PRODUCCIÓN DE ENZIMAS ANTIFÚNGICAS A PARTIR … · V Congreso Internacional de Ingeniería...

V Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica XVI Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica

VI Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular

Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C. P. 02090, México, D. F. Tel. y Fax: 5623 3088 email: [email protected], [email protected]

Clave: 1460

PRODUCCIÓN DE ENZIMAS ANTIFÚNGICAS A PARTIR

DE DESECHOS DE LA INDUSTRIA PESQUERA

Jacel, Adame García; Mariano, Avalos Mata; Gaspar de los Reyes,

González Cu

DIRECCIÓN DE LOS AUTORES

Km. 4.5 Carretera Cardel – Chachalacas, Ursulo Galván, Veracruz. Cp 91662 CORREO ELECTRÓNICO

[email protected]




INTRODUCCIÓN

Es evidente, que para lograr el establecimiento de los cultivos de interés agrícola en nuestro país y ampliar la frontera actual de producción, es necesario establecer condiciones viables de control de los hongos fitopatógenos que se encuentran en los suelos y atacan a las raíces, parte aérea y semillas en los diferentes ecosistemas (Barboza et al., 1998 y Benítez et al., 1998), ya que, el uso indiscriminado de productos químicos en la agricultura para el control de dichas enfermedades, ocasionan diversos problemas, tales como contaminación del medio ambiente, resistencia de las plagas y enfermedades a dichos productos químicos, aparición de organismos oportunistas perjudiciales para las plantas, daños a los animales y sobre todo riesgos para la salud humana. En la agricultura los pesticidas son sustancias químicas destinadas a matar, repeler, atraer, regular o interrumpir el crecimiento de plagas que dañan los cultivos. Consideramos plaga a aquellos organismos nocivos que transmiten enfermedades, compiten por alimentos y/o dañan bienes económicos y culturales (Olivera y Rodríguez, 2000). Es muy común que cuando comienza a usarse un nuevo pesticida, este sea eficiente para controlar las plagas y enfermedades con poca cantidad de producto. Sin embargo, un uso indiscriminado a través del tiempo, hacen que estos productos disminuyan su eficacia para el control de plagas y enfermedades por la aparición de resistencia biológica, lo que hace que la aplicación de estos productos aumente, ocasionando pérdidas económicas y daños ambientales y a la salud humana. La llamada resistencia a los productos químicos se produce porque entre los muchos individuos que componen la población de hongos fitopatógenos que atacan los cultivos, algunos producen enzimas inducidas que degradan al pesticida y son precisamente estos, que no han muerto, los que tienen descendencia y forman las nuevas poblaciones de hongos que heredan el gen de resistencia y la acción del fungicida contra ellas será mucho menor (Echarri, 1998). Estos productos son difíciles de degradar por los microorganismos del suelo y de eliminarse por los organismos, porque son poco solubles en agua y tienden a acumularse en los tejidos grasos. Cuando unos organismos son fuentes de alimentación por otros, el fungicida se va acumulando en mayores proporciones en los tramos finales de la cadena trófica. De esta forma, un producto químico que se encuentra en concentraciones muy bajas, nada peligrosas, en un bosque o un lago, termina estando en concentraciones decenas o cientos de veces más altas en los tejidos grasos de los animales, como aves rapaces, peces o mamíferos depredadores que están situados en lo más alto de la cadena trófica (Echarri, 1998). Se ha demostrado que los funguicidas perjudican la salud humana, ya que, crean sustancias residuales que quedan en los frutos y se transforman en el organismo cuando es ingerido dicho alimento. Así mismo, cuando se efectúan las aplicaciones directas, penetran en la ropa, afectando también al aparato respiratorio (Infoagro, 2004).




