proteïnes - UAB Barcelonade totes les tesis, així que vull donar les gràcies, que siguin...

TESI DOCTORAL

Estudi de la via d’agregació de tres proteïnes

implicades en diferents malalties

conformacionals humanes:

scFv‐h3D6 com agent terapèutic per a la malaltia d’Alzheimer,

AL‐12 com a causa d’Amiloïdosi de cadena lleugera, i PDZ3 com

a organitzador del proteoma.

Marta Marin Argany

Setembre 2013

DEPARTAMENT DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR

Estudi de la via d’agregació de tres proteïnes

implicades en diferents malalties

conformacionals humanes:

scFv‐h3D6 com agent terapèutic per a la malaltia d’Alzheimer,

AL‐12 com a causa d’Amiloïdosi de cadena lleugera, i PDZ3 com

a organitzador del proteoma.

Tesi presentada per Marta Marin Argany per optar al grau de Doctora en Bioquímica i Biologia Molecular sota la direcció de la Dra. Sandra Villegas

Hernández.

Unitat de Biociències del Departament de Bioquímica i Biologia Molecular. Universitat Autònoma de Barcelona.

Marta Marin Argany Dra. Sandra Villegas Hernández

Bellaterra, Setembre 2013

Alamevamareialmeupare

AGRAÏMENTS.

Perfielsagraïments!!Fatempsqueimaginoelqueescriuriaalsagraïments,iem

sortienunesfrasesfantàstiquesperatoteslespersonesquehanpassatperlamevavida

durantaquestsanysdetesi.Iara...iaranoséquèposar!!Jaja!!Nomésse’mpassapelcap

“s’haacabat!!ueeeee!!”.Peròbé,som‐hi!Que,alfinal,elsagraïmentséslapartmésllegida

detoteslestesis,aixíquevulldonarlesgràcies,quesiguininfinites,atotalagentquem’ha

ajudatiquehacregutenmiperpodercomençar,seguir,iacabaraquestaèpocadoctoral:

Laprimerapersona,laSandra.Agrair‐tetotimés.Maioblidaréeldiaqueemvaig

passarpelteudespatxenbuscad’algunarecomanacióperferpràctiquesalestrangerien

vaig sortir, al cap de quasi tres hores, amb una beca de doctorat entre les mans i mig

tremolant. Encara no acabo d’entendre què et va fer escollir‐me, jo que no aspirava a

massacosa!Peròvascreureenmidesdelprimermoment,iaixíencarahofas.Gràciesper

lagranpaciènciaquehastingutambmi,perensenyar‐metotdesdezero,per“deixar‐me”

arribar a les tantes al laboratori, per fer‐me científica. Gràcies per ser tan positiva i els

bons consells en les meves èpoques de crisi existencial científica. I mil gràcies per les

varies copesde cava, les conversesentrepitis, iperhaverescollit elmillor companyde

laboratoridemón,elGyo!

Gyo!camarada!Queyacasisomosdoctores!Jajaja!!Surrealista,verdad?Ycuando

decíamos “por qué no escogimos ser biólogos de campo, así ahora estaríamos filmando

documentalesporÁfrica,envezdepasarnoseldíapurificandoproteínasqueniseven!Y

siempre terminábamos “será que, en el fondo, nos encanta esto de las columnitas y las

diálisis,sinonoseentiende...”.Gyo,quegrandeconocerteytrabajarjuntos.Sintiestátesis

nosería lamisma,ymisañosenel labotampoco.Muchasgraciasporestarsiempreallí,

cerquita, pendiente y ayudando, sin necesidad demuchas palabras.Muchas gracias por

crearelcaosdentrodemiorden.Esosí,lapróximavezquenosencontremosnotevoya

limpiarniunaprobeta,quelosepas!Ahorasi…Vencimos!

I que no falti el Bernat! Bernaaaaat!! que vas arribar i ben formar el trio PFs

(Perro‐Flautasdeienalguns!).Quinabonaèpocaquevampassarelstres,iquèbéqueens

vas ajudar amb els p**** scrambleds!! Llàstima que haguessis de marxar, però sempre

quedaunmoltbonamicperanaraferbirresicompartirgransconverses!

IlaanovageneraciódePFs,queheuhagutd’aprendretotelquesabíemamarxes

forçadesisempreapuntperdonar‐nosuncopdemà.Moltbonafeina!Aquestbest‐seller

tambévapervosaltres,Laia,GiselaiJofre,iusdesitjounbondoctoratatotstres.

Apartdelgrup,agrairatotalagentdeldepartament,enespecialalskinàsics,per

deixar‐nostotelquefeiafaltaquanencaranoteníemellabomuntat.AlMohammed,pels

bons consells de savi, sempre a punt per ajudar en tot moment. L’Helena! Per tota la

feinadaquefa!iperrecordar‐nosquehemdefercomandesdetantentant!Icomono...al

Salva,persercomés, tanrondinairecombonapersona, ideixar‐meentraralxiringuito

sempreaúltimahoraiamblespresses.Iatotalarestadecompanysicompanyes,quede

ben segur quem’heu ajudat amb algun experiment, algun reactiu, algunmaterial, algun

conselloalgunaconversadistretaentrepassadissosicentrífugues...moltesgràcies!

