Programa de doctorado en Química Médica€¦ · USP-CEU 2 Escalas de tiempo en RMN Procesos de...

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Metodologías para la determinación estructural de fármacos y el estudio de fenómenos de

reconocimiento molecular

Programa de doctorado en Química Médica

Escalas de tiempo en RMN

Gema Domínguez Martín

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Escalas de tiempo en RMN

Procesos de relajación. Relajación espín-red. Relajación espín-espín. Determinación de T1. Determinación de T2, secuencia de eco de espín. Técnicas de doble resonancia. Deacoplamiento homonuclear. Desacoplamiento heteronuclear. Espectros editados utilizando secuencias de eco de espín: modulación por la constante de acoplamiento (SEFT y APT). Transferencia de polarización por irradiación selectiva (SPT). Transferencia de polarización por inversión de población (SPI). Experimento INEPT. Experimento DEPT.

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Procesos de relajación

• En un campo magnético estático B0, la magnetización longitudinal Mz (en el eje z) crece progresivamente desde cero hasta un valor máximo M0. En ese momento el sistema habrá alcanzado el equilibrio térmodinámico y la ocupación de los niveles vendrá gobernada por la estadística de Boltzman: el estado de espín ½ (es decir, aquel orientado como el campo B0) estará más poblado que el estado de espín -½, por lo que aparecerá una magnetización M0.

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• Si en esta situación aplicamos un pulso de radiofrecuencia de duración t a la frecuencia de resonancia, la muestra se verá afectada por la acción de un nuevo campo magnético dependiente del tiempo B1(t).

• El sistema absorbe energía provocando un aumento del número de estados con espín -½ y una disminución del número de estados con espín ½.

Se produce una pérdida de magnetización longitudinaly un incremento de magnetización transversal

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• Tras aplicar un pulso de 90º, el extremo del vector µ (vector de magnetización) desciende hacia el plano transversal xy describiendo una espiral y los protones adquieren la misma fase apareciendo la magnetización transversal(Mt)

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• Si se aplica un pulso de 180º, los protones no se detienen en el plano transversal, continúan su movimiento en espiral volviéndose a desfasar y aparece un componente negativo de la imantación longitudinal (-Ml).

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• Cuando finaliza el pulso de radiofrecuencia (RF) se necesita un tiempo para que la magnetización vuelva a alcanzar el equilibrio. Debido a que en RMN la emisión espontánea es muy poco efectiva, el retorno al equilibrio se logra a través de los procesos de relajación .

• Procesos de relajación (PR): Diferentes tipos de transiciones sin radiación mediante los cuales un núcleo en un estado de espín excitado vuelve al estado inferior o fundamental.

• Los procesos de relajación se dividen en dos categorías:

- Relajación espín-red (o longitudinal), en la misma dirección que el campo aplicado.

- Relajación espín-espín (o transversal), perpendicular a la dirección del campo.

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• Durante la relajación, el vector µ de cada protón regresa desde el plano transversal a su posición original recorriendo a la inversa la misma espiral pero a una velocidad de precesión diferente en función del tipo de protón.

• En primer lugar, los espines se desfasan mientras precesionan hasta que la distribución es uniforme. Por consiguiente, la magnetización transversal decreceprogresivamente hasta cero.

• En segundo lugar, la desexcitación de un gran número de espines reestablece la magnetización longitudinal Mz hasta su valor en el equilibrio térmico M0.

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• Cada proceso de relajación ocurre en un periodo de tiempo determinado, denominados tiempo de relajación longitudinal y tiempo de relajacióntransversal, T1 y T2, respectivamente (o sus recíprocos, las velocidades específicas de relajación longitudinal y transversal R1 y R2).

• Los procesos de relajación determinan la anchura de la señal. El principio de incertidumbre de Heissenberg demuestra que la anchura natural de una banda es inversamente proporcional al tiempo medio que el sistema permanece en el estado excitado.

• Desde un punto de vista operativo, la velocidad de relajación determina el tiempo que tenemos que esperar para que dos medidas consecutivasrealizadas sobre el mismo sistema sean realmente idénticas o la intensidad y la velocidad de repetición máximas de los pulsos que no cause saturación.

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Relajación espín-red, espín-retículo o longitudinal

• La relajación espín-red es conjunto de procesos mediante los que se recupera la magnetización longitudinal perdida tras el pulso de radiofrecuencia y se alcanza la magnetización del equilibrio termodinámico (M0).

