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PRODUCCIÓN A GRAN ESCALA DE PROTEÍNAS EN MICROORGANISMOS RECOMBINANTES

Laboratorio de Fisiología y Genética de Bacterias Lácticas

PRODUCCION DE PRODUCTOS COMERCIALES

• Requiere una Sociedad entre biologos moleculares e Ingenieros.• En los comienzos de la biotecnología molecular se pensaba que

“escalar” un proceso era solo cuestión de multiplicar.• Es decir se pensaba que las condiciones de laboratorio iban a ser efectivas a

gran escala.

PARÁMETROS A TENER EN CUENTA

• Temperatura• pH• Velocidad y forma de mezclado de las células• Demanda de oxígeno

• Tener en cuenta que las condiciones óptimas se modifican con cada cambio de 10 veces el volumen del biorreactor

PARÁMETROS A TENER EN CUENTA

• Diseño del biorreactor• Proveer condiciones de esterilidad• Contener a los microorganismos genéticamente modificados• Debe tener sondas para monitorear los parámetros de fermentacion

PROCESO DE FERMENTACIÓN

PRINCIPIOS DE CRECIMIENTO MICROBIANO

• Los microorganismos se pueden crecer en:• Batch (discontinua)• Fed-Batch (Batch alimentado)• Continuo

• Batch• Se adiciona el medio de cultivo y microorganismos al comienzo

• Fed-Batch• Los nutrientes se adicionan incrementalmente a diferentes tiempos, prolongando

la fase de crecimiento logarítmico del cultivo.• no se remueve el medio de cultivo hasta el final

• Contínuo• Se adiciona medio de cultivo nuevo constantemente y se remueve un volumen

igual de medio gastado.

FERMENTACIONES

FERMENTACIÓN CONTÍNUA

• Se logra un estado estacionario• La pérdida de células (por remoción del producto) se balancea por la ganancia

de células por crecimiento (división)• Se usa poco debido a la menor experiencia que se tiene, pero es mas

eficiente:• Los biorreactores son mas pequeños• El equipo necesario para la recolección, ruptura y procesamiento posterior es

mas pequeño que para fermentaciones batch• No hay tiempos muertos• El estado fisiológico de las células es mas uniforme

FERMENTACIÓN CONTÍNUA

• Desventajas:• La duración suele ser de 500 o 1000 hs (20 o 40 días), con lo cual se pueden

perder los plásmidos si no se aplica una presión de selección adecuada• Mantener la esterilidad por tanto tiempo es complicado• La calidad del medio de cultivo no suele ser estándar.

MAXIMIZAR LA EFICIENCIA

• Asegurar la provisión de oxigeno• Mantener el pH en un valor óptimo, adicionando ácido o base• Mezclado de los microorganismos, para homogeneizar nutrientes y

desechos.

• Cultivos de alta densidad (50-150 gr por L)• En general cuanto mayor densidad celular mayor cantidad de producto se

obtiene• Se logra optimizando:

• el medio de cultivo• Adicionando nutrientes en momentos precisos (midiendo concentración del sustrato

limitante)• Oxígeno

BIORREACTORES

• Hay muchos ejemplos pero la mayoría cae en tres clases fundamentales:• Tanques agitados (STRs) (A)• Tanque de burbujas (B)• Airlift (C y D)

BIORREACTORES

• Hay muchos ejemplos pero la mayoría cae en tres clases fundamentales:• Tanques agitados (STRs) (A)• Tanque de burbujas (B)• Airlift (C y D)

FERMENTACIÓN EN DOS ETAPAS EN AIRLIFT

• E. coli NM989 codifica la T4 DNA ligasa bajo el promotor inducible por temperatura

• La etapa de crecimiento se hace en un reactor de 10 L a 30°C.

• La etapa de inducción se hace en un reactor de 5 L a 42°C.

• Se transfieren 33 ml de suspensión por minuto, logrando un cambio de temperatura instantáneo.

• Las células permanecen 5h en el reactor de crecimiento (tiempo de retención o residencia) y 2h en el de inducción

• Se adiciona medio nuevo a cada reactor• Se extraen las células y procesan

COSECHANDO LAS CÉLULAS

• Centrifugación usado en la mayoría de las aplicaciones

• Microfiltración por membrana• Método tradicional (A), las células se acumulan en la

superficie y se reduce muy rápidamente el flujo• Método de flujo cruzado (B), solo una pequeña parte de

las células se adhieren y el flujo no disminuye tan rápido

PASO SIGUIENTE

• Si la proteína está en el medio de cultivo, concentrar generalmente por ultrafiltración

• Si está en el citoplasma de las células hay que romperlas

DISRUPCIÓN

PROCESAMIENTO POSTERIOR

• Depende de la aplicación de la proteína• Usos industriales menor pureza• Usos farmacéuticos, mayor grado de pureza