GràciesalaMarinaiatotalagentdelaClínicaMayo,perdonar‐melaoportunitat

de treballar amb ells. I al Jose i al seu grup de Granada, per les bones i agraïdes

col·laboracions que hem fet. Així com al Baldo i al seu grup de Bioinformàtica per

ensenyar‐meunamicadelseumóncomputacional.

Però què seria de tot plegat sense la famíliamigdia‐tincgana‐baixem‐solete‐bar‐

birres‐taper‐cafè?Noresseria!Quantscafèshauremfet?Iquinsfartsderiure?Heuestat

la millor teràpia per sobreviure en el món del laboratori. Aquesta tesi va dedicada a

vosaltres David, Pol, Font, Albert Serra, el Bigotis...i tots els que heu anat passant pels

dinarsiconversesdetaper.Enespecialperòalesmevesduesnenes:laPaulailaRitu.Ole

vosaltres!

IaraarribaeltorndeLaGranFamíliadeCanCargoliCanColoratta:lamevavida

paral·lela a la ciència. Sortde tenir‐vos cadadia al arribar a casa i perdistreure’mamb

plans irresistibles. Gràcies per voler entendre què hi faig tantes hores al labo, tot i que

semprehaestatmoltmésdivertitintentarcanviarelmón,oiquesi?Sougenials!

IquenofaltitotelgrupdeBioNenes:laDesi,laLaia,laJové,laPaula,laPadro,la

MireilaNeus.Nenes,aquestavapervosaltresitotselsanysqueportemjuntes!

A la Moni i a la Batet, i tota la penya de l’espardenya d’Horta República

Independent!

Ytambiénati,Roo,imposiblenoponerteentreestaslíneas,formaspartedeellasy

demi.

A laBola,porquesin tinuncahubierahechoundoctorado,aunquedigasqueno,

mehicistecrecericreerenmi,yesoniconunatesisseagradece.

I per tu, Kons.Mil gràcies per la paciència que has tingut durant l’últim any de

doctorat.Pelsànimsilaforçaquem’hasdonatperacabarambtotaixò.Perentendre’mi

aguantar‐me.Perser‐hisempreiseguiravançant!

Iperacabar,vulldedicarplenamentaquestatesialamevamare,almeupare,ials

meusgermans,elDavidielFerran.TambéalaNúriaialaLaia,iquenofaltinelspetits,el

JanilaLluna.ComtambéalrecorddelaPadrina.Pertotelvostrerecolzamentinfinitiper

quèusestimomolt!

ix

ÍNDEX.

AGRAÏMENTS.....................................................................................................................................................vii

ÍNDEX.....................................................................................................................................................................ix

ÍNDEXDEFIGURESITAULES.....................................................................................................................xvii

ABREVIATURES................................................................................................................................................xxi

Taulad’abreviaturesdelsaminoàcidsproteïnogènics...............................................................................xxv

Taulad’abreviaturesdelsnucleòtidsdeDNA/RNA.....................................................................................xxv

I. RESUM...........................................................................................................................................................1

II. INTRODUCCIÓ.............................................................................................................................................5

1. ESTRUCTURAIPLEGAMENTDEPROTEÏNES....................................................................................7

1.1. Antecedentshistòrics.....................................................................................................................................8

1.2. Energèticadeplegament..............................................................................................................................9

1.3. Embutsdeplegament.................................................................................................................................11

1.3.1. Intermediarisdeplegament................................................................................................12

2. Agregacióamiloide................................................................................................................................15

2.1. Mecanismedeformaciódefibresamiloides....................................................................................16

2.1.1. Determinantsamiloidogènics.............................................................................................19

2.2. Estructuradelesfibresamiloides.........................................................................................................19

2.3. Tipusdeviesamiloidogèniques.............................................................................................................20

2.3.1. Viadefibril·lacióamiloide...................................................................................................21

2.3.2. Viadefibril·lacióworm‐like................................................................................................22

2.4. Oligòmerssolubles.......................................................................................................................................23

2.4.1. Toxicitatdelsoligòmerssolubles.......................................................................................24

3. Amiloïdosiomalaltiesamiloidogèniques......................................................................................27

3.1. Malaltiad’Alzheimer....................................................................................................................................29

3.1.1. Proteïnaprecursoraamiloide,APP..................................................................................30

3.1.2. Hipòtesidelacascadaamiloide.........................................................................................32

3.1.3. Immunoteràpiacontral’Aβ.................................................................................................33

3.1.3.1. Fragmentsrecombinantsderivatsd’anticossos,scFv...................35

3.2. AmiloïdosisdeCadenaLleugera............................................................................................................37

3.2.1. VariabilitatdeseqüènciadelesLCiamiloidogènesi...............................................38

3.2.2. EstabilitatiagregaciódelescadenesLC.......................................................................39

3.2.3. DeterminantsestructuralsdelesproteïnesLCsamiloidogèniques...................39

3.2.3.1. InterfíciedelsdímersVL‐VLiamiloidogènesi...................................41

3.2.4. Futuresestratègiesterapèutiques....................................................................................43

4. Interactomaimalaltieshumanes......................................................................................................45

4.1. Proteïneshubidominismodulars........................................................................................................45

4.2. DominisPDZ....................................................................................................................................................47

x

4.2.1. CaracteritzacióestructuraldelsdominisPDZ.............................................................48

4.3. LaproteïnaPSD‐95......................................................................................................................................49

