneros Solenopsis, Monomorium y

Megalomyrmex: pirrolidinas 197B, 225C, 225H, 3-5 disustituida; piperidinas 223K,

225I, 253J; pirrolizidinas 223 (dos isómeros); I 167E, 195B, 223AB, 223R;

quinolizidinas 195C; DHQ cis-195A, cis-195J, cis-275B y cis-275B (Jones et al.

1980, 1982, 1984,1999, Spande et al. 1999). Estos mismos alcaloides también se han

encontrado en especies de ranas neotropicales pertenecientes a los géneros

Dendrobates y Phyllobates.

Por ello se han realizado hallazgos y trabajos tanto en campo como en laboratorio que

podrían explicar la relación entre la dieta y la presencia de alcaloides. En cautiverio y

durante siete semanas, Daly et al. (1994b) ofrecieron como alimento a ranas D.

auratus, hormigas de la especie Monomorium pharaonis, estas hormigas contienen

tres tipos de alcaloides indolizidinas (3,5 I y la monomorina-I) y pirrolidinas (trans-

2-heptil-5-(5-hexenil)-pirrolidina). Después del tiempo de alimentación detectaron en

la piel de las ranas una acumulación significativa de indolzidinas (sobretodo la

monomorina-I) aunque las pirrolidinas no fueron detectadas en los extractos de piel.

Por otro lado, y en medio silvestre, Saporito et al. (2004) detectaron PTX A 307A y

323A en hormigas formicinas de los géneros Brachymyrmex (B. longirostris y B. cf.

depilis) y Paratrechina (P. steinheili). Estos corresponden a los mismos alcaloides

detectados en extractos de piel de Dendrobates pumilio provenientes de los lugares

donde se colectaron las hormigas. Además, estas hormigas también se encontraron en

los contenidos estomacales de estas ranas, obteniendo con esto, una fuerte evidencia

27

de que las hormigas, como recurso alimenticio, son la fuente de las PTXs para esas

poblaciones de D. pumilio.

Recientemente, Dumbacher et al. (2004) descubrieron la presencia de BTXs en

extractos de los escarabajos Melyridae Choresine pulcra, C. rugiceps y C.

semiopaca, siendo esta última la especie que presentó una mayor concentración del

alcaloide. Los autores sugieren que estas especies son la posible fuente potencial de

BTXs también presentes en especies de aves passeriformes de los géneros Pitohui e

Ifrita.

2.5. Capacidad de acumulación de alcaloides

Se ha observado que la función ecológica de los de alcaloides en la piel de las ranas

es principalmente defensiva contra depredadores, al secretarlos la rana a la superficie

de la piel gracias a sistemas glandulares que estas poseen cuando se ven en

situaciones de peligro o estrés (Myers & Daly 1983, Daly et al. 1997b).

En un principio se planteó que estos alcaloides descubiertos en los extractos de las

pieles de las especies de dendrobátidos eran sintetizados por las propias ranas. Sin

embargo, estudios de laboratorio revelaron que en dendrobátidos mantenidos en

cautiverio los alcaloides bajaban sus niveles de toxicidad o se perdían totalmente

(Daly et al. 1997b). Ejemplo de ello se vio en un juvenil de Phyllobates bicolor

mantenido en un terrario cuando no presentó BTX, DHQ ni HTX, alcaloides

principales que posee la especie en vida silvestre (Daly et al. 1992). En otro caso

similar se observó en individuos de P. terribilis una disminución de sus niveles de

BTX-hBTX de 1140 µg/rana a 250 µg/rana luego de seis años de cautiverio, además

las BTXs ni ningún otro tipo de alcaloide se detectaron en los extractos de las pieles

de su F1. Esta disminución y/o pérdida de alcaloides fue igualmente observada en

especies de distintos géneros mantenidas en cautiverio: por ejemplo, los individuos de

28

Mantella viridis (Mantellidae), o ranas de Madagascar, no conservan PTX-A, que es

un alcaloide presente en individuos silvestres (Daly et al. 1997a).

Lo anterior puede sugerir que las ranas que poseen alcaloides no los sintetizan ellas

mismas – de novo- sino que han desarrollado un sistema de almacenamiento de estos

alcaloides a partir de la dieta (Daly et al. 1994b). Daly et al. (1994b) observaron que

este sistema de acumulación de alcaloides está ausente en géneros que no los

presentan, como por ejemplo especies de Colostethus (Dendrobatidae). Esto se

demostró cuando individuos de Colostethus talamancae y C. inguinalis que fueron

alimentados con una mezcla de alcaloides durante cinco semanas, no mostraron la

acumulación de estos en la piel, evento que sí ocurrió en especies de Dendrobates y

Phyllobates alimentadas con el mismo tipo de dieta (Daly et al. 1994b). Igualmente

la capacidad de retención de distintos alcaloides (HTX, DHQ, PTX, 3,5-P, 3,5 y 5,8 I,

1,4-Q) ha sido demostrada en experimentos con D. auratus, D. galactonotus, D.

castaneoticus, Epipedobates tricolor, P. bicolor (Daly et al. 1994b, Daly et al. 2003)

al alimentarlas con Drosophila previamente espolvoreadas con alcaloides extraídos

de otras ranas. Además, Daly et al (2003) observon en laboratorio, que algunas

especies del género Dendrobates (D. auratus, D. galactonatus y D. castaneoticus)

presentan una enzima, la 7-hidroxilasa, la cual permite transformar un alcaloide en

otro más tóxico haciendo la conversión de una PTX a aPTX. Lo anterior podría estar

explicando, de cierta forma, porque algunos alcaloides no han sido hallados en forma

madura en una fuente alimenticia, ya que se estarían formando a partir de un

precursor a través de una vía metabólica.

