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Genética microbiana

Capítulo 7

BASES DE LA MICROBIOLOGÍA

SECCIÓN I

SECCIÓN I. BASES DE LA MICROBIOLOGÍA Capítulo 7. Genética microbiana

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Figura 7-1 Experimento de Griffiths que muestra la evidencia para un factor transformador, más tarde identificado como DNA. En una serie de

experimentos, se inyectó Streptococcus pneumoniae a ratones vivos o muertos, encapsulados o no encapsulados, como se indica en los

experimentos marcados con las letras A a D.


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Figura 7-1 (Continuación) El experimento fundamental está marcado con la letra D, en el que se demuestra que las bacterias encapsuladas muertas proporcionan un factor que permite que las bacterias no encapsuladas maten al ratón. Además de proporcionar un sustento fundamental para la importancia de la cápsula en la virulencia de los neumococos, el experimento D también ilustra el principio de que el DNA es la base fundamental para la transformación genética. (Reproducida con autorización de McClane

& Mietzner, Microbial Pathogenesis: A Principles-Oriented Approach. Fence Creek Publishing, 1999.)


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Figura 7-2 Esquema de Watson y Crick de la estructura de DNA, mostrando el esqueleto

helicoidal formado por azúcaresfosfato, bicatenario, que permanecen unidos por enlaces

de hidrógeno entre las bases. (Redibujada con autorización de Snyder L, Champness W:

Molecular Genetics of Bacteria, Washington, DC: ASM Press, 2nd ed. 2002.)


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Figura 7-3 Pares de bases normales en el DNA. Arriba: par de adenina-timina

(A-T); abajo: par de guanina-citocina (G-C). Los enlaces de hidrógeno se indican por medio de líneas punteadas. Nótese

que los pares G-C comparten tres grupos de enlaces de hidrógeno, en

tanto que el par A-T sólo contiene dos. En consecuencia, las interacciones

G-C son más fuertes que las interacciones A-T (dR, desoxirribosa de

la estructura básica de azúcar-fosfato del DNA).


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Figura 7-4 Composición de un ribosoma que contiene una copia de las

fracciones 16S, 23S y 5S de RNA, así como varias proteínas. Las proteínas más grandes de la subunidad 50S se

denominan L1 a L3. Las proteínas que son más pequeñas que la subunidad

30S se designan como S1 a S21. (Redibujada con autorización de Snyder L, Champness W: Molecular Genetics of

Bacteria, Washington, DC: ASM Press, 2nd ed. 2002.)


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Figura 7-5 Ilustraciones del fago T2 con o sin ácido nucleico. Obsérvese que cuando el fago se encuentra cargado con ácido nucleico adquiere una forma diferente que cuando carece del mismo. Este diagrama se dibujó con base en observaciones realizadas en una

micrografía electrónica.


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Figura 7-6 Mecanismos de transferencia de DNA durante la conjugación. La célula donadora

produce una pilosidad, que es codificada por plásmidos y se pone en contacto con una célula

receptora potencial que no contiene el plásmido. La retracción de la privacidad acerca a las células y se forma un poro en las membranas

celulares adyacentes. Formación de señales de apareamiento que indican que el plásmido inicia la transferencia de un fragmento monocatenario

en oriT. El fragmento está constituido por un plásmido codificado con funciones tra. El

extremo 5′ de una cadena del plásmido se transfiere al receptor a través del poro. Durante

la transferencia, el plásmido se replica del donador e inicia la síntesis de DNA a partir del

extremo 3′ del fragmento oriT. La replicación de una cadena en el receptor continúa por

diferentes mecanismos conservadores de RNA. Ambas células contienen ahora plásmidos

bicatenarios y las células se separan. (Redibujada con autorización de Snyder L, Champness W:

Molecular Genetics of Bacteria, Washington, DC: ASM Press, 2nd ed. 2002.)


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Figura 7-7 Mecanismos de movilización de plásmidos. La célula donadora porta dos

plásmidos, un plásmido autotransmisible F que codifica las funciones tra que

promueven el contacto celular y la transferencia de plásmidos y un plásmido

susceptible de movilización. Las funciones mob codificadas por un plásmido

susceptible de movilización crean una muesca monocatenaria en oriT en la

región mob. Entonces ocurre la transferencia y replicación del plásmido

susceptible de movilización. También puede transferirse el plásmido

autotransmisible. (Redibujada con autorización de Snyder L, Champness W:

Molecular Genetics of Bacteria, Washington, DC: ASM Press, 2nd ed.