• La interacción entre los espines nucleares en estado excitado y los campos magnéticos fluctuantes generados por el entorno molecular o retículo devuelve el espín excitado al estado fundamental desprendiendo calor.

• La constante de tiempo que regula este proceso se denomina tiempo de relajación longitudinal T1.

• La relajación espín-red, que depende de la movilidad del retículo, es relativamente eficiente en los líquidos (T1 del orden de 1s), pero no lo es en los líquidos viscosos y en los sólidos cristalinos donde las movilidades son bajas, en esos casos T1 suele ser grande (T1 del orden de 102s).

• T1 disminuye a temperaturas elevadas porque aumenta la movilidad del sistema.

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Relajación espín-espín o transversal

• La relajación transversal es conjunto de procesos mediante los que la magnetización transversal decae hasta prácticamente cero tras un pulso de radiofrecuencia

• En la relajación transversal o espín-espín los espines nucleares dejan de precesionar perdiendo la magnetización transversal (en el plano xy).

• Este desfase está producido por tres fenómenos:

La interacción dipolar entre un espín en su estado excitado y otro espín del mismo tipo en su estado fundamental, el espín excitadoretorna al estado fundamental transfiriendo energía al otro espín que sufre la transición al estado excitado.

Desplazamiento químico: los núcleos con diferente desplazamiento precesan a diferentes frecuencias.

Inhomogeneidades en el campo magnético externo: núcleos bajo diferentes valores del campo magnético externo precesan a diferentes frecuencias.

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Relajación espín-espín o transversal

• La componente estática (paralela a B0) no interviene en la relajación. Varía de un núcleo a otro bajo el efecto de los campos producidos por los otros núcleos.

• Componente giratoria: si hay 2 núcleos vecinos de igual naturaleza, experimentarán mutuamente la acción de estas componentes giratorias y se pueden inducir transiciones entre las diferentes orientaciones de los espines nucleares. Ambos núcleos podrán interactuar intercambiando energía entre ellos. Este proceso se denomina inversión mutua de espines o flip-flop.

14USP-CEUT2 pequeño

relajación rápidaT2 grande

relajación lenta

Relajación espín-espín o transversal• La interacción entre espines no cambia la población neta del estado excitado

porque las poblaciones N1 y N2 no se ven modificadas, pero que la duración de vida del núcleo en el estado excitado disminuye y en consecuencia la señal se ensancha.

• Este fenómeno, que es irreversible, se caracteriza por un tiempo de relajación transversal T2.

• En moléculas pequeñas normalmente T2 ≈ T1 (tiempo largo de reestablecimiento del equilibrio). En moléculas grandes T1 >>> T2.

∆ν½ = 1 / πT*2

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Randomization in XY plane: Magnetization Decays

I h NET Magnetization

Transverse T2 Relaxation

Longitudinal T1 Relaxation

Relaxation Longitudinal and transverse

Magnetic field

A 90º pulse flips the z-magnetization to xy-plane

CLICK !

Random…Alignment…..

t

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Anchura de las bandas

• Normalmente, T2 condiciona la anchura de la señal.

• Sin embargo, en ciertos casos las señales se ensanchan de forma marcada al producirse un descenso muy acentuado de T1:

- La presencia de electrones desapareados (radicales). Los radicales orgánicos, el oxígeno molecular (dirradical) o las sales de metales de transición (iones paramagnéticos) producen ensanchamiento de las señales.

- La presencia de núcleos cuadrupolares (I > ½), como el 14N, puede producir también ensanchamientos en las señales de núcleos vecinos no cuadrupolares. Así los protones unidos a un 14N (Q = 1) o en posiciones próximas, dan lugar a señales notablemente más anchas que el resto de los protones de la molécula.

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Señales anchas en el espectro.

Muy lenta recuperación del equilibrio térmico (saturación)

Eficiente

T2↓

Poco eficiente

T1↑

Sólido

Señales finas en el espectro.

Rápida restauración del equilibrio térmico

Poco eficiente

T2↑

Eficiente

T1↓

Líquido

CaracterísticasRelajación espín-espín

Relajación espín-red

Estado físico

• Una relajación espín-red eficaz es una condición necesaria para que exista una distribución en los niveles de espín que no alcance la saturación y asípoder observar la señal de absorción de radiofrecuencia de una manera continua.