Sin embargo, llama la atención que en el caso del género Pseudophryne

(Myobatrachidae), las ranas exhiben un aumento del alcaloide pseudophyramina en

cautiverio, independientemente del tipo de alimentación, aunque las PTXs, también

presentes en estas ranas en vida silvestre, se perdieron durante el cautiverio (Smith et

al. 2002).

29

3. ANTECEDENTES ESPECÍFICOS

3.1. Dendrobates truncatus (Cope, 1861)

Dendrobates truncatus es una especie endémica de Colombia; se distribuye desde los

10 hasta los 1100 m (Silverstone 1975, Páez et al. 2002). Habita en el Río

Magdalena desde el municipio de Neiva (Huila) hasta la costa Caribe (Acosta com.

pers); en las tierras bajas alrededor de los extremos de las cordilleras Central y

Occidental y al occidente del Golfo de Urabá (Figura 2).

Esta especie, miembro del grupo tinctorius, presenta en estado adulto una longitud

rostro-cloaca de 23.5-31 mm; se caracteriza por tener dorsalmente la piel ligeramente

granular excepto en la parte posterior del vientre y en la superficie ventral del muslo y

por el tubérculo tarsiano ausente o ligeramente desarrollado (Silverstone 1975).

En vivo el color del dorso es negro con líneas amarillas completas dorsolateralmente

e incompletas lateralmente; el vientre y los flancos son negros, con retículo grueso

azul pálido. El tímpano es redondo y con diámetro igual a un medio del diámetro del

ojo. El segundo, tercero y cuarto discos de los dedos manuales son más anchos en las

hembras que en machos (Silverstone 1975) (Figura 1).

A B

Figura 1.Color en vivo de Dendrobates truncatus, A) vista lateral. B) vista ventral.

30

Al igual que en las demás Dendrobates, las hormigas representan una alta proporción

de su dieta (Toft 1981; 1995; Donelly 1991, Daly 1998, Saporito et al. 2004).

Zambrano (2000) encontró en contenidos estomacales de D. truncatus, que las

hormigas constituyen la principal fuente alimenticia (94.6%), seguido de otro tipo de

artrópodos como avispas, ácaros, colémbolos y cucarrones. En el caso de las

hormigas se encontraron en total nueve géneros: las Myrmicinae Wasmannia,

Solenopsis, Strumigenys, Mycocepurus, Pheidole, Crematogaster, Cyphomyrmex,

Hylomyrma y la Ponerinae Gnamptogenys. Silverstone (1975) encontró en el

contenido estomacal de un solo individuo de D. truncatus una especie de la familia

Staphylinidae (Coleoptera), una especie de la familia Entomobryidae (Colembola), y

www.globalamphibian.org

Figura 2. Mapa de distribución de la especie Dendrobates truncatus.

31

siete especies de la familia Formicidae: Dorymyrmex cf. biconis, Mycocepurus

smithi, Wasmannia auropunctata, Zacryptocerus maculatus, Pheidole sp.,

Aphaenogaster sp., y una especie de Myrmicinae.

3.1.1. Alcaloides encontrados en Dendrobates truncatus

Se han identificado alcaloides tóxicos pertenecientes a las clases histrionicotoxinas,

decahidroquinolinas, indolizidinas y trazas de otros alcaloides en extractos de piel de

D. truncatus (Daly et al. 1987, Spande et al. 1999), estos son:

• Alcaloides mayores:

Histrionicotoxina 259

Histrionicotoxina 283A

Alodihistrionicotoxina 285C

Decahidroquinolinas 219A

• Alcaloides menores:

Histrionicotoxina 235A

Neodihistrionicotoxina 285B

Octahidrohistrionicotoxina 291A

Decahidroquinola 243A

• Alcaloides en trazas:

Indolizidina 223D

Decahidroquinola 223 (A, B, C)

Decahidroquinola 269AB

32

3.2. Especies de hormigas

3.2.1. Paratrechina steinheili (Forel 1893)

La especie P. steinheili es una hormiga pequeña que pertenece a la subfamilia

Formicinae, tribu Lasinni (Fernández 2003a). Su rango de distribución cubre el

neotrópico, desde el sur de Méjico hasta el sur de Brasil y varias islas del Caribe

(Longino 2004).

Las especies de este género se encuentran asociadas al suelo en lugares naturales y

áreas ecológicamente alteradas. Se diferencian de las demás formicinas por los pelos

gruesos y erectos de la cabeza y promesonoto, así como la típica dentición

(Fernández 2003a). P. steinheili se caracteriza por tener escapo con macrochaetae

conspicua, alargada, fuertemente diferenciada; de color generalmente café, con

trocánteres contrastantemente claros que se diferencia de las coxas medias y

posteriores, con pubescencia presente sobre el mesosoma y variablemente presente en

el primer tergito gastral (Longino 2004) (Figura 3).

Recientemente Saporito et al. (2004) detectaron los alcaloides PTX 307A y 323A en

extractos de poblaciones de P. steinheili en la Isla Bastimentos (Panamá).

