PROCESOS 1

FUNDAMENTOS DEL PROCESO DE FIJACIÓN TISULAR

FIJACIÓN TISULAR

Fundamento: Consiste en interrumpir los procesos degradativos que aparecen tras la muerte celular, tratando

de conservar la arquitectura y composición lo más proxima posible a como se encontraba en el organismo

vivo.

Los procesos degradativos son: AUTOLISIS Y PUTREFACCIÓN

AUTOLISIS: Es el proceso por el cual después de la muerte, se produce la autodigestión enzimática celular,

tras la salida del contenido lisosómico al citoplasma por rotura de las membranas de estos orgánulos.

INTRINSECO (propio).

PUTREFACCIÓN: Efecto ejercido por determinadas toxinas y encimas bacterianas sobre los tejidos. Los

microorganismos que originan esta acción son de carácter saprofito y complementan el efecto lítico de la

autolisis hasta conseguir la total destrucción celular. EXTRINSICO.

Sobre ambos procesos influyen diversos factores que dependen:

a) Naturaleza del tejido: ej, el páncreas es un tejido rico en enzimas digestivas, o el intestino que

contiene gran cantidad de gérmenes.

b) De la temperatura: A mayor temperatura ambiente, mayor velocidad de autolisis y putrefacción.

Los puntos clave de un fijador son:

Preservación de las estructuras celulares y tejidos con minima o nula alteración de su estado natural.

Protección ante los siguientes procesos de inclusión y sección.

Preparación para los procesos de tinción y visión tanto con el microscopio óptico como con el

electrónico, para resistir el haz de fotones.

Como regla general la fijación se realiza tomando una sección de un tejido o material biológico que se coloca

en un líquido fijador (inmersión), de forma alternativa y en casos de experimentación pueden realizarse otros

sistemas de fijación como la perfusión del líquido fijador a través del sistema vascular.

Habitualmente se realiza primero la fijación de la pieza, a ser posible (siempre que no se vayan a realizar

técnicas que requieran su manejo en fresco) en el mismo lugar donde se ha realizado la extracción, quirófano,

sala de punción etc. Por estos motivos casi siempre se utilizan fijadores standard tanto para microscopía óptica

como electrónica y solo en casos especiales se utilizan otros fijadores.

En los cadáveres el problema del tiempo no es con respecto a la fijación de la muestra, pero si lo es el tiempo

que ha transcurrido entre la muerte y la autopsia, ya que este tiempo marca la intensidad de autolisis que

presenten los órganos. Para microscopia óptica el tiempo en que la imagen histológica no muestra

prácticamente alteraciones es de aproximadamente hasta 4-6 horas postmortem. (Si pasan más horas, aparecen

cambios morfológicos importantes).

El proceso de fijación es una interacción entre el fijador y grupos químicos del material a fijar. Es muy difícil

definir exactamente como se realiza este proceso. Los fijadores que se utilizan habitualmente en microscopia

se basan en la desnaturalización (rotura de uniones químicas, es decir, se rompen los puentes de hidrogeno de

las proteínas) y polimerización (reacción entre el fijador y el material a fijar formando uniones estables entre

compuestos químicos). En la microscopia óptica se utilizan fijadores cuyo mecanismo de acción es tanto

desnaturalizar como polimerizar.

La parafina no se lleva bien con el agua y el alcohol, por los tanto hay los pasos previos a la inclusión. Para

quitar el agua, deshidrataremos el tejido para eliminarla, esto lo haremos con OH, no se puede pasar de agua a

OH Abs porque el tejido sufriria una retracción muy fuerte (aguaOH 50ºC OH 70ºC OH 96ºC OH

Abs). Una vez eliminada el agua, hay que eliminar el OH, esto lo haremos con un aclarado de Xilol.

PRINCIPIOS GENERALES DE LA FIJACIÓN

1. No existe un método universal de fijación (un agente fijador adecuado para un tejido, puede no serlo

para otro).

2. No todos los fijadores conservan indefinidamente el tejido, ya que fijación no es equivalente a

conservación tisular.

3. Un defecto en la fijación jamás puede ser corregido.

4. Es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con graves defectos en la fijación.

CLASES DE AGENTES FIJADORES SEGÚN SU MECANISMO DE ACTUACIÓN

Los clasificamos en dos grupos:

Fijadores por métodos físicos: Se emplea el enfriamiento por congelación del tejido como método

para retrasar los procesos de autolisis y putrefacción tisular. Se usa en las biopsias intraoperatorias.

Fijadores por métodos químicos: Los agentes fijadores generalmente en forma líquida, actúan

desnaturalizando e insolubilizando las proteínas tisulares, lo cual bloquea la autolisis por inactivación

enzimática. Además algunos impiden el crecimiento bacteriano.

La fijación por métodos físicos es el método de elección para realizar estudios morfológicos y funcionales en

los que se quiere conservar intacta la estructura antigénica del tejido.

Para ello el material mas adecuado es el que no está fijado. De ahí que se proceda a la congelación de las

piezas en fresco, al objeto de conservarlas hasta el momento de realizar la técnica y además darles la

consistencia adecuada para su corte en secciones microscópicas.

El sistema de congelación es muy importante ya que congelaciones inadecuadas alteran la conservación

antigénica, afectan notablemente la morfología, dificultan el corte y en conclusión pueden conducir a

alteraciones tales que impidan la valoración de las técnicas inmunohistoquímicas.

El mejor método es la congelación en nitrógeno líquido mediante baño de isopentano. Esto da lugar a una

congelación adecuadamente rápida (que impide la formación de los cristales de hielo típico de los métodos

lentos), a muy baja temperatura (por debajo de los 100ºC) y sin contacto directo del nitrógeno con material a

congelar.

El material ha de estar en fresco y bañado completamente en suero fisiológico. La sección no ha de ser mayor

que 1x1 cm, con un grosor de 0,2 cm.

CARACTERISTICAS DE LOS FIJADORES POR MÉTODOS QUÍMICOS

CARACTERISTICAS QUE DEBE POSEER EL LÍQUIDO FIJADOR IDEAL:

1. Bloquear de inmediato la autolisis: Este efecto depende principalmente de su poder para producir la

desnaturalización de las proteinas, de forma que la actividad enzimatica del tejido queda paralizada.

Esta capacidad está relacionada fundamentalmente con la velocidad de penetración y de fijación que

posea el agente fijador.

a. Velocidad de penetración: Es la rapidez con la que un fijador se infunde en el interior de un

tejido. (1mm/h) Recuerda que puedes alterar la velocidad de penetración haciendo piezas mas

pequeña.

Influye en el tamaño de la pieza.

Velocidad es directamente proporcional al tamaño de la pieza.

b. Velocidad de fijación: No tiene que ser coincidente con la velocidad de penetración, por

ejemplo la formalina tiene una velocidad de penetración rápida pero fija con cierta lentitud.

Ello explica que el proceso de la fijación es un fenómeno químico determinado por el tiempo

que cada fijador tarda en precipitar y estabilizar los componentes químicos de los tejidos (lo

que tarda en romper los puentes de hidrogeno).

2. Efecto microbicida: Impide o retrasa la acción bacteriana desencadenante de la putrefacción.

3. No provocar en el tejido retracciones ni distorsiones, que determinen anomalías en su arquitectura.

Va a depender principalmente de los cambios inducidos de presión osmótica.

4. Inducción de cambios de textura y composición tisular, que favorezcan la inclusión, corte y

coloración.

Con lo cual podemos decir que no existe un fijador ideal, o lo que es lo mismo, todos los fijadores

actualmente disponibles ofrecen ventajas e inconvenientes que los harán indicados para cada tipo de muestras.

*No se puede usar formalina pura para fijar un tejido, ya que esta lo dañaría gravemente, así que hay que

reducirla*

REGLAS GENERALES A CONSIDERAR EN EL EMPLEO DE LÍQUIDOS FIJADORES

1. Colocar el tejido en el líquido fijador lo más rápidamente posible.

2. El tejido debe estar seccionado en láminas de hasta 4mm de grosor máximo. Si se realiza en un órgano

entero se deben realizar incisiones sobre superficie y apertura de cavidades, para que el líquido fijador

penetre rápidamente en su interior.

3. El volumen necesario de fijador está determinado por el tejido que se va a fijar. La relación de

volumen / pieza es de 20/1. (recipiente adecuado).

4. La presión osmótica del líquido fijador y el tejido serán equivalentes, si es necesario debe

compensarse la del primero utilizando soluciones salinas como agente de disolución.

5. El pH del líquido fijador debe aproximarse al pH fisiológico, salvo que su composición deba

contener ácidos. El pH estará entre 7 y 8.

6. El tiempo de fijación es específico para cada fijador, pero existe un tiempo máximo de fijación que

no debe ser sobrepasado.

FORMALDEHIDO O FORMOL (CHOH)

Es el fijador más clásico para microscopia óptica, es el tipo más simple y pequeño de los aldehídos, su peso

molecular es de 30. Para microscopía electrónica el fijador no podrá ser un formaldehído, sino glutamato.

La solución comercial de formaldehído (formalina) es al 40%, se acompaña de cantidad considerable de

metanol, entre un 11 y 16% que potencialmente puede actuar como fijador coagulante y desnaturalizador de

las proteínas, el agente induce la rotura masiva de los puentes e hidrogeno, determinantes de la estructura

helicoidal de las moléculas proteicas dando lugar a la formación de una red o malla reticular polipeptídica por

asociación de los grupos activos desenmascarados por el fijador.

Recuerda que el formol a 37-38% es al 100%

La formalina es una mezcla de formol, alcohol y agua y si queremos potenciar la velocidad de fijación

cambiaremos el alcohol por metanol.

VENTAJAS:

Es el fijador mas barato que existe (utilizado en los trabajos de rutina de los laboratorios de AP).

Es un buen fijador único (moderada conservación de la estructura tisular) pero podríamos decir que no

va demasiado bien con todas pero tampoco va demasiado mal.

Buen desinfectante y no endurece excesivamente los tejidos (conservar y almacenar biopsias y piezas

quirurgicas).

Provoca escasa retracción tisular, ya que su presión osmótica es muy parecida a la del tejido, por lo

tanto no expulsará mucha agua fuera del tejido.

Velocidad de penetración intermedia (aproximadamente 1mm/h apenas altera la coloración tisular por

ello es el agente de elección para fijar grandes piezas quirúrgicas

.

Excelente fijador para el tejido adiposo y lípidos en general. Fijación del tejido nervioso (con

formol salino). Impregnaciones argenticas (técnicas de coloración).

El proceso de fijación puede ser acelerado o retrasado, modificando la temperatura.

o A temperatura ambiente se consigue fijación en 24h-36h

o A 35ºC – 12-24h

o A 55ºC – 3h Las proteínas se desnaturalizan y se produce una retracción del tejido

provocando una gran deshidratación, por lo tanto no es aconsejable.

Es compatible con la mayor parte de las tinciones.

Relativa capacidad de fijación de las proteínas, pigmentos que contienen hierro y derivados.