• En la práctica esa condición no siempre se cumple y entonces la señal disminuye con el tiempo llegando incluso a desaparecer.

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Procesos de relajación: Determinación de T1 y T2

• Los tiempos de relajación T1 y T2 nos van a proporcionar una valiosa información sobre la muestra, debido a que están asociados a procesos relacionados tanto con la interacción entre los espines nucleares y sus entornos moleculares (T1) como con las interacciones entre los propios espines nucleares (T2).

• Nos van a permitir la utilización óptima del tiempo disponible para acumular los espectros y optimizar experimentos como el NOE o el STD que están basados en la relajación.

• T1 se determina usando secuencias multipulso, es decir, se generan varios pulsos de radiofrecuencias separados por intervalos de tiempo determinados. Para T1 se utilizan dos secuencias diferentes:

• Técnica de recuperación de saturación.

• Técnica de recuperación de la inversión

• T2 se determina mediante los multipulsos de eco de espín.

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Procesos de relajación: Determinación de T1 y T2

• Un pulso de radiofrecuencias equivale a la irradiación simultánea de un determinado rango de frecuencias y también a aplicar un campo magnético a la muestra, dada la relación entre frecuencia y campo:

• Las secuencias de pulsos son una serie de eventos (básicamente pulsos de radiofrecuencia separados por periodos de tiempos o delays) aplicados en el tiempo de modo secuencial, ordenado y predefinido, que provocan una modificación específica sobre el estado de los espines que luego se pueden relacionar con algún parámetro molecular a partir del análisis del espectro de RMN resultante.

Pulso de 90º iguala las poblaciones

Pulso de 180º invierte las poblaciones

ν = B0(1 - σ)γ

2π

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Determinación experimental de T1.Experimento de recuperación de la inversión

• Se aplica un pulso inicial de 180º que invierte la magnetización y los niveles poblacionales de la transición sobre la que actúa. Durante el intervalo de tiempo τ siguiente se produce relajación longitudinal cuya magnitud depende de la duración de dicho intervalo. Como la magnetizatión en el eje z no es detectable, se aplica un pulso final de 90º para dirigir el vector de magnetización hacia el plano xy y así pueda ser detectado.

• Según el intervalo τ que usemos veremos señales cuya intensidad varía en función del tiempo de relajación T1.

• Repitiendo el experimento a diferentes valores de τ puede determinarse el valor de T1 para las distintas señales en el espectro.

τ

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Determinación experimental de T1.Experimento de recuperación de la inversión

• Según el intervalo τ que usemos veremos señales cuya intensidad varía en función del tiempo de relajación T1.

• Repitiendo el experimento a diferentes valores de τ se puede determinar el valor de T1para las distintas señales en el espectro.

z

x

y

τ = 0

z

x

y

τ > 0

z

x

y

τ >> 0

z

x

y

z

x

y

z

x

y

90º TF

90º

90º TF

TF

180º

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Procesos de relajación: Determinación de T1Recuperación de la inversión

Secuencia: 180º - τ - 90º - Adquisición

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Procesos de relajación: Determinación de T1Recuperación de la saturación

Secuencia: 90º - τ - 90º - Adquisición Se usan secuencias de dos pulsos de 90ºseparados por un tiempo τ determinado.

El primer pulso tumba la magnetización al plano xy, es decir anula Mz, luego se deja que la magnetización se recupere durante un tiempo y finalmente se vuelve a tumbar al plano xy para poder medirla (el espectrómetro mide la componente x).

Variando el tiempo τ se obtienen puntos que se ajustan a una exponencial decreciente, obteniendo T1 como parámetro del ajuste.

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Experimento de recuperación de la inversión para evaluar los tiempos de relajación longitudinales de 13C en H2O

Espectros con τ = 1-12s y 50s. El C4 tiene una relajación longitudinal más efectiva que los otros carbonos.

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• Si el tiempo de espera entre pulsos (irradiación) es demasiado rápido la magnetización no se recuperará entre una irradiación y la siguiente, la señal se atenuará y en casos extremos puede desaparecer.

• En una medida donde no se permite relajación total entre pulso y pulso las señales de núcleos de mayor T1 (por ejemplo, 13C cuaternarios o carbonilos) tendrán menor intensidad que los de menor T1 (CH y CH2).