Figura 3. Paratrechina steinheili, vista latera

33

3.3.2. Wasmannia auropunctata (Roger 1863)

Es una hormiga de la subfamilia Myrmicinae, tribu Blepharidattini (Fernández

2003b), nativa del Neotrópico, con una amplia distribución que va desde Florida

(EEUU) hasta Argentina y en varias islas del Caribe, siendo considerada como plaga

en tres diferentes aspectos: invasión de cultivos (cacao, café, cítricos y ornamentales),

infestación de viviendas humanas y competencia interespecífica con fauna local

(Ulloa-Chachón & Cherix 1990, Longino 2003). Esta especie de hormiga habita en

la hojarasca, cortezas de árboles y debajo de piedras (Ulloa-Chacón & Cherix 1990,

Fernández 2003b). Es abundante en bosques primarios y secundarios, húmedos o

secos, sin embargo también se puede encontrar en áreas perturbadas (Longino 2003).

W. auropunctata es de color café-dorado a café, alcanza a medir entre 1.2-1.5 mm.,

su mandíbula está bien desarrollada (Ulloa-Chacón & Cherix 1990).

Morfológicamente posee un prominente cuadrado lateral de perfil en el nodo peciolar

el cual es característico de la especie (Longino 2003), su cabeza es larga y más

amplia que el tórax, los pelos del cuerpo son largos, erguidos y dispersos (Figura 4).

Su picadura es dolorosa y sus mandíbulas secretan alkilpirazinas (alcaloide

lipofílico), compuestos utilizados como señal de alarma y en funciones defensivas

(Howard et al. 1982).

Figura 4. Wasmannia auropunctata, vista lateral.

34

3.3.3 Drosophila melanogaster Meigen, 1830

Es una especie de la familia Drosophillidae originaria de Africa Central pero ahora se

considera cosmopolita al presentarse en varios países de clima templado. La especie

se caracteriza por tener ojos rojos, una coloración del cuerpo amarillo-café, con

anillos transversales negros en su abdomen (Figura 5). Exhiben un dimorfismo

sexual: las hembras son más grandes que los machos, además estos últimos presentan

coloración negra al final del abdomen (Roberts & Standen 1998).

Se ha comprobado que esta especie dada a consumir a ranas Dendrobatibatidae en

cautiverio no es fuente ni precursor para la obtención de los alcaloides tóxicos (Daly

et al. 1992)

Figura 5. Drosophila melanogaster, vista lateral.

35

4. JUSTIFICACION

En varias especies de ranas neotropicales de la familia Dendrobatidae se ha

encontrado una gran variedad de alcaloides los cuales además de poseer

características químicas únicas, presentan acciones fisiológicas que han despertado

gran interés farmacológico. El hecho de que ranas mantenidas en cautiverio hayan

disminuido la concentración de estos alcaloides y en algunos casos se haya visto la

pérdida total de estos, hace pensar que la fuente de estos alcaloides se encuentra en el

medio en que viven y más específicamente en su dieta. Aunque se ha descubierto en

varios grupos de artrópodos alcaloides que también se presentan en las ranas, la

mayoría de estos solo se han hallado en dendrobatidos lo cual hace pensar que

aparentemente estas toxinas son exclusivos de estas ranas.

En el presente trabajo se buscó establecer si existe una relación entre el tipo de

alimento y la presencia de alcaloides en la especie de rana Dendrobates truncatus,

manteniendo grupos de ranas en cautiverio con diferentes tipos de dieta.

5. HIPOTESIS

Si existe una relación entre el consumo de alimento y la presencia de alcaloides en

ranas del género Dendrobates (Dendrobatidae), debe ser posible observar diferencias

en la presencia de alcaloides en grupos de D. truncatus sometidos a diferentes tipos

de alimentación.

36

6. OBJETIVOS

6.1. General

Examinar si la especie Dendrobates truncatus genera su toxicidad a partir de un

insecto no Formicidae o si por el contrario, una dieta a base de hormigas genera su

toxicidad.

6.2. Específicos

Observar la presencia de alcaloides en ranas criadas en cautiverio y alimentadas con

Drosophila melanogaster.

Observar la presencia de alcaloides en ranas criadas en cautiverio y alimentadas con

hormigas: Paratrechina steinheili y Wasmannia auropunctata

7. METODOLOGIA

La fase experimental de la presente investigación se desarrolló en colaboración con el

Zoológico de Cali y el Departamento de Biología de la Universidad del Valle. Para el

desarrollo de los ensayos se establecieron y mantuvieron colonias de individuos

juveniles de D. truncatus (Zoológico) y de las hormigas de P. steinheili y W.

auropunctata (Univalle). La temperatura promedio mínima fue de 20 °C y la máxima

de 30 °C, con un fotoperiodo normal de 12h luz día.

37

7.1. Cría y mantenimiento en cautiverio de ranas

Adultos, machos y hembras, de D. truncatus mantenidos en cautiverio donados por

Piscilago Zoo fueron transferidos al Zoológico de Cali en enero y julio de 2004. Las

ranas fueron mantenidas en terrarios con bromelias y sustrato de musgos, piedras y

cortezas de árbol. La alimentación estaba constituida por pequeños artrópodos,

colectados por jameo en el zoológico. En diciembre de 2004 se colectaron posturas en

los terrarios y en cajas de petri fueron incubadas en oscuridad a 19 C° dentro de una

cubierta plástica. Con la última eclosión, a los 30 días, los renacuajos fueron

colocados en cajas plásticas circulares transparentes de 7 x 4cm. con agua, y

alimentados con comida para peces (Tetramin, Compañía Tetra) hasta completar la

metamorfosis de los individuos (en promedio 49 días). Lo anterior se realizó

siguiendo los parámetros que maneja la Fundación Zoológico de Cali para el

mantenimiento en cautiverio de esta especie.