(hemoglobina y hemoxiderína (destrucción de glóbulos rojos)

INCONVENIENTES

Por acción de la luz se transforma en ácido fórmico para evitar este inconveniente se deben guardar en

frasco topacio o emplearse en forma de soluciones neutras o tamponadas.

Debido a su incorporación progresiva al tejido en forma de puentes metilicos, el formaldehído se

consume durante el proceso de fijación, por lo cual debe encontrarse siempre en exceso. (20/1)

Por esto y por su baja presión osmótica (1800s), incorpora agua en los espacios intratisulares y el

volumen del tejido disminuye una vez fijado. (disminuye el volumen y aumenta el peso)

Para evitar esto se utiliza formol salino o amortiguado con tampones o solución de sacarosa.

Produce vapores irritantes sobre la mucosa nasal y conjuntiva.

Tras la utilización prolongada de formalina y por su conversión en ácido fórmico puede producirse una

reducción masiva de la hemoglobina hasta originar un precipitado cristalino birrefringente de color

pardonegruzco dificulta la observación al microscopio, y recibe el nombre de pigmento formólico.

(se produce una degradación y destrucción de la hemoglobina, por lo tanto se destruye el tejido).

SOLUCIONES FIJADORAS SIMPLES QUE CONTIENEN FORMALDEHIDO

a) FORMOL SALINO (Tejido nervioso, similar al formol taponado).

Se utiliza para prevenir el efecto osmótico que provoca el empleo de soluciones de formaldehido en

agua destilada. (Las muestra aguantan menos en formol salino)

COMPOSICIÓN: Formol al 10% …………. 100ml

Cloruro sódico…………. 9g

1 parte de formol comercial y 9 partes de H2O

Se parte del formol comercial al 100%

b) FORMOL TAMPONADO (Todo)

Es la solución mas empleada hoy día para prevenir el choque osmótico que provoca la disolución de

formalina en agua destilada, así como el deposito de pigmento formólico que ocurre a pH inferior a 6.

COMPOSICIÓN: Como amortiguador se emplea el tampón fosfato calibrado a pH 7,0 – 7,2.

Formalina comercial (formol) al 100%.....................100ml

Fosfato sódico monobásico………………………….4g

Fosfato sódico dibásico…………………………..…6,5g

Agua destilada…………………………………..….900ml

1L de formol al 10% formalina + agua destilada

c) FORMALINA ÁCIDA (es muy parecida al formol salino)

Se emplea para fijar el tejido nervioso en la preparación de algunas técnicas de impregnación

argéntica.

COMPOSICIÓN:

Ácido acético glacial……………….1cc

Formalina al 10%..................... ……99cc (partes)

d) FORMOL CALCICO DE BAKER (Tecnicas histoenzimatológicas)

Añadir CaCl2 al 1% a una solución de formalina neutra o tamponada al 10%

COMPOSICIÓN

10 ml solución ClCa2 al 1%

990 ml de formol tamponado

MEZCLAS FIJADORAS QUE NO CONTIENEN FORMOL

LÍQUIDO DE ZENKER (Biopsias de medula ósea, ya que es descalcificante)

Preparación: Solución stock de Zenker………………. 95ml

Ácido acético glacial…………………… 5ml

Solución stock: Cloruro de mercurio……………… 5g

Dicromato potásico………………. 2,5g

Sulfato sódico……………………. 1g

Agua destilada…………………… 100ml

LIQUIDO DE CARNOY (para el músculo y el hígado, se puede ver el glucogeno)

Es el mejor fijador para el glucógeno, y en general para los hidratos de carbono simple y para proteínas

fibrilares pero sobre todo para las miofibrillas. Sin embargo, produce una excesiva retracción histica así como

hemólisis de los eritrocitos y pobre conservación estructural de las proteínas globulares y del ADN.

Preparación:

Etanol absoluto………………. 60ml

Cloroformo………………….. 30ml

Ácido acético glacial………... 10ml

El mayor endurecimiento se produce al prolongar el tiempo de deshidratación en alcohol se puede prevenir

sustituyendo el etanol por metanol y produce menos retracción.

MEZCLAS FIJADORAS

Se clasifican en dos grandes grupos, dependiendo de que contengan o no formaldehído en su composición.

a) Mezclas fijadoras que contienen formol + otros fijadores

LIQUIDO DE BOUIN (piel, órganos endocrinos, testículos)

Es una mezcla utilizada como alternativa a la formalina, velocidad de penetración y fijación rápida.

Preparación: Solución saturada de ácido pícrico………….. 750ml

(Ácido pícrico al 1-2% en agua destilada)

Formalina comercial 40%................................ 250ml

Ácido acético glacial………………………… 50ml

pH final aproximado…………………………. 2,2

tiempo de fijación: de 2 a 24h

OBSERVACIONES: Tras la fijación, lavar abundantemente con alcohol de 70º hasta la decoloración

de la muestra para asegurarse la completa desaparición del ácido pícrico.

BOUIN ALCOHOLICO: (Dubosq-Brasil)

Constituyen una alternativa válida a la mezcla clásica de Bouin cuando la pieza que se va a fijar es

voluminosa (velocidad de penetración más elevada) y cuando se precisa una fijación especifica de

sustancias hidrosolubles como el Glucogeno, ya que evita su disolución.

Preparación:

Alcohol etilico al 80º……………. 75ml

Ácido pícrico…………………… 0,5g

Formalina concentrada 40%......... 30ml

Ácido acético glacial…………… 7,5 ml

OBSERVACIONES: mezclar antes de su uso.

TÉCNICA DE DESCALCIFICACIÓN (hay calcio en los huesos y en los tumores)

MATERIAL: LIQUIDOS DESCALCIFICANTES

1) MEZCLA DE CITRATO SÓDICA – ÁCIDO FÓRMICO

- SOLUCIÓN A: Citrato sódico al 20%

SOLUCIÓN B: Ácido fórmico al 50%

Ambas soluciones se mezclan al 50%, añadiendo la B sobre la A en el momento de usarla.

VENTAJAS:

1. No deteriora los tejidos

2. Descalcifica de 24 – 48 horas

2) FORMOL FÓRMICO AL 20 %

VENTAJAS:

1. Conserva la estructura

2. Su relativa lentitud (40 -50h) lo hace idóneo para descalcificar en fines de semana largos, etc.

3) ÁCIDO NÍTRICO AL 5%

VENTAJAS: Es muy rápido.

INCONVENIENTES: Deteriora los tejidos y no debe emplearse mas de 10 – 24h. Hay que tener

mucho cuidado.

DESCALCIFICACIÓN

Se denomina descalcificación a la completa eliminación de las sales de calcio presentes en los tejidos tras

haber realizado su fijación. Habitualmente este procedeimiento técnico se realiza de forma sistematica sobre

tejidos mineralizados (dientes y huesos) y esporádicamente, sobre material anatomicopatologico con

calcificaciones que dificulten o impidan la observación macroscopica de las lesiones. SOLO ESTÁ

DESACONSEJADO DESCALCIFICAR EL TEJIDO EN LAS ENFERMEDADES METABOLICAS. En

este caso se realizarán cortes de tejido sin descalcificar empleando un microtomo motorizado específico para

seleccionar tejidos duros incluidos en plastico.

Los principales agentes descalcificadores estan formados por acids fuertes o débiles , empleados aisladamente

o en conjunción con distintos líquidos fijadores.

METODO

1. Fijarlos en formol 24h.

2. Lavado de 15-30 minutos en agua.

3. Cortar bloques de 1,5 x 1,5 x 0,5 cm de dimensiones máximas.

4. Introducirlos en líquido descalcificante en proporción 50/1, procurando que todas las superficies

estén en contacto con el mismo. (contra mas líquido mas facilidad)

5. Vigilar la descalcificación cada 12 -24h probando su dureza con aguja o bisturí.

6. Cambiar cada vez el líquido. (2-3 veces).

7. Una vez descalcificadas, lavar con agua corriente las piezas antes de incluirlas en parafina.

METODOS Y TÉCNICAS DE INCLUSIÓN

Con excepción de los tejidos destinados a congelación, la mayor parte de las muestras para estudio

histopatologico requiere da la inclusión en un medio sólido.

La finalidad es proporcionar a la pieza anatómica homogeneidad y dureza suficiente para que se puedan

obtener secciones finas de calidad. Aunque es posible realizar la inclusión en muy diferentes medios, algunos

de ellos hidrosolubles, el método de elección sigue siendo la inclusión en parafina.

El tejido fijado se somete siempre a:

deshidratación

aclaramiento

infiltración

A excepción de la inclusión en un medio hidrosoluble que o requiere de los dos primeros pasos. En los

modernos laboratorios, se realiza de forma automática mediante procesadores de inclusión.

(Formolaguaalcohol)

1) DESHIDRATACIÓN

La deshidratación tiene por finalidad la eliminación completa de agua de la muestra tisular para que

se pueda embeber adecuadamente el tejido en aquellos medios de inclusión que no sean hidrosolubles.

La deshidratación podrá realizarse utilizando cualquier reactivo que sea capaz de absorber el agua de los

tejidos. Las principales condiciones de un agente deshidratante son dos:

a. No debe alterar las estructuras tisulares

b. Debe poder mezclarse con el reactivo intermediario o agente aclarante.

El proceso de deshidratación se suele realizar mediante el empleo de alcohol etílico, empleando una serie

de baños de graduación ascendente hasta llegar al alcohol absoluto, ya que la acción brusca de un alcohol de

elevada graduación sobre el tejido provocaría una elevada retracción de este. (fuerte choque osmótico)

El etanol es el que mejor deshidrata, es barato, no produce cambios estructurales importantes y es

miscible con los aclaradores.

Además del alcohol etílico, puede emplearse como agente deshidratante:

El alcohol metílico/metanol

Acetona

Alcohol butílico

Dioxano

Alcohol isopropílico

Tetrahidrofurano

H2OOH º

50

OH º

70

OH º

96

OHº

Abs

2) ACLARAMIENTO / PASO INTERMEDIO

Es el proceso por el cual se consigue la sustitución del agente deshidratante por una sustancia miscible con el

medio de inclusión que va a utilizarse. Con ello se pretende que toda la pieza histopatológica se encuentre

embebida en un agente químico líquido, en el que pueda disolverse el medio de inclusión, y de éste modo

penetrar en el tejido. Los agentes aclarantes también reciben la denominación genérica de líquidos

intermediarios.

El xileno es el agente aclarante de empleo habitual. También son agentes aclarantes:

El tolueno

Benceno

Cloroformo

Tetracloruro de carbono

Dioxano

El alcohol no es soluble con la parafina.

OHº

AbsXilol Xilol Xilol Xilol

TALLADO

Para realizar un tallado, necesitamos a un patólogo (que hará el tallado) un técnico, una mesa de tallado

(tijeras, bisturís, agujas histológicas, plancha de mármol, sondas, pinzas con dientes y sin dientes, cinta

métrica, cuchillos de autopsia), líquidos (fuente de formol, agua), flujo laminar de gases, un dictafono para

una descripción macroscópica, equipos de protección personal (bata, guantes, mascarilla, gafas…), hojas de

petición y los botes, los casets debidamente identificados del modo que el patólogo indique.