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Determinación experimental de T2.Eco de espines

• El campo magnético creado por el imán no es totalmente homogéneo. Las desviaciones de la homogeneidad hacen que los núcleos "sientan" un campo ligeramente distinto en función de su situación en el tubo de muestra. Así, los vectores magnéticos de los núcleos individuales, que componen la magnetización transversal del plano xy, se abrirán en abanico, disminuyendo la intensidad de este tipo de magnetización.

• En principio la evaluación de T2 podría realizarse mediante la medición de la anchura de las señales a altura media, pero en la práctica este parámetro está dominado por las inhomogeneidades del campo magnético, que es de carácter instrumental.

• El ancho de la señal se asocia entonces con el valor de T2 efectivo, T2*,

(T2* ≤ T2).

• Para evaluar al tiempo de relajación transversal T2, eliminando el efecto de las inhomogeneidades del campo B0, se hace uso de la técnica del eco de espines desarrollada por Hahn en 1950.

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• La secuencia de pulsos del eco de espines o de Hahn se muestra en la siguiente figura:

• Se aplica un primer pulso de 90º en x (para hacer bascular el vector de magnetización longitudinal al plano transversal) seguido de un tiempo τ, posteriormente se aplican conjuntos formados por pulsos de 180º en y o en x (el pulso de 180º reenfoca los espines desfasados) seguidos de intervalos de tiempo 2τ.

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• Veamos lo que ocurredespués del pulso de 90º:

z

x

yx

y

≡ x

y

x

y

x

y

τ

180ºτ

desfase

reenfoque

z

y

≡x

y

AQ

• Volvemos a las coordenadas xyz:

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• Si adquirimos la FID justo después del eco, la intensidad de la señal sólo estar afectada por T2 y no por las inhomogeneidades del campo B0.

Mxy(t) = Mxy(0) e-τ/T2

evolución detección

eco

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NN a 90oC

Mxy(t) = Mxy(0) e-τ/T2

31USP-CEUreenfoque delacoplamiento

Eco de espín y acoplamientos heteronucleares

• El eco de espines reenfoca la evolución del desplazamiento químico, si el pulso inicial de 90º para un núcleo determinado está ligeramente fuera de resonancia, el pulso de 180º lo reenfoca:

• También reenfoca los efectos del acoplamiento heteronuclear, el pulso de 180ºsólo afecta al 13C:

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Eco de espín y acoplamientos homonucleares

• El eco de espines no reenfoca los efectos del acoplamiento homonuclear. El pulso de 180º no selectivo, afecta tanto a los dos núcleos involucrados en el acoplamiento como a los espines de su pareja de acoplamiento:

• La secuencia de eco de espines se utiliza en diferentes experimentos multipulsos y multidimensionales. La secuencia elimina la evolución de los desplazamientos químicos y/o los acoplamientos heteronucleares.

evolución delacoplamiento

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Técnicas de doble resonancia

• Las técnicas de doble resonancia consisten, en términos generales, en la irradiación de la muestra con una frecuencia determinada (por ejemplo la de un protón o la de todos los protones) y al mismo tiempo registrar el espectro de la muestra de forma convencional, con lo que el espectro aparecerá como si dicho protón no existiera y por tanto desaparecerán los acoplamiento con él.

• Las técnicas de doble resonancia son una herramienta importante para:

- Simplificar el espectro

- Determinar la posición relativa de los protones de una molécula

- Localizar absorciones ocultas por otras

• Desacoplamiento homonuclear: se usa fundamentalmente en 1H-RMN para desacoplar unos protones de otros.

• Desacoplamiento heteronuclear: se utiliza fundamentalmente en 13C-RMN donde los espectros se realizan con “desacoplamiento protónico”, lo cual simplifica enormemente los espectros al no observarse acoplamientos 13C-1H.

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Desacoplamiento Homonuclear. Desacoplamiento espín-espín• Se irradia a la frecuencia de un protón determinado (en el centro de la señal si se

trata de un multiplete) y se registra el espectro de protones.

• Los acoplamientos del protón irradiado con el resto de los protones de la molécula desaparecen, el espectro se suele simplificar bastante y las asignaciones se pueden realizar de una manera más eficaz.

