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PROBLEMAS T6 (Clase) MTODOS ISOTPICOS

6.1.- Una muestra que contiene 35S (t1/2=87,1 das) exhibe una actividad de 10 mCi. Cul ser su actividad, expresada en dpm, despus de 174 das? S: 5.55109 dpm. 6.2.- El 14C posee un t1/2=5570 aos. Calcular a) la fraccin de tomos de 14C que se desintegra anualmente y b) la actividad especfica mxima del 14C. S: a) 0,02%; b) 1,421014 dpm/mol. 6.3.- A cuntos g de fsforo equivale 1 Ci de 32P? (t1/2=14,28 das). S: 3,5 pg 6.4.- Calcular la masa de 1 Ci de 14C (t1/2=5570 aos). S: 0,22 g 6.5.- Calcular la mxima radiactividad especfica terica que se puede conseguir para el 11C. Dato: periodo de vida media del istopo= 20,3 min; 1Ci= 3.71010 dps S: 2,061022 dpm/mol= 9,26109 Ci/mol = 1,861021 dpm/g= 838,6106 Ci/g. 6.6.- Un investigador recibe 5 mCi de 131I el mircoles a las 8 de la tarde. El experimento est programado para comenzar el siguiente lunes a las 8 de la maana. Indicar la actividad de 131I que dispondr el investigador para realizar el experimento (t1/2=8,04 das). S: 3,4 mCi 6.7.- Una muestra de AMP marcada con 14C y 32P exhibe una actividad especfica de S= 9500 cpm/mol. El 70% de la radioactividad inicial procede del 32P y el resto del 14C. Calcular la actividad especfica a los 7, 14 y 28 das. Datos: 32P= 5,6510-7 s-1; 14C = 1,4410-8 horas-1 S: 7 das 7586 cpm; 14 das 6208 cpm; 28 das 4546 cpm. 6.8.- Describe la preparacin de 1 mL de solucin [-32P]ATP 10 mM con actividad especfica 1,5105 dpm/mol. Para ello se dispone de las soluciones madre de ATP 0,1 M (frio) y [-32P]ATP con actividad especfica 30 mCi/mmol y concentracin 1mCi/mL. S: 99,77 L ATP 0,1 M (es decir: 9,977 moles) frio + 0,675 L [-32P]ATP (es decir: 6,7510-7 Ci =1,5106 dpm y 0,0225moles) completando hasta 1 mL con agua o solucin tampn.

6.9.- Un estudiante quiere determinar la cantidad de fsforo que absorbe un cultivo de tomates en un medio hidropnico. El experimento se realiza aadiendo una cantidad conocida de fosfato marcado con 1 Ci de 32P a la solucin hidropnica donde crecern las plantas. Despus de un periodo de 7 das de crecimiento se determina una actividad de 32P en las plantas de 6,78104 dpm. Qu porcentaje de fosfatos ha asimilado el cultivo de tomates a los 7 das de experimentacin? (t1/2= 14,28 das). S: 4,3 % 6.10.- En una experiencia de doble marcaje con 3H y 14C se introdujo 0,2 g de muestra en un contador discriminador de altura de pulso de dos canales A y B. En las mismas condiciones se determin la radiactividad de patrones de 3H y 14C en ambos canales. Una vez restado el ruido de fondo a todas las medidas se obtuvieron los siguientes datos:

cpm 3H 14C Muestra Canal A 175 80 120 Canal B 75 320 160

Sabiendo que la eficiencia es del 16 % para el 3H y del 80 % para el 14C,

calcula la radiactividad especfica de la muestra para cada uno de los radioistopos en Ci/g. Datos: 1 Ci= 3,71010 dps S: 3H 1,8 nCi/g; 14C 0,43 nCi/g 6.11.- A una serie de 6 muestras de patrones estndar cuya radiactividad es de 1250 dpm se les aade 5 cantidades crecientes de un extintor y se miden en un contador discriminador de altura de pulso dividido en dos canales A y B junto con un control sin extintor. Una muestra que tambin contiene el radioistopo y de la que se sabe que tiene extintores se mide en el mismo contador. Los resultados obtenidos son los siguientes:

cpm Control 1 2 3 4 5 MuestraCanal A 500 478 445 410 379 332 1822 Canal B 500 425 354 290 227 170 1211