Recuerda que las placas se cortaran cuboidalmente (1,5 x 1,5 x 0,5 cm)

El patólogo decide el método de corte según la estructura de la pieza, es decir, la orientación.

El resultado serán un número de casets identificados con las muestras ya talladas, fijadas y listas para

procesar.

3) INFILTRACIÓN, IMPREGNACIÓN, O INCLUSIÓN PRÓPIAMENTE DICHA.

Tiene por objeto rellenar o infiltrar completamente la muestra histopatológica con el medio que se va a utilizar

para embeber el tejido. El medio de inclusión ocupará por completo los espacios intra y extracelulares

inicialmente rellenos por el agua intratisular. Para conseguir éste efecto, casi siempre es imprescindible

eliminar todos los restos aclarantes residuales en el tejido.

INCLUSIÓN EN PARAFINA

Para la infiltración en parafina se usan habitualmente parafinas con punto de fusión de 56 a 58 grados

centígrados. Se realiza mediante baños sucesivos en parafina fundida. Estos baños deben renovarse

frecuentemente, porque se cargan de medio de aclaramiento y ello provoca descenso en el punto de fusión de

la parafina, volviéndola más blanda y menos apropiada para el corte. Además, por evaporación del solvente

después de la inclusión, se produce la desecación y retracción de la pieza lo que le da un aspecto típico de

cuero curtido de las inclusiones defectuosas.

Para procedimientos no rutinarios es posible realizar la infiltración en el vacío, que produce una infiltración

más rápida.

La inclusión en parafina de un tejido se puede realizar:

de forma manual

automática

El procedimiento manual ha sido desplazado por sistemas automáticos, pero sigue siendo válido para

el procesamiento de muestras que por su volumen, por ejemplo: piezas quirurgicas completas, o por su

extrema delicadeza no pueden ser incluidas en el procesador automático. Cuando hay que hacer una

inclusión rápida en parafina, el procesamiento manual puede ser acelerado realizando también en

caliente la deshidratación.

En el procesamiento automático se emplean automáticos que contienen multiples vasos para realizar

los baños y un sistema mecánico de transporte a través de ellos regulado por un programador horario.

Estos sistemas poseen tres ventajas fundamentales:

o Procesar simultáneamente gran cantidad de muestras distintas

o Economizar la cantidad de líquidos empleados en el proceso

o Realizar el procesamiento a lo largo de la tarde/noche, pudiendo elaborarse los bloques y

hacerse los cortes en la siguiente jornada de trabajo.

Para obtener buenos resultados es fundamental renovar a menudo los líquidos contenidos en los baños:

su enturbamiento o el olor a líquido aclarante en el último baño de parafina, indica la necesidad de

cambiarlos.

BAÑOS

TIEMPO PARA

PROCESAMIENTO

MANUAL AUTOMÁTICO

Formol 10% líquido de

lavado postfijación2 horas 2 horas

Etanol al 70% 2 a 4 horas 2 horas

Etanol al 96% 2 a 4 horas 2 horas

Etanol absoluto 1 a 2 horas 1 hora

Etanol absoluto 1 a 2 horas 1 hora

Etanol absoluto 1 hora 1 hora

Xileno o tolueno 1 hora 1 hora



Parafina líquida 1 hora 1 hora

Parafina líquida 1 hora 1 hora

Parafina líquida 2 horas 2 horas

TIEMPO TOTAL16 a 22

horas16 horas

BAÑOS TIEMPO PARA

PROCESAMIENTO

RÁPIDO

Formalina tamponada 30 min a 60ºC

Etanol al 70% 30 min a 60ºC


Etanol absoluto 30 min a 60ºC



Etanol acetona 15 min a 60ºC

Acetona 15 min a 60ºC

Xileno o tolueno 15 min a t. ambiente



Parafina líquida 15 min a 60ºC

Parafin líquida 30 min a 60ºC

Parafina líquida 1 hora a 60ºC

TIEMPO TOTAL 5 HORAS 30 MINUTOS

DESHIDRATACIÓN

sucio interme. limpio

H2O PF H2O PF OH 50º PF OH 70º PF OH 96º PF OH Abs PF OH Abs PF OH Abs

X X 45-60 ‘ 45-60’ 45-60’ 45-60’ 45-60’ 45-60’

2 5 min

15 min

ACLARAMIENTO

Xilol 1 PF Xilol 2 PF Xilol 3

60-90’ 60-90’ 60-90’

PARAFINA

Parafina 1 Parafina 2 Parafina 3

45-60’ 45-60’ 45-60’

FUNCIONES DEL TÉCNICO

Tiene a su cargo la programación del procesador automático el recambio periódico de sus líquidos y la

colocación en su interior de las canastillas que contienen los casetes. L inclusión se inicia al final de la jornada

y se completará durante la tarde/noche. Cuando la demanda de inclusiones es muy elevada, también es

competencia del técnico establecer las prioridades: en primer lugar se procesan las pequeñas biopsias de

diagnóstico, en segundo lugar las piezas quirúrgicas procedentes de cirugía, y por último el material de

autopsias e investigación.

La primera tarea diaria del técnico de AP, será la fabricación de los bloques de parafina correspondientes a la

inclusión del día anterior, una vez extraídas las muestras del procesador automático de tejidos.

En las piezas que requieren orientación especial, es conveniente que participe el técnico que ayudó al

patólogo. También es competencia del técnico el mantenimiento y limpieza del material empleado.

OTROS MÉTODOS DE INCLUSIÓN

Se aplican muy raramente en la práctica diaria, pero son de gran interés para investigación o en determinadas

tecnologías especiales, sobre todo en microscopia electrónica.

Es el caso de la inclusión en:

Medios hidrosolubles, como la gelatina y el polietilenglicol y su derivados.

La inclusión en celoidina.

La inclusión en plástico (resinas)

La principal ventaja de la gelatina es que no se precisa deshidratar el tejido, ya que es soluble en agua, por ello

se emplea cuando los compuestos a determinar no resisten el alcohol ni otros disolventes.

Sólo se emplea en casos muy especiales, y como método previo cuando hay que mantener unidos los

diferentes elementos de objetos heterogéneos que deben cortarse por congelación.

El polietilenglicol y sus derivados se emplean fundamentalmente para la demostración de enzimas, lípidos y

cuantos elementos tisulares puedan ser desnaturalizados por el calor o por el tratamiento con agentes

deshidratantes y aclarantes.

La inclusión en celoidina es recomendable para materiales de grandes dimensiones o excepcionalmente duros

por ej: centros nerviosos de animales grandes o tejido oseo, y también para materiales muy heterogéneos por

ej: el globo ocular. Con este procedimiento se obtienen bloques de gran dureza. La mayor limitación es el

mucho tiempo necesario para completar el procesamiento, dias e incluso semanas, y por otra parte los cortes

obtenidos a partir de celoidina no pueden ser inferior a 10 micras de grosor, por lo general serán de 15 micras.

BAÑOS

TIEMPO PARA

PROCESAMIENTO

RÁPIDO

Formalina tamponada 30 min a 60ºC






Etanol acetona 15 min a 60ºC

Acetona 15 min a 60ºC




Parafina líquida 15 min a 60ºC

Parafin líquida 30 min a 60ºC

Parafina líquida 1 hora a 60ºC

TIEMPO TOTAL 5 HORAS 30 MINUTOS

PROCESADOR

2) Panel de control

Palanca de encendido : ON/OFF. (Piloto – ON)

Selector. 3 posiciones: Manual – auto – OFF.

o Manual: No activa movimiento oscilante de los cestos. Se moverá de recipiente en recipiente

hasta que se ponga en OFF.

o Auto: Activa el movimiento de oscilación de los cestos. No ontrola el movimiento de la cúpula

hasta que los stops del disco están situados. (Piloto. Excepto si está en operación retardada)

Control para operación retardada. (piloto, cuando el selector está en auto)

Disco: periodo de 24 horas, 12 stops.

2) Al lado derecho, receptores para los enchufes de los potes de parafina. Los potes tienen unos pilotos que

se encienden cuando la palanca ON.

3) Fusibles a la izquierda

4) Palanca de control manual, debajo de la campana PULL. Usar solo cuando la campana esta elevada.

Derecha izquierda.

5) Campana de seguridad, si hay solidificación en los potes de parafina, un microinterruptor corta el circuito.

6) Parada automática en la parafina, se para el movimiento de rotación de la cúpula. Continua el movimiento

oscilante de los cestos hasta que la palanca OFF.

7) Los potes de parafina están ajustados para control automático de la temperatura en un rango de 37 – 62

grados C.

CONFECCIÓN DE LOS BLOQUES

Para confeccionar bloques en el laboratorio de anatomia patologica y citologia usamos la estacion de

inclusión. Esta consta de los elementos necesarios para confeccionar un bloque de parafina que contenga una

o varias muestras de tejido dentro de ella. El fundamento de la confección es obtener un soporte idóneo para

el tejido que permita cortarlo con la precision que requiera.

Las estaciones de inclusión constan de diferentes partes:

Dispensador de parafina líquida

Placa caliente (debao de la boquilla de vertido de parafina) donde se calentara el molde de acero y se

pone a la misma temperatura que la parafina líquida.

Placa fria: para solidificar la parafina (0ºC)

Piscina de parafina caliente

Aparte de la estacion de inclusión necesitamos:

Un mechero bunsen para calentar la aguja histologica y las pinzas

Aguja histologica

Pinzas con y sin dientes (Mejor una pinza atraumatica)

Moldes de acero

PROCEDIMIENTO Y TECNICA:

Sacar las muestras de la ultima parafina del procesamiento y meterlas en la piscina de parafina

caliente/dispensador

Encender la placa caliente y ponerla a temperatura de fusión (56-58ºC)

Colocar el molde de hacer debajo del grifo de parafina en la placa calefactora.

Dejar al menos 3 minutos.

Echar una pequeña cantidad de parafina sobre el molde asegurandonos que este a la temperatura

adecuada (0 opacidad).

Sacar el casset de la piscina de parafina caliente/dispensador y colocarlo sobre la placa caliente.

Abrimos el casset, cogemos los tejidos con una pinza y los ubicamos en el molde de acero. Para ello

utilizamos la pinza de disección sin dientes y la aguja histológica previamente calentadas con el

mechero bunsen para evitar el choque fuerte de temperatura.

Ponemos la tapa del casset y llenamos el molde hasta arriba (ver que la parafina sube por encima de la

rejilla del casset).

Traslado de ese molde a la placa fria donde se dejará aproximadamente durante 5 y 10 minutos.

Desmoldar, desbastar y cortar.

MICROTOMOS. TÉCNICAS DE CORTE DE LOS TEJIDOS

El microtomo es un instrumento mecánico con el que se realizan secciones tisulares de espesor micrométrico

y, por tanto, lo suficientemente delgadas para permitir su posterior observación microscópica.

