Ciencias Marinas (2012), 38(2): 427439427CMINTRODUCTIONMicrobialdiversityisclearlyatopicofconsiderableimportanceandinterest.Inthepastdecadesthemostsurprisingdiscoveriesinbiodiversityhavearisenfromstudiesonthedistributionofmicrobialcommunitiesintheocean. Marine ecosystemsare continually subject to oscilla-tionsinenvironmentalconditions.Itisnowwidelyrecog-nized that climate change and biodiversity are interconnected(Bowland2006).BecauseglobalwarmingisexpectedtoINTRODUCCINLa diversidad microbiana es claramente un tema de granimportanciaeinters.Enlasltimasdcadas,losdescubri-mientosmssorprendentesdelabiodiversidadsurgieronde estudios sobre la distribucin de las comunidades micro-bianasmarinas.Losecosistemasmarinoscontinuamenteestn sujetosaoscilacionesenlascondicionesambientales.Esampliamentereconocidoqueelcambioclimticoylabiodiversidad estn interconectados (Bowland 2006). DebidoFirst archaeal rDNA sequences from Argentine coastal waters:Unexpected PCR characterization using eukaryotic primersPrimeras secuencias de ADNr de Archaea en aguas costeras de Argentina: Inesperada caracterizacin por PCR con cebadores para eucariotasF Covacevich1*, RI Silva2, AC Cumino1, G Cal1, RM Negri2, GL Salerno11Centro de Estudios de Biodiversidad y Biotecnologa (CEBB), Centro de Investigaciones Biolgicas (CIB), Fundacin para las Investigaciones Biolgicas Aplicadas (FIBA), Vieytes 3103, 7600 Mar del Plata, Argentina.2Instituto Nacional de Investigacin y Desarrollo Pesquero (INIDEP), Mar del Plata, Argentina.* Corresponding author. E-mail: fcovacevich@fiba.org.arABSTRACT. Many members of Archaea, a group of prokaryotes recognized three decades ago, colonize extreme environments; however, newresearch has shown that Archaeans are also abundant components of plankton in the open sea, where they play a key role in the biogeochemicalcycles. Although the widespread distribution of Archaea in the marine environment is well documented there are no reports on the detection ofArchaea in the Southwest Atlantic Ocean. During the search for picophytoplankton sequences using eukaryotic universal primers, we retrievedarchaeal rDNA sequences from surface samples collected during the spring at a fixed monitoring station (EPEA) in the Argentine Sea. FromenvironmentalDNAandusingPCRmethodology,twoDNAfragmentsofabout1700and1450bpwerevisualizedafterelectrophoresisinagarosegels,andseparatelypurified,cloned,andsequenced.BLASTanalysisshowedthatsequencesofthehighestsizecorrespondedtoeukaryoticorganismsand,unexpectedly,thoseofabout1460bpcorrespondedtoarchaealorganisms.Phylogeneticanalysisshowedthatarchaeal sequences belong to Euryarchaeota of marine group II, characterized as a methanogenic lineage. This is the first report on the presenceof group II Euryarchaeota sequences in environmental water samples of the Argentine Sea. The fact that Archaea sequences were amplifiedwith primers non-specific for this group may suggest an unexpected abundance of these organisms in the early spring in the Argentine Sea.Key words: Euryarchaeota, Argentine Sea, environmental rDNA, PCR methodology, primer design.RESUMEN.MuchosmiembrosdeArchaea,ungrupodemicroroganismosdescritoshaceaproximadamente30aos,colonizanambientesextremos. Sin embargo, las investigaciones ms recientes han demostrado que las arqueas tambin son abundantes componentes del planktonmarino,siendoalgunosgruposdeArchaeacomponentesfundamentalesdelosecosistemasmarinosdebidoasurolclaveenlosciclosbiogeoqumicos.Aunquelaubiquidaddelasarqueashasidobiendocumentada,hastaelmomentonohayregistrosdelapresenciaderepresentantes de este grupo en el mar Argentino. En un estudio de biodiversidad orientado a determinar secuencias de picoplancton utilizandocebadores universales para eucariotas, se encontraron secuencias de ADNr de Archaea en muestras recolectadas durante la primavera en unaestacinfijademonitorizacin(EPEA)enelmarArgentino.ApartirdeADNambientalymedianteelusodelametodologadePCR,seobtuvieron dos fragmentosde aproximadamente 1700y1460pb, quefueron separadosy visualizadosdespus de electroforesis engelesdeagarosa y, luego, purificados, clonados y secuenciados. El anlisis de BLAST mostr que las secuencias de tamao superior correspondan aorganismos eucariotas y las secuencias de menor tamao pertenecan a Archaea. El anlisis filogentico mostr que las secuencias de ArchaeaseagrupanconEuryarchaeotamarinagrupoII,caracterizadocomounlinajemetangeno.steeselprimerreportedelapresenciadesecuenciasdeEuryarchaeotagrupoIIenaguasdelmarArgentino.El hechodequelassecuenciasdeArchaeahayansidoamplificadasconcebadores no especficos para este grupo podra sugerir una inesperada abundancia de estos organismos durante los inicios de primavera en elmar