Cul es la eficiencia en la medida de la muestra? Cul es la radiactividad

real de la muestra? S: i) 53 %; ii) 5723 dpm

6.12.- Un cultivo de fagos est marcado con una media de 42 tomos de 32P por fago. La eficiencia de deteccin del istopo en una emulsin gruesa es del 90 %. Cunto tiempo debe exponerse para tener una media de 9 brazos por estrella? Datos: t 32P= 14.2 das S: 5,57 das 6.13.- Con objeto de estudiar el recambio de Na+ en la sangre se inyecta 24NaCl en el torrente circulatorio de un animal, se toman muestras de sangre peridicamente y se mide su radiactividad:

Tiempo (h) 1 2 5 10 16 24 cpm/mL 3604 2928 2376 1412 756 329

Cul es el tiempo de recambio del in Na+ en la sangre? (t 24Na= 15 h)

S: 17 h 6.14.- Para estudiar la relacin entre iniciacin y elongacin de cadenas de RNA producto de la actividad de una RNA-polimerasa se incuba dicha enzima con rNTPs marcados con 14C en la ribosa (radiactividad especfica 100 cpm/mmol) y con 32P en el fosfato (radiactividad especfica (5000 cpm/mmol) y en presencia de molde y de los cofactores necesarios para la sntesis. Transcurridos 3 min, la reaccin se detiene por precipitacin con cido tricloroactico (TCA). La radiactividad incorporada en el precipitado se mide con un contador analizador de altura de pulso con dos canales A y B y se obtienen los siguientes resultados:

cpm 32P 14C Muestra

Canal A 215 455 407 Canal B 645 245 325

Calcula la longitud media, en nmero de nucletidos, de las cadenas

sintetizadas por la RNA-polimerasa as como el nmero de cadenas. S: i) 165 N/cadena; ii) 2,091019 cadenas. 6.15.- Una muestra de 10 g de protena fue hidrolizada en sus aminocidos. A esta muestra se le aadieron 3 mg de treonina marcada con 14C de radiactividad especfica 1000 cpm/mg. Posteriormente se aislaron los aminocidos mediante cromatografa de intercambio inico, obtenindose 60 mg de treonina pura con una radiactividad especfica 20 cpm/mg Cul es el porcentaje de Thr en la protena? S: 1,47 %

PROBLEMAS T7 (Clase) CROMATOGRAFA

7.1.- Las sustancias A, B, C y D presentan los siguientes Rfs en cromatografa en papel con cada uno de los 4 eluyentes siguientes:

Butanol-H20

Isopropanol-HCl

Benceno-. actico

Cloroformo-metanol

A 0,23 0,31 0,42 0,09 B 0,24 0,20 0,51 0,62 C 0,38 0,58 0,40 0,64 D 0,41 0,56 0,53 0,10

Qu procedimiento dara mejores resultados para separar las cuatro sustancias? (asumir desarrollo de 10 cm y resolucin de manchas cuando sus centros distan al menos 1 cm). En una cromatografa en capa fina bidireccional varia la resolucin si se invierte el orden de los eluyentes empleados? 7.2.- En un sistema cromatogrfico, un soluto tiene un tiempo de retencin de 407 s y una anchura en la base de 13 s en una columna de 12,2 cm de longitud. Calcular el nmero de platos tericos. S: 15680 platos tericos 7.3.- En un sistema cromatogrfico, un soluto tiene un tiempo de retencin de 407 s y una anchura en la base de 13 s. Un pico vecino es eludo a 424 s y tiene una anchura en la base de 16 s. Calcular la resolucin de la columna para estos dos componentes. S: Rs =1,17 7.4.- Tres solutos A, B y C son eludos de una columna de cromatografa (reparto, fase reversa) con volmenes de elucin de 36, 35 y 12 mL respectivamente. Se sabe que C no sufre ningn retraso en esta cromatografa ya que no interacciona en absoluto con la fase estacionaria. Cul es el nmero mnimo de platos tericos de la columna necesario para resolver completamente A y B? S: N= 20164; pero N= 8800 si se utilizan volmenes de elucin ajustados 7.5.- En un laboratorio de control de calidad se quiere poner a punto un mtodo de anlisis por HPLC en fase inversa de una mezcla de dos compuestos A y B. Se sabe que, en columna de octadecil-slice de 25 cm de longitud y utilizando una fase mvil de metanol-agua, los tiempos de retencin son 6,25 y 7,10 min respectivamente, el tiempo muerto es 1,4 min y la resolucin es 1,05.

a) Cul debe ser la longitud de la columna para conseguir una resolucin de 1,5?

b) Calcular los factores de retencin de A y B. Sern diferentes en la nueva columna?