Tipos fundamentales de microtomos:

microtomo de rotación o tipo Minot

microtomo de deslizamiento

Microtomo de congelación

Criostato o criotomo

Ultramicrotomo

Todos tienen los mismos principios básicos de funcionamiento; un portabloques en el que se apoya el material

que se va a cortar se hace incidir de forma periodica sobre una cuchilla, obteniendose secciones tisulares con

un espesor equivalente al que previamente se seleccionó en el tornillo micrométrico que controla el

mecanismo de avance.

El portabloques qiene un dispositivo de orientación que garantiza su paralelismo con la cuchilla y es posible

cambiar la posición del portacuchillas para variar el ángulo de inclinación de la mismo.

a) MICROTOMO DE ROTACIÓN O TIPO MINOT

El portabloques está colocado en posición vertical, y se mueve arriba y abajo delante del filo de la

cuchilla. El movimiento de rotación del brazo del microtomo produce además el avance automático y

constante del portabloques. Es un instrumento de gran precisión que permite obtener secciones

seriadas muy finas.

b) MICROTOMO DE DESLIZAMIENTO

Se le llama así debido a los carriles de que va provisto. Existen dos tipos fundamentales de

microtomos de deslizamiento, según que se movilice el portabloques sobre la cuchilla, permaneciendo

esta fija, o viceversa. En ambos casos, el movimiento que produce el corte es el avence y retroceso de

la porción móvil del microtomo sobre unas guias metálicas. Un tipo de microtomo de deslizamiento es

el TETRANDER, de gran tamaño, que permite realizar secciones de órganos completos. Se emplean

para efectuar cortes sobre tejido incluido en celoidina.

c) MICROTOMO DE CONGELACIÓN (Antiguo y obsoleto)

La congelación del material se realiza haciendo circular por el interior de su portabloques hueco, una

corriente de anhídrio carbónico procedente de una bombona a presión. De esta manera, el gas, al

expandirse en su interior, produce el enfriamiento progresivo de la superficie donde se coloca el tejido.

Una vez congelado el material, las secciones se practican con una cuchilla que pivota sobre un eje fijo,

de forma que el avance lo realiza el portabloques por un mecanismo directo de tornillo.

Este tipo de mirotomo ha sido desplazado por el criostato debido a sus inconvenientes:

o dependencia del gas carbónico para mantener la congelación.

o Espesor de los cortes, superior a 10 micras

o Dificultad para estirar los cortes realizados.

d) CRIOSTATO O CRIOTOMO

Consta de un microtomo de tipo Minot incluido en una cámara de congelación. El volante que controla

la realización del corte se encuentra en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance

están situados dentro de la cámara fria (normalmente a -20ºC). La cuchilla se encuentra en posición

horizontal y pueden obtenerse secciones seriadas grácias a la existencia de un sistema

antienrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla.

REALIZACIÓN DE CORTES CON EL CRIOSTATO

o Muestra en fresco humedecida con suero salino 0,9%.

o Entrega al patologo.

o Fijar, procesar e incluir la muestra en frío (colocaremos el tejido en la platina y le pondremos

gel OCT, lo colocamos en la pieza del criostato por donde pasará el Nitrogeno líquido para

congelar la muestra)

La muestra se pone tal cual viene.

Una vez engarzada en el portamuestras se congela y se corta entre 4-6 micras.

El resultado es un porta con tejido congelado.

o Se le da un baño de OH 96º y dos baños de para rehidratarlo.

o Se prepara la tinción y se tiñe (preferiblemente Hx).

e) ULTRAMICROTOMO (microscopia electrónica)

Es un microtomo básicamente derivado del tipo Minot, aunque dotado de numerosas mejoras técnicas

que permiten efectuar secciones de hasta unas pocas decenas de nanómetros de espesor a partir de

material incluido en plástico (hepoxiresinas).

TIPOS DE CUCHILLAS PARA EL MICROTOMO

En la actualidad se emplean fundamentalmente cuchillas desechables. Hay 4 tipos básicos de cuchilas:

Bicóncava: Parafina blanda + tejido blando (glandulas)

Planoconcavas: Tejidos Blandos (casi no se usan)

o Tipo Ay B.

Biplana estándar: tejidos blandos y duros

Biplana con faceta: Tejidos extremadamente duros

o Evitan la vibración.

o Traquea, zonas de pulmon, zonas cartilaginosas, músculo…

Desechables: Uso limitado y caro.

TÉCNICAS DE CORTE SOBRE BLOQUES DE PARAFINA

Es una de las labores de mayor trascendencia que debe realizar el técnico de laboratorio. Consta de 6 pasos:

Retallado y enfriamiento del bloque.

Fijación al portabloques.

Orientación del bloque.

Orientación de la cuchilla y desbastado del bloque.

Selección del espesor del corte.

Realización de las secciones.

RETALLADO Y ENFRIAMIENTO DEL BLOQUE

Retallar un bloque es el eliminar el exceso de medio de inlusión que rodea la pieza. Con los actuales

moldes esta maniobra es innecesaria. Antes de colocar el bloque en el microtomo debe enfriarse para

conseguir la consistencia óptima de la parafina. La temperatura ideal en el momento de realizar los

cortes se encuentra entre 5 y 10 grados centigrados. El enfriamiento más adecuado se obtiene

almacenando los bloques en una cámara frigorifica a 4ºC.

FIJACIÓN AL PORTABLOQUES

Hoy en dia en la confección de los bloques de parafina se emplean soportes plásticos que se adaptan al

portabloques.

ORIENTACIÓN DEL BLOQUE

Una vez colocado el bloque en el portabloques, se hace descender el brazo del microtomo hasta que la

superficie del bloque entra en contacto con la cara interna de la cuchilla de desbastado. En este

momento se comprueba el paralelismo entre ambas, en caso necesario se restablece mediante

manipulación del portabloques.

ORIENTACIÓN DE LA CUCHILLA Y DESBASTADO DEL BLOQUE

Se denomina orientación de la cuchilla a la inclinación de ésta con relación a la superficie del corte. El

ángulo de inclinación debe encontrarse entre 10 y 15 ºC.

o Si es mayor de 15ºC, la cuchilla estará excesivamenteperpendicular al bloque, el filo tiende a

introducirse profundamente en la parafina del bloque, arrancando parte de esta y provocando

una fuerte vibración de la cuchilla. Todo ello origina pequeñas ondulaciones en la superficie

del bloque y cortes de espesor muy irregular.

o Cuando el angulo de inclinación es menor de 10ºC, la cuchilla estará excesivamente paralela al

bloque, el filo no incide sobre la superficie del bloque, se desliza sobre é. De esta manera no es

posible obtener una sección hasta que el bloque ha avanzado lo suficiente. Esto trae como

consecuencia la obtención de cortes discontinuos de gran espesor.

Una vez orientada la cuchilla sobre el bloque, se procede al desbastado de este, eliminando las cpas de

parafina situadas sobre el tejido. El desbastado termina cuando se obtiene en cada corte la superficie

completa del tejido.

SELECCIÓN DEL ESPESOR DE LOS CORTES

Las secciones obtenidas a partir del tejido incluido en parafina suelen tener un espesor de entre 2 y 6

micras. El tejido incluido en parafina no puede ser cortado don un grosor mayor de 20 micras porque

los cortes se enrollan de manera irreversibles. En caso de que sea necesario, la inclusión del material se

debe realizar en CELOIDINA.

REALIZACIÓN DE LAS SECCIONES

Se sustituye la cuchilla de desbastado por la que vamos a emplear para los cortes finos. Iniciaremos el

movimiento rotatorio del brazo del microtomo hasta obtener una cinta de cortes (5-6 cortes). E

conveniente sujetarla según se vaya formando.

Cuando el tejido tiende a quebrarse o desmoronarse por estar demasiado frio, ser heterogeneo

(coagulos, tejido oseo, etc) o estar cargado de electricidad estatica, suele ser muy util exhalar vaho de

la respiración sobre el bloque de parafina.

o ESTIRADO DE LOS CORTES Y CONFECIÓN DE LAS PREPARACIONES

Se estiran en un baño con agua caliente a temperatura entre 50-56ºC gracias a las fuerzas de

tensión superficial que se generan en la ámina de parafina y tejido al hacerla flotar sobre el

líquido. Las posibles arrugas y pliegues que suelen producirse pueden ser eliminadas mediante

la manipulación de los cortes, una ves que están sobre el agua, con dos pinceles de pelo fino o

con dos agujas histoogicas.

Las burbujas de aire que se formadebajo de los cortes son difíciles de eliminar son producir

artefactos sobre el tejido, por ello evitaremos que se formen desprendiendolas periódicamente

de las superficies del baño, cuando éste se encuentra libre de cortes.

Por último se capturan los cortes elegidos, introduciendo verticalmente el portaobjetos en el

baño hasta tocar la sección por uno de sus bordes, el corte va quedando adherido al

portaobjetos según se retira del agua lentamente. Se deja drenar el aguador gravedad. Antes de

colocar en el baño seccions nuevas, eliminaremos cualquier vestigio de las anteriores para

evitar contaminaciones accidentales. Esto se consigue pasando sobre la superficie del agua un

pañuelo de papel de filtro.

o SECADO DE LAS PREPARACIONES HISTOLOGICAS

Se deben secar meticulosamente para evitar su desprendimiento. Se puede realizar de forma

rápida, colocando los portaobjetos en la estufa a 60ºC durante 30-60 minutos

SOLUCIONES ADHERENTES PARA PORTAOBJETOS

Para los procedimientos más rutinarios, la adhesión del tejido al portaobjetos queda garantizada con el

proceso de desengrasado. Pero hoy en dia se realizan muchas técnicas histoquímicas, de base

inmunológica y de biología molecular, que causan con gran frecuencia el desprendimiento de los

cortes, y por ello es imprescindible impregnar los portaobjetos con sustancias fijadoras que dificulten

éste fenomeno.

Para ello se han empleado sustancias naturales como la albumina de huevo o la gelatina, pero

actualmente están siendo sustituidas por materiales sintéticos como la polo-L-lisina, que aunque es

mucho más cara, proporciona la masima adhesividad.

Los portaobjetos impregnados en esta sustancia, se emplearán para técnicas inmunohistoquimicas con

multilpes pasos, y sobre todo para biología molecular, donde se requieren incubaciones prolongadas a

100ºC de temperatura.

FUNCIONES DEL TÉCNICO

Como norma general, cada técnico tiene asignado un número diario de bloques para seleccionar. El

número de técnicas solicitadas.

Además de los cortes, tiene a su cargo la supervisión y el mantenimiento de los aparatos utilizados.

TRATAMIENTO DE LOS CORTES PREVIO A LA COLORACIÓN

DESPARAFINACIÓN

Xilol 1 PF Xilol 2

En caliente (40-45ºC) En frio

10-15 min 10-15 min

o Desparafinación física: En la estufa a 60ºC entre 25-45 min (evapora el agua y quita la

parafina).

o Desparafinación química: Si ponemos en contacto la parafina con el xilol este la elimina.