4.3.1. DominiPDZ3delaproteïnaPSD‐95................................................................................50

4.3.1.1. Hèlix‐α3addicionaldeldominiPDZ3...................................................51

4.3.1.2. Loopβ2‐β3deldominiPDZ3....................................................................52

4.4. MalaltiesrelacionadesambelsdominisPDZ...................................................................................53

III. OBJECTIUS.................................................................................................................................................57

IV. MATERIALSIMÈTODESGENERALS..................................................................................................61

1. AparellsGenerals...................................................................................................................................65

2. TècniquesdeDNARecombinant.......................................................................................................67

2.1. Reaccióencadenadelapolimerasa,PCR..........................................................................................67

2.1.1. Dissenyd’encebadorsdePCR..............................................................................................67

2.1.2. MutagènesiDirigida................................................................................................................68

2.1.2.1. Reacciódemutagènesi................................................................................68

2.1.2.2. DigestióambDpnI..........................................................................................69

2.1.2.3. TransformacióproductesdePCR...........................................................69

2.2. IntroducciódeDNAforaniacèl·lulesbacterianes.........................................................................70

2.1.3. Preparaciódecèl·lulescompetentsd’E.coli.................................................................70

2.1.4. Transformaciódecèl·lulescompetentsd’E.coli.........................................................70

2.2. ExtracciódeDNAplasmídicdecèl·lulesd’E.coli............................................................................71

2.3. SeqüenciaciódelDNA.................................................................................................................................71

2.4. DeterminacióespectrofotomètricadelaconcentraciódeDNA...............................................72

3. Sistemesd’expressióipurificació.....................................................................................................73

3.1. Soquesd’Escherichiacoli..........................................................................................................................73

3.1.1. Soquesd’E.coliperalclonatgeiextracciódeDNAplasmídic.............................73

3.1.2. Soquesd’E.coliperal’expressióheteròlogadeproteïnes.....................................73

3.2. Mantenimentsoquesbacterianes..........................................................................................................74

3.2.1. Glicerinats15%.........................................................................................................................74

3.3. Medisdecultiu...............................................................................................................................................75

3.3.1. Medilíquid...................................................................................................................................75

3.3.1.1. MediLB...............................................................................................................75

3.3.1.2. Medi2xYT..........................................................................................................75

3.3.2. Medisòlid.....................................................................................................................................75

3.3.3. Antibiòtics....................................................................................................................................76

3.4. Vectorsd’expressió......................................................................................................................................76

3.5. Expressióheteròlogadeproteïnes.......................................................................................................78

3.5.1. Inducciódel’expressió............................................................................................................78

3.5.2. Obtenciódelextractecel·lular............................................................................................79

xi

3.6. Tècniquesdecromatografialíquida.....................................................................................................79

3.6.1. Cromatografiad’afinitat.......................................................................................................79

3.6.1.1. Cromatografiad’afinitatambhistidines..............................................79

3.6.1.2. Cromatografiaatmosfèricad’afinitatperlipopolisacàrids..........80

3.6.2. Cromatografiadebescanviiònicd’altaresolució.....................................................80

3.6.3. Cromatografiad’exclusiómolecular................................................................................82

3.6.3.1. Cromatografiad’exclusiómoleculard’altaresolució.....................82

3.6.3.2. Cromatografiaatmosfèricad’exclusiómolecularperintercanvi

detampó.83

3.7. Mètodesd’intercanvidetampóoextracciódesals.......................................................................84

3.7.1. Diàlisi.............................................................................................................................................84

3.7.1.1. Pretractamentdelssacsdediàlisi..........................................................84

3.8. Concentraciódelvolumdelesmostresproteiques.......................................................................85

3.9. ElectroforesienSDS‐PAGE.......................................................................................................................85

3.9.1. Preparaciódelgeld’acrilamida.........................................................................................86

3.9.2. Tincióidestinciódelgeld’acrilamida............................................................................87

4. tècniquesespectroscòpiques.............................................................................................................89

4.1. Determinaciódelaconcentraciódeproteïna..................................................................................89

4.2. DicroismeCircular........................................................................................................................................89

4.3. Fluorescènciadelsresidusdetriptòfan..............................................................................................90

4.3.1. Desnaturalitzacióquímicaiobtenciódeparàmetrestermodinàmics.............91

4.4. FluorescènciadelsfluoròforsTioflavinaTiANS............................................................................92

4.5. Espectroscòpiad’infraroigambtransformadadeFourier(FTIR)..........................................93

4.6. Microscòpiaelectrònicadetransmissió(TEM)...............................................................................94

4.6.1. TinciónegativadelesmostresdeTEM...........................................................................94

5. CultiusCel·lulars.....................................................................................................................................97

5.1. Líniacel·lulardeneuroblastomahumàSH‐SY5Y...........................................................................97

5.2. Subcultiucel·lular.........................................................................................................................................97

5.3. Reservoridelalíniacel·lular...................................................................................................................98

5.4. Comptatgedecèl·lules................................................................................................................................98

5.5. Experimentsdeviabilitatcel·lulardeSH‐SY5Y...............................................................................99

5.5.1. AssajosdeviabilitatperMTT..............................................................................................99

6. TècniquesbioinformàtiqUes............................................................................................................101

6.1. Modelatgetridimensionaldel’scFv‐h3D6......................................................................................101

6.2. ExPASy............................................................................................................................................................101

