Pruebas de Infectividad y Pruebas de Infectividad y Diagnóstico SerológicoDiagnóstico Serológico

DocenteDocente::

Universidad Nacional Universidad Nacional “Pedro Ruiz Gallo”“Pedro Ruiz Gallo”

Virología

Dr. Graciela Albino Dr. Graciela Albino CornejoCornejo

Lambayeque – Marzo 2007

PRUEBAS DE INFECTIVIDAD PRUEBAS DE INFECTIVIDAD EN VIRUS Y DIAGNÓSTICO EN VIRUS Y DIAGNÓSTICO

SEROLÓGICOSEROLÓGICO

Por : Rómulo Aycachi IngaPor : Rómulo Aycachi Inga Lisbeth Arias MattosLisbeth Arias Mattos

Alex Chafloque MillonesAlex Chafloque Millones Liliana Culqui LozadaLiliana Culqui Lozada

Pruebas de Pruebas de InfectividadInfectividad

Inoculación de animales Inoculación de animales susceptiblessusceptibles

• Usada en estudios de Usada en estudios de infectividad, ya que infectividad, ya que algunos virus no provocan algunos virus no provocan efectos reconocibles en efectos reconocibles en cultivos celulares pero cultivos celulares pero originan la muerte en originan la muerte en animales.animales.

• Otros usos: comprobación Otros usos: comprobación de inocuidad y poder de inocuidad y poder protector de vacunas protector de vacunas (poliomielitis), elaboración (poliomielitis), elaboración de éstas (rabia, viruela), de éstas (rabia, viruela), efecto neutralizante de efecto neutralizante de sueros inmunes y de sueros inmunes y de pacientes (con fines pacientes (con fines comerciales y comerciales y diagnósticos).diagnósticos).

• Oncogénesis viral, la Oncogénesis viral, la patogenia de los patogenia de los padecimientos virales, la padecimientos virales, la respuesta inmune a los respuesta inmune a los virus y el efecto de los virus y el efecto de los factores ambientales factores ambientales sobre las infecciones sobre las infecciones virales, así como el virales, así como el aislamiento primario de aislamiento primario de ciertos agentes.ciertos agentes.

• Vías de inoculación: Vías de inoculación: Intravenosa, Intravenosa, Intracerebral, Intracerebral, Intraperitoneal, Intraperitoneal, Intranasal, Intratraqueal, Intranasal, Intratraqueal, IntradermicaIntradermica

• Animales más usados:Animales más usados:

Procedimiento general para Procedimiento general para una prueba de infectividad: una prueba de infectividad:

• Realizar dilución seriada de la muestra desconocida Realizar dilución seriada de la muestra desconocida (diluciones decimales sucesivas ).(diluciones decimales sucesivas ).

• Inyectar muestras de cada dilución a un cierto Inyectar muestras de cada dilución a un cierto número de animales sensibles.número de animales sensibles.

• Tras un periodo de incubación adecuado, se Tras un periodo de incubación adecuado, se cuentan los animales vivos y muertos inyectados cuentan los animales vivos y muertos inyectados con cada una de las diluciones de la serie.con cada una de las diluciones de la serie.

• Se suele considerar como valor de referencia la Se suele considerar como valor de referencia la dilucion a la cual la mitad de los animales mueren.dilucion a la cual la mitad de los animales mueren.

• DesventajasDesventajas: son prolijos y menos exactos que los : son prolijos y menos exactos que los basados en cultivos celulares (solo resultan basados en cultivos celulares (solo resultan esenciales en el estudio de algunos tipos de virus esenciales en el estudio de algunos tipos de virus como estudios epidemiológicos de enterovirus y el como estudios epidemiológicos de enterovirus y el diagnóstico de arbovirus. diagnóstico de arbovirus.

Inoculación de huevos Inoculación de huevos embrionadosembrionados

• El cultivo de virus gripal El cultivo de virus gripal en huevo embrionado fue en huevo embrionado fue empleado por primera empleado por primera vez por Burnet en 1935.vez por Burnet en 1935.

• Ha sido posible cultivar Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos virus de diversos grupos en varias cavidades del en varias cavidades del huevo fecundado, o en el huevo fecundado, o en el propio embrión en propio embrión en desarrollo.desarrollo.