• Ejemplo: desacoplamiento homonuclear en la 3-aminoacroleína

La irradiación en el centro del doblete a 8.5 ppm (CO─H) hace que se simplifique la señal a 5,25 ppm (que queda como un doblete) y por tanto ésta debe corresponder a la señal del protón vecino al grupo aldehído, de igual modo, la irradiación del protón olefínico a 7,3 ppm hace que también se simplifique la señal a 5.25 ppm.

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• El desacoplamiento de hidrógeno de banda ancha (BB decoupling) es otra técnica de Doble Resonancia.

• Se irradia con una potencia elevada una banda de frecuencias que abarque el intervalo completo de desplazamiento de todos los protones. Para lograrlo, se modula la frecuencia del desacoplador mediante ruido de baja frecuencia.

• Así, los núcleos de 1H acoplados cambian de forma tan rápida la orientación de sus espines que los 13C acoplados con ellos, sólo “ven” un valor promedio que es nulo.

• Como resultado desaparecen los acoplamientos 13C-1H y las señales de 13C aparecen como singletes con una intensidad mayor.

• El inconveniente es que se pierde información sobre las constantes de acoplamiento 13C-1H.

Desacoplamiento Heteronuclear. Desacoplamiento de banda ancha

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Ejemplo: espectro de 13C RMN desacoplado del adamantano.

Mientras que el triplete a ~ 30 ppm es fácilmente identificable como un CH2, en el resto de las las señales los multipletesestán solapados.El espectro de 13C RMN desacoplado muestra claramente la existencia de tres tipos de carbonos

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Desacoplamiento Heteronuclear. Desacoplamiento off resonance

• Si se irradia en una zona muy cercana a la frecuencia de resonancia de los protones sin coincidir exactamente con ésta, lo que se obtiene es un espectro que denominamos de “off resonance”.

• Las señales aparecen como multipletes pero con una disminución significativa de las JCH, no hay tanto solapamiento de señales como en el espectro acoplado.

• Ventajas: sabemos el tipo de carbono que es cada una de las señales (metilo, metileno, metino o carbono cuaternario) dependiendo de la multiplicidad que presenten las mismas, información que se pierde en el espectro desacoplado o BB.

• Inconvenientes: los desdoblamientos no son siempre suficientemente claros, y si en un intervalo estrecho de desplazamiento químico aparecen muchas señales de carbonos se producen solapamientos que dificultan la identificación de los multipletes.

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Ejemplo: espectro de 13C RMN off resonance del propanol.

En rojo se representan las 1Jdel espectro de 13C acoplado

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Espectros editados utilizando secuencias de eco de espín: modulación por la constante de acoplamiento (SEFT y APT).

• Existen diferentes métodos, basados en la técnica del eco de espines o en la transferencia de polarización, que permiten editar un espectro 1D del espín heteronuclear X (13C o 15N), y que suministran información sobre el número de hidrógenos unidos al heteroátomo (SEFT, APT, INEPT, DEPT).

• La información no se extrae de acoplamientos residuales, sino de la intensidad de las señales que podrán ser positivas, negativas o nulas. Este efecto se consigue mediante experimentos modulados a través de J.

• La técnica SEFT (Spin-Echo Fourier Transform) es una de las aproximaciones más simples para determinar el número de hidrógenos unidos directamente a cada carbono.

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Secuencia de pulsos SEFT

τ =1/1JCH

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Técnica del Spin-Echo Fourier Transform (SEFT)

• Durante el periodo de evolución los diferentes componentes de los multipletes de carbono precesan a sus frecuencias individuales.

• La intensidad de las señales está modulada por la evolución del acoplamiento heteronuclear (JCH) durante el primer intervalo τ. Durante el segundo intervalo el acoplamiento heteronuclear no evoluciona pues estamos desacoplando a los protones. Por eso, las señales del espectro de 13C aparecen como singletes.

• El pulso de 180º reenfoca los desplazamientos químicos.

• El éxito del experimento depende de lo estrecho que sea el intervalo de valores de 1JCH, lo que constituye una limitación importante de esta técnica.

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Secuencia SEFT• Evolución de los vectores de magnetización del carbono bajo la influencia

del acoplamiento protón-carbono:

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Secuencia SEFT

• Espectro de 13C-RMN del alcanfor:

a) espectro convencional (no se muestra la señal del carbonilo)

b) τ = 1/J (θ = 180º)

c) τ = 1/2J (θ = 90º)

C

CH2

CH CH3

sólo aparecen señales de C y CH2

O

3CH3, 3CH2, 1CH, 2C

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Técnica del Attached Proton Test (APT)

• La técnica APT también permite determinar el número de hidrógenos unidos directamente a cada carbono lo que facilita la asignación de espectros de 13C RMN.