HIDRATACIÓN

OH Abs PF OH 96º PF OH 70º PF OH 50º PF H2Od

X 2 3-5 min 3-5 min 3-5 min x 2

5 min 5 min

COLORACIÓN

Los tiempos dependerán de cada colorante utilizado.

FUNDAMENTOS GENERALES DE LA COLORACIÓN

GENERALIDADES

El principio general de las coloraciones se basa en la propiedad que tienen los tejidos o formaciones celulares

de incorporar o fijar de modo variable determinadas sustancias llamadas colorantes.

TIPOS DE COLORANTES

Según su origen:

Colorantes naturales: Son relativamente escasos, se obtienen en forma de extractos a partir de ciertas

plantas o insectos. En histotecnología de rutina son ampliamente utilizados, siendo los más conocidos

como colorantes nucleares: Hematoxilina, Carmín.

Colorantes citoplasmaticos: Safranina, orceina.

Colorantes artificiales: La mayor parte son derivados de la anailina. Hoy en dia constituyen la base

de la mayor parte de las coloraciones histológicas. Inicialmente se obtenian del alquitran de carbón.

Hoy en dia se sintetizan en los laboratorios, por lo que su numero crece continuamente.

NATURALEZA QUÍMICA DE LOS COLORANTES

Podemos definir al colorante, como una sustancia que puesta en contacto con un soporte adecuado, se une a el

de forma perdurable transmitiéndole un color.

El soporte químico de la mayor parte de los colorantes naturales y de la totalidad de los artificiales es el

BENCENO (estable químicamente) (C6H6). Este hidrocarburo aromático es incoloro. Cuando el benceno se

pone en contacto con distintos radicales, se forman derivados bencénicos, los cuales absorben las radiaciones

luminosas dentro del aspecto visible y muestran color. A estos radicales se les llama CROMÓFOROS y al

derivado bencénico que se forma recibe el nombre de CROMÓGENO.

* Si unimos los bencenos con los cromóforos, formamos cromógenos que tienen capacidad de coloración*

Existen varios radicales cromóforos entre ellos: azoico (-N=N-), Etileno (>C=C<)…

Para que el cromogeno se transforme en colorante, se tiene que adicionar a otros grupos atomicos que tienen

la propiedad de disociarse electrolíticamente o de formar sales en los tejidos. A estos grupos se les denomina

AUXOCROMOS o potenciadores de color. Estos pueden tener carácter ácido o básico, siendo los

responsables de que si el colorante tenga mayor o menor afinidad por la estructura que va teñir.

CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES SEGÚN SUS GRUPOS AUXOCROMOS Y

APETENCIA TISULAR

COLORANTES ÁCIDOS: Son aquellos compuestos cuyo principio activo es el acido, como por

ejemplo la Eosina, Eritrosina, Fucsina ácida, Naranja G, Azul de Anilina… Utilizando principalmente

para el citolpasma celular y los compuestos básicos en general (proteínas celulares, organulos

citoplasmaticos…)

COLORANTES BÁSICOS: Están compuestos por una base colorante y un ácido indiferente, como

por ejemplo la Fucsina Básica, Azul de Metileno, Hematoxilinas, Verde de Metilo… Se emplean

principalmente para colorear los núcleos celulares, pero también colorean en ciertas condiciones, otras

estructuras ácidas (ADN).

COLORANTES NEUTROS: Se pueden considerar como sales, que resultan de la unión de un ácido

colorante y una base colorante. Pueden colorear conjunta o separadamente diversas estructuras, pero

casi no se utilizan.

COLORANTES INDIFERENTES: No poseen carácter ácido ni básico, por lo que simplemente

colorean los tejidos por un mecanismo de impregnación (impregnación argentica). Estos colorantes no

poseen polaridad.

COLORANTES METACROMÁTICOS: La mayor parte de los colorantes tiñen los tejidos de

forma ORTOCROMATICA, comunicandoles los distintos tonos del colorante. Sin embargo algunos

colorantes comunican a ciertos tejidos un color diferente del que le es propio a esto se le llama

METACROMASIA.

Los colorantes metacromáticos son básicos del tipo de la anilina, como por ejemplo el Azul de

Toluidina, Violeta de Metilo, Cristal Violeta, PAS, etc.

La metacromasia va a depender de:

o Las particularidades del colorante: grupo auxocromo, cromogeno y el pH.

o Caracteristicas del tejido o sus componentes, que se unen con el colorante para dar la

propiedad mencionada.

o El color primario del colorante se debe a que predomina en la solución la variedad monomérica

(molécula simple).

En la práctica, los colorantes metacromaticos se utilizan en concentraciones de 0,1 % en p/v. Debe

evitarse el exceso de tinción suele estar entre 5-20 minutos, en la mayor parte de los metodos.

MECANISMOS GENERALES DE LA COLORACIÓN

Existen tres mecanismos de coloración que se dan entre la materia colorante y los tejidos.

MECANISMO FÍSICO: Es el que se produce por dilución o por impregnación. El colorante al

ponerse en contacto con el sustrato a teñir no sufre cambios químicos, ninguno de los dos.

o Dilución: El colorante es más soluble en el tejido que en el disolvente que le sirve de vehiculo

como el colorante de las grasas (con alcohol la grasa se deshace, por lo tanto se utiliza

SUDAN).

o Impregnación: El colorante por su gran volumen molecular o por precipitación en forma de

agregados solubles, queda atrapado entre la malla de células y fibras que constituyen el tejido.

MECANISMO FISICOQUÍMICO: Estas coloraciones tisulares son las que se producen por la

atracción electroestatica entre las distintas sustancias que se van a colorear y los colorantes

propiamente dichos. Son el caso de los colorantes ácidos que tiñen estructuras básicas y viceversa.

Uno de los 2 o los 2 puede sufrir cambios químicos.

MECANISMO HISTOQUIMICO: Es un mecanismo puramente químico en el cual se produce una

reacción química entre el colorante y la estructura objeto de tinción, de forma que cuando

interaccionan forman un nuevo cromógeno que es el responsable del color obtenido. Los dos van a

cambiar, además se forma una nueva molécula.

COLORANTES NUCLEARES

La mayor parte de las coloraciones que se utilizan en histopatología contienen colorantes que tiñen de manera

especifica el núcleo celular, definiendo su contorno y realzando su contenido cromático. Por ello se utilizan

colorantes básicos con apetencia por los grupos fosfóricos ácidos del ADN.

Entre estos tenemos: Verde metilo, Fucsina Básica, Violeta de Cresilo…

Entre los naturales tenemos: Hematoxilinas, Safarina, Carmín…

COLORANTES CITOPLASMÁTICOS

En general son menos especificos que los nucleares, se fijan a los componentes extracelulares de los tejidos

provocando su tinción simultanea.

Los más utilizados son: Eosina, Eritrosina…

Colorean los tejidos en diversas tonalidades de ROJO y ROSA, se difunden fácilmente entre las estructuras

místicas, siendo fácilemte atraídas hacia los radicales básicos. Se puden emplear en solución acuosa o

alcoholica siendo más solubles en la primera, la eosina Y es mejor.

TRATAMIENTO DE LOS CORTES TRAS LA COLORACIÓN

DESHIDRATACIÓN

H2Od OH 50º PF OH 70º PF OH 96º PF OH Abs

X 2

PF Xilol

X 2

5 min 5 min 5 min 5 min 5 min 10 min

ACLARADO

Pasaremos los cortes al xileno, liquido que nos ca a servir como aclarante de la preparación,

haciendola transparente y eliminando todo el alcohol, al mismo tiempo se utilizan estos solventes

organicos ya que son miscibles con el medio de montaje que tenemos que utilizar.

MONTAJE Y CONSERVACIÓN DE LAS PREPARACIONES

Está destinado a facilitar el examen microscopio y especialmente a conservar los cortes durante muhos

años. Montar una preparación consiste en impregnarla de una sustancia inactiva, secarla y recubrirla

con una lamina fina de cristal llamada cubreobjetos.

o Medios de montaje

Un buen medio de montaje debe ser químicamente neutro, perfectamente transparente y

desprovisto de color, no alterarse con el tiempo y sobretodo peseer un indice de refracción

elevado a fin de revelar al máximo las diferencias de refringencia entre el medio y las

estructuras a estudiar.

o Medios no miscibles con el agua

Estos son los más utilizados, su empleo es fácil, su conservación ilimitada y su indice de

refracción es elevado (no produce distorsión). Actualmente se emplea el Eukitt, Histomount…

Una vez que el corte esté totalmente transparente se efectua el montaje depositando en el centro

del portaobjetos una buena gota de este medio. Este cubreobjetos es depositado rápidamente en

el centro de la preparación impregnada de Xilol. La sustancia de montaje se disuelve inmediate,

se extiende y generalmente aprisionan algunas burbujas de aire, que trataremos de eliminar con

mucho cuidado con la ayuda de una aguja histológica.

Con un trapo limpio y con un poquito de xileno trataremos de limpiar los bordes del cristal sin

pasar este por encima de la preparación. Las preparaciones montadas las colocaremos en una

bandeja portamuestras, hasta que estén secas para etiquetar y archivar.

o Medios miscibles con el agua (criostato, grasa)

Estos medios son de uso menos corriente que los precedentes, ya que su empleo es mas

delicado, sus propiedades conservadoras limitadas y su rendimiento óptico débil. Solo sirven

prácticamente para montar cortes por congelación conteniendo sustancias y vcolorantes

alcohol-solubles. Entre estos tenemos:

Glicerina gelatinizada (la mas utilizada)

- Gelatina………………. 15 gr

- Agua destilada……….. 100 ml

- Fenol………………….. una gota

- Glicerina……………… 100 ml

FUNDAMENTOS DE LA TINCIÓN CON HEMATOXILINA

La hematoxilina es un colorante natural que se extrae del árbol Haematoxilon Campechanum, se exporta en

palos de alrededor de un metro (palo de Campeche) se cortan en trozos pequeños para la extracción y el

colorante obtenido se utiliza no solamente para microscopia sinó también para teñir la seda y la lana, pero el

colorante natural no es un colorante activo, no genera color, ya que es un precursor de un cromoforo.

OXIDACIÓN DE LA HEMATOXILINA

Para que la hemaoxilina puede ser empleada como colorante en histotecnologia, (capacidad de tinción

muy limitada) ha de ser oxidada previamente a Hemateina (Cromóforo de la hematoxilina). Este

proceso de oxidación ha de ocurrir espontáneamente en contacto con el oxigenos del aire a lo largo de

4 a 6 semanas o de forma arificial a traves de agentes oxidantes actuando como Cromóforo, le

confiere la capacidad de teñir.

La hematoxilina así obtenida tiene una carga débilmente ácida y una coloración rojo vinosa.

o Oxidación física: Cuando entra en contacot con el aire ambiental (CO2).

o Oxidación química: Cuando entra en contacto con agentes químicos como el oxido de

mercurio.