7.2. Colecta, establecimiento y mantenimiento de las colonias de hormigas

Las colonias de P. steinheili fueron colectadas el 21 de enero de 2005 en el

Departamento de Risaralda, Municipio de Apia, Vereda Valladolid, Finca La Playita.

1440m. mientras que las de W. auropunctata se colectaron el 2 de febrero de 2005 en

el Departamento del Cauca, Municipio de Santander de Quilichao, Hacienda San

Julián, 980m.

Cada una de ocho colonias de hormigas, cuatro de P. steinheili y cinco de W.

auropunctata, se colocó en una caja plástica de 24 x 24 x 10cm., con dos o tres

ranuras de 3 x 3cm. selladas con anjeo metálico (Figura 6). Cada caja era recubierta

internamente con teflón para facilitar la manipulación de las hormigas. Dentro de las

cajas se colocó un recipiente plástico redondo (nido) que tenía en la parte superior

yeso y en su parte central un algodón que se sumergía en agua en la parte inferior del

envase, manteniendo húmedo el yeso. Este envase era cubierto por un recipiente

38

negro con agujeros para la entrada de las hormigas. En el caso de W. auropunctata, se

introducían los pedazos de tronco donde se encontraban las colonias, ya que se ha

visto que de esta forma tienen una mayor adaptación en cautiverio.

A B

Figura 6. A) cajas de colonias de hormigas. B) vista interna de la caja.

Una vez por semana, las hormigas eran alimentadas con dieta artificial, propuesta por

Keller et al. (1989), suplementadas con agua y miel todos los días. Las colonias

permanecieron por una semana en el insectario de la Universidad del Valle antes de

ser llevadas a las instalaciones del Zoológico de Cali.

7.3 Bioensayos

Se realizaron ensayos para establecer las condiciones adecuadas para el buen

mantenimiento de las ranas en cautiverio y el desarrollo de los bioensayos. Para los

grupos alimentados con hormigas se emplearon cajas plásticas de 18 x 18 x 6cm., con

una ranura de 3 x 3cm. en la parte superior de la tapa, sellada con organza (Figura 7).

Para el grupo alimentado con mosca de la fruta (D. melanogaster) se utilizó una caja

plástica de 16 x 23 x 9cm., con una ranura de 10.5 x 19cm. en la parte superior de la

tapa, sellada con anjeo y organiza (Figura 8). A cada caja se le colocaron piedras,

cortezas de árbol, un envase plástico pequeño de 2 x 2 x 2cm con agua; y una caja de

petri de 7 x 1cm con agua para la caja de D. melanogaster. Como sustrato se utilizó

39

papel absorbente blanco humedecido, el cual era cambiado dos veces por semana.

Este tipo de sustrato fue considerado el más apropiado, ya que era más fácil detectar

si las ranas estaban consumiendo la dieta, además, de que conservaba la humedad del

ambiente dentro de las cajas.

A B

Figura 7. Cajas para los grupos de D. truncatus alimentados con hormigas. A)

vista lateral. B) vista interna.

A B

Figura 8. Cajas para los grupos de D. truncatus alimentados con moscas de la fruta.

A) vista lateral. B) vista interna.

40

Se establecieron tres grupos de D. truncatus, cada uno conformado por tres

individuos. El primer grupo (control) se alimentó con D. melanogaster cepa

silvestre, criadas en medio de banano con suplemento vitamínico (Minaviar,

Compañía Chalver-veterinaria). Este tipo de alimentación aparentemente no aporta a

la dieta ningún precursor de los alcaloides tóxicos (Daly et al. 1992). Las moscas

eran espolvoreadas con vitaminas antes de proporcionárselas a las ranas. El segundo

grupo de ranas se alimentó con P. steinheili y el tercero con W. auropunctata.

Estas dos especies de hormigas se escogieron porque se han encontrado en el hábitat

de la rana pero específicamente, y más específicamente para el caso de

W. auropunctata ya que se encontró en contenidos estomacales de D. truncatus

(Silverstone 1975). D. melanogaster, al no ser fuente ni precursor de alcaloides para

los dendrobátidos, este tipo de alimentación se tomo para el grupo control.

El tiempo de alimentación para todos los grupos se realizó hasta que todos los

individuos de D. truncatus completaran, como mínimo, un total de ocho semanas de

haber comenzado la dieta.

7.4. Extracción y análisis de las muestras

7.4.1. Insectos

Para los extractos de los artrópodos se utilizó la metodología de Dumbacher et al.

(2004): individuos de cada grupo de insectos fueron macerados en 1 ml. de etanol al

90% y seguido de un proceso de sonicación (Sonicador Cole-Parmer 8892) por 30

minutos a temperatura ambiente, tomando de cada muestra el sobrenadante sin

ningún residuo sólido.