En el aire, agua y suelo existen microorganismos patógenos para plantas, animales y hombre que aprovechan sus mecanismos de infección para desarrollarse o multiplicarse sobre ellos, debido a esto es difícil considerar algún lugar libre de microorganismos (Montealegre, 2002). Dentro de los microorganismos patógenos para las plantas encontramos a los fitopatógenos, los cuales muestran una especificidad hacia el órgano al cual se unen, de forma que normalmente no atacan todas las partes de la planta hospedadora; algunos colonizan partes aéreas mientras que otros infectan las raíces. Emplean diferentes mecanismos para unirse a la superficie de la planta hospedera, en cualquier caso, la penetración en la planta precisa del contacto y la adherencia de las esporas y/o de la primera hifa que resulta de su germinación (tubo germinativo) a la superficie vegetal. El siguiente paso en el establecimiento de la infección supone la penetración de las hifas de los hongos patógenos en sus hospederos. La penetración puede tener lugar de forma mecánica, por digestión enzimática o a través de aberturas naturales (Rivera, 2002). El control de plagas y enfermedades con productos químicos es cada vez más cuestionado, por la exigencia de los consumidores en la reducción de la aplicación de estos productos. Los agroquímicos además de contaminar el medio ambiente no siempre dan buenos resultados, por lo que, se presenta hoy en día, mucha importancia a una agricultura más biológica (Infoagro, 2004). El control biológico es el empleo de organismos para combatir o controlar las plagas y enfermedades en los cultivos, de forma que, así se evita o reduce el empleo de pesticidas que dejan residuos tóxicos en el suelo, agua, los frutos y plantas, causando daños a la salud humana y animal (Infoagro, 2004). Las ventajas del control biológico para el combate de plagas y enfermedades en los cultivos agrícolas es que se puede utilizar indirectamente en los insectos depredadores o el uso de bioinsecticidas o biofungicidas con formulaciones que contengan enzimas antifúngicas o microorganismos que producen dichas enzimas. Las enzimas antifúngicas han sido aisladas de bacterias, hongos y plantas, las cuales son capaces de inhibir el crecimiento de hongos fitopatógenos (Flach et al., 1992). Las primeras observaciones del empleo de microorganismos productores de enzimas antifúngicas para el biocontrol de hongos fitopatógenos fueron efectuadas por Ordentlich et al., (1987) donde se demostró que había degradación parcial de las hifas de Sclerotium rolfsii por las enzimas producidas por Serratia marcescens. Posteriormente, Shapira et al (1989), produjeron altas concentraciones de enzimas antifúngicas codificadas por los genes de Serratia marcescens en E. coli recombinante, resultando efectivas para el biocontrol de enfermedades causadas por S. rolfsii y R. solani en algodón.