OXIDACIÓN

CROMÓFORO CROMÓGENO

A este proceso se le conoce como MADURACIÓN DE LA HEMATOXILINA puede ser acelerado

mediante agentes oxidantes artificiales artificiales como:

Oxido de mercurio………… 0,5 gr

Yodato de Sodio…………… 0,05gr

Permanganato potasico…….. 1,77 gr

Dicromato potásico………… 0,28gr

Clorato potásico…………….. 0,11gr

Yodato potásico…………….. 0,20gr

Todas estas cantidades están referidas a 1gr de hematoxilina.

La oxidación demasiado prolongada (sobremaduración) da lugar a compuestos casi todos incoloros y

sin utilidad, por lo tanto es fundamental utilizar en la preparación de los colorantes de hematoxilina la

cantidad correcta de oxidante. Estas soluciones de hematoxilina suelen estar influidas por el tipo de

disolvente que se utiliza. Así las soluciones acuosas neutras se sobreoxidan con facilidad por lo que

son relativamente inestables (Harris).Las alcoholicas glicerinadas tienen mayor duración (Carazzi).

LACAS DE HEMATOXILINA

Tras la oxidación, normalmente se debe incrementar su capacidad tintorial agregando grupos

auxocromos, que ademas le confiere un carácter fuertemente básico y son los respnsables de su

especificidad por los núcleos celulares.

Los auxocromos que se emplean son sales metálicas bivalentes o trivalentes, por lo general en forma

de alumbres de tal forma que se originan diversas lacas de hematoxilina de carácter básico y tonalidad

azulada o negruzca dependiendo de la sal metalica utilizada. La más utilizada es la Aluminica potásica

conocida como hemalumbre.

Estas sales englobadas dentro de los mordientes, actuando como nexos de unión entre el colorante y

los tejidos a través de la formación de un quilato en forma de precipitado insoluble.

Como regla general para la preparación de las lacas de hematoxilina debe tenerse en cuenta que todos

los componentes de la formula han de agregarse en el orden establecido y deben estar totalmente

disueltos antes de añadir el siguiente.

Hx + O2 HEMATEÍNA(cromoforo) + GRUPO AUXOCROMO BÁSICO (SAP) (Mordiente)

TECNICA HEMATOXILINA EOSINA

Es una tinción topográfica de conjunto del tejido de forma que es posible separar todos sus componentes

(separar lo ácido de lo básico). Es una coloración indirecta (uso de mordientes) y es progresiva o

regresiva.

HEMATOXILINA DE CARAZZI (500mL):

Hematoxilina…………………………..……… 500mg

Sulfato aluminico potásico (mordiente)……….. 20g

Yodato potásico (oxidante)……………………. 100mg

Glicerina…………..…………………………... 100ml

Agua destilada………………..……………….. 400ml

La hematoxilina de Carazzi es un colorante progresivo (aquella que a una mayor exposición,

más intensidad de color tendrá)

o Resultados

Coloración violeta

- Técnica:

o Se recogen los cestillos llenos de portaobjetos (con sus muestras o cortes correspondientes) y

se colocan en la estufa para eliminar la parafina del portaobjetos.

o Una vez realizada la desparafinación, se procede a empezar la hidratación. Para realizar la

hidratación, se preparará una batería en la campana extractora de gases, en la cual situaremos

unas cubetas identificadas.

OHº Abs OHº Abs OHº 96 OHº70X 2

H2Od

o Una vez se ha hecho la hidratación se pasa a la coloración con la Hematoxilina Carazzi durante

5 y 15 minutos.

o Una vez acabada la coloración con carazzi, se pasara el cestillo a una cubeta con agua del grifo,

cambiándola hasta que esta salga limpia.

o Se le da un lavado con agua destilada de 5 o 10 pases.

o Como ultima coloración se hace baño en eosina alcohólica de entre 2 y 3 minutos de duración.

o Un paso opcional es añadir amoniacal después de la eosina alcohólica.

o Por último se deshidrata, se aclara y se monta.

HEMATOXILINA HARRIS

La hematoxilina de Harris es una tinción regresiva (lo que se ha teñido no se puede retirar ni quitar los restos,

pero usando alcohol clorhídrico se pueden quitar los residuos básicos) por lo que hay que tener un control

exhaustivo del tiempo.

- Reactivos

o Hematoxilina………………………………… 1gr

o Alcohol absoluto…………………………….. 10 ml

o Alumbre potásico o férrico…………………. 20 gr

o Agua destilada………………………………….. 20 ml

o Oxido de mercurio……………………………… 0,5 gr

- Resultados

o Coloración azulada

- Técnica

Se disuelve la hematoxilina en el alcohol y el alumbre en agua caliente. Mezclar y hervir rápidamente,

se aparta de la llama y se le añade el óxido de mercurio, se mezcla por movimientos suaves de

rotación. Una vez enfriada la solución, se le añade de 2 a 4 cc cada 100 mL de disolución de ácido

acético glacial para reducir su capacidad tintorial, además le podemos añadir los 10 ml de alcohol ya

que todo se habrá evaporado durante la ebullición. Esta tinción tiene un inconveniente, tiene una

duración determinada de entre 6 y 12 meses.

EOSINA

Es el colorante citoplasmático por excelencia que posee una polaridad ácida, es el mas utilizado en

histotecnología de forma conjunta con la hematoxilina. Existen dos formas de presentación, la acuosa y la

alcohólica. Ambas poseen una concentración de eosina al 1%, siendo el disolvente en la acuosa el agua

destilada y en la alcohólica el alcohol de entre 80 y 96 º.

La eosina se vuelve más intensa y selectiva si se le añade entre 0,5 y 1 cc de acido acético glacial por cada

100 ml de disolución.

- Reactivos:

o OH 80º………………………………………. 100 ml

o Eosina alcohólica …………………………... 1 gr

o Acido acético glacial………………………… 1 ml

HEMATOXILINA-EOSINA

- Reactivos:

o Hematoxilina Harris/Carazzi

o Eosina alcohólica

- Resultados:

o Núcleos…………………………….…….. Pardo negruzco/azul negro

o Eritrocitos, músculos, gránulos eosinófilos………….. Rojo brillante

o Citoplasma………………………………. Rosa pálido o anaranjado.

- Técnica

- Se desparafina e hidrata el corte ya realizado previamente.

- Se hacen 5 pases de agua + amoniaco.

- Se hacen 5 pases de OH 96º + HCl

- Dependiendo de la hematoxilina que usemos:

o Hematoxilina de carazzi de entre 5 y 15 minutos.

o Hematoxilina de Harris de entre 3 y 5 minutos.

- Se hace un lavado en agua del grifo hasta que esta salga limpia.

- Se hace un lavado de agua destilada para acabar de limpiar los cortes

- Baño en la tinción de eosina alcohólica durante 2 o 3 minutos.

- Opcionalmente se puede hacer un paso por agua amoniacal para preparar los citoplasmas y fibras antes

de la eosina.

- Por último se deshidrata, se aclara y se monta el corte.

HEMATOXILINA FÉRRICA DE WEIGHERT

Colorante nuclear tricromico (1 nuclear y 2 citoplasmáticos)

Solución A:

- Hematoxilina…………….. 1gr

- Alcohol de 96º…………… 100 ml

Solución B:

- Agua destilada…………….. 95 ml

- Cloruro férrico al 29%.......... 4 ml

- Acido clorhidrico al 25 %..... 1 ml

B sobre A en proporción 1:1, una vez constituida, la duración máxima es de 2 semanas.

TECNICAS DE TINCIÓN ESPECIFICAS

COLORACIONES PARA FIBRAS DEL TEJIDO CONECTIVO

Todos los tipos de tejido conectivo o conjuntivo poseen dos elementos constituyentes principales:

- Las células

- La matriz extracelular: Componente fundamental que determina las propiedades físicas de cada tipo de

tejido conectivo. Está formado por:

o Un material amorfo y transparente denominado sustancia fundamental.

o Diversos tipos de fibras que se encuentran enclavadas en el interior de la sustancia

fundamental.

Las fibras del tejido conectivo (con base de proteína) son de tres tipos principales:

- Colágeno

- Reticulina

- Elastina

FIBRAS DE COLÁGENO

Es el principal tipo de fibra que se encuentra en la matriz extracelular de la mayoria de los tejidos conectivos.

Tienen una función básica de soporte. Se han descrito cuatro tipos principales de fibras de colágeno. Cada uno

de ellos presenta ligeras variaciones en al composición de las cadenas polipeptidicas que constituyen las

fibras. Estos elementos poseen afinidad por los colorantes ácidos. El colageno tipo I constituye cerca del 90

por cien del colágeno total del organismo y se dispone formando haces gruesos. Las tecnicas para tinción de

fibras de colágeno se agrupan clásicamente bajo la denominación de COLORACIONES TRICRÓMICAS.

FUNDAMENTO DE LAS COLORACIONES TRICROMICAS

En general se basan en los mismos principios teóricos. Se emplean tres tipos de colorantes:

- Un colorante nuclear: Por lo general una laca de hematoxilina férrica de weighter , ya que los demas

son muy ácidos.

- Dos colorantes ácidos, que se diferencian en sus propiedades físico químicas:

o Uno de ellos se encontrara en disolución verdadera (disolución homogenea en que todos sus

iones se disuelven por completo) de particulas pequeñas, finamente dispersas, puede emplearse

(teñira el citoplasma):

Acido Pícrico

Naranja G

Naranja de Metilo

o El otro estará en solución coloidal, de particulas gruesas. Derivan del anillo del trifenilmetano

(grupo auxocromo) (teñira el colágeno):

Fucsina ácida

Azul de anilina

Verde luz

En el proceso de fijación tisular, las proteinas de los citoplasmas celulares se agrupan para formar una

malla de poro muy fino. En cambio, las fibras del tejido conjuntivo forman una malla menos densa. El

colorante que se encuentra en solucion finamente dispersa puede penetrar en poco tiempo en todas las

estructuras, incluidas las mas finas (colorantes citoplasmáticos).

El colorante que se encuentra en solución coloidal de particulas gruesas, solo penetra en ese periodo

entre las mallas estructurales poco densas, todavía no habrá penetrando en las mallas estructurales

finas.

Si la coloración con los derivados del trifenilmetano (colorante ácido) se prolonga demasiado, se

origina una sobrecoloración de todos los elementos tisulares. En estas coloraciones es un factori

importante el valor del pH a que se utilizan los colorantes, ya que tienen mayor apetencia por las fibras

colágenas en medio fuertemente ácido (2,5).

Por lo que respecta a la coloración nuclear empleada, el bajo pH con que se realiza la coloración

diferencial hace aconsejabe utilizar lacas de hematoxilina que no sean decoloradas en el proceso de

tinción, las mas indicadas las lacas de hematoxilina férrica. También desempeñan un papel importante

los ácidos fosfotungstico o fosfomolibdico, que al parecer bloquean selectivamente los residuos

básicos existentes en el tejido a excepción de las fibras de colágeno, donde luego se acoplaran los

colorantes ácidos derivados del trifenilmetano.