2002.)


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Figura 7-8 A: Las células macho y hembra se unen por medio de una pilosidad F (pilosidad

sexual). B: Parejas las células de E. coli. Hay elongación de las células Hfr.


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Figura 7-8 C: Micrografía electrónica de un corte delgado de una pareja de células. Las

paredes celulares se encuentran en contacto íntimo con un área en la que se ha formado un “puente”. (Fotografía [A]: por cortesía de

Carnahan J y Brinton C. Fotografías B y C reproducidas con autorización de Gross JD y

Caro LG: DNA transfer in bacterial conjugation. J Mol Biol 1966;16:269.)


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Figura 7-9 Transferencia de DNA cromosómico por un plásmido integrado.

Formación de parejas de células, formación de una muesca en la secuencia F de oriT y

transferencia del extremo 5′ de DNA monocatenario F continuando como una

transferencia de plásmido F. Transferencia de DNA cromosómico con enlace covalente en

tanto permanezca estable la pareja de células. Rara vez ocurre la transferencia de

cromosomas completos de forma que la célula receptora permanece como F- incluso después de la recombinación. La replicación

en el donador por lo común acompaña la transferencia de DNA. También puede ocurrir cierta replicación de la cadena

transferida. Una vez en la célula receptora, el DNA transferido puede sufrir la combinación con secuencias homólogas en el cromosoma

receptor. (Redibujada con autorización de Snyder L, Champness W: Molecular Genetics of Bacteria, Washington, DC: ASM Press, 2nd

ed. 2002.)


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Figura 7-10 (Continúa)


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Figura 7-10 (Continuación) Cuatro etapas para la elongación de una cadena polipeptídica en la superficie de un ribosoma 70S. Arriba a la izquierda: una

molécula de tRNA que porta el anticodón complementario para el codón 1 en un extremo y AA1 en el otro extremo se une al sitio A. AA1 se une a tRNA a través de su grupo carboxilo; su hidrógeno del grupo amino porta un grupo formilo (F). Arriba la

derecha: una molécula de tRNA porta AA2 que se une al sitio B; su anticodón es complementario con el codón 2. Abajo a la derecha: un complejo enzimático cataliza

la transferencia de AA1 al grupo amino de AA2, formando un enlace peptídico (obsérvese que la transferencia en dirección opuesta está bloqueada por la

formilación previa del grupo amino de AA1). Arriba a la izquierda: los ribosomas se desplazan a la derecha de forma tal que los sitios A y B se encuentran en codones

opuestos 2 y 3; en el proceso, el tRNA se desplaza y se mueve al sitio A. El sitio B se encuentra nuevamente vacante y está listo para aceptar RNA3, portando AA3

(cuando el polipéptidos se completa y se libera, el grupo formilo se elimina por medios enzimáticos). (Redibujada con autorización de Stanier RY, Doudoroff M,

Adelberg EA: The Microbial World, 3rd ed. Copyright © 1970. Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, NJ.)


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Figura 7-11 (Continúa)


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Figura 7-11 Predicciones del modelo de atenuación. Etapa 1. El acoplamiento de transcripción/traducción tiene lugar como para cualquier gen bacteriano. Etapa 2. La polimerasa de RNA hace pausa y se forma un asa 1:2. Etapa 3. Los ribosomas interrumpen en el asa 1:2 y se encuentran con dos codones trp. Etapa 4. Si hay suficiente triptófano presente los RNA cargados con trp se encuentran presentes y los ribosomas realizarán la traducción de trpL. Esto causa que la polimerasa de RNA se interrumpa en el determinador independiente Rho compuesto por un asa 3:4. Paso 4 alternativo. Si hay limitación del triptófano (sin trpt-RNA), los ribosomas se detienen en los dos codones trp, en tanto que la polimerasa de RNA continúa. Se forma el asa 2:3. Paso 5 alternativo. El determinador 3:4 no puede formarse y la polimerasa de RNA continúa la transcripción en genes estructurales trp. Esto expone el sitio de unión del ribosoma (RBS) antes de trpE, lo que permite la traducción. (Reproducida con autorización de Trun N, Trempy J: Fundamental Bacterial Genetics. Blackwell Science Ltd, 2004.)


