Propagar la Mammillaria, un verdadero reto. · Es una especie de carácter ornamental que si bien...
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Propagar la Mammillaria, un verdadero reto. Título del trabajo
Memminger
Pseudónimo de integrantes
Biología
Área
Local
Categoría
Investigación Experimental Modalidad
8149156
Folio de Inscripción
Propagar la Mammillaria, un verdadero reto
3. Resumen
El cultivo de tejidos vegetales in vitro es un conjunto de técnicas que se
utilizan para la producción en masa de plantas genéticamente iguales y libres
de patógenos. Esta es una de las múltiples opciones que se tiene para las
especies que se encuentran en peligro de extinción. El CTV se basa en
recrear las condiciones del ambiente, pero en un medio estéril, nos permite
propagar plantas en cualquier momento del año. Es una técnica
recomendada ya que, con una porción de una planta, explante, se producen
masivamente copias genéticas de la misma.
Nuestra intención al realizar el CTV es encontrar un medio de cultivo
adecuado para salvar la Mammillaria, una especie en peligro de extinción, y
al encontrar el medio de cultivo que satisfaga las necesidades de esta planta
comenzar a propagarla de manera masiva para pasarla a un sustrato, donde
comenzará el proceso de aclimatación en el que los órganos que no estaban
siendo utilizados cuando la Mammillaria se encontraba en un medio de
cultivo, comiencen a cumplir con su función. Como una visión a futuro, al
concluir el proceso de aclimatación donaremos los ejemplares de
Mammillaria al sendero ecológico donde se encargan de cuidar a las plantas
que se encuentran en peligro de extinción.
Consideramos que este proyecto tiene especial importancia porque podemos
rescatar una especie en peligro de extinción y producirla de manera masiva,
pues, cuando se pierde una especie sucede un efecto domino en el que
después se pierde otra y otra hasta acabar con un ecosistema, eso sin
mencionar las consecuencias que económicas y sociales que esto conlleva.
Es por eso que surgió nuestro interés por propagar una planta que se
encuentra en peligro de extinción.
4. Introducción
4.1. Marco teórico
El investigador del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de
México (UNAM), Lázaro Guevara, en el marco del Día Mundial de la Vida Silvestre,
que se conmemora el 3 de marzo, afirmó que la estimación de especies de plantas
y animales silvestres que se encuentran amenazadas o en peligro de
extinción es de 30 por ciento. Expuso que lo anterior es preocupante porque la
vida silvestre es un recurso vital desde el punto de vista ecológico, cultural,
económico, político, recreativo y científico.
Las amenazas del cambio climático y de las actividades humanas en ambientes
naturales son de gran amenaza para la existencia de la vida salvaje. La mayoría de
las plantas que viven en los bosques tropicales están mayormente amenazadas.
Esto se debe, principalmente, a los cambios en nuestro hábitat y transformación de
los ecosistemas, la explotación excesiva, la destrucción, la deforestación y los
efectos del calentamiento global. Ya se estiman más de 1000 especies de plantas
mexicanas en peligro de extinción. Una de ellas es la Mammillaria mathildae.
Mammillaria mathildae es una especie perteneciente a la familia Cactaceae. Se
distribuye al este de la ciudad de Querétaro en México de donde es endémica. Su
hábitat natural es el bosque tropical caducifolio y el matorral crasicaule. Es
considerada como una especie en peligro de extinción debido a la pérdida de su
hábitat. Es una planta perenne carnosa y globosa, de color verde obscuro. Los
ejemplares silvestres llegan a medir hasta 6 cm de altura. Presenta entre 11 y 12
espinas radiales y una espina central, de color café rojizo, que termina en gancho.
Sus flores son blancas con el centro de color rosa.