Boller (1986), empleo un complejo de enzimas antifúngicas obtenidas a partir de Streptomyces kurssanovi, siendo efectivas para el biocontrol de Fusariosis en trigo. Estudios realizados por Mao et al (1998), en semillas de tomate y pimiento sembrados en el suelo infectado con Rhizoctonia solani, Phytium ultimátum, Sclerotium rolfsii y Fusarium oxisporum f. sp lycopersisi encontraron que, cuando fueron tratados con Gliocladium virens (Trichoderma virens) y la bacteria Burkholderia cepacea (Pseudomona cepacea) individualmente y en combinación, el porcentaje de plántulas erguidas de tomate y pimiento fue significativamente (P < 0.05) mayor que en las no tratadas, no existiendo diferencias con relación a los tratamientos. Al Trichoderma harzianum lo han descrito como un microorganismo utilizado para el biocontrol de hongos (Inbar y Chet, 1995; Limón et al., 1998; Carsolio et al., 1999), que produce un complejo de enzimas antifúngicas y el Bacillus thuringiensis es utilizado principalmente como agente de control de insectos; sin embargo presenta un activo sistema enzimático inducido por sustratos quitinosos que no ha sido bien estudiado. Así, Escudero et al (1998), al estudiarlo como agente de control de hongos fitopatógenos, encontraron que sus enzimas producidas a partir de la fermentación con cáscara de camarón inhibió el crecimiento de diversos hongos en medio líquido, afectando al Aspergillus terreus en un 82%, A. fumigatus en un 8% y moderadamente al resto de los demás hongos de entre el 26 al 56% cuando se aplico dicho sustrato. La manera en que las enzimas antifúngicas pueden ser utilizadas para el biocontrol de hongos fitopatógenos puede ser descrita como: 1. Introducir microorganismos nativos o genéticamente modificados en la rizósfera de los cultivos agrícolas capaces de expresar y secretar enzimas antifúngicas en presencia del hongo fitopatógeno (Carsolio et al., 1999 ), 2. Aplicar enzimas libres o inmovilizadas en el agua de riego o incorporadas como recubrimiento de la semilla (Oppenheim y Chet, 1992) y 3. Producir plantas transgénicas que expresen el gen de la quitinasa (Lorito et al., 1996). Las enzimas antifúngicas, son un conjunto de enzimas que catalizan la hidrólisis de la quitina, contenida en la cáscara de camarón o en la pared celular de los hongos fitopatógenos. Obteniendo como producto final N-acetilglucosamina (NAG). Gracias a esta actividad las enzimas antifúngicas se utilizan para el biocontrol de hongos fitopatógenos (Place, 1996). Las enzimas antifúngicas escinden los enlaces β entre el C1 y el C4 de dos unidades consecutivas de N-acetilglucosamina de la quitina (Flach et al., 1992). La degradación enzimática de la quitina a grandes rasgos, puede llevarse por dos caminos o vías, la vía quitinolítica y la vía de la quitosana. En la vía quitinolítica se obtiene como producto final el NAG, en tanto que en la vía de la quitosana una mezcla de NAG y glucosamina (Meens et al., 2000). Los caparazones de los crustáceos como jaibas, camarones o cangrejos representan la primera fuente para obtener quitina. Los caparazones, además de contener la quitina en forma de sales de calcio, también proveen de pigmentos rojos y proteínas con la misma calidad a la de la carne del crustáceo (García, 2002). En la captura de crustáceos sólo se aprovecha su carne, quedando los caparazones como desperdicios; Escudero (1998),




expresa que "a partir de este desperdicio se puede comenzar toda una industria dedicada a la producción de quitina y sus diferentes derivados" (García, 2002). Entre las aplicaciones de estos residuos es su transformación en harinas, que son utilizadas para enriquecer los alimentos de aves, peces y ganado (Cabello, 1998). Debido a la insolubilidad, complejidad química y tamaño de los sustratos quitinosos, los microorganismos no los degradan dentro de las células, si no que secretan las enzimas con diferente especificidad para hidrolizarlos y utilizar los compuestos solubles producidos e incorporarlos a las células como fuente de carbono y nitrógeno. La degradación de la quitina requiere de por lo menos dos enzimas, la endoquitinasa, que hidroliza quitina a subunidades de quitobiosa y β-N-acetilhexosaminidasa (quitobiasa) que hidroliza el dimero a NAG, de esta manera se forman complejos enzimáticos responsables de la degradación de la quitina (Place, 1996). Es por lo anterior, que en este trabajo se considera al control biológico como una alternativa para el biocontrol de hongos fitopatógenos, mediante el empleo de bacterias productoras de enzimas antifúngicas; las cuales según Barboza et al., 1998 y Benítez et al., 1998, al ser aplicadas a las semillas en el momento de la siembra, en el surco del plantío, agua de riego o por vía foliar puedan inhibir el crecimiento, multiplicación y sobrevivencia de dichos microorganismos, basándose en la degradación de la quitina contenida en su pared celular. La producción de las enzimas antifúngicas por parte de algunas bacterias se lleva a cabo mediante la utilización de desechos de la industria pesquera, como la cáscara de camarón, cangrejo y jaiba los cuales son fáciles de conseguir ya que, según datos de la Comisión Nacional de Acuacultura y Pesca (periodo Enero-Abril 2004), Veracruz sostuvo una producción de 630 toneladas de camarón, 882 toneladas de jaiba y 885 toneladas de cangrejo, quedando como desperdicio grandes cantidades de caparazón. En la mayoría de las veces, estos caparazones son depositados al aire libre contaminando el medio ambiente, debido al mal olor que desprenden, sin embargo pueden ser utilizados para producir quitina, quitinasa y otros derivados. Por ello, se consideró que, realizar un estudio sobre el control biológico de hongos fitopatógenos a partir de enzimas antifúngicas producidas por desechos quitinosos de la industria pesquera es económicamente viable, para conformar una línea de trabajo sobre esta temática en nuestra Institución. Por lo que, para realizar esta investigación se planteó el siguiente objetivo: Producir enzimas antifúngicas a partir del mejor sustrato quitinoso de la industria pesquera. Este trabajo partió de la hipótesis, de que al menos un sustrato presenta mayor crecimiento bacteriano y mejor actividad enzimática. Así la producción de enzimas antifúngicas por microorganismos aislados del suelo, como agentes de control biológico en los cultivos agrícolas, llevará a la adquisición de una nueva herramienta biotecnológica para el biocontrol de hongos fitopatógenos sin dañar el medio ambiente.