• El periodo de evolución suele ser 1/ 1JCH, de este modo las señales de los CH y CH3 aparecen como picos positivos mientras que los CH2 y carbonos cuaternarios son negativos.

• Secuencia APT:

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Espectro APT del acetato de colesterilo en CDCl3

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Transferencia de polarización (TP)

• 13C y 15N: poca abundancia natural y sensibilidad reducida en RMN.

• Los núcleos poco sensibles muestran bajas intensidades de señal debido a la escasa diferencia de ocupación de los dos estados nucleares en la inversión de espín.

• Transferencia de polarización: transferencia del exceso de población de un núcleo sensible (1H) a núcleos menos sensibles (13C, 15N) antes de perturbarlos.

• Se logra que las transiciones (absorciones y emisiones) del núcleo poco sensible se intensifiquen.

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Transferencia de Polarización por irradiación Selectiva (SPT).

Caso homonuclear• Para este diagrama usamos dos 1H que están ligeramente acoplados y

tienen una diferencia grande de δ. Se denominan I y S, con un • se indica el el exceso de población de un estado a otro:

• Ahora irradiamos y saturamos selectivamente una sola de las transicionescon un pulso de 90º (la 1,3 de I). Después de un tiempo, las poblaciones de esa transición se igualan y se modifica la intensidad de las transiciones quedependen de estas diferencias de población :

SPT

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Caso heteronuclear

• A pesar de que podemos usar las secuencias SPT y SPI para identificar espines en regiones muy complicadas de un espectro 1H, la TP homonuclear no es tan útil como la TP heteronuclear.

• El efecto que tiene la saturación o inversión de una de las transiciones de un núcleo sobre la distribución de las intensidades en la señal de otro núcleo acoplado con aquél es mucho más significativo en el caso heteronuclear.

• En el caso de un grupo 13C-1H (cloroformo), las diferencias de población de los niveles son más complejas que en el caso homonuclear.

• Si tenemos en cuenta los valores de razones giromagnéticas (γ1H/γ13C ≈ 4), las diferencias de población corresponden a la relación 10:8:2:0

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Caso heteronuclear

SPT (pulso de 90º sobre la transición 1,2 de 1H)

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SPI: (pulso de 180ºsobre transición 1,3)

Transferencia de Polarización por Inversión de población (SPI).

Caso homonuclear• Efectos más drásticos pueden obtenerse aplicando pulsos selectivos de 180º,

los que producen inversión de población entre los estados involucrados en la transición, tal como se muestra en la figura:

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b a

Ha

HbOEt

O

En este caso se inviertecada línea de los protonesolefínicos a y b. Vemoscomo las intensidades de las otras líneas varían.

Ejemplo de secuencia SPI

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Transferencia de Polarización por Inversión de población (SPI). Caso heteronuclear.

• En la figura se muestra el diagrama de niveles correspondientes al sistema CH. El doblete del hidrógeno tiene líneas 4 veces más intensas que el doblete del carbono.

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Transferencia de Polarización por Inversión de Población (SPI). Caso heteronuclear

+ 10 + 8

- 6 - 8

+ 2 + 2

Al manipular las poblaciones de los protones, la señal de 13C se intensifica cuatro veces (considerando señales positivas y negativas).

SPI (pulso de 180ºsobre la transición 1,2)

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Experimento INEPT (Insensitive Nuclei Enhanced

by Polarization Transfer)

• La técnica INEPT (Morris, Freeman, 1979) está diseñada para transferir polarización a través del acoplamiento 1H-13C a un enlace.

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Si J = 125 Hz, τ es 2 ms

Secuencia INEPT

De 2 a 7 se representan las magnetizaciones protónicas.En 8 la magnetización de 13C después de la transferencia de polarización.

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Secuencia INEPT• Tras el último pulso de 90ºy en 1H la magnetización MH

Cβ se encuentra invertida con respecto a MH

Cα. La magnetización debida a 13C se habrá incrementado en una proporción de -6 en sentido negativo y de 10 en sentido positivo.