Argentino.Palabras clave: Euryarchaeota, mar Argentino, ADNr ambiental, metodologa de la PCR, diseo de cebadores.Ciencias Marinas, Vol. 38, No. 2, 2012428have a significant influence on the hydrologic cycle over thenextseveralcenturiesandthusonspeciescomposition,theanalysisofthecurrentbiodiversityisurgent.Anincreasingamountofknowledgehasbeenreportedinthelastdecades;however,theintroductionofmolecularmethodologiesandmetagenomicanalysesopenednewavenuesintheunder-standing of marine microbial diversity. Using these tools, theubiquitouspresenceofcompletelynovellineages,withnorepresentatives in cultures, has been established for the threedomainsoflife:Bacteria(Giovannonietal.1990),Archaea(Delong1992,Fuhrmanetal.1992),andmorerecentlyEukaryota(Dezetal.2001,Lpez-Garcaetal.2001a,Massanaetal.2002,RomariandVaulot2004,Groisillieret al. 2006, Lovejoy et al. 2006).Achaeansaremicroscopicsingle-celledorganismsthatconstituteagroupofprokaryotes,recognizedin1977asanindependentmonophyleticgroup.Althoughinitiallytheywerebelievedtobelimitedtoanaerobic,hyperthermal,andhighlysalinehabitats,theywerealsofoundinbothmarineand freshwater environments (DeLong 1992; Fuhrman et al.1992; Massana et al.1997, 1998, 2000; Murray etal. 1999;Karner et al. 2001; Auguet and Casamayor 2008). Thus, it isrecognizedthatmarinearchaealpopulationsarediverse,complex,andwidespread(Danovaro2010).ThereisnowincreasingevidencethatmarineArchaeamakeanimportantcontributiontothebiogeochemicalnitrogenandcarboncycles (Bartossek et al. 2010).Basedon16SribosomalDNA(rDNA)phylogenyfromcultivatedorganisms,marineArchaeaarephylogeneticallydistributed through four main taxonomical clusters: one clus-terofCrenarchaeota,marinegroupI;andthreeclustersofEuryarchaeota,groupsII,III,andIV(Galandetal.2009).Members of marine group I play a key role in biogeochemi-calcycles,beingafundamentalcomponentofthemarineecosystem.AlthoughCrenarchaeotaconsistmainlyofthermophilicspecies,thegenomesoftwonon-thermophilicstrainshavebeencompletelysequenced:CenarchaeumsymbiosumandNitrosopumilusmaritimus(Prestonetal.1996, Knneke et al. 2005, Bartossek et al. 2010). Group IIArchaeaofplanktonicEuryarchaeotahavemorevariedmetabolisms(hencethenameeury-,meaningvariable),thoughmostbiochemicalstudieshavefocusedonmethano-genesis,auniquepropertyofsomeArchaea(comprisingHalobacteriales,Thermoplasmales,Thermococcales,Sulfo-lobales,Pyrodictiales,Archaeoglobus,Methanobacteriales).RepresentativesofgroupIIIarerestrictedtodeepwaters,havingbeenfoundinwatersbelowthephoticzone(Galandetal.2009).GroupIVwasfirstdiscoveredbyRodrguez-Valeraetal.(1979)andsequencesofitsmemberswereclearlydistinctfromallknownplanktonicArchaea(Lpez-Garca et al. 2001a).AnalysesofrDNAsequencesfromenvironmentalsam-ples have revealed that Archaea are ubiquitous and far moreabundantthanpreviouslyassumed(SteinandSimon1996,Karneretal.2001,DeLong2003).Culture-independentaqueseesperaqueenlosprximossigloselcalentamientoglobaltengaunainfluenciasignificativaenelciclohidrol-gico y, por lo tanto, en la composicin de especies, es urgenterealizarelanlisisdelabiodiversidadactual.Sibienenlas ltimasdcadaselconocimientoylosreportesdeestatemtica han aumentado, la introduccin de anlisis molecu-laresydemetagenmicahaabiertonuevoscaminosenlacomprensindeladiversidadmicrobianamarina.Medianteelusodeestasherramientas,sehaestablecidolaubicuapresenciadenuevoslinajes,sinrepresentantesencultivos,paralostresnivelesdelavida:Bacteria(Giovannonietal.1990),Archaea(Delong1992,Fuhrmanetal.1992)y,recientemente,Eukaryota(Dezetal.2001,Lpez-Garcaet al.2001a,Massanaetal.2002,RomariyVaulot2004,Groisillier et al. 2006, Lovejoy et al. 2006).Lasarqueassonorganismosmicroscpicosunicelularesprocariotasqueconstituyenungrupomonofilticoindepen-dientereconocidoen1977.Aunqueenunprincipiosecreaque se limitaban a los hbitats extremos anaerobios, hiperter-males, y altamente salinos, tambin fueron encontradas tantoenambientesmarinoscomodeaguadulce(DeLong1992;Fuhrmanetal.1992;Massanaetal.1997,1998,2000;Murray et al. 1999; Karner et al. 2001; Auguet y Casamayor2008). De este modo, se reconoce que las poblaciones mari-nas de Archaea son diversas, complejas y ubicuas (Danovaro2010).Enlaactualidadexisteevidenciacrecientedequelas arqueasmarinasrealizanunaimportantecontribucinalosciclosbiogeoqumicosdelnitrgenoydelcarbono(Bartossek et al. 2010).ApartirdelafilogeniabasadaensecuenciasdeADNribosomal (ADNr) 16S de organismos cultivados, las arqueasmarinasestndistribuidasfilogenticamenteencuatrogru-postaxonmicosprincipales:elgrupoCrenarchaeota;elgrupo marino I; y tres grupos de Euryarchaeota, grupo II, IIIy IV (Galand et al. 2009). Los miembros del grupo marino Icumplen un papel fundamental en los ciclos