Esta planta fue propagada en el ITESM-Campus Querétaro, dentro de su Programa
de Cactáceas (1986-2001), empleando técnicas tradicionales (semilla) y
desarrollando un método in vitro exitoso (proliferación 5 veces cada 4 semanas;
enraizamiento y adaptación ex vitro 100%). A lo largo de los últimos 15 años, la
Mammillaria mathildae ha sido una especie símbolo de la pérdida de la diversidad
biológica causada por la expansión urbana de la ciudad de Querétaro. A mediados
de los noventas un grupo de individuos de esta cactácea, provenientes de la
reproducción artificial, fueron plantados en los terrenos, entonces propiedad del
Centro de Rescate Ecológico Aztlán (pertenencia de las ecologistas Heidi Bauer e
Isabel Söhn López-Formet), situados apenas a un kilómetro de la localidad original
de La Cañada (ver la fotografía con el Sr. Charles Glass disponiéndose a plantar
una de estas biznagas). A pesar de los esfuerzos incesantes de algunos pocos, el
destino de esta suculenta continúa siendo desfavorable. En marzo del 2005, se
declaró una parte de la superficie del cerro del Tángano zona de preservación
ecológica; aunque M. mathildae no ha sido explícitamente referida de esa localidad,
el lugar sí constituye un hábitat potencial para el repoblamiento natural o artificial
(E. Sánchez, 2005, personal).
Es una especie de carácter ornamental que si bien no es una de las más
demandadas sí representa un símbolo para la conservación local y defensa del
medio en el municipio de Querétaro, en donde ha sido empleada como especie
bandera junto con el nopal Opuntia elizondoana. La importancia taxonómica, por ser
vínculo entre las Stylothelae del Este de México y las de occidente, es de
considerarse (E. Sánchez, 2005, personal).
De todo lo anterior, se deriva la necesidad de preservar esta especie, y una opción
es a través del Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) in vitro.
El cultivo de células y tejidos vegetales se refiere al conjunto de técnicas usadas
para crecer células, tejidos u órganos vegetales in vitro, bajo condiciones asépticas,
controladas y libres de microorganismos (Street 1977, Calva y Ríos 1999). Se basa
en el principio de totipotencia, que indica que cualquier célula vegetal contiene una
copia íntegra del material genético de la planta a la que pertenece sin importar su
función o posición en ella, y por lo tanto tiene el potencial para regenerar una nueva
planta completa (Ferl y Paul 2000).
El proceso involucrado en la transformación de una célula a una planta u órgano,
inicialmente lo llamaron diferenciación celular, pero actualmente se denomina
organogénesis.
El procedimiento general consiste en inocular un medio de cultivo gelificado
(generalmente con agar) con un fragmento de tejido u órgano vegetal, llamado
explante, previamente tratado para eliminar todo organismo que se encuentre en su
superficie (desinfestación).
El cultivo se incuba bajo condiciones ambientales de luz, temperatura y humedad
controladas, que junto con las fisicoquímicas y nutricionales conducen el desarrollo
del explante hacia la formación de una masa celular amorfa denominada callo, o
hacia la diferenciación en un tejido organizado que producirá órganos o embriones.
Los callos obtenidos mediante este procedimiento pueden subcultivarse para su
mantenimiento y propagación o inducir su diferenciación para formar órganos
(organogénesis), embriones (embriogénesis) o pasarse a un medio de cultivo
líquido para obtener células y pequeños agregados en suspensión.
Los cultivos se mantienen bajo las mismas condiciones físicas y fisicoquímicas
usadas para la inducción de callos. Los cultivos de órganos se pueden rediferenciar
hasta plantas completas (micropropagación) que luego se transfieren a invernadero.
La temperatura de los cultivos generalmente se controla entre 25 y 28 °C, el pH
entre 5.2 y 6.5 y la luz de 0 a 12,000 lux (Calva y Ríos 1999, Seabrook 1980, Martin
1980, Yasuda et al 1972).
Las principales aplicaciones de la técnica de cultivo de células, tejidos y órganos
vegetales son en los campos de micropropagación, obtención de plantas libres de
patógenos, preservación de germoplasma, mejoramiento genético, biosíntesis de
metabolitos e investigación básica en áreas como la genética, fisiología y bioquímica
(Fowler 1987, Carpita y McCann 2000).
