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Propagación de Laelia speciosa en medio MS adicionado con

agua de coco

RESUMEN

El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio) de material vegetal,

puede definirse como el cultivo en medios nutritivos de plantas, embriones,

semillas o cualquier parte u órgano de una planta que denominamos explante en

condiciones asépticas. Técnica que también se conoce como Cultivo de Tejidos

Vegetales (CTV) y que consiste en tomar una porción de la planta a la que se le

proporciona los nutrientes necesarios para diferenciarse en estructuras

vegetativas o crecer, el medio nutritivo que se le proporciona permite regenerar

una o muchas plantas, la composición de los medios de cultivos contienen

componentes básicos que son: sales minerales, vitaminas, hormonas, sacarosa y

un agente gelificante como el agar. A partir de dicha técnica se promovió el

crecimiento de plántulas de la orquídea Laelia speciosa de importancia ornamental

y económica por la belleza de su flor, en medios de cultivo MS adicionado con

agua de coco la cual contienen sustancias como citocininas que favorecen el

crecimiento celular, se comparó el crecimiento de las plántulas en medios MS 50-

100 y MS 50-50 con agua de coco y sin agua de coco, hasta el momento y

después de dos meses se observan diferencias significativas en el crecimiento de

las plántulas, algunos de los cultivos se han contaminado con hongos y bacterias,

problema que se está atendiendo cuidadosamente.

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Propagación de Laelia speciosa en medio MS adicionado con

agua de coco

MARCO TEORICO

El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio) de material vegetal,

puede definirse como el cultivo en condiciones asépticas, de plantas, embriones,

semillas o de cualquier parte u órgano de una planta que denominamos explante.

El Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) consiste en tomar una porción de la planta

y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas para

que las células crezcan de manera adecuada mediante un medio de cultivo

nutritivo esterilizado, esto permite regenerar una o muchas plantas, la composición

de los medios de cultivos vegetales va a diferir según la finalidad del mismo, no

obstante todo medio requiere de unos componentes básicos que son: sales

minerales, vitaminas, hormonas, azúcar y un agente gelificante como el agar.

La finalidad del CTV puede ser muy diversa por ejemplo: la obtención de plantas

libres de virus o bacterias, la micropropagación de plantas en vías de extinción o

plantas difíciles de propagar por otros métodos. La reproducción de plantas por

esta técnica es posible gracias a que las células vegetales son totipotenciales que

quiere decir que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta

entera de forma asexual.

El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos

25 años se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos,

para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales a lo que ha

motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa viable

en sus programas de producción.

Por esta técnica se han obtenido plantas ornamentales como: orquídeas, lirios y

rosas. Frutales: la piña, mango y aguacate. Plantas agrícolas: el plátano y la papa.

Cultivos agroindustriales: como la caña de azúcar y la palma de aceite, entre

muchas otras.

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La técnica de CTV o cultivo in vitro debe su origen a la investigación sobre

hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Los medios de cultivo

son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en

condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de células, tejidos u órganos

vegetales, estos medios preparados en el laboratorio requieren de un control en su

preparación, conservación y uso, que aseguren su confiabilidad en los resultados

obtenidos.

El medio más utilizado para propagar orquídeas es el de Murashige y Skoog (MS),

su composición se muestra en la tabla 1.

Tabla 1. Composición Química del medio MS

Sales de macronutrientes (mg·L-1) Sales de micronutrientes (mg·L-1)

NH4NO3 1650 KI 0.83

KNO3 1900 H3BO3 6.2

CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3

MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 8.6

KH2PO4 170 Na2MoO4·2H2O 0.25

CuSO4·5H2O 0.025

CoCl2·6H2O 0.025

Na2·EDTA 37.3

FeSO4·7H2O 27.8

Tomada de Roca, 1991

Aunque este medio es rico en nutrientes, existe una larga lista de componentes

que se han adicionado ocasionalmente a los medios de cultivo por ejemplo:

Agua de coco, jugo de frutos de tomate, extracto de levadura, extracto de

tubérculos de papa, Aminoácidos (asparagina, cisteína y L-tirosina), Ácidos

orgánicos (cítrico, málico, succínico y pirúvico) o Sustancias antioxidantes (ácido

ascórbico, L- cisteína y polivinilpirrolidona).

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Propiedades del agua de coco

El coco es una fruta de la cual se pueden aprovechar no solo su pulpa si no

también el agua que contiene, la cual posee una gran cantidad de propiedades

nutritivas y beneficiosas. El agua de coco tiene componentes tales como azúcares,

vitaminas, minerales, electrolitos (como potasio, magnesio, calcio, sodio y fósforo),

enzimas, aminoácidos, citocininas. A su vez es muy bajo en calorías y no tiene

contenidos grasos, lo cual lo convierte en una sustancia excelente para el cultivo

de plantas.

Las citocininas son reguladores de crecimiento que inducen la división celular,

retardan la senescencia de los cultivos y promueven la formación de brotes.