biogeoqumicos,ysoncomponentesfundamentalesdelecosistemamarino.AunqueelgrupoCrenarchaeotaconsisteprincipalmenteenespeciestermfilas,sehansecuenciadocompletamentelosgenomasdedoscepasquenosontermfilas:Cenarchaeumsymbiosum y Nitrosopumilus maritimus (Preston et al. 1996,Knnekeet al.2005,Bartosseketal.2010).Aunquelasarqueas del grupo II de los Euryarchaeota planctnicos tienenmetabolismosmsvariados(deahelnombreeury-,quesignifica variable), la mayora de los estudios bioqumicos sehancentradoenlaproduccindemetano,unapropiedadnicadealgunasarqueas(incluyendolasHalobacteriales,Thermoplasmales, Thermococcales, Sulfolobales, Pyrodictia-les, Archaeoglobus y Methanobacteriales). Si bien los repre-sentantes del grupo III se limitan a aguas profundas, tambinhansidoencontradosdebajodelazonafticaacutica(Galandet al.2009).ElgrupoIVfuedescubiertoporRodrguez-Valera et al. (1979) y las secuencias de sus miem-brosfueronclaramentedistintosdetodoslosplanctnicosconocidos hasta el momento (Lpez Garca et al. 2001a).Covacevich et al.: First archaeal rDNA sequences from the Argentine Sea429techniquesbasedon16SrDNAanalysesshowedtheexistenceofArchaeaintheopenocean,marinesediments,soils,andfreshwater-lakesediments(Massanaetal.2000,Schleperetal.2005,Galandetal.2009,Bartosseketal.2010).Particularly,marineArchaeahavebeenshowntoreside in coastal, offshore temperate, and cold waters world-wide(DeLong1992,Fuhrmanetal.1992,Massanaetal.1997,Galandetal.2010).Karneretal.(2001)foundthatpelagic Crenarchaeota form the North Pacific Gyre comprisemore than 30% of the total microbial cells between 200 and5000 m. Herndl et al. (2005) estimated that, at 100 m depth,Euryarcheotacontributedabout17%ofpicoplanktonabun-danceoftheNorthAtlanticSea,whilethecontributionofCrenarchaeotawasabout18.5%.Primerstodetectarchaealsequencesbypolymerasechainreaction(PCR)approachhavebeendesignedtoamplifyallprokaryotic16SrDNAgenes,andarereferredtoasuniversal(DasSarmaandFleischmann 1995, Reysenbach and Pace 1995, Vetriani et al.1999,Bakeretal.2003,http://bioinfo.unice.fr/454/VC/archaea_primers_sorted_by_Fsequences.html),orforthedetectionofspecifictaxa(Bakeretal.2003).Lpez-Garcaet al. (2001a, 2001b) found Euryarchaeota sequences belong-ingtomarinegroupsIIandIIIinAntarcticPolarFrontseawaterbyusinganddesigningdifferentprimersetsfor16S rDNA amplification.To our knowledge there are no reports on the detection ofArchaeaintheSouthwestAtlanticOcean.Inthisstudy,wereportthepresenceofrDNAarchaealsequencesinsurfacewater samples of the Argentine Sea that constitute the begin-ning of more comprehensive studies to understand the contri-bution of prokaryotes to the biogeochemical cycles of marineecosystems.MATERIAL AND METHODSSample collectionWatersampleswerecollectedduringmonthlycruisesconductedonboardtheR/VCapitnCanepa(INIDEP).Surface water samples were collected in September, October,andNovemberatthefixedEPEA(EstacinPermanentedeEstudios Ambientales) station in the Argentine Sea (3828 S,5741 W;27nauticalmilessouthofMardelPlata,Argentina).Environmentalcharacteristicsofthesamplingsite(photosyntheticallyactiveradiation,temperature,andsalinity) were described by Silva et al. (2009). Water samples(2.5L)weretakenusingabucketatthesurface,prefilteredthroughafilterof25mporesizetoeliminatemicro-planktoncomponents,passedthroughapolycarbonatemembraneof3mporesize(Nuclepore)toremovenanoplanktoncomponents,andfinallyfilteredthroughamembrane of 0.2 m pore size (Durapore). Filters were trans-ferredintoacryovialtube,immediatelyfrozeninliquidnitrogen, and stored at 80 C until nucleic acid extraction.Los anlisis de secuencias de ADNr a partir de muestrasambientaleshanreveladoquelasarqueassonubicuasymucho ms abundantes de lo que se supona (Stein y Simon1996,Karneretal.2001,DeLong2003).Lastcnicasinde-pendientesdecultivobasadasenelanlisisdeADNr16SdemostraronlaexistenciadeArchaeaenelmarabierto,ensedimentosmarinos,ensuelosyensedimentosdelagosdeagua dulce (Massana et al. 2000, Schleper et al. 2005, Galandet al. 2009, Bartossek et al. 2010). Se ha demostrado que enparticular, las arqueas marinas habitan aguas costeras, aguastempladas de alta mar as como aguas fras de todo el mundo(DeLong1992,Fuhrmanetal.1992,Massanaetal.1997,Galand et al. 2010). Karner et al. (2001) encontraron que lascrenarqueotas pelgicas del giro del Pacfico Norte compren-den ms del 30% de las clulas microbianas totales encontra-dasentrelos200a5000m.Herndletal.