MATERIALES Y MÉTODOS

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Control Biológico del Instituto Tecnológico de Úrsulo Galván y en el Laboratorio de Biofertilizantes en el Campo Experimental “La Posta” CIRGOC-INIFAP. Para obtener el sustrato, se recolectó cáscara de camarón, cangrejo y jaiba de las empacadoras de Alvarado, Ver; se lavaron con agua corriente para eliminar restos orgánicos, se secaron al aire libre a 35-40°C en invernadero. Las muestras se molieron en un molino pulvex a tamaño de partícula de 50 mesh y se almacenaron en botes de plástico hasta su utilización. Por otra parte, las muestras de suelos fueron recolectadas del municipio de Medellín de bravo, campos en los que se cultiva tomate y chile principalmente, empleando el método del zig-zag a una profundidad de 20 cm aproximadamente y se trasladaron en cajas de unicel. Para la preparación de sobrenadantes, se pesó 1g de suelo de cada muestra y se depositaron en matraces Erlenmeyer de 250 ml, el cual contenía 200 ml de solución salina y 50 ml de solución de cáscara de camarón al 6% estéril para realizar una selección inicial de bacterias. Las muestras fueron colocadas en agitación durante 72 horas a 200 rpm. Posteriormente, se tomaron 5 ml de solución de suelo de cada muestra y se colocaron en tubos para centrífuga, y se centrífugo durante 5 minutos a 1500 rpm. El sobrenadante obtenido se observó al microscopio, posteriormente, se colocó en tubos de ensaye manteniéndose a una temperatura de 4°C hasta su posterior utilización y conservación. La fase experimental consistió en tres etapas: 1) Aislamiento y selección de bacterias en medio agar nutriente y Salmonella-Shigella 2) Selección de bacterias productoras de enzimas antifúngicas 3) Cultivo de microorganismos en medio conteniendo cáscara de camarón al 6%. Aislamiento y selección de bacterias en medio agar nutriente y Salmonella-Shigella Se suspendieron 23 g de agar nutriente en un litro de agua destilada y se sometió a calentamiento en una parrilla hasta que hirviera por 2 minutos, y se esterilizó en autoclave 15 minutos a 1lb/pug2. Para el agar Salmonella y Shigella se suspendieron 60 g en un litro de agua destilada y se sometió a calentamiento en una parrilla hasta que hirviera por 2 minutos. Una vez solidifacados se sembro el inóculo con ayuda de un asa, por el método de las estrías. Las placas se incubaron, en posición invertida, a 32-35 °C. A las 72 horas de incubación se llevo a cabo una caracterización macroscópica de los microorganismos aislados en el medio nutritivo, evaluando aspectos como: forma, borde, elevación, y superficie de las colonias. De acuerdo a la caracterización se seleccionaron colonias perfectamente aisladas;