• También se emplearon También se emplearon huevos de pato y de huevos de pato y de ganso (un periodo de ganso (un periodo de incubación mas incubación mas prolongado) prolongado)

• Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por consiguiente, se deben partes del embrión; por consiguiente, se deben inyectar en la region apropiada, P. ej. los mixovirus inyectar en la region apropiada, P. ej. los mixovirus crecen bien en la membrana corioalantoidea, en crecen bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La infección puede producir una lesion alantoidea. La infección puede producir una lesion tisular local conocida como pústula, cuyo aspecto, a tisular local conocida como pústula, cuyo aspecto, a menudo, caracteristico del virus.menudo, caracteristico del virus.

• El crecimiento de un virus en un embrión de pollo El crecimiento de un virus en un embrión de pollo puede provocar la muerte del embrio (p.ej. virus de puede provocar la muerte del embrio (p.ej. virus de la encefalitis), producir pústulas o placas sobre la la encefalitis), producir pústulas o placas sobre la membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar hemaglutininas en los líquidos o vacuna), desarrollar hemaglutininas en los líquidos o tejidos embrionarios (influenza) o desarrollar virus tejidos embrionarios (influenza) o desarrollar virus infectante (poliovirus tipo 2).infectante (poliovirus tipo 2).

• En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por la técnica de inoculación de pueden cuantificar por la técnica de inoculación de huevos embrionados al correlacionar el número de huevos embrionados al correlacionar el número de pústulas contadas con la dilucion viral inoculada.pústulas contadas con la dilucion viral inoculada.

Procedimiento:Procedimiento:• Desinfectar la superficie Desinfectar la superficie

de la cáscara con yodo.de la cáscara con yodo.• Perforar con un pequeño Perforar con un pequeño

taladro estéril.taladro estéril.• El agujero se sella con El agujero se sella con

gelatina y se incuba el gelatina y se incuba el huevo.huevo.

• El método exacto de El método exacto de inoculación y la edad del inoculación y la edad del embrión que se emplea, embrión que se emplea, dependen del virus dependen del virus problema. problema.

• virus de la influenza a virus de la influenza a partir de material partir de material recogido de la garganta, recogido de la garganta, suele inocularse en la suele inocularse en la cavidad amniótica de cavidad amniótica de embriones de 7 a 8 días. embriones de 7 a 8 días.

• A parte de las cavidades A parte de las cavidades amniótica y alantoidea, se amniótica y alantoidea, se suele usar la membrana suele usar la membrana corioalantoidea y el saco corioalantoidea y el saco vitelino. vitelino.

• Algunas veces, puede Algunas veces, puede inyectarse directamente el inyectarse directamente el virus en el embrión en virus en el embrión en desarrollo, recurriendo a la desarrollo, recurriendo a la inculacion intravenosa, inculacion intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. intraperitoneal o intracerebral.

Inoculacion y Aislamiento Inoculacion y Aislamiento en Cultivos Celularesen Cultivos Celulares

• En 1907 el biólogo En 1907 el biólogo estadounidense Ross Granville estadounidense Ross Granville Harrison descubre que los Harrison descubre que los tejidos vivos pueden tejidos vivos pueden cultivarse, es decir, pueden cultivarse, es decir, pueden crecer fuera de su órgano crecer fuera de su órgano original.original.

• En 1949 el microbiólogo En 1949 el microbiólogo estadounidense John F. Enders estadounidense John F. Enders anuncia su descubrimiento de anuncia su descubrimiento de una técnica que permite el una técnica que permite el cultivo de virus en cortes de cultivo de virus en cortes de tejidos en lugar de en órganos tejidos en lugar de en órganos o en organismos completos. o en organismos completos.

• Desde 1950, el sistema más Desde 1950, el sistema más empleado para el aislamiento empleado para el aislamiento y propagación de la mayoría y propagación de la mayoría de los virus. de los virus.

• Tipo de biosustrato Tipo de biosustrato empleados para la empleados para la propagación de virus. propagación de virus.

• Consisten en un sistema Consisten en un sistema formado por células formado por células provenientes de un órgano o provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de mantenidas en medios de cultivo de composición cultivo de composición química definida y en química definida y en condiciones de temperatura, condiciones de temperatura, pH, aireación y humedad pH, aireación y humedad controladas. controladas.

