PROCEDIMIENTOS TECNICOS COLORACIONES …esecarmenemiliaospina.gov.co/2015/images/calidad/mapa3/8...

MANUAL CÓDIGO ADT-S2M5

PROCEDIMIENTOS TECNICOS COLORACIONES

VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 1 de 26

COLORACION MYCOBACTERIUM LEPRAE

1. Propósito u objetivo

Realizar un examen oportuno y de valor diagnóstico para el médico.

2. Alcance

Se realiza a todo usuario que se le haya ordenado y el cual haya sido facturado.

3. Responsable

Área de Microbiologia, Bacterióloga, asignada de turno.

4. Fundamento e información general

La lepra es causada por la bacteria Mycobacterium leprae. No es muy contagiosa y tiene un

largo período de incubación (tiempo antes de que aparezcan los síntomas), lo cual dificulta

saber dónde y cuándo alguien contrajo la enfermedad. Los niños son más propensos que los

adultos a contraerla.

La lepra tiene dos formas comunes: la tuberculoide y la lepromatosa. Ambas formas ocasionan

úlceras en la piel, pero la forma lepromatosa es la más grave y produce grandes protuberancias

e hinchazones (nódulos).

La lepra es común en muchos países del mundo y en los climas templados, tropicales y

subtropicales.

5. Información de seguridad

Use guantes quirúrgicos y ropa de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio

aceptados para el trabajo con suero o plasma.

No use las pipetas aspirando con la boca.

Para mejores resultados, siga las instrucciones.

No use después de la fecha de caducidad

Utilice las normas de Bioseguridad

Este test se almacena a temperatura ambiente. No requiere refrigeración.

6. Muestra, materiales y equipos.

Materiales:

Alcohol Acido

Fuscina ZN

Azul de metileno

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003230.htm



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 2 de 26

Laminas

Pinzas Kelly

Lancetas

Aplicadores

7. Procedimiento

RESPONSABLE P-H-V-A ACTIVIDAD REGISTRO

Coordinador

laboratorio

P Velar por la adquisición, recepción y

almacenamiento de insumos para el área de

Inmunología.

Formato

solicitud de

pedido.

Auxiliar de

Laboratorio

H Protocolo de Lavado de Manos

Auxiliar de

Laboratorio

H Solicitar el esquema corporal.

Auxiliar de

Laboratorio

H Revisar sitio de la lesión.

Auxiliar de

Laboratorio

H Láminas desengrasadas con alcohol al 70%

(nuevas).

Auxiliar de

Laboratorio

H Utilizar Lápiz de punta de diamante.



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 3 de 26

Auxiliar de

Laboratorio

H Utilizar puntas tipo kelly, recubiertas en los

extremos.

Auxiliar de

Laboratorio

H Muestrear: Linfa o Líquido intersticial del lóbulo de

oreja izquierdo, lóbulo de oreja derecho, codo

izquierdo, codo derecho y moco nasal

Auxiliar de

Laboratorio

H Filtrar los colorantes cada 8 días.

Auxiliar de

Laboratorio

H Fijar láminas con mechero.

Auxiliar de

Laboratorio

H Cubrir la lamina con 2 mL de fuscina de ZN por 10

minutos.

Auxiliar de

Laboratorio

H Decolorar con 2 mL de alcohol acido por 1 minuto.

Auxiliar de

Laboratorio

H Enjuagar y agregar 2 mL de azul de metileno por 2

minutos.

Auxiliar de

Laboratorio

H Enjuagar con agua de chorro.

Auxiliar de

Laboratorio

H Dejar secar y se lleva a la bacterióloga para su

lectura

Bacteriólogo H Leer la lamina por índice bacilar

Coordinador

de

laboratorio o

de calidad

V Seguimiento al cumplimiento del procedimiento.

Coordinador

de

laboratorio o

de calidad

A Enviar el formato y las laminas al LSP

RESULTADOS

Índice Bacilar: 2+2+2+1+1/5= 1.6



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 4 de 26

VALOR DE REFERENCIA:

IB= 0.2-3.0 si se leen 5 muestras

8. Anexos o Bibliografía

Guía del Laboratorio de Salud Publica.

Guía del Instituto Nacional de Salud



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 5 de 26

COLORACION DE FIELD-GOTA GRUESA


La prueba tiene por objeto, ser el método de identificación de hemoparásitos en las

muestras sanguíneas, gracias a la visualización de las diferentes formas del Plasmodium

después de un adecuado proceso de tinción.