Un medio de cultivo es una formulación de sales inorgánicas y compuestos
orgánicos (vitaminas, aminoácidos, etc.), fitorreguladores de crecimiento y fuente
de carbono; requeridos para la nutrición y manipulación de los cultivos in vitro.
Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre seis y
40 compuestos, cada formulación tiene un fin específico.
De entre la gran diversidad de éstos, habitualmente se utiliza el medio Murashige
y Skoog (MS) es el medio más conocido. Se elaboró en 1962, tomando el cultivo
in vitro de tabaco como modelo y siguiendo un procedimiento cuantitativo se
determinaron las concentraciones más adecuadas de todos los nutrientes. El
medio MS es apto para la mayoría de las especies, por lo que es de amplia
utilización, excepto para las más sensibles a la salinidad ya que se caracteriza
por tener una elevada concentración salina. En el Anexo 1, se encuentra la
formulación del medio MS.
4.2. Objetivo
• Indagar sobre el medio de cultivo que cumpla con los requerimientos de la
Mammillaria para que pueda desarrollarse adecuadamente desde el callo
hasta la plántula.
4.3. Problema
Como parte de nuestro proyecto de investigación decidimos indagar sobre
diferentes plantas que se encuentran en peligro de extinción, para así encontrar el
medio de cultivo necesario para propagarlas de manera masiva y evitar la extinción
de alguna especie. Luego, nuestras asesoras nos llevaron al laboratorio de CTV de
la Facultad de Química (Conjunto E); ahí, las investigadoras hicieron preguntas y
nosotras participamos asertivamente, demostrando nuestro interés en las especies
en peligro de extinción. Entonces, nos proporcionaron callo de la especie
Mammillaria, una planta perteneciente a la familia Cactaceae.
La investigadora, responsable del laboratorio de CTV, Mtra. María Teresa Olivares,
nos explicó que hasta el momento sólo habían logrado generar el callo de la
especie, pero no habían logrado avanzar más. Por lo tanto, esperaba que nosotras
lográramos desarrollar la plántula.
Así, nuestro problema se limitaba a encontrar un medio de cultivo óptimo para el
desarrollo del callo hasta la plántula. Es decir, buscar los nutrientes y sus
concentraciones, necesarias para la generación de la plántula.
4.4. Hipótesis
Sí el desarrollo del callo de la Mammillaria está controlado por el
metabolismo hormonal y/o de suplementos del medio de cultivo, entonces
se observará el desarrollo del callo hacia la plántula, al manipular estos
componentes del medio.
5. Desarrollo
Se utilizó la técnica de cultivo de tejidos vegetales in vitro, en donde se pueden
destacar algunas etapas; pero, es necesario aclarar que cada etapa requiere de una
metodología en específico. No obstante, que mencionaremos e ilustraremos las
etapas, únicamente se detallará la elaboración de los medios, por ser el punto
central de la investigación. Las etapas son:
a) Lavado y esterilización de los materiales a usar.
b) Preparación de los medios de cultivo, incluyendo su esterilización.
En general se deben considerar los siguientes puntos:
I. Colocar agua destilada y esterilizada, en un vaso de precipitado de plástico
(aproximadamente dos tercios del volumen a preparar).
II. Se agregan las sustancias que van a formar parte del medio de cultivo
vegetal (indicadas en la Tabla 1).
III. Los componentes como el agar y sacarosa se solubilizan por separado (en
ese orden) con ayuda de la placa de agitación y calentamiento en horno de
microondas, teniendo cuidado con el hervor. Se agregan al vaso.
IV. Cuando el medio de cultivo requiera carbón activado, éste se agregará
después de haber ajustado el pH al medio.