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Figura 7-12 A: separación de los fragmentos de DNA con

base en el tamaño por electroforesis en HELLP. Los

fragmentos pequeños migran con mayor rapidez que los

fragmentos grandes y en un intervalo determinado por las

propiedades del gen, la distancia de migración

proporciona en términos generales el logaritmo del

tamaño del fragmento. Los fragmentos de DNA pueden

visualizarse con base en su florescencia después de la

tinción con colorante.


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Figura 7-12 B: el tamaño de los fragmentos de restricción depende de su ubicación en los sitios de restricción en el DNA. En este ejemplo, un fragmento de 4.0 pares de

kilobases (kbp) formado por enzimas de restricción EcoR1 (E) contiene los sitios respectivos para las enzimas de restricción HindIII (H) y SalI (S) en las posiciones correspondientes a 1.0 y 3.5 kbp. El patrón de electroforesis en A revela que la enzima de restricción E no corta el fragmento de 4.0 kbp (primer trayecto); el

desdoblamiento con enzima de restricción H produce fragmentos de 3.0 y 1.0 kbp (segundo trayecto); el desdoblamiento con enzima de restricción S da origen a

fragmentos de 3.5 y 0.5 kbp (tercer trayecto) en tanto que el desdoblamiento de los fragmentos H y S forma fragmentos de 2.5, 1.0 y 0.5 kbp (cuarto trayecto). Los

fragmentos de 0.5 kbp se encuentran entre los sitios S y E, que se eligieron como sonda para determinar el DNA con secuencias de hibridación, como se muestra en C.


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Figura 7-12 C: Identificación de fragmentos de

hibridación. Los fragmentos de restricción se separaron

como se observa en A. El procedimiento de

hibridación revela los fragmentos que se

sometieron a hibridación con una sonda de 0.5 kbp.

Éstos son fragmentos de 4.0 kbp formados por enzimas

de restricción E, el fragmento de 3.0 kbp que se encuentra entre los sitios E y H y el fragmento de 0.5 kbp que se encuentra entre los

sitios S y H.


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Figura 7-13 Formación de un plásmido recombinante o quimérico a partir de

DNA detonador y un vector del receptor. El vector es un plásmido que porta el

sitio de restricción EcoR1, que sufre desdoblamiento por enzimas y se prepara para ligadura mediante la eliminación de los grupos fosfato

terminales. Este paso evita que los extremos adhesivos del plásmido se

unan en ausencia de material insertado. El DNA donador se trata con las mismas

enzimas de restricción y un enlace covalente cierra la molécula mediante

una ligadura. Un marcador de resistencia farmacológica, mostrado como ampR en

el plásmido, puede utilizarse para seleccionar los plásmidos recombinantes

después de su transformación en Escherichia coli. Las enzimas de la

bacteria hospedadora completan el enlace covalente del DNA circular y

median su replicación.


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Figura 7-14 Uso de sondas para identificar clonas que contienen fragmentos específicos de DNA. Las colonias pueden transferirse a un filtro y calentarse de forma tal que las células se destruyan y

el DNA se adhiera al filtro. Más tarde, el filtro puede ser tratado con una solución que contenga una sonda de DNA marcada en forma apropiada, lo que produce hibridación específica con las

clonas deseadas. La autorradiografía subsiguiente del filtro identifica estas clonas (círculos oscuros). Las clonas también pueden ser expuestas a sondas con anticuerpos para saber si

sintetizan un producto proteínico específico.


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Figura 7-15 Determinación de la secuencia de DNA por el método de Sanger (terminación didesoxi). La elongación enzimática del DNA se interrumpe por la inclusión de análogos didesoxi

de trinucleótidos correspondientes con A, C, G y T por separado en mezclas de reacciones paralelas. El grupo resultante de cadenas elongas interrumpidas se separa por secuenciación en

gel y puede deducirse la secuencia al notar la base que corresponde a cada incremento en la longitud de la cadena. La secuenciación en gel se lee de abajo hacia arriba, y cada línea

corresponde con un incremento en una base.


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Figura 7-16 Mutagénesis dirigida al sitio. Un cebador sintetizado por medios químicos que contiene la mutación G (en el recuadro) se hibridiza con una secuencia silvestre insertada en el DNA a partir

de un fago monocatenario. Se utilizan reacciones de polimerización para formar heterodúplex bicatenario que porta la mutación en una cadena. La introducción del heterodúplex en la bacteria

hospedadora seguida de segregación produce cepas que portan la forma de replicación con el DNA silvestre insertado o un fragmento insertado que adquiere la mutación química diseñada.

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