S: a) 51 cm, b) KA= 3,46; KB= 4,07, iguales 7.6.- En una columna de 10 cm de longitud, se lleva a cabo la separacin cromatogrfica de dos sustancias A y B, obtenindose factores de capacidad de 0,8 y 1,0 respectivamente.

a) Si se considera una resolucin de 1 para ambos picos, calcular la altura equivalente de plato terico.

b) Si el tiempo de retencin de la sustancia no retenida es de un minuto, calcular los anchos de banda en la base de los analitos A y B.

S: a) 0,0692 mm, b) WA= 0,189 min; WB= 0,210 min 7.7.- Qu procedimiento cromatogrfico podra emplearse para separar las histonas (protenas muy bsicas, con un pI en torno a 10) de un extracto proteico crudo? 7.8.- La reaccin catalizada por el enzima E, el cual requiere Mg2+ como cofactor, es:

A + B C + D Se pretende averiguar si esta reaccin es ordenada o al azar. Hay algn indicio previo de que el orden podra ser: Mg2+, A, B. Cmo se podra investigar esta cuestin mediante procedimientos cromatogrficos? (sugiere ms de una forma). 7.9.- La glutamato-deshidrogenasa (GDH) es un enzima que cataliza la siguiente reaccin:

Glutamato + NAD+ + H2O -oxoglutarato + NH4+ + NADH + H+ El aspartato acta como inhibidor competitivo de esta reaccin. El GDP es un activador alostrico (unin a un sitio distinto al de los sustratos) de la reaccin. Para comprobar estas propiedades se realiza una cromatografa de afinidad en columna de agarosa a la que se ha unido el aspartato (-CO-CHNH2-CH2-COOH) como ligando. Se aplica entonces a la columna una fraccin purificada del enzima GDH, en forma de varias alcuotas en diferentes medios de elucin: 1) Tampn pH=7.0 2) Tampn + NAD+ 2 mM 3) Tampn + GDP 5 mM 4) Tampn + NAD+ 2 mM + GDP 5 mM 5) Tampn + NAD+ 2 mM + Glutamato 0,1 M

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7.12.- Qu ocurre si se representa Ve frente a log MM en lugar de Kav frente a log MM? Servira tambin para la obtencin de la masa molecular de una protena problema? 7.13.- Cules son los valores lmite tericos de Kav? Qu indicara si se obtiene para una protena una Kav> 1? Sera correcta la deduccin de la masa molecular para esa protena? Por qu? Cmo podra evitarse el fenmeno que origina valores de Kav> 1? 7.14.- Se pretende determinar la constante de disociacin del triptfano a la seroalbmina humana y para ello se emplea una columna cromatogrfica rellena de Sephadex G-25 y equilibrada con un tampn conteniendo triptfano a concentracin conocida. Se aplica en la columna 20 mg de la protena disueltos en 1 mL de la disolucin de equilibrado y se eluye con la misma disolucin. La elucin cromatogrfica es registrada continuamente midiendo la A280. La experiencia se repiti empleando 5 concentraciones diferentes de Trp en la disolucin tampn de equilibrado. Se determin en todos los casos el rea del pico vacante (Tabla)

[Trp], M (en tampn de equilibrado)

rea pico vacante (A280 x mL)

3,4 0,42 5,8 0,62 8,1 0,72 10,4 0,84 14,7 0,97

Determina la constante de disociacin (Kd).

Datos: 280 Trp= 5560 M-1cm-1; MM albmina humana= 69000. Asumir un solo sitio de unin para el Trp, dado que la protena es monomrica. La funcin de saturacin para este caso es: = [Trp]/(Kd + [Trp]) S: n= 1; Kd= 9,72 M, Ka= 0,103 M-1 7.15.- Se desea concentrar una disolucin de una protena que se halla disuelta a 0,24 mg/mL en tampn Tris 20 mM pH 8,1 (pKa= 8,1). La masa molecular de la protena es de 24000 y su pI=6,0. Describe al menos dos procedimientos cromatogrficos que permitan concentrar esta protena. Describe los detalles de los procedimientos. 7.16.- Se hidroliz, por tratamiento con HCl 6 M (30 horas), una cierta cantidad de una protena y el hidrolizado resultante se pas a travs de un analizador automtico de aminocidos obteniendo los resultados de la Tabla.

mols Mr Ala 0,147 89 Arg 0,105 174 Lys 0,126 146 Gly 0,168 75 Met 0,042 149 Ser 0,252 105

El tratamiento de la misma protena con tripsina dio lugar a una serie de pptidos ms cortos cuyo nmero no pudo determinarse con exactitud (por solapamiento de manchas en cromatografa en capa fina bidimensional), pero se estim en torno a 10. Determina la masa molecular de la protena.