V. El pH se ajustará con ayuda del potenciómetro a 5.7 ± 0.1, este ajuste es
importante, puesto que afecta el tejido. Con la consistencia del medio en pH
< 4.8, el gel pierde firmeza, se hace blando y pH > 6.0 adquiere una
consistencia más dura, el pH se ajusta con NaOH o HCl 0.1 N. Se afora al
volumen deseado.
VI. Con ayuda de una probeta graduada, se depositan 30 ml de agua en un
frasco Gerber para que éste sirva de referencia en cuanto a la cantidad de
medio de cultivo que debe depositarse en cada frasco.
VII. Se abren los frascos Gerber (previamente esterilizados y rotulados) y se
agregan aproximadamente 30 mL del medio de cultivo preparado en cada
frasco. Posteriormente se cierran de inmediato.
VIII. Los frascos se esterilizan en la autoclave a una temperatura de 120ºC (20
lb.in2) durante 20 minutos, verificando el nivel de agua de la autoclave en
condiciones de seguridad.
IX. Los frascos esterilizados, se sacan de la autoclave antes de enfriarse por
completo y se colocan en una superficie recta para favorecer la regularidad
de la superficie del medio.
X. Finalmente, los medios completamente fríos están listos para inocularse.
c) Inoculación de los medios de cultivo con el material biológico a usar, en este
caso, el callo de la Mammillaria.
d) Incubación de los medios de cultivo inoculados en condiciones de luz y
temperatura controladas.
e) Aclimatación de las plántulas.
En el esquema 1, se puede observar los principales componentes de un medio de
cultivo, así como la función de cada uno. Ahí mismo, se encuentran las sustancias
con las que nosotras trabajamos; pues, aunque existe una gran variedad de ellas,
sólo utilizamos a las que tenemos en el laboratorio. Por citar un ejemplo, existen
varios carbohidratos que se pueden utilizar como fuente de energía y
osmoreguladores, tales como el manitol, sorbitol, fructuosa y otros; sin embargo,
únicamente usamos sacarosa, porque es a la que tenemos acceso.
En la Tabla 1, se encuentra detallada la composición de cada medio de cultivo que
experimentamos y en la Tabla 2, se justifica su composición.
Tabla 1. Composición de los medios de cultivo probados
COMPONENTE MEDIO DE CULTIVO
CONTROL Mm1 Mm2 Mm3 Mm4 Mm5 Mm6 Mm7 Mm8
MS (comercial)
50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50%
Agar (g/L)
9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0
Tiamina (mg/L)
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Ácido nicotínico (mg/L)
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Piridoxina (mg/L)
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Myo-Inositol (mg/L)
100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
Glicina (mg/L)
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Sacarosa g/L)
45.0 45.0 45.0 45.0 45.0 45.0 45.0 30.0 15.0
Cefotaxime (mg/L)
--- 10.0 0 10.0 --- --- --- --- ---
BAP (mg/L)
--- 0 15.0 15.0 --- --- --- --- ---
Agua de coco (%)
--- --- --- --- 20 0 20 20 20
Carbón activado (g/L)
--- --- --- --- --- 1.0 1.0 1.0 1.0
Nota: Hay que enfatizar que las concentraciones para todas las sustancias que utilizamos,
son las recomendadas y usualmente usadas en la bibliografía revisada.
Tabla 2. Justificación de la composición de los medios (introducción de variables)
Medio de
cultivo
Justificación
Control Es en el que se encontraba el callo inicialmente y que se nos
proporcionó junto con el callo.
Mm1 Se decidió introducir al medio de cultivo un antibiótico (cefotaxime)
porque aún teníamos problemas de contaminación bacteriana en los
medios de cultivo y queríamos prevenirla.
Mm2 El BAP (Bencil Amino Purina) es una fitohormona que promueve la
diferenciación del callo, es por ello que se introdujo al medio de
cultivo.
Mm3 También se probó utilizar en conjunción cefotaxime y BAP.