(2005)estimaronque,enlaprofundidadde100m,Euryarcheotacontribuyecon alrededor del 17% de la abundancia de picoplancton delmardelAtlnticoNorte,mientrasquelacontribucindeCrenarchaeotafuedealrededordel18.5%.Loscebadoresusados para detectar secuencias de Archaea por la metodolo-gadereaccinencadenadelapolimerasa(PCR,porsussiglas en ingls: polymerase chain reaction) se conocen comouniversalesyhansidodiseadosobienparaamplificartodoslosgenesADNr16Sdeprocariotas(DasSarmayFleischmann1995,ReysenbachyPace1995,Vetrianietal.1999,Bakeretal.2003,http://bioinfo.unice.fr/454/VC/archaea_primers_sorted_by_Fsequences.html)oparaladeteccindedeterminadostaxa(Bakeretal.2003).Lpez-Garcaetal.(2001a,2001b)encontraronsecuenciasdeEuryarchaeota pertenecientes a los grupos marinos II y III enel agua del mar Antrtico Polar diseando y utilizando diver-sos cebadores para la amplificacin del ADNr 16S de dichogrupo.Segn nuestro conocimiento, no existen registros sobre ladeteccindeArchaeaenelocanoAtlnticosudoccidental.Enesteestudio,seinformalapresenciadesecuenciasdeADNr de Archaea detectadas en muestras de agua superficialdelmarArgentino,yseconstituyeeliniciodeestudiosquese deberancontinuarparaentenderlacontribucindelosprocariotasalosciclosbiogeoqumicosdelosecosistemasmarinos.MATERIALES Y MTODOSRecoleccin de las muestrasLas muestras de agua fueron recolectadas durante campa-asmensualesrealizadasabordodelB/ICapitnCnepa(INIDEP).Lasmuestrasdeaguasuperficialserecolectaronenseptiembre,octubreynoviembreenlaEstacinPerma-nente de Estudios Ambientales (EPEA) en el mar Argentino(3828S,5741O;27millasnuticasalsurdeMardelPlata, Argentina). Las caractersticas ambientales del sitio demuestreo(radiacinfotosintticamenteactiva,temperaturaCiencias Marinas, Vol. 38, No. 2, 2012430Nucleic acid extractionGenomic DNA was extracted from marine samples (foursubsamplesineachcollection)accordingtostandardproto-cols(SambrookandRussell2001).Nucleicacidextractionbegan with the addition of lysozyme (1 mg mL1) to the filterunitandincubationat37 Cfor30min.Then,proteinaseK(0.5mgmL1)andsodiumdodecylsulfate(SDS,1%)wereadded,andthefilterwasincubatedfor2hat55 C.Thelysate was recovered from the filter, which in turn was rinsedwith1mLoflysisbuffer(Tris-HCl50mM,pH8;EDTA40 mM,pH8;sucrose0.75M;nuclease-freewater)withlysozyme (1 mg mL1). All centrifugations were performed at13,000rpmandat4 C.Aftercentrifugationfor7min,theupperphasewastransferredtoacleantube.Thepooledlysates were extracted twice with an equal volume of phenol-chloroform-isoamylalcohol(25:24:1;pH8)andoncewithchloroform-isoamylalcohol(24:1).Afterremovinganyresidualphenolbycentrifugation,theaqueousphasewastransferredintoanew1.5-mLtubecontaining750Lcoldisopropanoland1/10volumesodiumacetate(0.3Mfinalconcentration, pH 5.2). Tubes were placed in 20 C freezerovernight.Aftercentrifugationfor30minthesupernatantwas decanted into a beaker and the DNA pellet washed with200 L of 70% ethanol at 20 C. The DNA pellet was driedandre-suspendedin50LPCRwaterandstoredat20 Cuntiluse.DNAconcentrationwasdeterminedbymeasuringabsorbance at 260 nm.PCR amplification, cloning, and sequencingExtractedDNAwasusedastemplateinPCRreactionsusingtheeukaryotic18SribosomalDNA(rDNA)-specificprimersEukA5-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3andEukB5-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3(Medlinetal.1988).ThePCRconditionswereasfollows:initialDNA denaturizing for 3 min at 94 C, followed by 30 cyclesofdenaturizingfor45sat94 C,annealingfor1minat55 C, extension for 3 min at 72 C, plus one additional cyclewithafinal10-minchainelongationat72 C.The25-Lreaction volume contained 50 ng of DNA and 5 pmol of eachprimer. Following amplification, the PCR products were ana-lyzedbyelectrophoresisona0.8%agarosegelandDNAfragmentswerevisualizedwithethidiumbromide.DNAfrom the agarose gel was extracted using the QIAGEN MinE-luteGelExtractionKit.ThepurifiedPCRproductswereclonedintothepGemTEasyVectorcloningkit(Promega).TherecombinantplasmidwasinsertedintoEscherichiacoliDH5 competent cells, which were grown in LB medium at37 Cfor20min.Culturesweresprayedwith ahandleofDygraskionLB/Ampicillin/IPTG/X-Gal(1 mLof100mgmL1 ampicillin, 0.12 g isopropyl--D-thiogalactopyranoside(IPTG) in 5 mL deionized water; 0.10 g 5-bromo-4-chloro-3-indoly--D-galactoside (X-gal) in 2 mL N,N-dimethylforma-mide).Twentycoloniesofeachsample(atotalof100y salinidad)fuerondescritasporSilvaetal.