2. Alcance

Identificar las diferentes formas de Plasmodium en las muestras sangre, después de una

correcta coloración.

3. Responsable

Área de Parasitologia, Bacterióloga, asignada de turno.


La gota gruesa es una técnica de realización sencilla, cuya finalidad es la observación de

trofozoitos de hemoparásitos (fundamentalmente el género Plasmodium, al que pertenecen

las diferentes especies causantes del paludismo o malaria), cuando éstos no pueden

visualizarse directamente en la extensión o frotis sanguíneo.


Prueba para diagnostico microscópico

Todos los componentes son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la

etiqueta.

No utilizar después de la fecha de caducidad.

Filtre los reactivos o colorantes antes de usar.

Debe evitarse su contaminación durante su uso.

Todas las muestras deben considerarse potencialmente peligrosas, manipular como

agente altamente infeccioso.

Realizar control de calidad.


6.1 Muestra: Sangre total tomada en tubo tapa lila (EDTA) Y por punción digital.

6.2 Materiales:

Papel absorbente.

Laminas.

Colorante de Field A

Colorante de Field B.



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 6 de 26

Azul de metileno.

Solución de buffer o amortiguadora

Marcador o lápiz de cera.

Caja de petri/ Lamina concava

6.3 Equipos:

Microscopio.

9. Procedimiento

Modelo forma de Extendido:


Coordinador

laboratorio


almacenamiento de los colorantes.

Formato

solicitud de

pedido.

Bacteriólogo P Alistar la papelería para el registro de los datos

clínicos del paciente, anexar ficha notificación de

SIVIGILA

Bacteriólogo H Se marcan tres láminas, dos para gota gruesa y



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 7 de 26

uno para extendido de sangre periférica (el

extendido se colorea con wrigth técnica

estandarizada por el laboratorio clínico.

Bacteriólogo H Se toma la muestra de sangre con una lanceta

nueva del dedo índice o medio del paciente, se

limpia con algodón y alcohol y después se seca

con una torunda de algodón seco, se limpia la

primera gota de sangre y luego se coloca la gota

sobre la lámina.

Bacteriólogo H Se coloca la gota utilizando otra lamina

portaobjetos formando un cuadrado homogéneo

y se extiende la sangre realizando el menor número

de movimientos sobre la muestra para no dañar la

morfología del parasito

Bacteriólogo H Dejar secar las gotas horizontalmente a

temperatura ambiente.

Bacteriólogo H Para la coloración de Field: Sumergir la lámina

seca por 2 segundos en azul de metileno.

Bacteriólogo H Dejar escurrir.

Bacteriólogo H Preparar en un tubo 3 ml de solución

amortiguadora Ph 7.2, 1 gota de solución A, 1 gota

de solución B, por cada lámina a colorear.

Bacteriólogo H Los colorantes se filtran cada 8 días

Bacteriólogo H Alistar la caja de petri con un aplicador partido en

dos, de tal manera que cada extremo de la lámina

quede sobre el aplicador o sobre la lámina

cóncava.

Bacteriólogo H Colocar la lámina invertida y adicionar el colorante

con una pipeta de pasteur de tal manera que

ocupe todo el espacio, evitar burbujas deje actuar

por 10 minutos.

Bacteriólogo H Dejar escurrir en una toalla de papel y dejar secar.

Bacteriólogo H Informar negativo si no se observa ninguna forma

parasitaria en 200 campos microscópicos.

Bacteriólogo H Si observa Plasmodium, proceder a identificar la

especie parasitaria.

Bacteriólogo H Dejar secar y se lleva a la bacterióloga para su

lectura.

Coordinador

de

laboratorio o

de calidad

V Seguimiento al cumplimiento del procedimiento de

coloración y recuento de parásitos.