V. CAPÍTOLS................................................................................................................................................103

xii

CAPÍTOL 1: Un fragment variable de cadena senzilla (scFv‐h3D6) anti‐Aβ impedeix la

formació de fibres amiloides i la citotoxicitat del pèptid Aβ mitjançant la retirada

d’oligòmersdelaviaamiloide..................................................................................................................105

1. RESUM......................................................................................................................................................107

2. INTRODUCCIÓ........................................................................................................................................109

3. MATERIALSIMÈTODES......................................................................................................................113

3.1. Expressióipurificaciódel’scFv‐h3D6.............................................................................................113

3.1.1. Expressióheteròlogadel’scFv‐h3D6............................................................................113

3.1.2. LLisiCel·lular...........................................................................................................................113

3.1.3. Solubilitzaciódelafraccióproteicainsoluble..........................................................114

3.1.4. Replegamentgotaagotadelafraccióproteicasolubilitzada.........................114

3.1.5. DigestióambproteasaTEV..............................................................................................114

3.1.6. Cromatografiad’afinitatambhistidines....................................................................115

3.1.7. Cromatografiadebescanvicatiònic.............................................................................116

3.2. ExpressióipurificaciódelaproteasaTEV.....................................................................................117

3.2.1. ExpressióheteròlogadelaproteasaTEV...................................................................117

3.2.2. PurificaciócitoplasmàticadelaproteasaTEV........................................................118

3.2.3. Cromatografiad’afinitatambhistidinesd’altaresolució...................................118

3.3. Determinaciódel’estructurasecundàriadel’scFv‐h3D6........................................................118

3.3.1. EspectredeCDalUV‐llunyà.............................................................................................119

3.3.2. Espectred’infraroigambtransformadadeFourier..............................................119

3.3.3. Desnaturalitzaciótèrmica.................................................................................................119

3.4. PreparaciódelpèptidAβ1‐42..................................................................................................................120

3.5. AgregaciódelpèptidAβ1‐42il’scFv‐h3D6.......................................................................................120

3.6. Assajosdecitotoxicitat............................................................................................................................120

3.6.1. Preparaciómostresd’scFv‐h3D6peralsassajosdecitotoxicitat....................121

3.7. Microscòpiaelectrònicadetransmissió(TEM)............................................................................122

3.8. Assajosd’agregacióperfluorescència.ThTiANS.......................................................................123

4. RESULTATS.............................................................................................................................................127

4.1. Expressióipurificaciódel’scFv‐h3D6.............................................................................................127

4.1.1. Dimeritzacióiformesscrambleddel’scFv‐h3D6....................................................128

4.2. Identificaciódel’intermediarid’agregacióWLdel’scFv‐h3D6............................................130

4.3. Prevenciódelatoxicitatdel’Aβ1‐42perl’scFv‐h3D6..................................................................133

4.4. MisfoldingdelpèptidAβ1‐42...................................................................................................................135

4.5. Misfoldingdel’scFv‐h3D6......................................................................................................................137

4.6. MisfolgingdelcomplexAβ1‐42‐scFv‐h3D6.......................................................................................138

5. DISCUSSIÓ...............................................................................................................................................141

5.1. Expressiódel’scFv‐h3D6il’activitatdelaxaperonatrx..........................................................141

5.2. Perfildeplegamentdel’scFv‐h3D6sotapertorbaciótèrmica..............................................141

5.3. Efectedel’scFv‐h3D6sobrelafibril·lacióicitotoxicitatdelpèptidAβ1‐42.......................142

xiii

5.4. Efectedel’scFv‐h3D6invivo................................................................................................................143

CAPÍTOL2:Modelatgetridimensionald’unfragmentvariabledecadenasenzilla(scFv‐h3D6)

específiccontraelpèptidAβ1‐42iredissenyracionaldelamolècula...........................................145

1. RESUM......................................................................................................................................................147

2. INTRODUCCIÓ........................................................................................................................................149


3.1. Recercadeproteïnamotlleperhomologiadeseqüència........................................................153

3.2. ModelatgetridimensionaldelscFv‐h3D6.......................................................................................153

3.3. Numeracióestàndarddel’scFv‐h3D6ilocalitzaciódelesregionsCDR...........................154

3.4. Caracteritzacióestructuraldelmodeld’scFv‐h3D6perDSSP...............................................154

3.5. Predicciódetendènciaal’agregacióperTANGO.........................................................................154

3.6. AlineamentMúltipleiResidusConservats.....................................................................................155

3.7. AminoàcidScanning‐Mutation.............................................................................................................155

4. RESULTATS.............................................................................................................................................157

4.1. Proteïnamotlle:l’scFvespecíficcontradelvirusSARS............................................................157

4.2. Possibilitatsdemodels3Dperal’scFv‐h3D6...............................................................................158

4.3. Determinaciódelmodeldemínimaenergia..................................................................................159

4.4. NumeracióKabatdel’scFv‐h3D6ilocalitzaciódelesregionsCDR....................................160

4.5. Caracteritzaciódelmodeltridimensionaldel’scFv‐h3D6.......................................................162

4.6. Exposiciódelsresidusalsolvent........................................................................................................163

4.7. Predicciódetendènciaal’agregació.................................................................................................164

4.8. AlineamentMúltiple.................................................................................................................................165

4.9. AminoàcidScanning‐Mutation.............................................................................................................167