Posteriormente se agruparon todas aquellas que presentaban las mismas características macroscópicas quedando al final cepas diferentes entre sí. Se prepararon nuevamente medios de cultivo agar nutriente en placas de Petri y se sembraron las cepas seleccionadas por sus diferencias macroscópicas, incubándose durante 72 horas, para un mayor aislamiento y caracterización, de tal manera que solo se encontrara un tipo de bacteria por caja de Petri. Selección de bacterias productoras de enzimas antifúngicas Se prepararon los medios de cultivo conteniendo cáscara de camarón, cangrejo y jaiba a una concentración de 6% suspendiéndose en agua destilada; Posteriormente se calentó en una parrilla hasta ebullición, filtrándose con una gasa el medio 3 veces para eliminar los residuos de cáscara; una vez filtrados, se agregaron 20 g/L de agar bacteriológico y se sometió a esterilización en la autoclave a 1 lb/in2 durante 15 minutos. Posteriormente se vertieron en placas Petri para su utilización.Se sembraron en cada placa Petri conteniendo cáscara de camarón, cangrejo y jaiba las cepas para determinar el mejor sustrato, la siembra se llevó a cabo por el método de las estrías con dos repeticiones de cada cepa en cada uno de los sustratos. Cultivo de microorganismos en medio conteniendo cáscara de camarón al 6% Para determinar la capacidad de cada microorganismo de utilizar quitina como única fuente de carbono, se utilizaron matraces Erlenmeyer con capacidad de 500 ml, volumen de trabajo de 250 ml y como sustrato cáscara de camarón molido a una concentración del 6%, pH 7.0 ±2 y esterilizado a 1lb/pug2 durante 15 minutos. Posteriormente, se inoculó el medio de cultivo con 5 ml de solución salina al 0.85 % que contenía suspendida cada una de las cepas de bacterias y se incubó a una temperatura de 30°C ± 2°C. Se establecieron tres repeticiones por cepa. Para la lectura de crecimiento bacteriano a través del tiempo, se emplearon 5 ml del medio por cada repetición y se determinó la capacidad de cada microorganismo de degradar la quitina contenida en la cáscara de camarón, como única fuente de carbono, tomando lecturas de absorbancia en el espectrofotómetro Spectronic® cada 12 h durante 96 h. Diseño experimental y análisis estadístico Para evaluar el crecimiento bacteriano a través del tiempo en medio de fermentación conteniendo cáscara de camarón, se utilizó un diseño completamente al azar con replicas de tres para cada uno de los tratamientos. A los resultados obtenidos se les aplicó un análisis de regresión polinomial cuadrática.




RESULTADOS

Aislamiento y selección de bacterias en medio agar nutriente y Salmonella-Shigella De las muestras de suelos agrícolas colocados en matraces Erlenmeyer y posteriormente sembrados en agar nutriente se aislaron y seleccionaron 42 cepas según sus características macroscópicas. En cada una de las muestras de suelo el número de colonias fue diferente, además de que presentaron características macroscópicas diferentes, tales como tamaño, color, bordes, transparencia, consistencia, brillantez y elevación. Posteriormente se agruparon todas aquellas cepas que presentaban características macroscópicas iguales quedando solo 25. Para un mejor aislamiento y caracterización de las bacterias, estas fueron aisladas nuevamente en agar nutriente, para obtener cultivos áxenicos (Figura 1) que nos permitieran inocularlas con mayor facilidad en los medios de cultivo de cáscara de camarón, cangrejos y jaiba.

Figura 1. Cultivos áxenicos de bacterias cultivadas en agar nutriente. En esta figura se presentan nueve de las 25 cepas aisladas.




Selección de bacterias productoras de enzimas antifúngicas A las 48 horas de que se inocularon los medios de cultivo de cáscara de camarón, cangrejo y jaiba con las 25 cepas para sus selección (Figura 2), se presentó crecimiento bacteriano en los tres sustratos, sin embargo por su mejor desarrollo y multiplicación de las bacterias según las características de sus colonias, tales como delimitación perfecta de la estría, mayor número de colonias en las 25 cepas y menor tiempo en el crecimiento bacteriano, se determinó al sustrato de cáscara de camarón como el mejor, por lo que se determinó utilizarlo como material de trabajo en la etapa de fermentación a las 25 cepas.