41

7.4.2. Anfibios

En el caso de los individuos de D. truncatus se obtuvieron muestras de exudaciones y

de piel, en cada caso fueron manipuladas de la siguiente forma:

Para los exudados se utilizó la metodología implementada por Grant & Land (2002)

y Osorio (2003) llamada TAS (Transcutaneous Amphibian Stimulator) por sus

siglas en inglés, mediante el cual las ranas son estimuladas utilizando un dispositivo

de emisión de voltaje (protocolo desarrollado en el Laboratorio de Biofísica de la

Universidad del Valle, Santiago Castaño com. pers. abril 2005). Las ranas son

excitadas con microchoques eléctricos de 6 voltios, 1Hz de frecuencia y una duración

de pulso de 6,5 milisegundos, el cual induce por estrés a la exudación de las toxinas

que son colectadas con pequeños trozos de papel filtro (Whatman) los cuales se

colocaban en recipientes de polipropileno con 1 ml de etanol, para después ser

sonicadas (igual que la muestra anterior).

En la separación de alcaloides de las pieles se utilizó la metodología establecida por

Daly et al. (1987), con una variante en el método, ya que se utilizó etanol en lugar de

metanol para el macerado de las pieles (Daly com. pers.). Las muestras entre 50-

500mg fueron maceradas dos veces, en un volumen de etanol entre 5-10 ml., el

extracto fue diluido en igual volumen de agua y a esta mezcla acuosa se le agregó dos

veces el volumen de cloroformo, se agitó tomando la fase orgánica. A la muestra

resultante se le adicionó la mitad en volumen de HCl 0.1 N y se agitó, tomando

después el HCL se ajustó su pH a 9 con NH4OH 1 N. A esta solución se agregó la

mitad en volumen de cloroformo, se agitó y nuevamente se tomó la fase orgánica, la

cual fue secada. El residuo fue reconstituido en 1 ml de etanol.

42

8. Métodos analíticos

Para el análisis de la presencia-ausencia de alcaloides en las muestras se realizaron

dos pruebas analíticas:

8.1. Reactivo de Mayer:

Este es un reactivo que produce precipitados cuando hay presencia de alcaloides. El

color del precipitado que se forma al agregar este reactivo a una solución que tenga

alcaloides, es de color blanco. De acuerdo con la abundancia de los precipitados

formados, se tabulan los resultados con (+++), (++), (+) o (-), teniendo en cuenta que

cualquier turbidez que se aprecie claramente es considerad positiva. La muestra tiene

que estar acidificada para un mejor desarrollo de la prueba (Sanabria 1983).

Para este trabajo se extrajo de cada muestra una alícuota de 0.3 ml y se agregaron dos

gotas del reactivo de Mayer; las muestras se acidificaron previamente con HCL (0.5

N) para el manejo de la prueba. Como control se utilizó una muestra con alcaloide ya

conocido (voacangina).

8.2. Cromatografía de capa delgada (CCD):

“Es un método rápido y simple para la detección y aislamiento de alcaloides. Los

extractos de D. pumilio y D.histrionicus han servido como referencia estándar en los

análisis cromatográficos de los extractos de otras especies y poblaciones del género

Dendrobates.

La cantidad de un alcaloide en la placa cromatográfica es aproximadamente

proporcional al diámetro de la mancha y el ancho relativo de este, al paso de la

extensión relativa de la migración del alcaloide en el solvente. Cada mancha posee

una relación de flujo (Rf) la cual constituye una característica física constante para

cada compuesto (Daly et al. 1987)”.

43

El valor del Rf va entre 0 y 1, y se calcula así:

Rf Distancia desde el origen hasta el centro de la mancha

Distancia del solvente que ha recorrido desde el origen

En este trabajo se realizó una CCD, empleando como fase móvil metanol cloroformo

(grado cromatográfico) en relación 1:1 y como fase estacionaria silicagel (f254

Merck). Para esta cromatografía se utilizaron extractos de los individuos de D.

truncatus de cada grupo mantenido en cautiverio. Como controles se utilizaron

extractos de pieles de D. truncatus silvestres (control positivo) y Colostethus sp.

(control negativo), ya que las especies de este último género no posee alcaloides

lipofílicos. Esta prueba también se realizó para las muestras de insectos con el

objetivo de comprobar la presencia o no de alcaloides en estos.

Se tomaron alícuotas de las muestras con tubos capilares y se sirvió sobre la capa

cromatográfica a 0.5 cm del extremo inferior. Se dejaron secar las muestras y la placa

se introdujo en una cámara de vidrio previamente equilibrada con la mezcla de

solventes. La migración se dejó transcurrir hasta que los solventes llegaran hasta la

parte superior de la placa. Después de retirada la placa se dejó secar al medio

ambiente. A continuación, la placa fue revelada en presencia de calor (50 ºC) con

sulfato de cerio, reactivo específico para alcaloides (Merck 1980).

9. RESULTADOS

9.1. Consumo de las dietas

Durante el tiempo de experimentación se observó que la hormiga P. steinheili no fue

consumida por D. truncatus. En algunos casos individuos de esta especie de hormiga

era encontrados muertos en los terrarios presentando un estado de haber sido expelido

por la rana. Caso contrario se observó con la otra especie de hormiga W.

44

auropunctata y la mosca de la fruta D. melanogaster, las cuales sí fueron consumidas

por la rana. Lo anterior se demostró ya que se conocía el número de hormigas que se

colocaban en los terrarios todos los días.