4.10. Redissenydel’scFv‐h3D6apartirdelmodel3D.........................................................................168

4.10.1. Mutacionsenelnuclihidrofòbic..................................................................................168

4.10.1.1. Resultatsexperimentalsdelsmutantsdissenyats.....................170

4.10.2. Re‐dissenydelextremC‐terminaldel’scFv‐h3D6................................................171

5. DISCUSSIÓ...............................................................................................................................................173

5.1. Mutacionsalnuclihidrofòbicaugmentenlatendènciaal’agregaciódel’scFv‐h3D6.174

5.2. L’elongaciódel extremC‐terminal augmenta l’estabilitat termodinàmica idisminueix

latendènciaal’agregaciódell’scFv‐h3D6......................................................................................................175

CAPÍTOL 3: Estudi inicial, mitjançant tècniques espectroscòpiques, de les propietats

termodinàmiques d’un domini variable d’Ig implicat en l’Amiloïdosi de cadena lleugera.

Mutacionsrestaurativesiestabilitat......................................................................................................177

1. RESUM......................................................................................................................................................179

2. INTRODUCCIÓ........................................................................................................................................181


3.1. MutagènesiDirigida..................................................................................................................................185

3.2. Expressióheteròlogadel’AL‐12imutantsrestauratius..........................................................186

xiv

3.3. Purificacióproteïnaperiplasmàticasoluble..................................................................................186

3.3.1. Cromatografiadebescanvianiònic..............................................................................187

3.3.2. Cromatografiad’exclusiómolecular.............................................................................187

3.4. Purificacióproteïnacitoplasmàticainsoluble...............................................................................188

3.4.1. LLisiCel·lular...........................................................................................................................188

3.4.2. Solubilitzaciódelafraccióproteicainsoluble..........................................................189

3.4.3. Replegamentperdiàlisidelafraccióproteicainsoluble.....................................189

3.5. Determinaciódel’estructurasecundàriaiterciàriadel’AL‐12imutants.......................189

3.5.1. EspectreCDalUV‐llunyà...................................................................................................189

3.5.2. Espectredefluorescènciadelresidudetriptòfan...................................................190

3.5.3. DesnaturalitzaciótèrmicaperfluorescènciaiCD..................................................190

3.5.4. Desnaturalitzacióquímicaperfluorescència...........................................................190

3.5.4.1. Obtenciódelsparàmetrestermodinàmics.......................................190

3.6. Estudid’agregaciódel’AL12imutantsperFTIR........................................................................191

4. RESULTATS.............................................................................................................................................193

4.1. Estructurasecundàriadel’AL‐12.......................................................................................................193

4.1.1. Estructurasecundàriadelsmutantsrestauratius..................................................194

4.2. Desnaturalitzaciótèrmicadel’AL‐12................................................................................................196

4.2.1. Desnaturalitzaciótèrmicadelsmutantsrestauratius..........................................197

4.3. Estabilitattermodinàmicadel’AL‐12...............................................................................................199

4.3.1. Estabilitattermodinàmicadelsmutantsrestauratius.........................................201

4.4. Estudidel’agregaciódel’AL‐12perFTIR.......................................................................................201

4.4.1. Estudidel’agregaciódelsmutantsrestauratius.....................................................205

5. DISCUSSIÓ...............................................................................................................................................207

5.1. Estructurasecundària,desplegamentiestabilitatdeldominiAL‐12................................207

5.2. Viad’agregaciódeldominiAL‐12induïdapertemperatura..................................................208

5.3. Efectedelesmutacionsrestaurativessobrel’agregacióiestabilitatdeldominiAL‐12.

209

5.4. Expectativesdefuturenelestudidel’agregaciódel’AL‐12..................................................210

CAPÍTOL4:EstudiperFTIRde laviad’agregaciódeldominiPSD95‐PDZ3:Reorganització

estructural en fibres‐β de tipus worm‐like i citotoxicitat, i implicació de l’hèlix‐α3 en

l’estabilitatiagregaciódeldominiPDZ3...............................................................................................213

1. RESUM......................................................................................................................................................215

2. INTRODUCCIÓ........................................................................................................................................217


3.1. ExpressióipurificaciódeldominiPDZ3imutants.....................................................................221

3.2. AgregaciódeldominiPDZ3imutants..............................................................................................221

3.3. Espectroscòpiad’infraroigambtransformadadeFourier......................................................221

3.4. Microscòpiaelectrònicadetransmissió(TEM)............................................................................222

xv

3.5. AssajosdecitotoxicitatdeldominiPDZ3........................................................................................222

3.6. ExperimentsdeDSC,DLSiCDdelesdiferentsvariantsdeldominiPDZ3......................223

3.7. Espectroscòpiad’RMN.............................................................................................................................223

4. RESULTATS.............................................................................................................................................225

4.1. EspectredeFTIRdeldominiPDZ3natiu........................................................................................225