MHCα

MHCβ

• El último pulso de 90ºx en 13C hace que la señal se vuelva observable al rotarla hacia el eje y. La información obtenida es la misma que la del experimento SPI, pero se evita utilizar pulsos selectivos.

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Experimento INEPT Ejemplo:

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Experimento INEPT Reenfocado

• Para eliminar los acoplamientos carbono-protón en el espectro sin cancelar las señales, es necesario añadir a la secuencia de pulsos INEPT normal dos pulsos de 180º (para reenfocar) y dos tiempos de espera (∆ = 1/8J) en ambos núcleos después de los dos últimos pulsos de 90º y posteriormente adquirir y desacoplar.

• Con este experimento se obtiene una señal completamente desacoplada, en fase y amplificada por la transferencia de polarización.

Secuencia de pulsos INEPT reenfocado

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Experimento INEPT Reenfocado

• Dependiendo del tipo de carbono se utilizan diferentes ∆:

CH → ∆ = 1/4J (~ 1.79 ms); CH2 → ∆ = 1/8J (~ 0.89 ms); CH3 → ∆ = 1/8J

• Se necesita una situación de compromiso, en la práctica suele usarse:

∆ = 3/8J (~ 2.68 ms)

• La limitación principal de la técnica INEPT radica en su sensibilidad al ajuste del intervalo ∆. En sistemas con una variación apreciable de 1JCH, por ejemplo, en presencia de carbonos con diferente hibridación, pueden presentarse problemas con la intensidad y con el signo de las señales.

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Secuencia INEPT

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Experimento INEPT

Reenfocado

• Ejemplo:

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Experimento DEPT (Distortionless Enhancement


• El experimento DEPT (Bendall, Doddrell, Pegg 1981) es la técnica de edición espectral actualmente más utilizada.

• También está basado en la Transferencia de Polarización.

• Presenta una menor sensibilidad a las variaciones de 1JCH que la técnica INEPT, utiliza una secuencia de pulsos más corta y menos sensible a los errores que se producen al introducir en el programa parámetros como la achura de pulso o los delays (dependientes de las constantes de acoplamiento).

• Secuencia de pulsos DEPT:

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Experimento DEPT (Distortionless Enhancement


• Se pueden obtener espectros DEPT en los que solamente aparecen las señales de CH, CH2 o CH3.

• Hay que realizar tres espectros DEPT diferentes.

• Un espectro DEPT con θ = 135º muestra a los grupos CH3 y CH como señales positivas y a los CH2 como señales negativas.

• Cuando sea necesario diferenciar grupos CH3 de grupos CH se puede repetir el experimento con θ = 90º que sólo muestra los grupos CH.

• El experimento con θ = 45º muestra a todos los carbonos hidrogenados como señales positivas.

• Los carbonos cuaternarios se obtienen por diferencia del espectro normal de 13C desacoplado.

64USP-CEU60 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20f1 ppm

13C desacoplado

O

MeH

pulegona

DEPT 135: CH, CH3

CH2

DEPT 90 sólo CH

65USP-CEU

INEPT/DEPT

• Para la determinación de la multiplicidad de los carbonos y para editarespectros normalmente se utiliza el experimento DEPT (DistortionlessEnhancement by Polarisation Transfer).

– La secuencia DEPT es menos sensible que la INEPT a las variacionesdel valor de las JCH porque φ es independiente de J. En el el espectroINEPT ocurren distorsiones cuando en la molécula hay diferentes tiposde JCH. Por ejemplo: JCH alifática= 110-130Hz, JCH aromática= 160-180Hz. La solución de compromiso JCH ~ 145 Hz presenta un error del 20%.

– La secuencia DEPT genera los multipletes en fase (adquisición sin desacoplamiento) con un patrón regular de intensidades, mientras quela secuencia INEPT básica genera los multipletes en antifase.

66USP-CEU

INEPT/DEPT

• El experimento INEPT es superior al DEPT en la transferencia de polarización entre núcleos y se usa habitualmente como secuencia básica en los experimentos 2D heteronucleares (HSQC).

• La secuencia INEPT es más conveniente en experimentos a baja temperatura o para muestras con pesos moleculares altos (T2 pequeño)

Programa de doctorado en Química Médica€¦ · USP-CEU 2 Escalas de tiempo en RMN Procesos de...

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