Las orquídeas

Las Orquídeas son plantas herbáceas perennes de la familia Orchidaceae, clase

Liliopsida (monocotiledóneas), muy abundantes, con más de 600 géneros y

17.000 especies en el mundo. Aunque son más abundantes en los trópicos,

también existen especies en ambientes templados, desde el nivel del mar a

grandes altitudes.

Las orquídeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas, hermafroditas

(ambos sexos en la misma flor), zigomorfas (con 1 solo plano de simetría),

trímeras (3 sépalos y 3 pétalos) y una columna central que sustenta las

estructuras reproductivas masculinas (anteras) y femeninas (pistilo).

El fruto es una cápsula seca con muchas semillas pequeñas, sin endospermo y

con embrión no diferenciado. Algunas viven en las ramas de los árboles (epifitas),

otras sobre rocas (litofíticas) y algunas en el suelo (terrestres). Las raíces de las

epífitas y litofílicas están adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia

orgánica, ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo.

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La orquídea Laelia speciosa

Esta especie tiene una amplia gama de color en sus flores en racimos que pueden

ser erectos o péndulos. La planta es resistente a la sequía y puede tolerar tanto

las condiciones de temperatura fresca como calurosa. Forma pseudobulbos de

unos 6 a 30 cm de longitud, ovoides y están claramente separados.

Cada pseudobulbo desarrolla una o dos hojas céreas, de unos 20 cm de longitud.

Las floraciones de la planta se producen desde

finales de la primavera, en verano hasta otoño,

sus flores tienen fragancia.

La inflorescencia es un racimo y puede tener

una longitud de 30 cm y generalmente poseen

de tres a cuatro flores de color rosa o púrpura

en cada inflorescencia.

Laelia speciosa crece fácilmente en cultivo y son resistentes a las sequías, sus

raíces pueden recibir corrientes de aire y aguantar ciclos de humedad o sequía.

Laelia speciosa es una planta que se desarrolla en lugares altos, teniendo

preferencia por unas condiciones soleadas, frías y secas.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Debido al interés que las personas tienen por Laelia speciosa han llegado a

extraerla de su medio natural para comercializarla de manera ilícita, actividad que

puede llegar a colocarla en peligro de extinción, la importancia económica que

tiene para los lugareños del área en donde crece ha llevado a buscar formas

alternativas de propagación y establecimientos de invernaderos en donde se

pueda multiplicar y comercializar para reducir el impacto del saqueo a la que está

expuesta. Actualmente en el laboratorio de CTV del Jardín botánico de la UNAM

se propaga en medios MS, por lo que nos dimos a la tarea de probar el Medio MS

adicionado con agua de coco (que contiene citocininas) a partir de cual esperamos

obtener una mayor producción de plántulas y/o observar un aumento en el tamaño

de las plantas. Se pretenden sustituir también de esta manera el uso las

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sustancias químicas del medio de cultivo por extractos naturales que favorezcan el

crecimiento de la planta.

JUSTIFICACIÓN

Las orquídeas son plantas muy cotizadas por lo llamativo de sus flores, lo que ha

ocasionado que sean extraídas de sus hábitats naturales. Laelia Speciosa no es

la excepción, su importancia ornamental se debe a lo llamativo de sus flores por lo

cual la gente las extrae y comercializa vendiéndolas bajos costos lo que sugiere

que las personas las extraen con facilidad y comercializan por su alta, demanda

llevándolas a una disminución de sus poblaciones, por lo que a través del CTV

pretendemos promover su propagación así como encontrar las condiciones

adecuadas para el crecimiento de las plántulas que posteriormente se puedan

mantener en el invernadero hasta la época de floración, en un primer avance de

nuestra investigación se ha logrado el establecimiento de cultivos con plantas

sanas que al adicionarles agua de coco presentan un crecimiento favorable. El

llevar este tipo de investigaciones nos permitirá contar con información que

favorezca el establecimiento de plantas que produzcan semillas para su

conservación.

OBJETIVOS

1. Propagar la orquídea Laelia Speciosa por el método de cultivo in Vitro

2. Evaluar el desarrollo de los cultivos en medio MS (50-100%) y medio MS

(50-50%) adicionado con agua de coco.

3. Conocer y adquirir habilidad en el manejo de la técnica de CTV.

4. Aplicar los conocimientos adquiridos en las asignaturas Biología y Química

durante establecimiento de cultivos in vitro.

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HIPÓTESIS

Al colocar plantas de Laelia speciosa en medios de cultivos MS adicionadas con

agua de coco se espera obtener un mayor número de plántulas o un aumento en

su tamaño.

MÉTODO Y TÉCNICAS UTILIZADAS

Materiales y equipo

Plantas de Laelia speciosa, obtenidas y donadas por el Laboratorio de

Cultivo de Tejidos Vegetales del Jardín Botánico del Instituto de Biología de

la UNAM.

EQUIPO MATERIAL

Autoclave Matraz Erlen Meyer de 2000 mL

Parrilla de calentamiento Probeta de 1000 mL

Agitador magnético Balanza

Mechero de bunsen Propipeta

Balanza Analítica Frascos de Gerber

Potenciómetro Vaso de precipitados 1 L.