PROBLEMAS T8 (Clase) ELECTROFORESIS

8.1.- En unas determinadas condiciones de electroforesis, la velocidad de movimiento de la Gly a pH 9,5 es de 2 cm/h. Cul ser la velocidad a pH 8,1 y a pH 5,5? Cul sera la velocidad mxima que puede alcanzar la Gly y a qu pH se producira? Datos: Gly: pK1(COOH)= 2,4; pK2(NH3+)= 9,8 S: pH= 8,1; 0,12 cm/h hacia el nodo; pH=5,5; 4,5 10-3 cm/h hacia el ctodo. 8.2.- Una mezcla de tres tripptidos se intenta separar por electroforesis en papel. Qu pH es el ms adecuado para obtener una buena separacin?

A: His-Glu-Ser B: Lys-Asp-Arg C: Val-Glu-Arg

8.3.- Los dipptidos -aspartilhistidina y -aspartilhistidina poseen las siguientes caractersticas de disociacin:

Determinar la relacin entre las movilidades electroforticas de ambos pptidos en disolucin a pH 1,90. Cul sera la tcnica ms apropiada para su separacin: electroforesis de zona o electroenfoque? S: / = 1,19 8.4.- El gel de poliacrilamida se emplea tanto en cromatografa de exclusin molecular como en electroforesis. En cromatografa las molculas ms grandes eluyen antes, sin embargo en electroforesis quedan ms retardadas. A qu se debe esta diferencia de comportamiento? 8.5.- Haz un esquema del resultado de una electroforesis en acetato de celulosa (pH 7,0) de las siguientes protenas (el punto de aplicacin de la muestra es el centro de la tira). Comntalo brevemente.

MM pI Protena A 60000 7,0 Protena B 20000 8,0 Protena C 60000 5,0

pK1 pK2 pK3 pK4 -Asp-His 2,45 3,03 6,82 7,98 -Asp-His 1,90 2,95 6,90 8,72

8.6.- Interpreta las siguientes representaciones de Ferguson. Indica las relaciones relativas, en cuanto a carga, masa y densidad de carga, entre las protenas representadas en cada grfica.

8.7.- Se ha determinado la movilidad electrofortica relativa del enzima lactato-deshidrogenasa y de varias protenas patrn en electroforesis en gel de poliacrilamida al 7.5 % en presencia de SDS, obtenindose los valores de la Tabla:

Muestra Patrones

protena Lactato-deshidr. BSA Catalasa Glutamato-

deshidr.

Glicerald- 3-P-

deshidr. Tripsina Mioglob

MM (kDa) ? 68 60 53 36 23.3 17.2 Rm 0,455 0,18 0,22 0,29 0,40 0,60 0,74

Calcula la masa molecular de la lactato deshidrogenasa.

S: MM 33,9 kDa. 8.8.- Una electroforesis discontinua de protenas se lleva a cabo en las siguientes condiciones:

Tampn de electroforesis: cido actico/alanina pH 5,0

Gel concentrador: 5 % acrilamida; tampn cido actico/acetato sdico pH 5,0

Gel separador: 14 % acrilamida; tampn cido actico/ acetato sdico pH 4,0

Indicad cul es el in gua (leading ion), y el in de rastreo (trailing ion). Enumerar las discontinuidades introducidas.

5% acrilamidatampn cido actico/acetato sdico, pH 5.0

14% acrilamidatampn cido actico/acetato sdico, pH 4.0

tampn electroforesis cido actico/alanina, pH 5.0 +

-

Log Rm

% acrilamida

A

B

Log Rm

% acrilamida

AB

CD

1 2

8.9.- La electroforesis de un enzima, previamente tratado con SDS y 2-mercaptoetanol, en gel de poliacrilamida conteniendo SDS genera dos bandas con movilidades relativas de 0,51 y 0,56. La masa molecular del enzima activo, determinada por cromatografa de exclusin molecular sobre Sephacryl S-200 HR (confirmada por ultracentrifugacin) es de 130000.