(2009).Lasmuestras de agua (2.5 L) fueron recolectadas de la superficie,prefiltradasatravsdefiltrocontamaodeporode25mparaeliminar los componentes del microplancton, pasadas atravsdeunamembranadepolicarbonatodeporode3m(Nuclepore)paraeliminarloscomponentesdelnanoplanc-ton,yfinalmentefiltradaatravsdeunfiltrodemembranade poro de 0.2 m (Durapore). Los filtros fueron transferidosa tubos aptos para congelacin (crioviales), congelados inme-diatamenteennitrgenolquidoyalmacenadosa80Chasta la extraccin de cidos nucleicos.Extraccin de cidos nucleicosEl ADN genmico fue extrado a partir de las muestras deaguademar(cuatrosubmuestrasencadatiempodemues-treo)deacuerdoconprotocolosestndares(SambrookyRussell2001).Laextraccindecidosnucleicosseinicicon la adicin de lisozima (1 mg mL1) a la unidad de filtro yla incubacin a 37 C durante 30 min. Posteriormente se aa-dieronproteinasaK(0.5mgmL1)ydodecilsulfatosdico(SDS,1%),yelfiltrofueincubadodurante2ha55 C.El lisado se recuper del filtro, que a su vez fue lavado con1 mL de solucin tamponada de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8;40 mM EDTA, pH 8; sacarosa 0.75 M; agua libre de nuclea-sas) con lisozima (1 mg mL1). Todas las centrifugaciones serealizarona13,000rpmya4C.Despusdelacentrifuga-cindurante7min,lafasesuperiorsetransfiriauntubo limpio.Loslisadosfueronextradosdosvecesconun volumenigualdefenol-cloroformo-alcoholisoamlico(25:24:1; pH 8) y una vez con cloroformo-alcohol isoamlico(24:1). Despus de eliminar el fenol residual por centrifuga-cin,lafaseacuosasetransfiriauntubode1.5mLcon750 Ldeisopropanolfroy1/10volumendeacetatodesodio(0.3Mdeconcentracinfinal,pH5.2).Lostubossecolocaronenuncongeladora20Cdurantelanoche.Despusdeunacentrifugacindurante30min,elsobrena-dante fue eliminado y el precipitado de ADN fue lavado con200 L de etanol al 70% fro (conservado a 20 C). El preci-pitado de ADN fue secado y resuspendido en 50 L de aguaPCR yalmacenadoa 20 C hasta su uso. La concentracindeADNobtenidasedeterminmidiendolaabsorbanciaa260 nm.Amplificacin por PCR, clonado y secuenciacinEl ADN extrado se utiliz como molde en las reaccionesdePCRconcebadoresespecficosparaeucariotas(ADNribosomal(ADNr)18S),EukA5'-AACCTGGTTGATCCT-GCCAGT-3'yEukB5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACC-TAC-3' (Medlin et al. 1988). Las condiciones de PCR fueronlassiguientes:desnaturalizacininicialdelADNa94Cdurante3min,seguidopor30ciclosdedesnaturalizacina94 C durante 45 s, hibridacin a 55 C durante 1 min, exten-sina72Cdurante3min,yunaelongacinfinala72CCovacevich et al.: First archaeal rDNA sequences from the Argentine Sea431positivewhitecolonies)weregrownseparately(37 C,overnight)inLBmediumwithampicillin.ThepresenceofrDNA inserts was confirmed by colony PCR using the sameprimersandamplificationconditions.ThePCRproductsweredigestedwiththerestrictionendonucleaseHaeIII.Alldigestionswerecompletedindependentlyandperformedin15 L of final volume with 3 L of PCR product, 10 buffer,and3unitsofrestrictionendonuclease.Thesolutionwasincubated at 3 C for one hour. Digested samples were run byelectrophoresis (80 V, 3 h) in agarose gels (2.5%) (MetaPhor,Cambrex Bio Science Rockland Inc., Maine, USA). Agarosegelswerestainedwithethidiumbromideandtherestrictionfragment length polymorphism (RFLP) products were visual-izedwithUVtransillumination.Sizeofinsertswascon-firmed by plasmid digestion using EcoR1 restriction enzyme(Promega,Madison,Wisconsin,USA).Theinsertsfrom98clonesweresequenced,20ofthemcorrespondingtoa16SrDNAArchaeasequence(Macrogen,SouthKorea),whichwas deposited in GenBank (uncultured HQ541865).Phylogenetic analysis and rDNA thermodynamic properties predictionComparisonsofrDNAsequenceswereperformedusingnucleotidesequencesavailableintheNationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)databases(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).SequencealignmentsweregeneratedusingtheCLUSTALWsoftwareandgraphicrepresentationsofphylogenetictreeswereperformedusingtheMEGA4software(Tamuraetal.2007).Thetreeswerestatistically evaluated with non-parametric bootstrap analysis(numberofreplicates=1000).TherRNAanalyseswereperformedusingtheSILVArRNAdatabase(http://www.arb-silva.de),andthesecondarystructuresforDNArwerepredictedusingLocARNA(http://rna.informatik.uni-freiburg.de:8080/LocARNA.jsp)fromFrieburgRNAtools.LocARNAperformsSankoff-stylesimultaneousalignmentsandfolding,andgenerateshigh-qualityalignmentstakinginto account structural similarities (Smith et al. 2010).RESULTS AND DISCUSSIONInourstudyofpicophytoplanktondiversityintheArgentine Sea we used EukA/EukB primers to PCR amplifyeukaryoticsmallsubunitribosomalrDNAgenes(Medlinet al.1988)fromDNAextractedfromsurficialseasamplescollectedduringspringintheArgentineSea.Dezetal.