Bisturí

Cuarto de incubación Cajas Petri

Sustancias químicas del Medio MS Pinzas de disección

Matraz Aforado de 100 mL

PROCEDIMIENTO

Nuestro trabajo experimental se llevó a cabo en el Laboratorio de Biología CREA

del Siladin del Plantel Sur.

En el Laboratorio se montó un espacio que se acondiciono para llevar a cabo la

siembra y trasplante de plántulas de Laelia speciosa en medios MS (control) y

medios MS adicionados con agua de coco.

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Se estableció un lote de 80 frascos con plantas, de las cuales 40 fueron colocadas

en medios MS al 100% de macronutrientes, micronutrientes y vitaminas, de

acuerdo al medio Murashige Skoog (1962) y Roca (1991).

Las otras 40, fueron colocadas en medio MS al 100% de macronutrientes, 100%

de micronutrientes y 50% de vitaminas más 100 mL de agua de coco en un litro de

medio.

Una vez listo los medios de cultivo procedimos a la siembra de Laelia speciosa,

la cual se llevó a cabo en un área estéril, trabajamos en condiciones asépticas

usando cubrebocas y cabello recogido, también fue importante el uso de la bata.

Una vez colocadas las plantas dentro de los frascos con medio de cultivo se

sellaron con egapack y colocaron en una cámara de incubación en condiciones de

luz constante por 24 horas.

Se llevó a cabo un registro del crecimiento de las plantas durante dos meses.

RESULTADOS

Plantas en medio MS: Concentración de macronutrientes, micronutrientes y

vitaminas al 100% mantenidas en cámara de incubación con luz constante

por 24 horas.

De los 40 frascos que contenían plántulas en esta condiciones, se registró un

aumento en la talla de la planta de aproximadamente 1.0 a 1.5 cm durante estos

dos meses, en los cuales las plantas también se conservaron sanas.

Plantas en medio MS: Concentración de macronutrientes, micronutrientes

100% y vitaminas al 50%, medio adicionado con 100 mL agua de coco (900

mL de medio/ 100mL agua de coco) mantenidas en cámara de incubación

con luz constante por 24 horas.

De los 40 frascos que contenían plántulas en esta condiciones es decir medio

adicionado con agua de coco, se registró un aumento en la talla de la planta de

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aproximadamente de 1.0 a 1.7 cm durante estos dos meses, como se muestra la

diferencia entre el tamaño de la plantas en el grupo control con el experimental fue

poco significativo, consideramos que se requiere de un poco más de tiempo para

observar el efectos de las sustancias que contienen el agua de coco en el

crecimiento de Laelia speciosa.

Preparación de soluciones

stock

Preparación de Medios de cultivo

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Establecimiento de plántulas de Laelia speciosa

Orquídea Laelia speciosa

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Finalmente se logró el establecimiento de los cultivos en los dos medios probados

durante nuestro experimento.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

El uso de medio de cultivo MS para propagar la orquídea Laelia speciosa fue

adecuado, se estableció un lote importante de más de 100 frascos con las

plántulas, de las cuales 80 se mantuvieron en observación. Es importante

mencionar que durante el establecimiento de estos cultivos tuvimos algunos

problemas de contaminación principalmente por bacterias y hongos por lo cual

implementamos rigurosas medidas de asepsia durante la siembra y subcultivo de

nuestras plantas, lográndose finalmente erradicar este problema.

Se requiere llevar a cabo un registro cuantitativo del tamaño de las plantas más

riguroso, sin afectar la siembra de las plántulas con problemas de contaminación,

por lo cual se propone llevar a cabo un registro de la masa de la planta o adaptar

algún dispositivo que nos permita medir sin riesgo su tamaño.

Nuestros resultados deberán confirmarse con el seguimiento de los cambios en

las plantas durante los siguientes meses.

El registro del crecimiento se llevó a cabo durante los meses de enero a febrero.

CONCLUSIONES

La técnica de cultivo de tejidos vegetales resulta ser un procedimiento propicio

para la propagación de especies vegetales, en el caso de Laelia speciosa fue

posible su cultivo, consideramos que se requiere de más tiempo para poder

afirmar que el efecto de las citocininas en el crecimiento y multiplicación de las

plántulas es significativo.

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Consideramos que hemos adquirido una gran experiencia en el trabajo en el

laboratorio, en el uso de material y equipo así como en la elaboración de medios

de cultivo, siembra y cuidado de plantas in vitro.

Creemos que mediante este tipo de técnicas es posible la multiplicación masiva

de plantas y el rescate de especies que se encuentran en peligro de extinción

además de ser una alternativa viable para propagar plantas de importancia

económica como Laelia speciosa, dando alternativas de producción de plantas

que puedan ser comercializadas sin alterar las poblaciones de los hábitats

naturales.

REFERENCIAS

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edit. Xyz, calicolombiaPag. 3-33

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Strasburger, E. 1981.Tratado de Botánica. Ed. Marín