Bacteriólogo A Si los resultados se hallan fueran del rango de

tolerancia, tomar las medidas correctivas

Registrar

Formato Acta



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 8 de 26

necesarias.

de Calidad

Resultados

Lineamientos nacionales para la lectura de la gota gruesa

Gota gruesa: Negativo

Resultado negativo:

Se considera cuando se revisan como mínimo 200 campos y no se observa en la muestra

ninguna forma parasitaria:

Resultado positivo:

Especie:

Recuento: parasitos/uL

Realizar el recuento con 200 leucocitos, de la siguiente manera:

Numero de parásitos / μl de sangre = Numero de parásitos x 8.000 leucocitos/μl

200 leucocitos

Si hay menos de 100 parásitos en 200 leucocito, hacer el recuento hasta 500 leucocitos,

así:

Numero de parásitos / μl de sangre = Numero de parásitos x 8.000 leucocitos/μl

500 leucocitos

Si la parasitemia es muy alta contar 500 parásitos y los leucocitos que haya encontrado,

usando la fórmula:

Numero de parásitos / μl de sangre = 500 parásitos x 8.000 leucocitos/μl

Numero leucocitos contados

Para Plasmodium vivax:



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 9 de 26

Se cuentan todas las formas indistintivas a la vez, es decir no se clasifican sus formas.

Para Plasmodium falciparum:

Se cuentan todas las formas sexuadas (Gametocitos) o asexuadas (trofozoitos y esquizontes)

presentes en la lámina.

Para infección mixta:

Primero se cuenta la especie más predominante y posteriormente la que se encuentra en menor

número.

EJEMPLO DE INFORME DE RESULTADOS

En los resultados, para los casos en los que se presenten lecturas dudosas en láminas, éstas se

reportaran escribiendo una nota de pendientes por confirmación, y a la mañana siguiente ,

previo informe y revisión con la epidemióloga de la Clínica (para los casos detectados en el

turno de la noche, fines de semana y festivos) y para los casos diurnos su confirmación se

efectuará en las tres horas siguientes como máximo, tiempo en el cual se elevará consulta y

apoyo con la lámina del caso correspondiente al Laboratorio de Salud Pública – Secretaria

de Salud de Florencia.

En caso de que el resultado sea negativo y el cuadro clínico sea muy sugestivo de esta

patología se debe proceder a tomar muestras en los picos febriles del paciente.

Reportar todo caso positivo con género, especie y recuento sin importar la especie.

Toda lámina positiva o negativa debe guardarse para enviar con el reporte a la Secretaría

de Salud Departamental.



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 10 de 26

La forma infectante del parásito es el Esporozoito, las formas asexuadas son los trofozoitos

y las formas sexuadas los gametocitos.

Luego del tratamiento se debe realizar controles a los pacientes, para el caso de P. vivax

control al día 14 y en el caso de P.falciparum al 3 y 5 día; en casos de malaria complicada

y pacientes hospitalizados el control de debe realizar a diario.

Control de Calidad a la coloración:

El control de calidad se debe realizar con una muestra de un Cuadro Hemático el cual

tenga eosinofilia para poder así valorar la viabilidad de la coloración de Field.


Manual de microbiología.

Protocolo de Vigilancia y Control de Malaria- Instituto Nacional de Salud

Diagnostico Malaria: Morfología y recuento – Instituto Nacional de Salud 2013



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 11 de 26

COLORACION DE ZIEHL NEELSEN (ZN)


La prueba tiene por objeto, servir como método de identificación del Micobacterium

tuberculosis en las muestras de esputo enviadas al laboratorio para su análisis.

2. Alcance

Identificar el Micobacterium tuberculosis en el laboratorio clínico.

3. Responsable

Área de Microbiologia, Bacteriólogo, asignada de turno.


La tuberculosis constituye un grave problema de salud pública en Colombia; por tanto, se

requiere de una ardua labor de todas las entidades y personas involucradas en el control

y prevención de la enfermedad. El laboratorio clínico es fundamental en el diagnóstico de

esta patología; por ello, la necesidad de un proceso definido y claro de trabajo para así

lograr una acertada identificación.

La baciloscopia, es la búsqueda microscópica mediante la coloración de Ziehl Neelsen de

bacilos ácido-alcohol resistentes (baar) en cualquier espécimen clínico.

El mecanismo de la acido alcohol resistencia (AAR) es doble y requiere la penetración de

la fucsina al citoplasma bacilar, así como la interacción química con los ácidos micólicos y

los péptidos, glicolípidos presentes en la pared celular de las micobacterias.

Esta reacción impide la salida de la fucsina atrapada en el citoplasma celular, cuando es

expuesta a la acción de alcohol-acido, lo cual asegura la brillantez y el color rojo intenso

de los gérmenes.