9.2. Detección de alcaloides

9.2.1. Reactivo de Mayer:

Salvo para el control positivo, la cual poseía alcaloides ya establecidos, y de D.

truncatus silvestre, todas las demás muestras mostraron ser negativas para el Mayer,

cabe anotar que las únicas muestras a las cuales no se les realizó esta técnica fueron a

las de insectos, ya que durante el proceso de acidificación estas se alteraban. Los

resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Detección de alcaloides. Resultado de las muestras con el reactivo de

Mayer. C= control, muestra con alcaloides ya conocida; COL= Colostethus sp.;

DTS= D. truncatus silvestre; WRP= piel D. truncactus alimentada con W.

auropunctata; DRP= piel D. truncactus alimentada con D. melanogaster; WR=

extracto de D. truncatus alimentadas con W. auropunctata y DR= Extracto de D.

truncatus alimentadas con D. melanogaster. (+)=presencia de alcaloides, (-)=

ausencia de alcaloides.

MUESTRA CANTIDAD (ml) REACTIVO DE MAYER

C 0,3 (+++)

COL 0,3 (-)

DTS 0,3 (++)

WRP 0,3 (-)

DRP 0,3 (-)

WR 0,3 (-)

DR 0,3 (-)

45

Figura 9. Revelado de la cromatografía en capa delgada con reactivo de sulfato de

cerio. Las bandas oscuras muestran la presencia de alcaloides en las muestras con sus

Rf. COL= Colostethus sp. , DTS= D. truncatus silvestre, WRP= piel D. truncactus

alimentada con W. auropunctata, DRP= piel D. truncactus alimentada con D.

melanogaster, W= W. auropunctata, D= D. melanogaster, WR= Extracto de D.

truncatus alimentadas con W. auropunctata y DR= Extracto de D. truncatus

alimentadas con D. melanogaster.

COL DTS WRP DRP W D WR DR

Rf= 0.85

Rf= 0.17Rf= 0.07

Rf= 0.051

Rf= 0.20

Rf= 0.12Rf= 0.15

Rf= 0.74 Rf= 0.71

COL DTS WRP DRP W D WR DR

Rf= 0.85

Rf= 0.17Rf= 0.07

Rf= 0.051

Rf= 0.20

Rf= 0.12Rf= 0.15

Rf= 0.74 Rf= 0.71

46

9.2.2. Cromatografía en capa delgada

El revelado de la cromatografía en capa delgada con el reactivo para alcaloides,

sulfato de cerio, sólo mostró bandas de color café para D. truncatus silvestre, y las

dos muestras de insectos, W. auropunctata y D. melanogaster, mientras que las

demás muestras no presentaron banda alguna, indicando la ausencia de alcaloides

(Figura 9). La muestra de D. truncatus silvestre mostró tres bandas las cuales tenían

un Rf de 0,07, 0,17 y 0,85. En la de W. auropunctata se observaron cuatro bandas con

un Rf de 0,051, 0,12, 0,20 y 0,74 respectivamente, y en D. melanogaster se

observaron dos bandas con un Rf de 0,15 y 0,71.

10. DISCUSIÓN

Las ranas de la familia Dendrobatidae pertenecientes al género Dendrobates tienen la

capacidad de secretar alcaloides tóxicos gracias a glándulas granulares que poseen en

la piel (Daly 1998). Sin embargo, aunque estas ranas pueden retener estos alcaloides

en cautiverio por varios años, se ha visto que estas no los producen y todo apunta a

que las ranas secuestran y acumulan tales toxinas de una dieta de pequeños

artrópodos usando un sistema (fisiológico) de captura que todavía no se ha podido

identificar (Clark et al. 2005).

El presente trabajo pretendió examinar si existe una relación entre el consumo en

cautiverio de dos diferentes especies de hormigas y la presencia de alcaloides en la

rana D. truncatus, pero no se encontró evidencia de dicha relación, como se discute a

continuación.

10.1. Consumo de las dietas

Durante el experimento se observó el no consumo de P. steinheili al contrario del

consumo de D. melanogaster y W. auropunctata en cautiverio. Este comportamiento

en cautiverio puede estar mostrando que en la rana D. truncatus presenta una

selectividad en el consumo del recurso alimenticio, así sea el único recurso-presa que

47

se le presente a la rana en cautiverio. Aunque en varios trabajos se ha descubierto que

en la mayoría de los miembros de la familia Dendrobatidae -en especial los géneros

Dendrobates, Phyllobates y Epipedobates- su principal fuente de alimento los

constituyen altas proporciones de hormigas (Toft 1981, 1995, Donnelly 1991,

Caldwell 1995, Zambrano 2000, Osorio 2003), Toft (1995) menciona que las ranas

presentan características tanto morfológicas como fisiológicas que pueden estar

relacionadas con el tipo de alimentación que estas consumen. Una de las

características que menciona es la fisiología digestiva de la rana la cual puede

determinar el consumo o no de presas con alto contenido de quitina o que en algunos

casos esta pueda tener algún grado de toxicidad, dificultando así el consumo de la

presa. Esto puede estar explicando por qué P. steinheili no fue consumida por D.

truncatus debido a que esta no fue palatable para la rana y por lo tanto rechazada por

la rana, caso que también expone Zambrano (2000) sugiriendo que existe una

incapacidad diferente al tamaño para el consumo de presas por parte de D. truncatus,

como es la presencia de pelos largos y gruesos en especies de hormigas del género

Paratrechina y hormigas del género Atta y Acromyrmex. Demostrando con esto, que

aunque se sugiera que el género Dendrobates es un grupo hormiga-especialista (Toft

1981) hay una selección de presa dentro de esta especialización de recurso

alimenticio.