• Los más usados son los Los más usados son los cultivos en monocapa (capa cultivos en monocapa (capa de células que crecen de células que crecen adheridas a la superficie del adheridas a la superficie del recipiente que las contiene ). recipiente que las contiene ).

• Otros sistemas (cultivos Otros sistemas (cultivos en suspensión, en suspensión, explantos, cultivos de explantos, cultivos de órganos, cultivos en órganos, cultivos en microcarriers.microcarriers.

• No existe un cultivo No existe un cultivo celular susceptible a celular susceptible a todos los virus, de modo todos los virus, de modo que un laboratorio de que un laboratorio de diagnóstico viral debe diagnóstico viral debe disponer de distintos disponer de distintos cultivos celulares.cultivos celulares.

• El virus herpes simplex El virus herpes simplex crece bien crece bien in vitro in vitro en en cultivos primarios, cepas cultivos primarios, cepas y líneas celulares (MRC-y líneas celulares (MRC-5, RK, HEp-2, HeLa, Vero 5, RK, HEp-2, HeLa, Vero u otras). u otras).

• El citomegalovirus El citomegalovirus (CMV) sólo crece en (CMV) sólo crece en cultivos primarios de cultivos primarios de pulmón fetal humano o pulmón fetal humano o bien en algunas cepas bien en algunas cepas celulares derivadas del celulares derivadas del mismo órgano y especie mismo órgano y especie (MRC-5) (MRC-5)

• Línea celular como HEp-Línea celular como HEp-2 no permite el 2 no permite el crecimiento de CMV, crecimiento de CMV, rotavirus, influenza, rotavirus, influenza, pero sí adenovirus, VRS, pero sí adenovirus, VRS, parainfluenza, herpes parainfluenza, herpes simples, poliovirus y simples, poliovirus y otros.otros.

Sistemas más utilizados:Sistemas más utilizados:• Cultivos primariosCultivos primarios: varios tipos de células. La mayoría : varios tipos de células. La mayoría

crecimiento limitado in vitro, (generalmente 5 a 10 crecimiento limitado in vitro, (generalmente 5 a 10 subcultivos). Son permisivas a un amplio rango de virus; subcultivos). Son permisivas a un amplio rango de virus; p. e., células de riñón embrionario humano (REH).p. e., células de riñón embrionario humano (REH).

• Cepas de células diploidesCepas de células diploides: Derivadas de tejidos : Derivadas de tejidos normales. En producción de vacunas, aislamiento viral y normales. En producción de vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar materiales tóxicos. como sustratos para probar materiales tóxicos. Constituidas por un tipo de células que retienen su Constituidas por un tipo de células que retienen su número cromosómico diploide original (fibroblastos de número cromosómico diploide original (fibroblastos de pulmón).pulmón).

• Líneas celularesLíneas celulares: Son células inmortalizadas en el : Son células inmortalizadas en el laboratorio, resisten (n) número de pases. Se laboratorio, resisten (n) número de pases. Se caracterizan por derivarse de tejidos normales o de caracterizan por derivarse de tejidos normales o de tumores malignos y se han pasado por los menos 70 tumores malignos y se han pasado por los menos 70 veces in vitro. veces in vitro.

• Células Vero (riñón de Células Vero (riñón de mono verde africano)mono verde africano)

• LLC-MK2 (riñón mono LLC-MK2 (riñón mono rhesus) rhesus)

• BSC-1 (también de BSC-1 (también de tejido normal de riñón tejido normal de riñón de mono) de mono)

• HeLa y HEp-2 derivadas HeLa y HEp-2 derivadas de células humanas de células humanas malignas (éstas malignas (éstas generalmente tienen un generalmente tienen un número variable de número variable de cromosomas y a veces cromosomas y a veces también son también son denominadas líneas denominadas líneas celulares heteroploides). celulares heteroploides).