El papel del mordiente (solución fenolada) es definitivo porque fomenta la penetración de

la fucsina y su unión con los lípidos bacilares, haciéndola más liposoluble y menos

hidrosoluble.

La coloración se realiza en tres tiempos: tinción, decoloración y contraste.




VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 12 de 26

Prueba solo para diagnóstico in Vitro.


etiqueta.








6.1 Muestra: Esputo.

6.2 Materiales:

Papel Kraft.

Escobillones.

Laminas.

Bata desechable.

Utilizar Elementos de Protección Personal

Tapa Boca N95-

Colorante Fucsina de Ziehl Neelsen.

Alcohol acido

Colorante azul de metileno.

6.3 Equipos:

Microscopio.

10. Procedimiento

Modelo forma de Extendido:


Coordinador P Velar por la adquisición, recepción y Formato



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 13 de 26

laboratorio almacenamiento de los colorantes. solicitud de

pedido.

Auxiliar del

Laboratorio

H Lavarse las manos

Auxiliar del

Laboratorio

H Limpiar el mesón con Hipoclorito de Sodio al 1% y

colocar el papel KRAFT (50 cm aproximadamente).

Auxiliar del

Laboratorio

H Partir un bajalengua en dos tratando que las

puntas queden asperas

Auxiliar del

Laboratorio

H Extender homogéneamente suficiente cantidad

de la partícula mas purulenta y realice el

extendido en un pequeño ovalo centrado de 2

cm*1cm

Auxiliar del

Laboratorio

H Elimine el bajalengua inactivando con hipoclorito

de sodio al 2.5% por 10 minutos y luego descarte

en el guardián.

Auxiliar del

Laboratorio

H Flamear la lamina tres veces por el mechero.

Auxiliar del

Laboratorio

H Filtrar los colorantes cada 8 días

Auxiliar del

Laboratorio

H Cubrir la lámina con 2 ml de fucsina de ZN por un

tiempo de 5 min. Se flamea por 5 min. Calentando

3 veces (sin dejar hervir).

Auxiliar del

Laboratorio


Auxiliar del

Laboratorio

H Decolar con 2 ml de alcohol acido por 3 min.

Auxiliar del

Laboratorio

H Enjuagar y agregar 2 ml de azul de metileno por 1

min.

Auxiliar del

Laboratorio


Auxiliar del

Laboratorio

H Dejar secar y se lleva a la bacterióloga para su

lectura.

Bacteriólogo H Deje caer una gota de aceite de inmersión sobre

el extendido, evitando que la punta del gotero

entren el contacto con el extendido.

Al enfocar la lámina con el objetivo de 100X, se

observaran los bacilos tenidos de color rojo intenso

sobre un fondo azul claro.

Leer e informar

Coordinador

de

laboratorio o

de calidad

V Seguimiento al cumplimiento del procedimiento

de la coloración.



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 14 de 26

Coordinador

de

laboratorio o

de calidad

A Enviar el formato y las láminas al LSP

Informe de Resultados: Escala Semicuantitativa

RESULTADO INFORME

No BAAR en 100 campos No se observan BAAR en la muestra

examinada

1-9 en 100 campos Nº exacto de bacilos en 100 campos

10 y 99 en 100 campos +

1-10 por campo en 50 campos ++

Mayor a 10 por campo en 20

campos

+++

Control de calidad de la coloración

Se debe realizar en forma rutinaria cada vez que se efectué la coloración de Ziehl

Neelsen.



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 15 de 26


Guía del Laboratorio de Salud Pública.

Guía del Instituto Nacional de Salud

COLORACION DE WRIGHT


La prueba tiene por objeto, servir como método de identificación de las diferentes

células sanguíneas, gracias a la visualización de la morfología de las mismas después de

un adecuado proceso de tinción.

2. Alcance

Identificar las diferentes células sanguíneas, partiendo de una muestra sangre y después

de una correcta coloración.

3. Responsable

Área de Hematologia, Bacteriólogo, asignada de turno.


El frotis sanguíneo, una vez seco, se somete a un proceso de fijación y posteriormente a una

tinción mediante un colorante adecuado. En la mayoría de los laboratorios los colorantes

más empleados para la tinción hematológica se basan en el de Romanowsky, constituidos

fundamentalmente por la mezcla de eosina y azul de metileno.