10.2. Relación de la dieta con la producción de toxinas

En D. truncatus, se ha demostrado la presencia de dos tipos de alcaloides mayores en

su piel, las histrionicotoxinas y pumiliotoxinas (Daly et al. 1987). El método de

cromatografía en capa delgada, el cual ha sido ampliamente utilizado para mirar la

presencia de alcaloides en la piel de los anfibios, confirmó efectivamente la presencia

de estos alcaloides en los individuos silvestres de D. truncatus, ya que en la muestra

se presentó una mancha con un Rf=0,85, coeficiente de relación de flujo designado

para la HTX 283A, alcaloide reportado para esta especie en estado silvestre, las otras

manchas en esta muestra mostraron unos Rf que pueden ser para los alcaloides que no

se conocen en la bibliografía sobre esta especie de rana. A diferencia del resultado

48

con las ranas silvestres, las muestras de los individuos de D. truncatus que fueron

criados y mantenidos en cautiverio con las dietas específicas no se observaron

manchas en la placa cromatográfica, demostrando la no presencia de alcaloides en sus

pieles (Figura 9). Cabe anotar que el resultado de las muestras de Colostethus sp. fue

lo que se esperaba al no presentar alcaloides, y de igual forma se observó la ausencia

del sistema de captura de alcaloides señalado por Daly et al. (1994b) ya que esta

especie fue colectada en el mismo lugar donde se colectaron los individuos silvestres

de D. truncatus la cual si presentó alcaloides. De igual forma, aunque de forma

colorimétrica, la prueba de Mayer también arrojó los mismos resultados para las

muestras de las ranas (Tabla 2).

Los datos datos que indican la ausencia de alcaloides, en el caso de las ranas

alimentadas con moscas de la fruta (D. melanogaster) estaría demostrando la

dependencia alimenticia por una alimentación específica que le suministraría los

alcaloides presentes en la especie D. truncatus en vida silvestre. Evidencia de esto

también se ha visto en varios dendrobátidos (Dendrobates, Epipedobates y

Phyllobates) y mantelidos (Mantella) mantenidos con un tipo de alimentación

diferente al silvestre han perdido su toxicidad (Daly et al. 2000b). D. auratus

mantenidos en cautiverio y alimentados con Drosophila sp. no presentaron alcaloides

en sus pieles (Daly et al. 1992, Daly et al. 1994a). De la misma manera no se les

detectó alcaloides a ranas M. aurantiaca (Mantellidae) después de haber sido

sometidas a una alimentación con D. melanogaster y grillos (Daly et al. 1997a).

Ya para el caso de los individuos que alimentados con W. auropunctata tampoco

presentaron alcaloides, aunque las muestras de hormigas al igual que la de las moscas

presentaron alcaloides (Figura 9). Se ha visto que no siempre todos los alcaloides que

presentan los individuos-presa son tomados por las ranas, ejemplo de ello lo

observaron Daly et al. (1994b) en el cual individuos de D. auratus solo capturaron el

alcaloide monomorina-I de una dieta en cautiverio con hormigas Monomorium

pharaonis, mientras otros dos alcaloides, de las clase de las indolizidinas y las

49

pirrolizidinas, que también se presentan en esta especie de hormiga no fueron

retenidos por la rana. Sin embargo, se ha podido comprobar que en algunas

poblaciones de especies de hormigas que poseen alcaloides lipofílicos no siempre

estos se presentan, así estas se encuentren dentro de localidades geográficas cercanas.

Saporito et al. (2004) demostraron en la isla Bastimentos (Panamá) que no todas

las poblaciones de la hormiga Brachymyrmex longicornis presentaban

pumiliotoxinas, sugiriendo que tanto una variación espacial y temporal estaría

afectando la presencia o no de los alcaloides. De la misma manera Daly et al. (2000b)

plantean que los artrópodos silvestres que se presentan en la estación seca (en el

Panamá-Pacífico) aparentemente le podrían estar suministrando algunos de los

muchos alcaloides a la rana D. auratus según algunos experimento de esta especie

tanto en campo como de laboratorio. Además las diferencias en cuanto a los niveles y

rangos de alcaloides encontrados en las pieles de varios dendrobátidos

presumiblemente reflejan muchos factores, tales como la disponibilidad y

adaptabilidad de alcaloides que puedan contener las presas item, selección de presa

por las especies de rana, y la selectividad y grado de expresión del sistema de captura

de alcaloides en cada especie de rana (Daly et al. 2000b).

En la naturaleza la búsqueda de los recursos alimenticios de los diversos alcaloides

lipofílicos detectados en los extractos de las pieles de las dendrobátidos, continúa

siendo uno de los mayores retos para los químicos-ecologistas (Daly 1998), y aunque

cada vez es más clara la evidencia de que el consumo de hormigas por estas ranas es

la principal fuente para la mayoría de estos alcaloides, la interacción de los

mecanismos genéticos y medioambientales (dieta) todavía no se comprende. Hasta el

momento se conoce que ocho de las más de 20 clases estructurales de alcaloides

lipofílicos encontrados en la piel de las ranas se presentan también en varias especies

de hormigas de los géneros Monomorium, Megalomyrmex, Solenopsis

(Diplorhoptrum), Tetramorium, Brachymyrmex (Myrmicinae); Anochetus

(Ponerinae); Paratrechina y Camponotus (Formicinae) (Jones et al. 1999, Daly et

al. 2000b, Saporito et al. 2004, Clark et al. 2005), sin embargo, la mayoría de las

50

especies de estos géneros son el recurso para alcaloides lipofílicos menores, y sólo

hasta el momento se han reportado dos especies de hormigas para alcaloides mayores

de la familia de las HTX (Saporito et al. 2004) las cuales son el recurso-fuente de

alcaloide para una especie de dendrobátido (D. auratus), mientras que la fuente de los

demás alcaloides mayores aun continua siendo un misterio.