(2001)demonstratedthespecificityoftheEukA/EukBprimer pair to construct clone libraries of eukaryotes and theabilityoftheprimerstorecoverdistantphylogenetically-relatedeukaryoticgroups(Stramenopiles,Alveolates,Prasinophytes,Chrysomonads,Cercomonads,andFungi)fromNorthAtlantic,Antarctic,andMediterraneansurfacewaters.Moreover,thoseprimersweresuccessfullyusedinmorerecentbiodiversitystudiesofmarinepicoeukaryotesdurante10min.Elvolumendereaccinde25Lcontena50 ng de ADN y 5 pmol de cada cebador. Luego de la ampli-ficacin, los productos de PCR fueron analizados por electro-foresis en gel de agarosa al 0.8% y los fragmentos de ADN sevisualizaronconbromurodeetidio.ElADNseextrajodelgel de agarosa utilizando un kit de extraccin QIAGEN Min-Elute Gel. Los productos de PCR purificados fueron ligadosalvectorpGemTeasy(Promega).ElplsmidorecombinanteseintrodujoenclulascompetentedeEscherichiacoliDH5,quefueroncrecidasenmedioLBa37Cdurante20 min. Luego, el cultivo fue sembrado homogneamente enmedioslidoLB/ampicilina/IPTGX-Gal(1mLde100mgmL1 ampicilina, 0.12 g isopropyl--D-thiogalactopyranoside(IPTG)en 5 mL agua deionizada;0.10g5-bromo-4-chloro-3-indoly--D-galactoside(X-gal)en2mLN,N-dimethylfor-mamida)conunasadeDygraski.Veintecoloniasdecadamuestra(untotalde100coloniaspositivasblancas)fueroncultivadasporseparado(37C,durantelanoche)enmedioLBconampicilina.LapresenciadeinsertosdeADNrfueconfirmadaporPCRapartirdecadacolonia,utilizandolosmismos cebadores y las condiciones de amplificacin especi-ficadasanteriormente.LosproductosdePCRfuerondigeri-dosconlaendonucleasaderestriccinHaeIII.Todaslasdigestiones se realizaron de forma independiente y se realizen15Ldevolumenfinalcon3LdeproductodePCR,solucintamponada10Xy3unidadesdeendonucleasaderestriccin.Lasolucinseincuba37Cdurante1h.Lasmuestrasdigeridasfueronsometidasaelectroforesis(80V,3 h)engelesdeagarosa(2.5%)(MetaPhor,CambrexBioScience Rockland Inc., Maine, EUA), que fueron teidos conbromuro de etidio y los fragmentos de restriccin polimrfi-cos (RFLP) resultantes fueron visualizados por transilumina-cinUV.EltamaodelosinsertosfueconfirmadopordigestindelplsmidoconlaenzimaderestriccinEcoR1(Promega,Madison,Wisconsin,EUA).Sesecuenciaronlosinsertos de 98 clones y 20 de ellos resultaron ser una secuen-ciaADNr16SdeArchaea(Macrogen,CoreadelSur),quefue depositada en el GenBank (HQ541865 no cultivada).Anlisis filogentico y prediccin de propiedades termodinmicas del ADNrLascomparacionesdesecuenciasnucleotdicasdelosADNr se realizaron utilizando las bases de datos pblicas dis-poniblesdelNationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).Losalinea-mientos de las secuencias se realizaron utilizando el softwareCLUSTALW.Losrbolesfilogenticosfueronevaluadosestadsticamente con el anlisis de bootstrap no paramtrico(nmeroderepeticiones=1000).LarepresentacingrficadelrbolfilogenticoserealizutilizandoelsoftwareMEGA4 (Tamura et al. 2007). Los anlisis de RNAr se hicie-ronprimeramenteconlabasededatosSILVA(http://www.arb-silva.de),yluegosepredijeronlasestructurassecundariasutilizandoLocARNA,herramientasparaCiencias Marinas, Vol. 38, No. 2, 2012432(Groisillier et al. 2006, Guillou et al. 2008, Hoppenrath et al.2009,Notetal.2009).TheanalysisoftheamplificationproductsusingEukA/EukBprimersafterseparationbyelectrophoresisonagarosegel,revealedthatwhileaDNAfragmentofexpectedsize(1700bp)waspresentinallthesamples, an additional band of 1460 bp was visualized in allsamples collected in September and October (fig. 1a). About66%oftheanalyzedsamplesshowedthesecondlowestband.ThetwoDNAamplifiedfragmentswereseparatelypurified and cloned in E. coli cells (fig. 1b). Inserts of clonescorresponding to each month showed the same sizes. Furthersequencingoftheinsertsrevealedthatnucleotidesequencesof1700-bpbandscorrespondedtoeukaryoticorganisms.In the case of samples collected in September, the sequenceswereascribedmainlytoStramenopila(e.g.,Bolidomonassp.) andAlveolata(e.g.,Laboeasp.),whereasthoseofOctobermatchedthesequencesbelongingtoStramenopila(e.g.,Pedinellasp.)andprasinophyceanChlorophyta(e.g.,Bathycoccussp.).AmplifiedDNAofsamplescollectedinNovember produced only one band of about 1700 bp (fig. 1a)RNA de Freiburg (http://rna.informatik.uni-freiburg.de:8080/LocARNA.jsp).LocARNApermiterealizarelalineamientoy plegado simultneo al estilo Sankoff, y genera alineamien-tos de alta calidad que toman en cuenta la similitud estructu-ral (Smith et al. 2010).RESULTADOS Y DISCUSINEnnuestroestudiosobreladiversidaddelpicofitoplanc-ton en el mar Argentino se utiliz el par de cebadores EukA/EukB (Medlin et al. 1988) para amplificar por PCR los genesdelasubunidadribosomalmenordeeucariotasapartirdelADN extrado de muestras recolectadas durante la primaveraen la superficie del mar Argentino. Dez et al. (2001) habandemostrado la especificidad de este par de cebadores EukA/EukBparalaconstruccindebibliotecasdeclonesdeeucariotasylacapacidaddeestoscebadorespararecuperarsecuenciasdeeucariotasfilogenticamentedistantes(estramenofilos,alveolados,prasinofceas,crisomonados,cercomonasyhongos),enaguassuperficialesdemaresdelFigure1. Agarose gel electrophoresis of DNA fragments amplified by PCR: (a) from genomic DNAfrom representative surface samplescollected in the Argentine Sea during spring (lane 1, in September; lane 2, in October; and lane 3, in November) using the primer pair EukA/EukB;and(b)fromcoloniesoftransformedEscherichiacolicells(colony-PCR)harboringamplifiedDNAfragmentsmentionedin(a).Amplification products from samples collected in September (lanes 13), October (lanes 46), and November (lanes 79). MM, 500-bp DNAladder (MeBep Bioscience). Arrows indicate the two amplicons obtained. The 1460-bp fragment corresponds to archaeal rDNA sequences.DNA fragments were visualized with ethidium bromide.Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos de ADN amplificados por PCR: (a) a partir de ADN genmico de las muestrassuperficialesrecolectadasenelmarArgentinodurantelaprimavera(calle1,enseptiembre;calle2,enoctubre;ycalle3,ennoviembre),amplificadas con el par de cebadores EukA/EukB; (b) a partir de las colonias transformadas de clulas de Escherichia coli (PCR de colonia)quecontenanlosfragmentosdeADNamplificadosmencionadosen(a).Productosdeamplificacindelasmuestrasrecolectadasenseptiembre(calles13),octubre(calles46)ynoviembre(calles79).MM,marcadordepesomolecularparaADNde500pb(MeBepBioscience). Las flechas indican los dos amplicones obtenidos. El fragmento de 1460 pb correspondi a secuencias de ADNr de Archaea. Losfragmentos de ADN se visualizaron con bromuro de etidio.MM 1 2 317001460aSeptember1 2 3October4 5 6November7 8 9MMbCovacevich et al.: First archaeal rDNA sequences from the Argentine Sea433andsequencesmatchedsequencesbelongingtoAlveolata(e.g.,Noctilucasp.).Surprisingly,nucleotidesequencesofthe1460-bpinsertscorrespondedtoarchaealrDNA,whoseRFLPpatternsweresimilarandresulteddifferentfromthesequences of eukaryotes (fig. 2). The sequences of the insertsmatchedanunculturedmarineArchaeagroupedwiththemarine group II Euryarchaeota (fig. 3).ThesequencealignmentsoftheArchaea16SrDNAand18SrDNAuniversalprimers(EukA/EukB)usedforPCRamplificationconfirmedthattheprimerpairshares100%identitywitharchaealrDNAregions.AnalyseswiththeSILVArRNAdatabase(http://www.arb-silva.de)indicatedthatitwouldbepossibletoPCRamplifyusingEukAandEukBasprimersonlyaverysmallnumberofarchaealsequences(2outof11,954Archaeaavailablesequences).Therefore,thefactthatarchaealsequencescouldberecov-ered from the environmental DNA with primers designed foreukaryotessuggeststhatsomescarceArchaeastrainsofmarinegroupIIwereveryabundantatleastinSeptemberAtlnticoNorte,laAntrtidayelMediterrneo.Porotraparte,loscebadorestambinfueronutilizadosconxitoenestudios posteriores de biodiversidad de picoeucariotas mari-nos(Groisillier etal.2006,Guillouetal.2008,Hoppenrathet al. 2009, Not et al. 2009). El anlisis de los productos deamplificacin por PCR usando el par EukA/EukB despus dela separacin por electroforesis en gel de agarosa revel queen todas las muestras estaba presente un fragmento de ADNdeltamaoesperadoparaeucariotas(1700pb)yquesevisualizabaunabandaadicionalde1460pbsloenlasmuestras recogidas en septiembre y octubre (fig. 1a). Alrede-dor del 66% de las muestras analizadas mostraron la segundabanda inferior. Los dos fragmentos de ADN amplificados sepurificaronporseparadoyseclonaronenclulasdeE.coli(fig. 1b). Los insertos de los clones recolectados en cada mesmostraronelmismotamao.Adems,lasecuenciacindelos insertosrevelquelassecuenciasdelosnucletidosde1700pb(bandassuperiores)correspondanaorganismoseucariotas.Enelcasodelasmuestrasrecolectadasenseptiembre,lassecuenciassecorrespondieronprincipal-menteconsecuenciasdisponiblesdeestramenofilos(e.g.,Bolidomonassp.)yalveolados(e.g.,Laboeasp.).Lassecuenciasdelosnucletidosde1700pbdelasmuestrasrecolectadasenoctubrecoincidieronconlassecuenciaspertenecientesalosestramenofilos(e.g.,Pedinellasp.)y clorfitas prasinofceas (e. g., Bathycoccus sp.). Las ampli-ficacionesdeADNcorrespondientesalasmuestrasrecolec-tadasennoviembreprodujeronslounabandadealrededorde 1700 pb (fig. 1a) y las secuencias obtenidas coincidieronconlassecuenciaspertenecientesalosalveolados(e.g.,Noctiluca sp.). Sorprendentemente, las secuencias de nucle-tidos de los insertos de 1460 pb correspondieron a ADNr deArchaea, cuyos patrones de RFLP fueron similares entre s ydiferentesdelassecuenciasdeloseucariotas(fig. 2).Lassecuenciasdelosinsertoscoincidieronconarqueasmarinasnocultivadas,agrupadasconelgrupomarinoIIdeEuryar-chaeota (fig. 3).Los alineamientos de las secuencias del ADNr 16S obte-nidodeArchaeayloscebadoresuniversalesEukA/EukButilizadosparalaamplificacinporPCRdelADNr18Sdeeucariotasconfirmquedichopardecebadorestiene100%deidentidadconfragmentosdelADNr16SdeArchaeaobtenido. Los anlisis con la base de datos SILVA para ADNr(http://www.arb-silva.de)indicaronqueloscebadoresEukAy EukB slo amplificaran un pequeo nmero de las secuen-ciasdisponiblesdeArchaea(2de11,954secuenciasdeArchaea).Porlotanto,elhechodequeunasecuenciadeArchaea