La coloración de Wright es una modificación de la de Leishman (especialmente indicada

para la visualización de parásitos del paludismo) y sus características son similares a las de la

tinción de May-GrÜnwald-Giemsa.




VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 16 de 26



etiqueta.








6.1 Muestra: Sangre total tomada en tubo tapa lila (EDTA).

6.2 Materiales:

Papel absorbente.

Laminas.

Colorante de Wright.

Marcador o lápiz de cera

6.3 Equipos:

Microscopio.

11. Procedimiento


Coordinador

laboratorio



Formato

solicitud de

pedido.

Bacteriólogo H Cubrir la lamina con 3 ml del colorante de WRIGTH

por 3 minutos.

Bacteriólogo H Agregar 2 ml de agua destilada y se sopla hasta

que salga el brillo metálico, tener precaución de

no desbordar el liquido dela lamina se deja por 2

minutos.

Bacteriólogo H Enjuagar con agua de chorro.

Bacteriólogo H Dejar secar y se lleva a la bacterióloga para su

lectura.

Bacteriólogo V Observar el microscopio los aspectos morfológicos

de las células.

Coordinador

de

laboratorio o

de calidad


coloración.

Bacteriólogo A Si los resultados se hallan fueran del rango de Registrar



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 17 de 26


necesarias.

Formato Acta

de Calidad

Resultados

Mediante la coloración de Wright pueden distinguirse los siguientes aspectos morfológicos

de las células:

- forma, dimensiones y contorno de las células sanguíneas.

- Núcleo celular y Restos de cromatina: color purpura.

- Citoplasma de linfocitos: color azul.

- Citoplasma de monocitos: color grisáceo.

- Granulaciones polinucleares: Eosinofilos (naranja), Basófilos (azul oscuro), neutrófilos

(color pardo).

- Hematíes: color rosa pálido.

- Reticulocitos: color azulado.


Manual de hematología.



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 18 de 26

COLORACION LEISHMANIA


Es un método rápido, económico y de fácil realización. Su sensibilidad varía con el

tiempo de evolución de la lesión (a menor tiempo de evolución mayor sensibilidad). El

examen directo puede realizarse de dos maneras: haciendo un raspado del borde

interno de la ulcera o haciendo una incisión y raspando el borde activo de la lesión. La

primera metodología tiene la ventaja de ser menos dolorosa, sangrar menos y ser más

fácil, rápida y económica que la segunda.

2. Alcance

Identificar las diferentes amastigotes, después de una correcta coloración.

3. Responsable

Área de Parasitologia, Bacterióloga, asignada de turno.


El agente etiológico de la Leishmaniasis es un protozoario del genero de Leishmania, que

pertenece al reino Protista, subreino Protozoa, orden Kinetoplastida y a la familia

Trypomastidae. En la actualidad, el género de Leishmania se divide en dos subgéneros,

según su desarrollo en el intestino de los flebótomos vectores: Leishmania, en el intestino

medio o anterior y Viannia, en el intestino posterior, medio y anterior de los flebótomos. Las

leismaniasis se presentan bajo dos formas diferentes. Una promastigota que es móvil y

flagelada, comúnmente encontrada en el vector invertebrado, libre, alargado de 10 a 14

por 1.5 a 3.5 mm, se multiplica en el vector y migra a la parte anterior del mosquito y estalla

allí hasta ser inoculada. Y la amastigota es inmóvil, intracelular, dentro de los macrófagos y

otras células del sistema reticuloendotelial del huésped vertebrado.




etiqueta.









VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 19 de 26


6.1 Muestra: Cualquier tipo de muestra dependiendo la lesión como pápulas, nódulos o

placas, según solicitud de personal médico.

6.2 Materiales:

Guantes.

Algodón.

Alcohol al 70%.

Solución salina.

Jabón quirúrgico.

Gasa estéril.

Laminas portaobjetos.

Lancetas u hojas de bisturí.

Colorante de Field A

Colorante de Field B.

Azul de metileno.

Agua destilada.


6.3 Equipos:

Microscopio

12. Procedimiento



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 20 de 26


Coordinador

laboratorio



Formato

solicitud de

pedido.

Bacteriólogo H Realizar una limpieza del sitio de la lesión, utilizando

gasa impregnada de alcohol, solución salina y/o

jabón quirúrgico.

Si hay costra se debe remover cuidadosamente,

raspando el borde activo de la lesión.