4.1.1. EspectredeFTIRdel’agregaciódeldominiPDZ3..................................................227

4.1.2. Influenciadelaforçaiònicasobrel’agregaciódeldominiPDZ3....................228

4.1.3. CitotoxicitatdelsagregatsdePDZ3..............................................................................230

4.1.4. MicroscòpiaelectrònicadelsagregatscitotòxicsdePDZ3.................................231

4.1.5. AnàlisisperRMN‐HSQCdelsaspectesmolecularsdel’agregaciódelPDZ3.

232

4.2. Efectedeladeleciódel’hèlix‐α3sobreelplegamentdeldominiPDZ3............................234

4.2.1. Efectedeladeleciódel’hèlix‐α3sobrel’agregaciódeldominiPDZ3............237

4.2.1.1. EspectredeFTIRdeldomini∆10ct‐PDZ3natiu............................238

4.2.1.2. EspectredeFTIRdelintermediarid’agregaciódel’∆10ct‐PDZ3.

240

4.3. Interaccióhèlix‐α3iloopβ2‐β3ielseuefectesobrel’agregaciódeldominiPDZ3.....241

4.3.1. EstructurasecundàriadelestatnatiudelsmutantsdePDZ3...........................241

4.3.2. Estructurasecundàriadelintermediarid’agregaciódelsmutantsdePDZ3.

244

4.4. Anàlisiscalorimètric(DSC)delmutantsdeldominiPDZ3......................................................246

5. DISCUSSIÓ...............................................................................................................................................249

5.1. Lafulla‐βflexibledónallocal’agregaciódelPDZ3.....................................................................249

5.2. Importànciadelacadena‐β3enlareorganitzaciódelafulla‐βflexible............................250

5.3. Roldel’hèlix‐α3enelplegamentil’agregaciódeldominiPDZ3..........................................252

5.4. Residusimplicatsenlesinteraccionsentrel’hèlix‐α3ieldominiPDZ3...........................253

VI. CONCLUSIONSGENERALS...................................................................................................................255

VII. BIBLIOGRAFIA.......................................................................................................................................265

APÈNDIXD’ARTICLES...................................................................................................................................287

xvii

ÍNDEXDEFIGURESITAULES.

FiguraI.1.Representaciódel’estructuradeproteïnes.............................................................................................7

FiguraI.2Modelsdeviesdeplegamentdeproteïnes...............................................................................................9

FiguraI.3.Diagramaenergèticdelplegamentproteic...........................................................................................10

FiguraI.4.Representaciód’unembutdeplegamentdeproteïnes...................................................................11

FiguraI.5.Representacióesquemàticadel’embutdeplegamentid’agregació.........................................17

FiguraI.6.Representacióesquemàticadelspossiblesestatsconformacionalsquepotadoptaruna

cadenapolipeptídicailesprincipalsinterconversionsentreells.....................................................18

FiguraI.7.Modeldel’organitzacióestructuraldelesfibresamiloides..........................................................20

FiguraI.8.Modeld’agregacióamiloidedependentdenucleació.......................................................................21

FiguraI.9.Modeldecompetènciaentreviad’agregacióamiloideiviaWL..................................................22

FiguraI.10.Estructuracristal·linadel’oligòmerK11V‐TRiformacióamiloide........................................23

FiguraI.11.Reducciód’activitatcerebralidepòsitsfibril·larsenl’AD...........................................................30

FiguraI.12.TallproteolíticdelaproteïnaAPPiformaciódelpèptidAβ......................................................31

FiguraI.13.Esquemadelahipòtesisdelacascadaamiloideacobladaalciclededeposicióamiloide..

........................................................................................................................................................................................33

FiguraI.14.Esquemadelsdominisd’Igivariantsrecombinants......................................................................35

FiguraI.15.Cinèticad’agregaciódelpèptidAβ1‐42...................................................................................................36

FiguraI.16.Amiloïdosidecadenalleugera(AL).......................................................................................................37

FiguraI.17.AlineamentmúltiplededominisVLamiloidogènicsilasevalíniagerminalκIO18/O8.

........................................................................................................................................................................................40

FiguraI.18.Estructurad’immunoglobulinesidominisVL...................................................................................41

FiguraI.19.Diferenciesenlainterfíciedimèricaentreeldímerd’AL‐09ideκIO18/O8.....................42

FiguraI.20.PromiscuïtatdelainterfíciedimèricadelsdominisVLamiloidogènics................................43

FiguraI.21.Representaciódel’organitzaciódelfluxd’informaciócel·lular................................................46

FiguraI.22.ExempledeproteïnesmultidominiquecontenendominisPDZ..............................................47

FiguraI.23.RepresentaciódelplegamentcanònicdelsdominisPDZ.............................................................48

TaulaI.2.ClassificaciódedominisPDZenfunciódelasevaespecificitatd’unió.......................................49

FiguraI.24.Localitzaciópost‐sinàpticaiinteraccionsmolecularsdelaproteïnaPSD‐95....................50

FiguraI.25.Estructuracristal·linadeldominiPDZ3..............................................................................................51

FiguraI.26.Representaciódelsresidusdelloopβ2‐β3deldominiPDZ3implicatsenlainteracció

ambpèptidsil’hèlix‐α3addicional................................................................................................................53

FiguraM.1.Mapadelsvectorsd’expressiópET‐trx1aipET‐12a......................................................................77

FiguraM.2.Cromatografiadebescanviiònic.............................................................................................................81

FiguraM.3.Cromatografiad’exclusiómolecular......................................................................................................82

FiguraM.4.EspectredeCDdediferentsestructuressecundàriesdeproteïnes........................................90

Figura1.1.Representaciódelesdiferentsformesscrambleddel’scFv‐h3D6.........................................128