Sin excluir el importante rol que pueda tener la interacción con organismos

simbióticos, dieta y factores ambientales que juegan un papel importante en la

producción de alcaloides (Daly et al. 1992), la presencia de tales alcaloides solo en

Amphibia, y que algunos de estos compuestos sólo sean específicos para unos

géneros, argumenta la idea de un control genético sobre las vías de biosíntesis de

alcaloides para explicar por qué diferentes especies de dendrobátidos que coexisten

en simpatría en las selvas tropicales posean diferentes clases y perfiles de alcaloides

(Daly et al. 1987), aun compartiendo ofertas de alimento similares en términos de

artrópodos..

Este trabajo realiza por primera vez un estudio ex situ con unas de las posibles fuentes

alimenticias que podría explicar la relación que puede existir en la dieta y la presencia

de alcaloides en la rana Dendrobates truncatus. Además de estas dos especies con

que se trabajó faltan por evaluar muchas de las especies de hormigas consideradas

como posibles precursores para la producción de alcaloides en esta rana, como

Solenopsis y Pheidole que son megadiversos. Sin embargo, los resultados del

presente estudio constituyen un paso muy importante para la comprensión del

fenómeno de producción de alcaloides, dado que, al no encontrarse producción de

alcaloides en ranas alimentadas con dieta monoespecífica, podrían plantearse

hipótesis alternas como la combinación de varias especies de hormigas en la dieta

(polifagia). El origen de la toxicidad en estas ranas también podría deberse a la

interacción de factores ambientales y genéticos. Por lo tanto, hacia el futuro se

plantea prioritario continuar con la cría artificial de la rana para realizar modelos

51

experimentales más complejos, por ejemplo de tipo factorial, que permitan dilucidar

la influencia o no de la dieta en la producción de alcaloides en D. truncatus.

11. CONSIDERACIONES FINALES Y CONCLUSIONES

Se estandarizaron las condiciones para el mantenimiento en cautiverio de la especie

de rana D. truncatus. Las condiciones ambientales en los terrarios temperatura

promedio mínima fue de 20 °C y la máxima de 30 °C, con un fotoperiodo normal de

12h luz día. Además se observó que la utilización de papel blanco absorbente como

sustrato de los terrarios puede ayudar a evaluar más fácilmente el consumo de

alimento por parte de la rana cuando las presas que se le ofrecen a estas son muy

pequeñas y difíciles de manipular.

De igual forma, también se estandarizaron el mantenimiento en cautiverio para las

especies de hormigas P. steinheili y W. auropunctata, las cuales se mantuvieron a la

misma temperatura y con el mismo fotoperiodo que las ranas. La dieta artificial

suministrada, la miel y el agua, fue bien recibida por parte de las dos especies.

Se observó que en condiciones de cautiverio D. truncatus presentó escogencia en el

tipo de alimentación, al presentar una selección positiva por la mosca de la fruta D.

melanogaster y la hormiga W. auropunctata, mientras que la selección fue negativa

para la otra especie de hormiga P. steinheili.

Los individuos en cautiverio de D. truncatus que fueron alimentados con D.

melanogaster y W. auropunctata no presentaron alcaloides en las muestras de piel ni

en las exudaciones. Este resultado sugiere la relación que existe entre la alimentación

y los alcaloides presentes en estas ranas ya que si esta función metabólica fuera

determinada únicamente por la constitución genética de la especie, entonces todas las

ranas, independientemente de la dieta, hubieran presentado alcaloides en sus pieles,

caso que no sucedió.

52

D. melanogaster y W. auropunctata presentaron alcaloides en sus extractos, los

cuales no se hallaron en las ranas alimentadas con estas dos especies, lo que sugiere

que debe existir un control genético del metabolismo para la toma de alcaloides

específico para cada especie de rana.

Ya que se observó que las ranas de Dendrobates truncatus nacidas y mantenidas en

cautiverio no generaron ningún alcaloide, sumándose que se tiene un protocolo

establecido de cría en cautiverio, y además, que no es una especie que se encuentra

en peligro de extinción, se presenta a D. truncatus como un buen modelo biológico

para desarrollar investigaciones en laboratorio encaminadas a conocer cual(es)

podrían ser las fuente(s) y la forma de captura de las histrionicotoxinas, las cual a hoy

en día no se conoce.

53

12. RECOMENDACIONES

1. Montar experimentos en cautiverio de alimentación con otro tipo de especies de

hormigas que han sido encontradas en los contenidos estomacales de D. truncatus,

para analizar como podrían estar afectando la toxicidad de la rana.

2. Tomar muestras de artrópodos en las zonas de hábitat de la rana y hacer estudios

por cromatografías de gases y espectrometría de masas, con el fin de identificar

alcaloides que puedan estar compartiendo con las ranas.

3. Ya que se ha documentado que las plantas poseen alcaloides, establecer en un

estudio de campo si existe una cadena biológica planta-artrópodo-vertebrado en la

captura de los alcaloides presentes en las ranas.

4. Implementar este tipo de estudios en cautiverio para evaluar la toxicidad y su

relación con la alimentación con otras especies de ranas venenosas de la familia

Dendrobatidae.

54

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