Si hay dos o más lesiones escojan la de MENOR

EVOLUCION.

NOTA: Para la limpieza de la lesión no se debe

utilizar ninguna solución yodada, ya que puede

interferir en la lectura del examen.

Bacteriólogo H Realizar un raspado con el borde romo de una

lanceta o de una hoja de bisturí. Hágalo de

manera tal que no sangre mucho, presionando el

sitio de la lesión hasta hacer isquemia.

Bacteriólogo H Hacer una incisión con bisturí de 3-6mm de

longitud por 1-3mm de profundidad y raspado del

borde activo de la lesión, previa infiltración de 0.1-

0.2 ml de xilocaina, se debe lograr hemostasia

haciendo presión con los dedos.

Bacteriólogo H El material así obtenido se extiende en forma suave

sobre una lamina portaobjetos nueva,

previamente limpia, desengrasada y debidamente

rotulada. Se toman otras tres muestras de la misma

forma, para realizar tres laminas por paciente.

Bacteriólogo H Dejar secar las muestras a temperatura ambiente

teniendo las precauciones necesarias en climas

cálidos y húmedos.

Bacteriólogo H Introducir la lámina en azul de metileno por 5

(nombre del paciente)

(identificación de la lesión)

(fecha)



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 21 de 26

segundos.

Bacteriólogo H Sacar e inmediatamente poner en contacto con

una preparación de 3 ml de sales fosfatadas y una

gota solución de Field A y una gota de solución

Field B. se puede ayudar para esto, con una caja

de petri o un vaso plástico inclinado contra el

mesón para que facilite la capilaridad y el

contacto muestra-solución.

Bacteriólogo H Dejar por 25 minutos.

Bacteriólogo H Dejar secar.

Bacteriólogo H Leer al microscopio en objetivo de 100X con aceite

de inmersión, para buscar los amastigotes que

pueden encontrarse intra o extracelularmente.

Para identificar un amastigote como tal debe

observarse las formas ovaladas o redondeadas y

distinguirse claramente la membrana celular, el

núcleo y el kinetoplasto.

Coordinador

de

laboratorio o

de calidad


coloración.



necesarias.

Registrar

Formato Acta

de Calidad

Resultados

- POSITIVO: Cuando se encuentran uno o más amastigotes al recorrer toda la lámina.

- NEGATIVO: Cuando no se encuentran amastigotes al recorrer toda la lámina.


Manual de parasitología.

Guía para la Atención Clínica Integral del Paciente con Leishmaniasis.

Protocolo de Vigilancia y control de Leishmaniasis- INS-Ministerio de la Protección Social.

COLORACION DE GRAM




VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 22 de 26

La prueba tiene por objeto, servir como método de identificación de las bacterias Gram

positivas y Gram negativas de las muestras enviadas al laboratorio para su análisis.

2. Alcance

Identificar las bacterias Gram negativas y Gram positivas en el laboratorio clínico.

3. Responsable

Área de Hematologia, Bacteriólogo, asignada de turno.


La pared celular de las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano,

además de dos clases de acidos teicoicos: anclado en la cara interna de la pared celular y

unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie el

ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido como

mureina). Por el contrario la capa de péptidoglicano de las Gram negativas es delgada y se

encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta la

interna) por medio de lipoproteínas.

Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas.

La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípidos y lipopolisacaridos. Por lo tanto,

ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de

su pared.

La clave es el peptidoglicano ya que es el material que confiere su rigidez al a pared celular

bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram

negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana

externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos como alcohol/acetona. La

capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el

complejo de cristal violeta/yodo que se formo previamente, y por lo tanto este complejo se

escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario las Gram positivas al

poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son

susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros

cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y

manteniendo la coloración azul-violácea.



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 23 de 26

El Cristal Violeta: (colorante básico/catiónico), se combinan con los constituyentes

celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos

ácidos, este penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram

negativas).

El Lugol: Está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está

presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en

solución acuosa con el cristal violeta. La mayor cantidad de ácidos grasos en los

microorganismos gran positivos generan más afinidad por los agentes oxidantes. Todos los

mordientes (como el yodo) son oxidantes; su efecto consiste en dar a la sustancia oxidada

un carácter más ácido.