Mm4 Luego que no se vio ninguna mejora en M1, M2 y M3, con respecto al
control. Se introdujo agua de coco, quien promueve la inducción de la
embriogénesis somática y la maduración de los embriones.
Mm5 Se adicionó carbón activado, porque favorece la germinación y la
maduración de los embriones. También ayuda a controlar la
oxidación, un problema al que veníamos enfrentándonos, desde el
control.
Mm6 Se probó la conjunción de agua de coco y carbón activado.
Mm7 Una vez que se empezó a desarrollar la plántula, se disminuyó la
cantidad de sacarosa, para obligar a la planta a realizar la
fotosíntesis.
Mm8 Se probó una concentración menor de sacarosa.
6. Resultados
En la foto de la izquierda se muestra
el medio de cultivo control, observe
que el medio es claro, casi
translucido y que el callo de la
Mammillaria es verde opaco.
Las siguientes figuras muestran los medios de cultivo con los que se inició la
investigación.
Mm1 Mm2 Mm3
Cefottaxime BAP Cefottaxime + BAP
La fotografía de la izquierda, muestra el medio de cultivo con cefotaxime, un
antibiótico que se adiciono para prevenir el desarrollo de bacterias. En la
imagen de en medio, se muestra el medio adicionado con BAP (Benzo Amino
Purina) una hormona que promueve la diferenciación de callo. Finalmente,
en la izquierda se muestra el medio con cefotaxime y BAP. Advierta que en
los tres medios se oxido el callo, por lo que se consideró probar con otras
variables.
La imagen de arriba muestra, a la izquierda el control, y a la derecha los
medios de incubación Mm6 con agua de coco y carbón activado, Mm5 con
carbón activado y Mm4 con agua de coco, en orden de izquierda a derecha.
Note que en el medio 4 no hubo desarrollo del callo, y que en los medios 5 y
6, no hay diferencias significativas. Ahora el medio de cultivo es negro, por la
presencia del carbón activado.
Control En orden de izquierda a derecha, los medios de cultivo Mm6, Mm5 y Mm4
Aunque en los frascos de los medios de
cultivo Mm5 y Mm6, no se observó
diferencias; sí se observaron diferencias a
la hora de resembrar los callos, pues quizá
por lo ennegrecido del medio no se lograba
ver que el cultivo Mm5, tenia más callo
oxidado que el Mn6. Las imágenes de la
izquierda, así lo evidencian.
La primera imagen muestra la cantidad de
callo oxidado con respecto al no oxidado en
el cultivo Mm6.
En la segunda imagen, del lado izquierdo
se muestra la cantidad de callo oxidado que
se quito a un frasco de cultivo Mm5 y la de
la derecha, lo muestra para el cultivo Mm6.
Lo anterior nos lleva a inclinarnos por el
cultivo Mm6.
Al dar seguimiento al medio Mm5, el
que contiene, además del medio
basal o control, carbón activado y
agua de coco, se observó que el callo
empezó a diferenciarse, pero no
lograba hacerlo por completo, así se
muestra en la fotografía de la derecha
Entonces, se decidió bajar la concentración de sacarosa, para obligar a la
especie a realizar la fotosíntesis y elaborar su propia fuente de energía, de
tal manera que se terminará de diferenciar el callo. De ahí, se experimentó
con los medios Mm7 y Mm8, en comparación con el control, contenían dos
tercios de sacarosa en Mm7 y uno en Mm8. Se observó que en el Mm7 la
diferenciación del callo era mejor. Las imágenes de abajo lo avalan.
Finalmente, la plántula generada a partir del callo se pasó a sustrato, tal
como se muestra abajo.
7. Análisis e interpretación de resultados
Es importante comentar que el cultivo de tejidos vegetales es una técnica
multidisciplinaria, que demanda muchos y variados conocimientos, además
de habilidades. Dominarla es imprescindible para dar validez a los resultados.