FIBRAS DE RETICULINA

El colágeno tipo III da lugar al tipo de fibra conocido como reticulina, que antes se consideró que

representaba una especie distinta de fibra debido a su afinidad por las sales de plata con las que se tiñe de

negro grisaceo.

Las fibras de reticulina forman la delicada malla reticular de sostén en los tejidos muy celularizados tales

como el higado y los organos linfoides. Para poner de manifiesto éstas fibras se emplea la impregnación

argéntica (plata metenamina).

IMPREGNACIÇON ARGENTICA

Se basa en la reducción del nitrato de plata (forma más estable de la plata) AgNO 3 hasta obtener plata

metálica, para conseguir que se deposite sobre los tejidos en forma de precipitado.

- Formas de impregnación argentica

o Impregnación argentica por mecanismos predominantemente físicos y físico-químicos:

Hasta que no hayamos reducido la plata, la impregnación no hará nada, por eso necesitamos un

agente reductor externo, ya que los tejidos tienen afinidad por la plata, son ARGILOFILOS

(apetencia de un tejido o estructura por los iones de la plata metalica.

Para que sea posible este tipo de impregnación:

Se necesitan varios agentes reductores externos (tejidos argentofilos pero no

argentafines)

Los tejidos a teñir deben presentar argentofilia, que es la propiedad de unirse a los iones

de plata derivados del nitrato de plata o de la plata amoniacal. Posteriormente los iones

de plata atraídos por el tejido (por fuerzas electroestáticas) son precipitados a plata

metálica por acción de un agente reductor externo.

Este tipo de impregnación puede realizarse por la reacción de BIEL CHOWSKY, impregnación

argentica en dos tiempos:

Impregnación primaria:

AgNO3 (5%) + Agente reductor 5 gotas al 40 % Ag2O

(base fuerte OHNa, OHK)

Ag2O + NH3 (gota a gota) Plata amoniacal Ag(NHO3)2

La plata amoniacal es soluble en agua pero inestable e iónica

Impregnación secundaria:

Plata amoniacal + Formol (10%) Plata metálica

Esta impregnación es para cuando el tejido no es argentafin

* Si el tejido es argentafin, no haria falta seguir con la impregnación secundaria *

La plata metalica es la que se deposita sobre el tejido en forma de moleculas muy estable. No

todos los tejidos tienen idéntica apetencia por la plata, tanto la carga electrica como la textura

de las células por teñir, interviene de manera decisiva.

* La reducción es quitar electrones de una molécula usando sustancias oxidantes.

* La oxidación es coger electrones de una molécula mediante sustancias reductoras.

* Un tejido argentofin será argentofilo, pero un tejido argentofilo no será siempre argentofin,

ya que este necesita un agente reductor.

En general , la plata metálica en forma de finos precipitados tiene especial apetencia por

depositarse sobre estructuras fibrilares finas y pr superficies celulares dotadas de delgadas

prolongaciones tales como células de la glia, neuronas, fibras reticulares del tejido conjuntivo,

etc, que por este motivo reciben la denominación de argirófilas.

o Impregnación argéntica por mecanismo histoquímico: No requiere un agente reductor

externo, ya que el tejido poseera sustancias argentofines (capaces de reducir la plata por si

solas).

Para que sea posible éste tipo de impregnación, los tejidos deben presentar

ARGENTAFINIDAD, que es la propiedad de reducir la plata amoniacal a plata metálica sin la

intervención de agentes reductores externos. En este caso el tejido interviene activamente a

través de una reacción química de reducción.

Esta propiedad es caracteristica de determinadas granulaciones citoplasmaticas presentes en

células cutáneas como los melanocitos que secretan melanina, y ciertas células de secreción

endocrina presentes en el tubo digestivo y que reciben el nombre de células argentafines

(células calciformes).

MANIOBRAS COMPLEMENTARIAS A REALIZAR USUALMENTE EN LA IMPREGNACIÓN

ARGENTICA

- En la mayor parte de las técnicas es conveniente realizar un tratamiento previo con un agente oxidante

del tejido como el PERMANGANATO POTASICO, que hace que aparezcan en las estructuras,

grupos químicos que favorecen la coloración.

Cuando se emplea permanganato potasico deben blanquearse los cortes a continuación con una

solución de METABISULFITO SÓDICO u ACIDO OXALICO.

- Después de la impregnación argéntica se puede realizar un viraje con una solución de cloruro de oro,

que dará un color negro azulado a los depositos pardo negruzcos de la plata.

- Siempre hay que fijar la coloración con TIOSULFATO SÓDICO (Hiposulfito), que retira la sal de

plata no reducida y la plata metálica que no ha impregnado las estructuras.

- La limpieza del material de vidrio que se emplea en este tipo de tinción debe de ser escrupulosa,

cualquier impureza en él o en el agua destilada utilizada para lavarlo hace precipitar la plata

amoniacal.

- Uno de los principales problemas que plantean las técnicas de impregnación argéntica es la fijación del

corte al portaobjetos. Es muy frecuante que se desprendan sobretodo si el grosor de los cortes es

elevado y el portaobjetos no está impregnado de alguna sustancia adhesiva. Para evitarlo emplearemos

los portaobjetos adecuados y los cortes serán lo mas delgado posible (no mas de 5 micras).

FIBRAS DE ELASTINA

Las fibras elasticas del tejido conjuntivo se encuentran fundamentalmente en determinados órganos dotados

de especial distensibilidad, vasos sanguineos, piel, pulmón, disponiendose en forma de fibras y hojas

discontinuas en la matriz extracelular. Están compuestas por un núcleo central de naturaleza proteica, rodeado

de elastomucina (carácter ácido, es una capa protectora de la fibra). Esta capa parece esencialmente

responsable de las afinidades por los colorantes de las fibras elasticas.

El colorante más empleado es la orceina (carácter ácido aunque tiñe fibras ácidas) que se fija selectivamente

aunque sin especificidad absoluta sobre estos elementos. Tambien se puede emplear la TÉCNICA DE

GOMORI que ya no se usa.

MÉTODO TRICRÓMICO DE MASSON

Reactivos:

- Hematoxilina de Harris (núcleos)

- Rojo Mallory (disolución verdadera):

o Fucsina ácida…………………………. 1gr (colágeno)

o Naranja G……………………………... 0,4gr (citoplasma)

o Agua destilada………………………… 300ml

o Acido ácetico glacial………………….. 1cc (mordiente)

- Ácido fosfomolibdico al 1% (diferenciador)

- Verde luz (disolución coloidal)

o Agua destilada………………………… 100cc

o Verde luz……………………………… 1gr

o Acido acético glacial…………………. 1cc (mordiente)

Técnica

- Desparafinar e hidratar

- Hematoxilina de Harris ---- 5min

- Lavar con agua ---- paso ligero

- Rojo Mallory ---- 3 min


- Acido fosfomolibdico ---- paso ligero

- Verde luz ---- 3 min


- Deshidratar, aclarar y montar

Resultados

- Nucleos Azul

- Citoplasmas. Queratina, fibras musculares y eritrocitos Rojo anaranjado

- Colágeno Verde, azul

MÉTODO TRICRÓMICO DE VAN GIESON

PICROFUCSINA DE VAN GIESON: Es una coloración tricrómica compuesta por una coloración nuclear

(hematoxilina férrica), una coloración citoplasmática por un colorante ácido (ácido pícrico) y una coloración

selectiva del colágeno por otro colorante ácido (fucsina ácida).

Reactivos

- Hematoxilina férrica de Weighert

- Picro-fucsina de Van Gieson (solución coloidal)

o Solución 1:

Fucsina ácida……………. 1gr

Agua destilada…………… 100 ml

o Solución 2:

Solución acuosa saturada de ácido pícrico (solución verdadera)

o Solución de trabajo:

Solución 1………………. 10 ml

Solución 2………………. 90 ml

La solución actua mejor si se deja madurar durante algunas semanas. Si está recién preparada se le agrega

inmediatamente antes de su uso, 0,25 ml/100ml de ácido clorhídrio concentrado

Técnica


- Hematoxilina férrica de weighert ---- 10/12 min

- Lavar en agua corriente ---- 5 min

- Aclarar en agua destilada

- Teñir en la solución de trabajo de Van Gieson ---- 30 segundos /1 min

- Secar con papel de filtro

- Lavar rapidamente en etanol al 70%

- Completar la deshidratación con rapidez, aclarar y montar

Resultados

- Nucleos azul negruzco

- Citoplasmas amarillo

- Colágeno rojo intenso

TÉCNICA DE WILDER (RETICULINA)

Reactivos:

- Permanganato potásico al 0,5% (oxidante del tejido)

- Acido oxalico/metabisulfito de sodio al 1% (blanqueante adquirir color)

- Alumbre férrico al 2% (ayuda a las fibras colágenas)

- Formol al 10% (revelante)

- Hiposulfito sódico al 5% (retira la sal no reducida y la plata metalica no fijada)

- Plata Wilder/ Plata amoniacal

o Hidroxido de sodio al 3%................................... 40 cc

o Nitrato de plata al 10%....................................... 40 cc

o Añadir amoniaco gota a gota hasta que la disolución se vuelva transparente.

o Añadir agua destilada………………………… 320 cc

Técnica:


- Permanganato potasico al 0,5 % ………………………5 min

- Lavar en agua destilada

- Acido oxalico al 1% hasta decolorar


- Alumbre férrica al 2%.................................................... 1º min (colorear fibras)


- Plata de Wilder/amoniacal………………,……………. 7 min (impregnación primaria)


- Formol al 10% paso ligero hasta color tabaco (impregnación secundaria)


- Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados

- Fibras reticulares negro (color lápiz)

- Fibras colágenas amarillento rojizo

TÉCNICA DE ORCEINA – VAN GIESON (FIBRAS ELASTICAS Y COLÁGENAS)

Reactivos

- Solución de Orceina:

o Orceina…………………………………. 1gr

o Alcohol etilico al 70%............................. 100 ml

o Acido clorhidrico concentrado ………... 0,6 ml

- Alcohol ácido:

o Alcohol absoluto ……………………… 100ml

o 10 gotas de HCl concentrado

- Solución número 2 de Van Gieson (Picrofucsina)

o Solución acuosa de fucsina ácida al 1% …………… 15 ml

o Solución acuosa saturada de ácido pícrico …………. 50 ml

o Agua destilada ……………………………………… 50 ml

- Solución de ácido pícrico:

o Alcohol etilico al 96% ……………………… 1 parte

o Solución acuosa saturada de ácido pícrico…. 2 partes

Técnica solución 2 de Van Gieson

- 5 min Hx férrica

- Lavado H2O grifo

- Lavado H2O destilada

- Acido pícrico- fucsina ácida 5 min

- Deshidratar

Resultados

- Núcleos Marrón/Negro

- Colágeno Rosa

- Musculo Amarillo

Técnica


- Solución de orceina ---- 30/60 min

- Lavar en agua ---- 2/3 min

- Secar en papel de filtro

- Alcohol de 95 grados , lavar el exceso de colorante

- Alcohol absoluto ---- 5/30 min hasta decolorar, cuando aparece marrón pálido examinar microscópio,

las fibras eslasticas apareceran de color purpura.