Indica la posible estructura cuaternaria del enzima as como la masa molecular de sus subunidades. La movilidad relativa de protenas patrn sometidas a electroforesis en presencia de SDS en iguales condiciones se muestra en la siguiente Tabla:

Protena Masa molecular Movilidad

relativa Mioglobina 17800 0,75 Tripsina 23600 0,60 G3PDH 36000 0,40 Ovoalbmina 43500 0,16

S: MM= 26000 y 28000.

8.10.- Una protena oligomrica se somete a electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS bajo dos condiciones diferentes:

1) La protena, en estado nativo, se trata durante un tiempo limitado con un agente entrecruzador (ello lleva a la unin covalente, parcial, de las cadenas polipeptdicas que estn en contacto en la estructura nativa). Tras la electroforesis SDS-PAGE se obtienen 4 bandas con Rm 0,10; 0,30; 0,52 y 0,70.

2) La protena, sin tratamiento previo, se somete a SDS-PAGE y se obtienen 2 bandas de Rm 0,52 y 0,70. El densitometrado del gel proporciona unos valores de 33690 y 12578 unidades arbitrarias respectivamente para estas dos bandas.

Por otro lado se someten a electroforesis en las mismas condiciones 4 protenas patrn de masas moleculares 15, 40, 60 y 90 kDa las cuales generan 4 bandas con Rm de 0,82; 0,40; 0,22 y 0,04 respectivamente.

Cul es la masa molecular de la protena en estado nativo? Qu conclusiones se pueden deducir respecto a la estructura cuaternaria de la

protena? S: MM nativo 80 kDa

8.11.- La siguiente Tabla muestra el comportamiento de una protena X, comparada con patrones de masa molecular conocida, en SDS-PAGE y en geles en gradiente de poliacrilamida (PAGGE).

SDS-PAGE PAGGE Rm (relativa al azul de bromofenol)

Distancia recorrida (mm)

Protena X 0,47 51 Patrn 15 kDa 0,86 81 Patrn 28 kDa 0,58 66 Patrn 40 kDa 0,43 59 Patrn 65 kDa 0,26 52 Patrn 89 kDa 0,14 49 Patrn 118 kDa 0,04 46

Determina la masa molecular de la protena X. Se obtiene informacin

adicional por haber realizado dos tipos distintos de electroforesis? Se puede determinar Rm, respecto a un marcador (por ejemplo azul de bromofenol) en PAGGE? S: MM SDS-PAGE, 38 kDa; MM PAGGE, 76 kDa 8.12.- La migracin de RNA en geles de poliacrilamida es inversamente dependiente de su masa molecular. Se ha realizado la electroforesis de RNA del fago T5 de E. coli, en un gel de poliacrilamida del 10 %, empleando como patrones RNAs de masa conocida, obtenindose los siguientes resultados:

distancia (cm) 8 6 1,8masa molecular 2,6104 3,8104 8,5104

Calcula la masa molecular de los dos tipos de RNA del fago, sabiendo que

migran 4,3 y 2,4 cm en las mismas condiciones que los patrones anteriores. S: MMD4.3= 5,3104; MMD2.4= 7,.6104 8.13.- Un fragmento de DNA con extremos XbaI-KpnI se introduce en el sitio de clonacin mltiple (EcoRI-XbaI-PstI-KpnI-BamHI-HindIII) de un vector pBS (4,2 kpb). El plsmido circular obtenido se somete a digestin por diversos enzimas de restriccin y los productos se desarrollan en electroforesis en gel de agarosa (0,8 %) junto con patrones de tamao conocido (fragmentos de DNA lineales). Un esquema del gel tras la electroforesis, teido con bromuro de etidio y expuesto a luz ultravioleta se muestra en la figura. Realiza el mapa de los puntos de corte de los enzimas de restriccin utilizados.