• A9 (fibroblastos A9 (fibroblastos subcutáneos de ratón) subcutáneos de ratón)

• BHK21 (fibroblastos de BHK21 (fibroblastos de hámster)hámster)

• BRL3A (epitelio de BRL3A (epitelio de hígado de rata) hígado de rata)

• GHI, GH3 (epitelio de GHI, GH3 (epitelio de rata)rata)

• L929, LS, S180 L929, LS, S180 (fibroblastos de ratón) (fibroblastos de ratón)

• L1210, L5178Y, P388D1 L1210, L5178Y, P388D1 (linfocitos de ratón)(linfocitos de ratón)

• MCF7 (epitelio humano)MCF7 (epitelio humano)• 3T3-L1 (fibroblastos de 3T3-L1 (fibroblastos de

ratón suizo) ratón suizo) • 3T3-A31 (fibroblastos 3T3-A31 (fibroblastos

de ratón BALB/c) de ratón BALB/c) • NRK49F (fibroblastos de NRK49F (fibroblastos de

riñón de rata). riñón de rata).

• Líneas celulares más usadas: células Hep-2, Líneas celulares más usadas: células Hep-2, HeLa y VeroHeLa y Vero

• Células diploides más utilizadas: líneas de Células diploides más utilizadas: líneas de fibroblastos de pulmón (MRC5) para el fibroblastos de pulmón (MRC5) para el aislamiento de citomegalovirus (CMV). aislamiento de citomegalovirus (CMV).

• Cultivo primario más utilizado: riñón Cultivo primario más utilizado: riñón humano embrionario (RHE) permisible a los humano embrionario (RHE) permisible a los virus de circulación frecuente como el virus de circulación frecuente como el herpes (HSV), adenovirus (ADV), herpes (HSV), adenovirus (ADV), enterovirus, virus sincicial respiratorio (RSV)enterovirus, virus sincicial respiratorio (RSV)

• Elección por una u otra línea celular Elección por una u otra línea celular dependerá del virus que se quiera dependerá del virus que se quiera evidenciar.evidenciar.

Fibroblasto de ratón Fibroblasto de ratón (3T3-L1)(3T3-L1)

Hepatocitos de Hepatocitos de monomono

Hepatocitos Hepatocitos humanoshumanos

HepG2 HepG2 (hepatoma)(hepatoma)

M6 M6 (carcinoma (carcinoma de colon)de colon)

Monocapa obtenida a Monocapa obtenida a partir de explante de partir de explante de

córnea bovinacórnea bovina

Efecto Citopático (ECP) Efecto Citopático (ECP) • Cambios degenerativos Cambios degenerativos

específicos observados específicos observados en una línea celular en una línea celular como consecuencia de como consecuencia de la replicación de un la replicación de un virus infectante.virus infectante.

• Puede aparecer Puede aparecer después de 3 ó 4 días.después de 3 ó 4 días.

• A través de éstos A través de éstos cambios morfológicos cambios morfológicos celulares es posible celulares es posible poner en evidencia la poner en evidencia la presencia de un virus presencia de un virus en determinado tipo de en determinado tipo de cultivo de células . cultivo de células .

• Formación de sincicios Formación de sincicios • Formación de vesículasFormación de vesículas• Formación de inclusionesFormación de inclusiones• Redondeamiento y Redondeamiento y

desprendimiento de la desprendimiento de la monocapa celularmonocapa celular

• Virus Respiratorio Virus Respiratorio SincicialSincicial: formación de : formación de sincicios o células sincicios o células gigantes en Hep-2 gigantes en Hep-2

• AdenovirusAdenovirus: células : células redondeadas en Hep-2 redondeadas en Hep-2 con formación de racimos con formación de racimos dejando áreas sin células dejando áreas sin células

Esquemas de algunas lesiones Esquemas de algunas lesiones citopáticas características citopáticas características

• Herpes simple. Inclusión eosinofílica intranuclear que desplaza la Herpes simple. Inclusión eosinofílica intranuclear que desplaza la cromatina hacia la membrana nuclear, que adquiere un aspecto de cromatina hacia la membrana nuclear, que adquiere un aspecto de “collar de perlas”.“collar de perlas”.

• Citomegalovirus. Inclusión eosinofílica intranuclear rodeada por un Citomegalovirus. Inclusión eosinofílica intranuclear rodeada por un halo claro que la separa de la membrana nuclear.halo claro que la separa de la membrana nuclear.

• Adenovirus. Inclusión intranuclear basófila. Núcleo suele presentar Adenovirus. Inclusión intranuclear basófila. Núcleo suele presentar una forma de flor con una inclusión central separada casi una forma de flor con una inclusión central separada casi completamente de la membrana nuclear retraída por un halo claro.completamente de la membrana nuclear retraída por un halo claro.