El Alcohol-Acetona: Sirve para realizar la decoloración. El alcohol acetona empleado para

aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con

mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram

negativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células gram positivas) se

disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta

con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general

de la pared celular.

Fucsina: Es un colorante de contraste utilizado para distinguir las bacterias Gram

negativas. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas,

mientras que las Gram positivas permanecen azules.




VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 24 de 26



etiqueta.








6.1 Muestra: Cualquier tipo de muestra, según solicitud de personal médico.

6.2 Materiales:

Papel absorbente.

Laminas nuevas.

Colorante violeta de gram.

Colorante lugol de gram.

Alcohol cetona.

Colorante fucsina de gram.


6.3 Equipos:

Microscopio.

Reloj cronometro digital.

13. Procedimiento


Coordinador

laboratorio



Formato

solicitud de

pedido.

Bacteriólogo H Flamear la lámina tres veces por el mechero.

Bacteriólogo H Colocar las láminas fijadas sobre el soporte con el

extendido hacia arriba, separadas y con el número

de identificación orientado hacia quien colorea.

Bacteriólogo H Cubrir el extendido con 0.5 ml de violeta de gram,

Dejar por 1 minutos.


Bacteriólogo H Agregar 0.5 ml de lugol de gram, por 1 minuto.



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 25 de 26


Bacteriólogo H Decolorar el extendido con 0.5 ml de alcohol

cetona por 15 segundos.


Bacteriólogo H Agregar al extendido 0.5 ml de fucsina de gram

por 40 segundos.

Bacteriólogo H Lavar con agua de chorro y escurrir.

Bacteriólogo H Dejar secar.

Coordinador

de

laboratorio o

de calidad


coloración.



necesarias.

Registrar

Formato Acta

de Calidad

Resultados

Los microorganismos Gram positivos: al microscopio se observan de color violeta.

Los microorganismos Gram negativos: al microscopio se observan de color rojo.

Control de calidad de la coloración

Se debe realizar en forma rutinaria cada vez que se efectué la coloración de Gram.

Control Gram positivos

Se debe efectuar con una cepa de Gram positivos previamente identificada y conocida, para

lo cual se pueden emplear extendidos pequeños, utilizando una gota de solución salina estéril y

una colonia de la cepa seleccionada, dejar secar, fijar, rotular como control de Gram positivos y

guardar protegidos de la luz para ser usados cada vez que se realiza la coloración de Gram.

Control Gram Negativos

Se debe efectuar con una cepa de Gram negativos previamente identificada y conocida, para

lo cual se pueden emplear extendidos pequeños, utilizando una gota de solución salina estéril y

una colonia de la cepa seleccionada, dejar secar, fijar, rotular como control de Gram negativos

y guardar protegidos de la luz para ser usados cada vez que se realiza la coloración de Gram.

Control De Calidad Interno



VERSIÓN 1

VIGENCIA 14/09/2015

PÁGINA 26 de 26

Se prepara varios extendidos disponiendo sobre las láminas portaobjetos una gota de

solución salina

Se coge una colonia de la cepa ATCC de Gram (+) y se emulsiona en la solución salina

Se coge una colonia de la cepa ATCC de Gram (-) y se emulsiona en la misma gota de

la solución salina.

Se extiende y se deja secar.

Se marca en un extremo: Control Gram

Se guardan en una caja de láminas marcada: Control de coloración de Gram y la fecha

de la preparación.

Se colorea una lámina de control de Gram al tiempo con las láminas de las muestras de

los pacientes de la rutina.

Se realiza la lectura: verificando la presencia del germen Gram (+) y Gram (-), violeta y rosada

respectivamente.


Manual de microbiología.

JACQUELINE OLAYA MARTINEZ CARGO: AUDITORA DE CALIDAD DE APOYO DIAGNOSTICO Y TERAPEUTICO.

NOMBRE: ESAIN CALDERON IBATA. CARGO: COORDINADOR DE GARANTIA DE LA CALIDAD

NOMBRE : DAVID ANDRES CANGREJO TORRES CARGO: GERENTE

ELABORO REVISO APROBÓ

PROCEDIMIENTOS TECNICOS COLORACIONES …esecarmenemiliaospina.gov.co/2015/images/calidad/mapa3/8...

Documents

Transcript of PROCEDIMIENTOS TECNICOS COLORACIONES …esecarmenemiliaospina.gov.co/2015/images/calidad/mapa3/8...