Aminocido Abreviatura pKa1 pKa2 pKaR Mr

cido asprtico Asp D 2,09 9,82 3,86 113 cido glutmico Glu E 2,19 9,67 4,25 147 Alanina Ala A 2,34 9,69 - 89 Arginina Arg R 2,17 9,04 12,48 174 Asparragina Asn N 2,02 8,80 - 132 Cistena Cys C 1,71 10,78 8,33 121 Fenilalanina Phe F 1,83 9,13 - 165 Glicina Gly G 2,34 9,60 - 75 Glutamina Gln Q 2,17 9,13 - 146 Histidina His H 1,82 9,17 6,00 155 Isoleucina Ile I 2,36 9,68 - 131 Leucina Leu L 2,36 9,60 - 131 Lisina Lys K 2,18 8,95 10,53 149 Metionina Met M 2,30 9,20 - 131 Prolina Pro P 1,99 10,60 - 115 Serina Ser S 2,21 9,15 - 105 Tirosina Tyr Y 2,20 9,11 10,07 181 Treonina Thr T 2,63 10,43 - 119 Triptfano Trp W 2,38 9,39 - 204 Valina Val V 2,32 9,62 - 117

PROBLEMAS T9 (Clase) CENTRIFUGACIN

9.1.- Calcula la velocidad angular a partir de las siguientes velocidades de rotacin.

a) 2400 rpm b) 1000 rps

Si una partcula situada a 12,5 cm del eje de giro se encuentra girando a las velocidades anteriores, Cul es el campo centrfugo relativo al que se encuentra sometida? S: a) 251,33 rad/s; b) 6283,2 rad/s; a- 806g; b- 503554g 9.2.- Un procedimiento de ultracentrifugacin requiere centrifugar durante 10 horas en un rotor cuyo campo centrfugo relativo mximo es de 150000g. Si el fondo del tubo est situado a 9,8 cm del eje, Qu velocidad debe emplearse? Si debido a un deterioro del rotor este slo puede emplearse a una velocidad mxima de 30000 rpm, Cul puede servir como procedimiento alternativo de ultracentrifugacin bajo esta limitacin? S: 37000 rpm; teniendo en cuenta que 21t1= 22t2 15,2 horas 9.3.- Una suspensin de material biolgico contiene cuatro clases de partculas subcelulares con las siguientes caractersticas:

Partcula s20, w (Svedberg)

Densidad (g/mL)

P1 5,3107 1,405 P2 4,4105 1,410 P3 1,1104 1,292 P4 9,8103 1,102

Disea un esquema de separacin que permita aislar las partculas con un

grado de contaminacin mnimo. S: La cuatro tienen s diferentes se podran separan por centrifugacin diferencial, pero no es posible el aislamiento completo. Si por centrifugacin zonal: P3 y P4 por isopcnica (p.e. sacarosa 10 %- 1,04 g/mL, 50 % 1,23 g/mL). P1 y P2 por centrifugacin zonal de velocidad de sedimentacin en gradiente de densidad. 9.4.- Demuestra que los ribosomas eucariotas, formados por las subunidades 40S y 60S originan una unidad 80S. Asume que tanto el ribosoma completo como sus subunidades son partculas esfricas y que poseen idntico volumen especfico parcial. Cul sera el s de una partcula formada por un dmero de ribosomas? (aplica las mismas suposiciones anteriores).

S: Se trata de demostrar la dependencia de s con M. De Svedberg, s=mp(1-d)/f. Ponemos mp en funcin de M y n Avogadro: mp=M/Na; y f= 6r (r= radio de esfera, de volumen Volp=4/3r3 y Volp=mp/pVolp=M/Nap, as =1/pVolp=M/Na). Sustituyendo s=M2/3{[(4/3)1/3(1-d)]/6[Na2/31/32/3]}. Todo entre las llaves son constantes para todas las partculas (enunciado)s=M2/3K. Ecuacin aplicable a cualquiera de las partculas. s60=M602/3K; s40=M402/3K y srib=(M60+M40)2/3K. Finalmente se llega a: srib3/2=s403/2+s603/2srib3/2=403/2+603/2. srib=80,1S. sdmero=[2srib3/2]2/3; sdmero=[2(80,1)3/2]2/3; sdmero=127,3S 9.5.- Mediante centrifugacin diferencial de un extracto de tejido se obtuvieron 4 fracciones en las que se determin la actividad de 4 enzimas marcadores y de un enzima problema (X) cuya localizacin subcelular se deseaba conocer. Los datos de actividad enzimtica (u.a./mL), junto con los de contenido proteico total en cada fraccin, se muestran en la siguiente Tabla:

Fraccin Protena (mg/mL)RNA-

polimerasaCitocromo-

oxidasa Glucosa-6-fosfatasa

Lactato-DH X

I 0,82 9,43 315,4 266,7 169,3 93,7 II 1,23 0,37 2760,4 505,4 539,7 231,4 III 0,65 0,12 312,6 467,4 352,3 179,7 IV 0,32 0,04 30,8 82,2 446,0 38,7

Cul es la localizacin subcelular ms probable de X?

