8/18/2019 Principios Cromatografía

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“SeparacionesCromatográficas”

M. en C. Martha Hernández

Labra

 Principios

• Fue inventada ydenominada así, aprincipios del sigloXX por el botánicoruso Mikhail Tswett.

Historia Sus estudiospioneros

se enfocaron

en la separaciónde clorofilas y

xantofilas

usando unsolvente

en una columnaempacada conCaO y alumina.

El nombre fue dadopor Tswett , viene delgriego chroma quesignifica color ygraphien que significaescritura,literalmente: escriturade color.

Definición

• Método de separación en el que seaprovechan las diferencias en elcomportamiento de partición entreuna fase móvil y una fase estacionariapara separar los componentes de unamezcla.

http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Chromatography_of_chlorophyll_results.jpghttp://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Chromatography_of_chlorophyll_results.jpg

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Definición de Términos

En todas las separaciones cromatográficasparticipan:

una fase móvil yuna fase

estacionaria

La fase estacionaria:

Consiste en partículas, general-mentesólidas, pequeñas y con una superficiemicroporosa, de forma que presenta unamplio desarrollo superficial.

Puede estar empaquetada en forma decolumna o extendida en forma de capa.

Fase EstacionariaSólidos muy porosos con

capacidad adsorbente: Gel desílice (SiO2); Alúmina (Al2O3),

CelitaLa superficie del gel de sílice

interacciona con los compuestosorgánicos mediante

interacciones de carácter polar :• Puentes de hidrógeno

• Interacciones electrostáticas

Los compuestos más polaresinteraccionan

más fuertemente con la sílica

La fase móvil:

• Puede ser un

líquido o un gas, y su función estransportar a loscomponentes de lamezcla a travésdel sistema cro-matográfico.

En cromatografía de líquidos(columna, capa fina, HPLC) lafase móvil es una mezcla de

disolventes llamada:ELUYENTE

En cromatografía de gases lafase móvil es el

GAS PORTADOR.

Fase móvil

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El Eluyente puede ser:

• Una solución isocrática que consisteen el empleo del mismo eluyente paralograr la separación.

• Una elución por gradiente queconsiste en mezclar dos o maseluyentes distintos de modo que lacomposición de la fase móvil cambiecon el trascurso del tiempo.

 Eluyentes polares:Rompen más

eficazmente lasuniones de los

compuestos con lafase estacionaria.

Arrastran másrápidamente a los

compuestos.

Naturaleza del eluyente:

 Eluyentes no polares:

No rompen lasuniones de los

compuestos con lafase estacionaria.

 Arrastran muy

lentamente a loscompuestos.

Tendencias en las Fases móviles masempleadas y en Compuestos a

Separar

Clasificación

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Cromatografía de Intercambio Iónico

• En condiciones determinadas serán retenidasen la columna las muestras que tengan una

carga complementaria a la matriz del gel,siendo eluidas las restantes.• Para eluir las muestras retenidas se puede

variar la carga iónica del solvente o su pH deforma que se alcance al punto isoeléctrico dela muestra de interés o el de la matriz,neutralizando de este modo la fuerza queretiene a la muestra en la columna.

Cromatografía de Intercambio Iónico

• Se realiza sobre matrices que tienen una carga neta.

• La carga de la matriz de la columna así como la carga

de la muestra dependerá del pH del solvente y de su

fuerza iónica (proporcional a la concentración de

iones).

• Se usa en la separación de moléculas grandes

(proteínas y ácidos nucleícos).

Carga negativa: intercambio de cationes

Carga positiva: intercambio de aniones

Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes seemplean intercambiadores iónicos inorgánicos.

Cromatografía de Afinidad o de ExclusiónMolecular

Cromatografía de Exclusión

• Hay diferentes tamaños de partículapara un gel.

• Este técnica se emplea en la separaciónde proteínas de alimentos,determinación de glucosa y fructosa enzumos de fruta, etc.