Figura1.2.Identificaciódel’scFv‐h3D6natiuilesformesscrambled.........................................................129

xviii

Figura1.3EspectredeCDalUV‐llunyàdel’scFv‐h3D6adiferentstemperatures................................130

Figura 1. 4.Deconvolució de l’espectre de FTIRde la regió d’amida I’ de l’scFv‐h3D6 a diferents

temperatures.........................................................................................................................................................131

Figura1.5.Desnaturalitzaciótèrmicadel’scFv‐h3D6.........................................................................................132

Figura1.6.AssaigdeviabilitatperMTTdelalíniacel·lulardeneuroblastomahumàSH‐SY5Y.....133

Figura1. 7. Formacióde fibresamiloides iWLperpartde l’Aβ1‐42, l’scFv‐h3D6 i el complexAβ1‐

42:scFv‐h3D6,enfunciódelatemperaturailapresenciadeDMSO..............................................136

Figura1.8.Assaigd’agregacióperfluorescènciadeTioflavinaTiANS......................................................137

Figura1.9.Assajosd’agregació induïdaper temperaturaper fluorescènciadeTioflavinaT iANS.

.....................................................................................................................................................................................138

Figura 1. 10. Diagrama energètic de la via d’agregació del pèptid Aβ1‐42, de l’scFv‐h3D6, i del

complexAβ1‐42:scFv‐h3D6...............................................................................................................................143

Figura2.1.EvoluciódelesestructuresproteiquesdipositadesenelPDB................................................149

Figura2.2AlineamentdelaseqüènciascFv‐h3D6amblaseqüènciamotlle2GHTrp:B.....................157

Figura2.3.Modelsteòricsdel’estructura3Ddel’scFv‐h3D6.........................................................................158

Figura2.4.Perfilsenergèticsdecadaundels5models.....................................................................................160

Figura2.5.Esquemadelaseqüènciadel’scFv‐h3D6inumeracióKabat..................................................161

Figura2.6.Modeltridimensionaldel’estructuradel’scFv‐h3D6..................................................................162

Figura2.7.Superfícied’exposicióalsolvent............................................................................................................164

Figura2.8.Predicciódelatendènciaal’agregaciódel’scFv‐h3D6...............................................................165

Figura2.9.Alineamentmúltipledel’scFv‐h3D6....................................................................................................166

Taula2.1.AminoàcidScanning‐Mutation..................................................................................................................167

Figura2.10.Desnaturalitzaciótèrmicaiquímicadel’scFv‐h3D6ilessevesvariants..........................170

Figura2.11.Detalldel’extremC‐terminaldelscFv‐h3D6.................................................................................172

Figura3.1.Estructuracristal·linade laproteïnaAL‐12 isolapamentamb laproteïnagerminalкI

O18/O8....................................................................................................................................................................183

Taula3.2.Detall i localitzaciódelesinteraccionsalteradesoperdudesdegutalesmutacionsque

contélaproteïnaAL‐12....................................................................................................................................184

Figura3.2.EstructurasecundàriaiexposiciódeLW35del’AL‐12adiferentstemperatures..........193

Figura3.3.Estructurasecundàriadelsmutantsrestauratiusd’AL‐12........................................................195

Figura3.4.EspectredefluorescènciadelresiduTrp35delmutantQ96Y.................................................196

Figura3.5.DesnaturalitzaciótèrmicaAL‐12...........................................................................................................197

Figura3.6.Desnaturalitzaciótèrmicadelsmutantsrestauratiusd’AL‐12................................................198

Figura3.7.Desnaturalitzacióquímicaperureadel’AL‐12ielsseusmutantsrestauratius..............200

Figura 3. 8. Deconvolució de l’espectre de FTIR de la regió amida I’ de l’AL‐12 a diferents

temperatures.........................................................................................................................................................202

Figura3.9.Evolució,enfunciódelatemperatura,delsprincipalscomponentsdelespectredeFTIR

alaregiódel’amidaI’del’AL‐12imutantsrestauratius..................................................................205

Figura 4. 1. Descomposició en bandes de l’espectre deconvolucionat de FTIR del domini PDZ3

adquiritentampóKH2PO450mM,pH7.5...............................................................................................225

xix

Figura4.2.EspectredeCDdeldominiPDZ3entampóKH2PO450mM,pH7.5......................................226

Taula 4. 1. Descomposició en bandes de l’espectre deconvolucionat de FTIR del domini PDZ3

adquiritentampóKH2PO450mM,pH7.5...............................................................................................227

Figura4.3.EvoluciódelesprincipalscomponentsdelespectredeFTIR,sotadiferentscondicions,

durantlaincubacióa60°C.............................................................................................................................229


adquiritentampóPBS,pH7.4.......................................................................................................................229


adquiritentampóKH2PO450mM,pH7.5,més150mMd’NaCl....................................................230

Figura4.4.AssaigdeviabilitatperMTTdelalíniacel·lulardeneuroblastomahumàSH‐SY5Y.....231

Figura4.5.ImatgesdeTEMdeldominiPDZ3incubata60°C,entampóPBS,pH7.4..........................232

Figura4.6.Espectredecorrelació1H‐15NHSQC‐RMNdeldominiPDZ3entampóKH2PO450mM,pH

7.5,desde25a60°C.........................................................................................................................................233

Figura4.7.CorbesdeldesplegamenttèrmicdeldominiPDZi∆10ct‐PDZ3obtingudesperDSC...235