Es por ello que decidimos empezar con la incorporación a los medios de
cultivo de un antibiótico, para prevenir la proliferación de bacterias, pues la
verdad nos tomo bastante esfuerzo y concentración dominar la técnica, es
decir, no tener contaminación bacteriana, ni de hongos en los cultivos.
También, consideramos al inicio, la incorporación de una hormona que
estimulará la diferenciación del callo, pues como se expreso en el marco
teórico, la técnica de CTV (cultivo de tejidos vegetales), se basa en el
principio de totipotencialidad, el callo es solo un cumulo de células
indiferenciadas, que deben evolucionar a células diferenciadas o
especializadas para empezar a funcionar como una planta completa. Una de
las funciones de la hormona BAP, es precisamente promover la
diferenciación del callo. Sin embargo, los resultados de la experimentación
nos demuestran que estas sustancias no ayudan a lograr tal diferenciación.
Luego de realizar estos experimentos, nuestra primera pretensión fue probar
otras hormonas, sin embargo, eso no fue posible porque no contamos con
otras en el laboratorio. Así, en la bibliografía consultada se menciona mucho
el uso de agua de coco y carbón activado como suplementos nutrimentales
para los cultivos de tejidos. Se reporta que la función del carbón activado es
como adsorbente y antioxidante, dado que los cultivos se oxidaron decidimos
incorporar esta variable.
Por otra parte, se atribuye al agua de coco la propiedad de promover el
desarrollo y maduración de embriones, por ello se pensó que este ingrediente
puede ayudar a la diferenciación del callo.
A su vez, la sacarosa en un medio favorece el crecimiento de la planta,
puesto que la sacarosa es parte del proceso de fotosíntesis y el metabolismo.
Se probaron cada uno por separado, en los medios de cultivo Mm4 y Mm5,
y en el Mm6 se conjuntaron los dos. Cabe hacer mención que se noto una
gran mejoría y desarrollo del callo cuando están presentes ambos; pero hay
que aclarar que el callo se empezó a diferenciar pero no se completaba ésta,
porque como se observa en las fotos, solo aumenta la masa del callo y se
vislumbra alguna plántula muy pequeña.
Con este avance nos motivamos, pues la verdad ya habíamos dedicado
mucho tiempo y esfuerzo y aún se había visto ningún avance. Luego se
decidió disminuir la cantidad de sacarosa, pues probablemente el callo
estaba muy mimado con todos los nutrientes en exceso, que no tenía la
necesidad de desarrollarse. También, vimos avances, pues al disminuir su
concentración de sacarosa se mejoró el desarrollo hacia la plántula.
Los resultados indican que el mejor medio para promover el desarrollo del
callo es el Mm7, pues con éste logramos llegar a obtener la plántula.
Nuestra motivación es mayúscula, porque logramos nuestro objetivo. Sin
embargo, estamos conscientes que solo es el principio para la
micropropagación masiva de esta especie, pues necesitamos seguir
investigando para lograr primero que se reproduzcan los resultados, y
segundo, que la planta pueda aclimatarse favorablemente para completar el
esquema de etapas de la técnica CTV.
También, hay que remarcar, que tuvimos la suerte de partir del callo, así nos
ahorramos la etapa de desinfectar la especie, sembrar los tejidos y generar
el callo.
8. Conclusiones
El medio de cultivo encontrado para propiciar el desarrollo de callo hacia la
plántula es el Mm7:
MS (comercial)
50%
Agar (g/L)
9.0
Tiamina (mg/L)
0.1
Ácido nicotínico (mg/L)
0.5
Piridoxina (mg/L)
0.5
Myo-Inositol (mg/L)
100.0
Glicina (mg/L)
2.0
Sacarosa g/L)
30.0
Agua de coco (%)
20.0
Carbón activado (g/L)
1.0
La técnica de CTV es apropiada para la micropropagación de especies en
peligro de extinción.
La Mammillaria es una especie perteneciente a la familia Cactaceae. Es
considerada como una especie en peligro de extinción debido a la pérdida de su
hábitat. Sin embargo, es posible preservarla, por la técnica de CTV.