Figura 2. Cepas de bacterias cultivadas en medios selectivos. El inciso a, corresponde al medio de cultivo de cáscara de camarón; el b, al de jaiba y c, al medio de cultivo de cáscara de cangrejo).




Cultivo de microorganismos en medio conteniendo cáscara de camarón al 6% La fermentación se siguió durante 96 horas en las cuales se tomaron lecturas de absorbancia para determinar el crecimiento de los microorganismos en el medio de cáscara de camarón de cada una de las cepas bacterianas, para ello se llevó a cabo un análisis de regresión polinomial cuadrática, donde se observó una tendencia variable de aprovechamiento de quitina, determinándose las cepas 2, 17, 23 con un tiempo de crecimiento a las 48 horas y 6, 19, 23, 24 y 25 con un tiempo de crecimiento a las 60 horas como las mejores (Figura 3).

Figura 3. Gráficas de valores de absorbancia. En esta figura se ilustra el crecimiento de los microorganismos durante el proceso de fermentación en medio de cultivo conteniendo cáscara de camarón.




DISCUSIÓN

Al sembrar los microorganismos en agar Salmonella y Shigella, no se observó crecimiento bacteriano, por lo que podemos estar seguros que no se trabajó con microorganismos dañinos para la salud. Para la obtención de enzimas antifúngicas se empleó cáscara de camarón como sustrato debido a que los microorganismos aprovecharon con más facilidad la quitina de este crustáceo como fuente de carbono; estableciéndose de una manera superior al de cangrejo y jaiba, siendo que en cangrejo no presentaron colonias las cepas 5, 17 y 21 y las cepas 6, 12, 22 y 21 en cáscara de jaiba. Lo anterior nos da un indicio de que la quitina presente en los sustratos empleados presenta diferentes espacialidades, lo que provoca que las bacterias se comporten de manera distinta. De tal forma que se puede suponer que las cepas seleccionadas, aunque lentamente, son capaces de hidrolizar estos sustratos distintos en su composición (Place, 1996). Este resultado nos permite deducir que estas bacterias producirán distintos tipos de enzimas antifúngicas, las cuales no serán específicas para un solo tipo de hongo, sino que serán efectivas para cualquier hongo fitopatógeno. Las cepas aisladas y seleccionadas presentaron diferentes comportamientos en la fermentación empleando cáscara de camarón como sustrato, observándose que unas cepas son más efectivas que otras, esto se debe probablemente al comportamiento diferente de cada bacteria, lo que provoca que algunas cepas se adapten con mayor facilidad al medio y a las condiciones de fermentación. Al final de la fermentación se obtuvieron 15 litros de bioproducto, los cuales contenían las enzimas antifúngicas: quitinasas, proteasas y glucanasas, capaces de degradar los diferentes sustratos según su especificidad. Por los resultados obtenidos, se demuestra que las bacterias aisladas y seleccionadas efectivamente utilizan la quitina contenida en la cáscara de camarón y por consiguiente obtienen un rápido crecimiento y producción de enzimas antifúngicas.

CONCLUSIONES

Las 25 cepas bacterianas aisladas y seleccionadas fueron capaces de aprovechar los desechos quitinosos como única fuente de energía.




En el medio agar Salmonella-Shigella no hubo crecimiento de ninguna clase de microorganismo por lo que se puede concluir que no se esta trabajando con microorganismos dañinos para la salud humana. El mejor sustrato quitinoso para el crecimiento de microorganismos en medios de cultivo sólido fue el de cáscara de camarón, en comparación con el de cáscara de jaiba y cangrejo. De las 25 bacterias seleccionadas, las cepas 2, 6, 17, 19, 23, 24 y 25 fueron las mejores al utilizar mayor cantidad de quitina como fuente de carbono. Es posible producir enzimas antifúngicas como proteasas, glucanasas y quitinasas, a partir de la fermentación de desechos quitinosos de la industria pesquera




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