pudo ser recuperada a partir del ADN ambiental concebadores diseados para amplificar secuencias de eucariotassugierequealgunascepasdeArchaeadelgrupomarinoIIseranmuyabundantes,porlomenosduranteseptiembreyoctubre, lo que evidenciara en la hibridacin una competen-ciadeloscebadoresentrelassecuenciasdeArchaeaydeeucariotaspresentesenelADNextradodelasmuestrasrecolectadas.1 2 3 4 MMFigure2.RFLPpatternsobtainedfrom1700-bp(lanes1and2)andfrom1460-bp(lanes3and4)amplicons.ThePCRproductswereincubatedwithHaeIIIandthedigestionproductswereseparatedbyelectrophoresisinagarosegels(2.5%).DNAfragments were visualized after ethidium bromide staining.Figura 2. Patrones de RFLP obtenidos de los amplicones de 1700pb (calles 1 y 2) y de 1460 pb (calles 3 y 4). Los productos de PCRfueron incubados con HaeIII y los productos de la digestin fueronseparadosporelectroforesisengelesdeagarosa(2.5%).LosfragmentosdeADNsevisualizarondespusdelatincinconbromuro de etidio.Ciencias Marinas, Vol. 38, No. 2, 2012434and October,consideringtheobviouscompetitionintheannealingstepbetweenarchaealandeukaryoticsequencesfor the primers.The identification of archaeal sequences led us to analyzetheprimersreportedtospecificallyretrievesequencesoftheseorganisms.WecomparedEukAandEukBsequenceswiththeArchaeaprimersandwiththemoreabundantsequenceweobtainedinthisstudy(HQ541865)(table1).WhereassomeofthereportedprimersalignwiththeHQ541865sequenceinmoreinternalpositionsthanEukA andEukB,othershavepoorornocomplementationwithHQ541865.Bakeretal.(2003)proposedtwonewprimerpairstoamplifysequencesfromCrenarchaeoteandEuryarchaeotatypestrains(A571F5-GCYTAAAGSRIC-CGTAGC-3/UA1204R5-TTMGGGGCATRCIKACCT-3andA751F5-CCGACGGTGAGRGRYGAA-3/UA1406R5-ACGGGCGGTGWGTRCAA-3).Gantneretal.(2011)alsopresentedtwonewarchaealprimers(340F5-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3 and 1000R 5-GGCCATG-CACYWCYTCTC-3)whichweredesignedfrom8500LaidentificacindesecuenciasdeArchaeanosllevaanalizarloscebadoresregistradoscomoespecficospararecuperarsecuenciasdeestosorganismos.Paraello,secompararonlassecuenciasdeloscebadoresEukAyEukBconotrosregistradosparaArchaeayconlasecuenciams abundanteycompletadeArchaeaqueseobtuvoeneste estudio (HQ541865) (tabla 1). Mientras que algunos deloscebadoresanalizadossealinearonconlasecuenciaHQ541865enposicionesmsinternasqueEukAyEukB,otrospresentaronescasaonulacomplementacinconHQ541865.Bakeret al. (2003)propusierondosnuevospares deoligonucletidos(A571F5'-GCYTAAAGSRICCG-TAGC-3'/UA1204R5'-TTMGGGGCATRCIKACCT-3'yA751F5'-CCGACGGTGAGRGRYGAA-3'/UA1406R5'-ACGGGCGGTGWGTRCAA-3')paraamplificarsecuenciasdeCrenarchaeoteyEuryarchaeota.TambinGantneretal.(2011) registraron dos nuevos cebadores para Archaea (340F5'-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3'y1000R5'-GGCCATG-CACYWCYTCTC-3'),quefuerondiseadosapartirde8500 alineamientosdesecuenciasdisponiblesdeArchaeaFigure 3. Phylogenetic 16S rDNA-based tree showing the position of the novel archaeal 16S rDNA sequence identified from surface watersamplesoftheArgentineSea.TheinformationusedwasdownloadedfromtheMicrobialGenomesResourceoftheNationalCenterforBiotechnology Information (NCBI).Figura3.rbolfilogenticobasadoensecuenciasdeADNr16SdondesemuestralaubicacindesecuenciaADNr16SdelaarqueaidentificadaapartirdemuestrassuperficialesdelmarArgentino.LainformacinutilizadafueobtenidadelsitioMicrobialGenomesResource del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Korarchaeota ( Rhodobium marinum D30791) ( Pyrobaculum aerophiluml L07510) (D26490) Sulfolobus solfataricus Uncultured crenarchaeote (U63339) Unidentified korarchaeote (L25303) Korarchaeota (AF255604) (AJ318041) Nanoarchaeum equitans (Y00275) Archaeoglobus fulgidus (U20163) Pyrococcus furiosus (D37982) Thermococcus peptonophilus (AB107768) Thermococcus celericrescens (EU887285) Haladaptatus litoreus (AB291225) Haloarchaeon (AF071880) Halobacter utahensis Uncultured marine euryarchaeote (AF257279) Uncultured archaeon (AJ133621) Uncultured marine euryarchaeote (AF257278) Uncultured marine euryarchaeote (FJ002864) Uncultured marine euryarchaeote (DQ156395) Uncultured marine euryarchaeote (DQ156380) This Study Uncultured marine euryarchaeote (AF257277) Uncultured marine euryarchaeote (EU650264) Unidentified euryarchaeote (U78206) Uncultured (AY856357) marine euryarchaeote Uncultured marine euryarchaeote (EU650240)95100100100100979610070100100100911007298959073627145670.05Euryarchaeota-Group IINanoarchaeotaCrenarchaeota-Group IEuriarchaeota - Other GroupsEuryarchaeota-Group IIIEuryarchaeota-Group IVCovacevich et al.: First archaeal rDNA sequences from the Argentine Sea435alignedarchaealsequencesbyusingtheSILVAdatabase.Theyreportedthatdesignedprimersshowedhigharchaealspecificity(