- Completar la decoloración del fondo con alcohol ácido ---- 2/10 min observando a simple vista.

- Lavar en agua corriente por lo menos 5 minutos

- Colorear con la solución de Van Gieson numero 2 ---- 2/3 min

- Diferenciar en la solución de ácido pícrico hasta que aparezca solo en rojo la colágena


Resultados

- Fibras elasticas marrón (concentración de orceina + alta)

- Fibras colágenas rojo

- Citoplasmas y músculo amarillo pálido

TÉCNICA DE LA ORCEINA (nuclear azul de metileno)

Reactivos:

- Mordiente:

o Permanganato potásico………………………….. 0,15 gr

o Ácido sulfúrico………………………………….. 0,015 cc

o Agua destilada…………………………………... 100 cc

- Ácido oxálico al 2%

- Solución de orceina:

o Orceina…………………………………… 0,4 gr

o Ácido clorhidrico………………………… 1 cc Orceina ácida

o Alcohol de 70 grados……………………. 100cc

- Alcohol ácido:

o Alcohol absoluto………………….. 100 cc

o Ácido clorhidrico…………………. 10 gotas

Técnica


- (opcional azul de metileno y agua)

- Mordiente ---- 3 minutos

- Lavar en ácido oxalico ---- 5 min

- Lavar en agua corriente

- Solución de orceina ---- 20/30 min

- Lavar en agua corriente

- Lavar y decolorar en alcohol de 96 grados y extraer el exceso de colorante

- Alcohol ácido ---- 2/5 min

- Lavar en agua corriente ---- 5 min


Resultados:

- Fibras elasticas Negro- marrón

- Nucleo Azul

- Colágeno No teñido

La solución de orceina no dura mas de un mes en la nevera, a temperatura ambiente dura como maximo una

semana.

El azul de metileno tiñe los fibroblastos (sus núcleos)

COLORACIONES PARA ESTUDIOS NEUROHISTOLÓGICOS

La finalidad de las preparaciones neurohistológicas es poner de manifiesto los tres elementos constitutivos

fundamentales del sistema nervioso: las células nerviosas, las vainas de mielina que rodean a las fibras

nerviosas y la glia o tejido de sostén.

Se pueden realizar:

- COLORACIONES NO ARGENTICAS:

o Coloraciones para neuronas y grumos de Nissl: Los grumos de Nissl, o sustancia tigroide,

son acumulo de reticulo endoplasmatico rugoso que se encuentran en el citoplasma de las

neuronas, y estan compuestos por RNA ribosómico y RNA mensajero. Para teñirlos se

emplean colorantes básicos como: azul de metileno, azul de toluidina, tionina, violeta de

cresilo…

Estos colorantes se unen a los ácidos nucleicos por un mecanismo físico químico de atracción

electroestática. Además de colorear los grumos de Nissl tiñen los núcleos, ya que estos

contienen ADN. Para que la coloración sea adecuada se necesita un pH ácido

TÉCNICA DE NISSL

Soluciones:

- Tampón acetato

o Acetato sódico………………………………………1 parte

o Acido acetico……………………………………….. 4 partes

- Solución de cresilo extra:

o Violeta de cresilo extra o tionina…………………… 0,5 gr

o Tampón acetato…………………………………….. 100 ml

Resultados:

- Grumos de Nissl y núcleos Violeta

- Células nerviosas Azul tenue

- Estructuras restantes No se tiñen

- COLORACIONES PARA VAINAS DE MIELINA

Determinadas fibras nerviosas van recubiertas por unas envolturas llamadas vainas de mielina que

contienen sustancias lipoides. Poner de manifiesto estas grasas es importante, ya que en ciertas

enfermedades se observa su desaparición. El método de Kluver- Barrera utiliza como coloranteel luxol

Fast blue, según ciertos autores se produce una atracción fisico-quimica entre la mielina y el colorante,

para otros lo que sucede es que el luxol Fast blue tiene una gran apetencia por los fosfolípidos y la

tinción tien lugar por una disolución del colorante en la mielina. Con esta tecnica queda teñida no solo

la mielina, sino tambien las celulas nerviosas y sus núcleos por una tinción combinada con violeta de

cresilo.

En la actualidad la inmunohistoquimica está desplazando a las coloraciones clásicas, ya que mediante

anticuerpos específicos se identifican con claridad la mielina y los oligodendrocitos que la producen.

MÉTODO KLUVER- BARRERA

Solución:

- Luxol Fast blue al 0,1%

o Luxol Fast blue.................................................................. 0,5 gr

o Alcohol de 96º…………………………………………… 500 ml

o Acido acetico glacial 10% ……………………………… 2,5 ml

- Violeta de Cresilo al 0,1 %

o Violeta de Cresilo……………………………………….. 0,5 gr

o Agua destilada…………………………………………… 500 ml

o Acido acetico glacial al 10%............................................. 75 gotas

- Carbonato de litio al 0,5%

o Carbonato de litio……………………………………….. 0,25 gr

o Agua destilada…………………………………………… 500 ml

- Alcohol etilico al 70%................................................................... 500 ml

Resultados:

- Vainas de mielina Azul o verde azulado

- Neuronas y grumos de Nissl Violeta o rosado

HISTOQUÍMICA

La histoquímica es una rama de la histología que sirviendose de reacciónes químicas estudia la localización

microscópica de las sustancias que componen los tejidos o la actividad de las enzimas.

La histoquímica es la aplicación de reacciones químicas en la técnica histológica con el fin de localizar y

determinar de manera científica, ciertas sustancias y su actividad. En todas estas reacciones químicas o bien se

tiñe la sustancia que buscamos o los colorantes reaccionan con ella químicamente.

- Tinciones para glúcidos

- Tinciones para lípidos

- Tinciones para pigmentos

- Histoquímica enzimatica

TINCIONES PARA HIDRATOS DE CARBONO O GLÚCIDOS

Los hidratos de carbono son polialcoholes oxidados (polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas).

Si el grupo carbonilo se encuentra en posición terminal (aldehido) y si el grupo carbonilo está incluido en la

cadena por lo general en posición 2 (cetona).

- Las moleculas más sencillas de hidratos de carbono se denominan monosacaridos.

- Por condensación de dos a diez moleculas de monosacáridos se forman oligosacáridos.

- Si el numero de moleculas de monosacaridos es superior a 10 se forman polisacaridos.

Se perderan tantas moleculas de agua como uniones se originen.

Los monosacáridos al igual que los oligosacáridos son solubles en agua, disminuyendo su solubilidad con el

grado de polimerización llegando a la total insolubilidad que suelen presentar los polisacaridos. Los glucidos

monómeros o poco polimerizables no se conservan en las preparaciones histológicas ordinarias debido a su

gran solubilidad. Sólo los polisacaridos son detectables por métodos histoquímicos.

Entre los polisacaridos, podemos considerar:

- Los polisacaridos simples, como el glucogeno (glucosa + glucosa…) musculo e higado

- Los polisacaridos complejos, que se subdividen en tres grandes grupos:

o Mucopolisacaridos:

Acidos (dependiendo de que presenten o no grupos ácidos)

Condroitina : Proteina de la sustancia fundamental del cartílago

Sustancia fundamental del tejido

Ácido hialurónico

Células glandulares del epitelio respiratorio

Neutros (con frecuencia se hallan unidos a una proteina, formando glucoproteinas o

mucoproteinas)

Glándulas intestinales de duodeno y yeyuno principalmente (células calciformes

que segregan mucina, “moco”)

Revestimiento gástrico (pepsina, factor intrinseco…)

La queratina

Tiroglobulina

Heparina

o Mucoproteínas: Son complejos de proteínas y polisacáridos en los que predomina el primer

componente. Si el contenido en hexosamina es superior al 4 % se denominan mucoproteinas, si

es inferior se denominan glucoproteinas.

o Mucolípidos: Son una mezcla de polisacaridos y ácidos grasos complejos, que se encuentran

generalmente en forma de cerebrósidos y gangliosidos (SNC y mielina).

Para la demostración histológica del GLUCOGENO, pueden emplearse dos tipos de técnicas:

- Técnicas histoquímicas: reacción del PAS

Los MUCOPOLISACARIDOS ÁCIDOS son fáciles de caraterizar por métodos histoquímicos, fundamental

se emplea:

- La técnica del azul alcián

- La reacción metacromática (azul de toluidina)

Los MUCOPOLISACARIDOS neutros, MUCOPROTEINAS, GLUCOPROTEINAS Y MUCOLÍPIDOS

constituyen un grupo homogéneo, desde el punto de vista de su detección. A menudo se les designa con el

nombre de compuestos mucides.

La reacción del PAS es uno de los mejores métodos para su detección, se dice que son compuestos PAS +, a

diferencia de los mucopolisacáridos ácidos que son compuestos PAS -.

REACCIÓN DEL PAS

Fundamento

Consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido periódico para incrementar el número de grupos carbonilos

presentes en ellos, de modo que puedan ser posteriormente demostrados por el reactivo de SCHIFF.

Los hidratos de carbono contienen grupos carbonilos relativamente aislados, en una porción aproximada de

uno por molécula de monosacárido. Por ello es necesario oxidarlos, con el fin de incrementar dichos grupos,

ya que solo pueden ser detectados por el reactivo de Schiff, si se encuentran situados en carbonos contiguos.

El agente oxidante es generalmente el ácido periódico, aunque en alguna variante puede utilizarse el ácido

crómico. Los mucopolisacaridos ácidos no pueden ser oxidados por el ácido peryódico por presentar grupos

ácidos: carboxilicos o sulfatados, en lugar de grupos alcoholicos.

TINCIÓN P.A.S

Reactivos:

- Acido peryódico 0,5%

- Bisulfito Sódico al 2%

- Hx Carazzi

- Reactivo de Schiff

o H2O……………………… 200 cc

o Fucsina básica……………. 2 gr

o Metabisulfito sódico

o HCl concentrado…………. 1 cc

o Carbono activado

Preparación:

Se lleva a ebullición el agua y se añade la fucsina. Se disuelve y se enfria a 50ºC. Filtrar y añadir

metabisulfito y HCl (color rosa pálido). Se deja reposar 24 h en un frasco opaco y se filtra (la solución no

tiene que tener color, entre transparente y rosa pálido). Añadir el Carbono más o menos unos 8 gr cada 200 ml

de solución. Dejaremos reposar unas horas y lo filtraremos (en nevera y frasco topáceo). Cuando coja un color

rosadito lo tiramos.

Técnica:


- Crear dobles enlaces con el acido periódico ---- 10 min.

- Lavado en agua ---- 2/10 min

- Reactivo de Schiff ---- 20/30 min

- Bisulfito sódico

- Lavado en agua ---- 10 min

- HX Carazzi ---- 3/5 min

- Lavado en agua del grifo ---- 2/4 min


Resultados:

- Nucleos Azul

- PAS + Rosa, rojo (a veces naranja)

- PAS - Incoloro

PROCESOS 1

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