A menor tamaño mayor resolución ymenor gasto en la columna.

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Cromatografía de Afinidad

Permite la separación de mezclas por su afinidad o capacidad de unión a undeterminado ligando.

Las muestras que se retienen en la columna son aquellas que se unenespecíficamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente ala matriz de la columna.

Después de que las muestra que no se unen al ligando son lavadas o eluídasa través de la columna, la muestra de interés que ha quedado retenida en lacolumna se eluye (se libera) mediante el empleo de una solución quecontiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre elligando y la proteína

Cromatografía de Filtración en Gelo de Adsorción

Técnicas Manualesde

 Laboratorio

Cromatografía en CapaFina

Se utiliza para separar

moléculas relativamentepequeñas.

Consiste en una faseestacionaria y una móvil.

Fase estacionaria: CelulosaAlmidón, Azucares, Gel desílice (silicagel), Óxido dealuminio (alúmina) ,Carbón activo (carbón enpolvo)

•Lo anterior unido a unasuperficie sólida (vidrio,aluminio, plástico o papel) El principio es : La sustancia de interés se adherirá a la

fase estacionaria o se moverá con la fase móvil,viajando una distancia que es inversamenteproporcional a la afinidad por la fase estacionaria.

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La polaridad es la basede esta técnica.

La fase estacionariaformada por gel de sílicees polar y los analitos a

separar presentarándiferentes polaridades.

Quedarán mas retenidospor la fase estacionaria

los mas polares y,

la elección deldisolvente en función de

su polaridad,

hará que los analitossean arrastrados mas

rápidomas despacio,

incluso quedarcompletamente

retenidos en la faseestacionaria,

consiguiendo suseparación.

Factor de Retención

El factor de retención es un parámetro

dentro de la cromatografía que nos permitecuantificar la interacción entre la fase móvil yel analito que se esta logrando separar.

Dentro de la cromatografía en capa fina, esnecesario eluir la placa, revelarla, determinarla distancia que recorrió el analito para poderobtener el Factor de Retención.

Punto deaplicación

Frente delEluyente

Factor deRetención

Mezclas con menorpoder de elución:Arrastran poco a loscompuestos Rf menor

Influencia de la estructura de los compuestos en el Rf 

Influencia del eluyente en el Rf 

Mezclas con mayor poderde elución (más polares):Arrastran mucho a loscompuestos Rf mayor

Localización de sustancias

Si los compuestos separados no son coloreadoses necesario revelar la posición de dichoscompuestos, para ello existen dos tipos de

métodos:

Métodos Físicos Métodos Químicos

Métodos

Químicos

Utilización de reactivosreveladores como:

Generales

Yodo, ácidosulfúrico.

Específicos

2,4  – dinitrofenilhidracina

(paraaldehidos ycetonas).

Verde debromocresol(para ácidoscarboxílicos).

Para-dimetilaminobenzalde

hido

(para aminas).

Ninhidrina(para

aminoácidos).

Métodos

Físicos

El más común

UV-Visible Temperatura

Reveladores

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Cromatografía en Columna

También es consi-

derada como croma-tografía preparativa,puesto que esutilizada para purificarsuficiente cantidad desustancia para un usoposterior, más quepara análisis.

En la cromatografía encolumna la separación seconsigue haciendo fluir lamezcla a través de unacolumna de adsorbente.

Los compuestos emergende la columna a tiemposdiferentes, y pueden serrecogidos en fraccionesseparadas.

Comúnmente se suele usarcomo adsorbente alúmina osílice. Las fases móviles seusan en función de lapolaridad de los compuestosa separar.A continuación se enumerauna lista de menor a mayorpolaridad de las fases mó-

viles comúnmente usadas:

HexanoTolueno

DiclorometanoCloroformo

Dietil éterAcetato de etilo

Acetona1-Propanol

EtanolMetanol

Agua