S: se divide la actividad enzimtica de cada marcador y de X por la concentracin de protena (actividad especfica). 9.6.- Se centrifugan a 30000 rpm las subunidades 30S y 50S ribosomales y el tRNA 4S procariotas en un rotor con los radios de giro (x) siguientes: xmin= 4 cm y xmx=10 cm. Cul es el tiempo necesario de centrifugacin, tsed, para sedimentar completamente la subunidad 50S? Bajo estas condiciones qu % de las partculas 30S y tRNA 4S han sedimentado tambin? S: con la forma integrada de la ecuacin de Svedberg5horas 9min. De nuevo con la misma ecuacin, pero ahora la incgnita el xmn en el que sedimentaran las otras partculas: 30S70 %; tRNA 4S11,83 %. 9.7.- Se pretende separar mitocondrias y cloroplastos desde un homogeneizado vegetal. Ambas partculas presentan una forma similar que puede ser considerada esfrica, pero los cloroplastos son ms voluminosos (8,2 10-3 mm3) que las mitocondrias (5,010-3 mm3). Las densidades tambin son diferentes: 1,22 g/cm3 para los cloroplastos frente a 1,28 g/cm3 para las mitocondrias.

carqu

losbueparcueisoS: apares e clorclorVolmc=rad6(11,0 1,0 9.8moaceultrello18 ultrbasfueresHAParultrmaadjDequlas det

a) Si racterstic condici

b) Ens valores ena separtculas enta que

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Hay quroplastos roplastos l=4/3r3 = 110-5g yios: rm= 0

1-0,781d)64 g/mL.

b) En 65 y 1,22.

8.- Se polecular etiltransfracentrifuo se emp

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Las protenas patrn empleadas fueron: a, catalasa MM 240.000; b, aldolasa MM 158.000; c, seroalbmina bovina MM 68000 y d, citocromo c MM 12500. El gradiente fue fraccionado del fondo a la superficie. S: Aplicando el procedimiento de Martin y Ames (M2/3 vs Distancia) MM=140000. Por el procedimiento de Redon y Calcagno (log M vs log Distancia)MM=141000 9.9.- Cul es la composicin de bases aproximada del DNA del fago T1 de E. coli sabiendo que su densidad de flotacin en cloruro de cesio es de 1,7057 g/mL? S: Existe una relacin emprica que permite deducir: % GC fagoT1= 47,7 % 9.10.- La centrifugacin a 30000 rpm de una determinada partcula en una ultracentrfuga analtica origina los siguientes resultados:

Tiempo (min) Distancia del frente al eje (cm) 2 6,225

10 6,310 14 6,358 18 6,400 22 6,445 26 6,491

Calcula el coeficiente de sedimentacin de la partcula.

S: 29,2S 9.11.- Una protena de volumen especfico parcial () es 0,72 mL/g se somete a ultracentrifugacin analtica (60000 rpm) disuelta en un medio de densidad 1,015 g/mL. Repitiendo la ultracentrifugacin con distintas concentraciones de protena se obtuvieron los siguientes coeficientes de sedimentacin:

Concentracin (mg/mL) s, (Svedbergs) 0,02 9,61 0,05 9,09 0,07 8,77 0,10 8,33

a) Conociendo el coeficiente de difusin de la protena (D= 3,310-7 cm2/s) y

la temperatura de 27C, calcular la masa molecular de la protena. b) Si la viscosidad del medio (27,d) eran 1,160 centipoises (cP) calculad el

coeficiente de sedimentacin estndar de la protena (s20,w) Datos:R (cte gases)= 8,3 J/molK= 8,3107 erg/molK (1 erg=1gcm2/s2). 1 Poise (1 P)= 1 g/cms; 1 cP= 0,01 g/cms; 20,w= 1,009 cP; 20,w= 0,998 g/mL S: a) s0= 10S. MM= 280000, hay que tener en cuenta la ley de Fick que relaciona el coeficiente de difusin, D, con el coeficiente de friccin, f; b) s020,w= 12S.