• Enterovirus. Inclusión eosinofílica citoplásmica que desplaza al Enterovirus. Inclusión eosinofílica citoplásmica que desplaza al núcleo que se condensa. La célula aparece retraída y el citoplasma núcleo que se condensa. La célula aparece retraída y el citoplasma se vuelve más acidófilo. se vuelve más acidófilo.

Células con efecto Células con efecto citopatico celular citopatico celular en forma de en forma de sincitios, por virus sincitios, por virus de Newcastle de Newcastle

Células con efecto citopático Células con efecto citopático celular, las células se celular, las células se observan con aumento de observan con aumento de tamaño y forma redonda, por tamaño y forma redonda, por virus de influenza aviar virus de influenza aviar

Células Vero E6 inoculadas Células Vero E6 inoculadas con muestras de orofringe con muestras de orofringe de pacientes con SRAS. de pacientes con SRAS. Efecto citopático temprano Efecto citopático temprano del Coronavirusdel Coronavirus

Efecto citopatico del virus de Efecto citopatico del virus de la diarrea viral bovina en la diarrea viral bovina en cultivo primario de testiculo cultivo primario de testiculo bovinobovino

Cuerpos de InclusiónCuerpos de Inclusión• Estructuras anómalas Estructuras anómalas

dentro del citoplasma o dentro del citoplasma o núcleo de las células núcleo de las células parasitadas, demostrables parasitadas, demostrables por tinción según métodos por tinción según métodos de Mann, Sellers o de Mann, Sellers o Giemsa.Giemsa.

• Estas estructuras, Estas estructuras, muestran afinidad por muestran afinidad por colorantes ácidos (eosina colorantes ácidos (eosina o fucsina ácida) y son o fucsina ácida) y son eosinófilas. eosinófilas.

• Son redondas u ovales, de Son redondas u ovales, de aspecto granularaspecto granular

• Caracterizan a algunas Caracterizan a algunas infecciones, rabia infecciones, rabia (cuerpos de Negrí) y (cuerpos de Negrí) y viruela (cuernos de viruela (cuernos de Guarnieri).Guarnieri).

• Las intranucleares son de Las intranucleares son de dos tipos, A y B. dos tipos, A y B.

• Tipo A: provoca fuerte Tipo A: provoca fuerte reacción de la materia reacción de la materia nuclear, la inclusión se nuclear, la inclusión se aprecia con un halo claro a aprecia con un halo claro a su alrededor, libre de su alrededor, libre de cromatina (fiebre amarilla cromatina (fiebre amarilla y el herpes simple). y el herpes simple).

• Tipo B: ocasionan poca Tipo B: ocasionan poca respuesta en la célula, por respuesta en la célula, por lo común ocupan los lo común ocupan los espacios sin cromatina espacios sin cromatina (poliomielitis). (poliomielitis).

• Algunos ocupan todo el Algunos ocupan todo el espacio nuclear, espacio nuclear, sarampión. sarampión.

Cultivo celular Cultivo celular mostrando un mostrando un corpusculo de corpusculo de inclusión intranuclearinclusión intranuclear

Células epidérmicas Células epidérmicas con cuerpos de con cuerpos de inclusión en el nucleoinclusión en el nucleo

Corpúsculos de NegriCorpúsculos de Negri

HemadsorciónHemadsorción• Cuando el virus infectante Cuando el virus infectante

incorpora proteínas virales con incorpora proteínas virales con propiedad de hemaglutininas propiedad de hemaglutininas en la membrana celular, las en la membrana celular, las células infectadas se pueden células infectadas se pueden descubrir por la adsorción de descubrir por la adsorción de eritrocitos de ciertas especies eritrocitos de ciertas especies animales, que se puede animales, que se puede observar al microscopio de observar al microscopio de luz.luz.

• En ortomixovirus y En ortomixovirus y paramixovirus se pueden paramixovirus se pueden reconocer por hemadsorción reconocer por hemadsorción de eritrocitos de cobayo a las de eritrocitos de cobayo a las células.células.

• Es posible demostrar la Es posible demostrar la infección por aquellos virus infección por aquellos virus que presentan proteínas que presentan proteínas hemoaglutinantes. hemoaglutinantes.

+ GR cobayo =

Célula con hemaglutininas virales

Hemadsorción

Técnica de hemadsorción