En la actualidad, algunos investigadores y organismos trabajan en preservar las
especies y paliar esta abrupta desaparición. Hay que notar los esfuerzos de la
UNAM por fomentar el cultivo y conservación de algunas de nuestras plantas
mexicanas en peligro de extinción. El Jardín Botánico del Instituto de Biología
de la universidad resguarda en sus colecciones 300 de las 945 especies
consideradas en riesgo de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana 059. Si bien
conservar algunos ejemplares de plantas en riesgo en los Jardines Botánicos es
útil, no es suficiente para asegurar la conservación de las especies vegetales de
nuestro país y el planeta. Por ello, proponemos estudios de este género para
ayudar a la preservación de las especies.
9. Fuentes de información
Sánchez, E., Arias, S., Hernández Martínez M. M. y Chávez, R. 2006. Ficha
técnica de Mammillaria mathildae. En: Sánchez, E. (compilador). Apuntes técnicos
para el conocimiento de la situación de conservación de especies de la familia
Cactaceae en el estado de Querétaro. Jardín Botánico Regional de Cadereyta "
Ing. Manuel González de Cosío" Consejo de Ciencia y Tecnología del Estado de
Querétaro-(CONCyTEQ). Bases de datos SNIB-CONABIO. Proyecto No. CK016.
México, D.F.
Altamirano, R. & Sharry, S. (2018). Aplicación del cultivo de tejidos in vitro (CTV)
para la propagación de especies leñosas. Facultad de Ciencias Agrarias y
Forestales. Universidad Nacional de Plata. Consultado el 3 de marzo de 2019. (pp.
11-15).
Castillo, A. (2004). Unidad de Biotecnología, INIA Las Brujas. Propagación de
plantas por cultivo in vitro: una biotecnología que nos acompaña hace mucho
tiempo. Recuperado el 3 de marzo de 2019. (pp. 3-8).
Mateo-Sagasta, L. (1990). Cultivo in vitro de las plantas superiores. México:
Editorial Trillas. (pp. 73).
Morgan, W.M. (2000). International Plant Laboratories, Baltonsborugh. Cultivo de
tejido vegetal. Recuperado el 3 de marzo de 2019.(pp. 1-4).
Reinoso, R. F. (2017). Departamento de Química Inorgánica e Instituto
Universitario de Materiales. Universidad de Alicante. Alicante, España. Versatilidad
de los materiales basados en carbono. Recuperado el 7 de marzo de 2019. (pp. 2-
3).
ANEXO 1
Preparación de las soluciones madre para el medio de cultivo Murashige y
Skoog (1962) (MS).
Componente Concentración en el medio MS
(mgl-1)
Concentración en la solución madre (mgl-
1)
Pesar (g) para 1 litro
Macroelementos (10X)
NH4NO3 1650 16500 16.5
KNO3 1900 19000 19.0
CaCl2 .2H2O 440 4400 4.4
MgSO4.7 H2O 370 3700 3.7
KH2PO4 170 1700 1.7
Microelementos (200X)
H3BO3 6.2 1240 1.240
MnSO4. 4H2O 22.3 4460 4.460
ZnSO4. 7H2O 8.6 1720 1.720
KI 0.83 166 0.166
Na2MoO4. 2 H2O 0.25 50 0.050
CoCl2. 6H2O 0.025 5 0.005
CuSO4.5H2O 0.025 5 0.005
Hierro (100X)
EDTA-NaFeO4 43 4300 4.3
Vitaminas (200X)
Ácido nicotínico 0.5 100 0.100
Piridoxina 0.5 100 0.100
Tiamina 0.5 100 0.100
Myo-inositol 100 20000 20.000
Otros
Glicina 2 400 *
Sacarosa 30000 Añadir fresco 30.00
Agar 8000 Añadir fresco 8.000
* Pesar 50 mg y disolver en 100 ml de agua destilada