Figura4.8.Distribuciódepoblacionsdelsdiferentsestats eneldesplegament tèrmicdeldomini

PDZ3ideldomini∆10ct‐PDZ3......................................................................................................................237

Figura4.10.Comparaciódelsprincipalscomponentsdel’espectrenatiudeFTIRdelsmutantsdel

dominiPDZ3,adquiritsentampóKH2PO450mM,pH7.5ia25°C..............................................241

Taula4.5.Descomposicióenbandesdel’espectredeconvolucionatdeFTIRdelsmutantsdeldomini

PDZ3adquirit en tampóKH2PO450mM,pH7.5, i comparacióambelsvalorsdeldomini

PDZ3..........................................................................................................................................................................243

Figura 4. 11 Evolució, en funció del temps d’incubació a 60ºC, dels principals components de

l’espectrenatiudeFTIRdelmutantPDZ3‐E401R,adquiritsentampóKH2PO450mM,pH

7.5...............................................................................................................................................................................244

Figura 4. 14. Comparació de les corbes del desplegament tèrmic del domini PDZ3 i les seves

variantsobtingudesperDSC..........................................................................................................................247

Taula 4. 6. Paràmetres termodinàmics del desplegament tèrmic del domini PDZ3 i les seves

variants....................................................................................................................................................................247

Figura4.15.AnàlisisperTANGOdelesregionspropensesal’agregaciódeldominiPDZ3...............251

Figura4.16.Evolució,enfunciódeltempsd’incubacióa60°C,delabandade1620cm.1deFTIR,

corresponentalsagregats‐β,deldominiPDZ3ilessevesvariants..............................................254

xxi

ABREVIATURES.

Abs AbsorbànciaAD Malaltiad’AlzheimerAEX Cromatografiad’intercanvianiònic(AnionExchangeChromatography)AFM MicroscòpiadeforçaatòmicaAICD APPIntracellularC‐terminalDomainAL AmiloïdosidecadenalleugeraAMPA àcidα‐amino‐3‐hidroxi‐5‐metil‐4‐isoxazolpropiònicANS Àcid8‐anilin‐naftalè‐sulfònicAPOE ApolipoproteïnaEAPOJ ApolipoproteïnaJAPP Proteïnaprecursoraamiloide(AmyloidPrecursorProtein)Aβ1‐42 Pèptidβ‐amiloide(residus1‐42del’APP)Aβ39‐42 Pèptidβ‐amiloide(residus39‐42del’APP)BLAST BasicLocalAlignmentSearchToolCAA Angiopatiaamiloidecerebral(CerebralAmyloidAngiopathy)CD Dicroismecircular(CircularDichroism)CDR Regiócomplementariad’antigen(ComplementaryDeterminingRegion)CEX Cromatografiad’intercanvianiònic(CationExchangeChromatography)CRIPT Cysteine‐RichInteractorProteincal CaloriesC‐terminal Carboxi‐terminalCβ Carboni‐βdelenllaçpeptídicCα Carboni‐αdelenllaçpeptídicD EstatDesplegatDa Daltonsdeg Graud’el·lipticitatDNA Àciddesoxiribonucleic(Desoxyribonucleicacid)DLS DynamicLightScatteringDMEM/F‐12 Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium/NutrientMixtureF‐12HamDMSO DimetilsulfòxiddNTP DesoxiribonucleòtidtrifosfatDO600 Densitatòpticaa600nmDSC DifferentialScanningCalorimetrydsDNA DNAdedoblecadena(double‐strandDNA)DSSP DefinitionofSecondaryStructureofProteinsD2O AiguadeuteradaE.coli EscherichiacoliEDTA ÀcidetilèdiaminotetraacèticELISA Enzyme‐LinkedImmunoSorbentAssayetal. Icol·laboradors(delllatíetalter)ExPASy ExpertProteinAnalysisSystemFab Fragmentd’unióal’antigen(Fragmentantigen‐binding)FBS Sèrumfetalboví(FetalBovineSerum)Fc Regióconstant(Fragmentcrystallizableregion)

xxii

Fn Fluorescènciaintrínsecaal’estatnatiuFu Fluorescènciaintrínsecaal’estatdesplegatFPLC FastProteinLiquidChromatographyFTIR Espectroscòpiad’infraroigambtransformadadeFourierFXS SíndromeXfràgil(FragileXSyndrome)g Gramsg RCF(RelativeCentrifugalForce)GK DominiGuanilatKinasaGndCl ClorurdeGuanidiniGSH GlutatióreduïtGSSG Glutatióoxidath HoraHSQC‐NMR HeteronuclearSingleQuantumCoherence‐NuclearMargneticResonanceHC Cadenapesada(HeavyChain)HCl ÀcidclorhídricHFIP 1,1,1,3,3,3‐hexafluoro‐2‐isopropanolI Intermediarisdeplegamentmeta‐estableIg ImmunoglobulinaIDP Proteïnaintrínsecamentdesordenada(IntrinsicallyDisorderedProtein)IMAC ImmobilizedMetalionAffinityChromatographyIPTG Isopropilβ‐D‐1‐tiogalactopiranòsidI‡ EstatdetransicióJ JouleKd Constantd’equilibridedissociaciódelcomplexproteïna‐lligandL LitresLB MediLuria‐BertaniLC Cadenalleugera(LightChain)LPS LipopolisacàridM Molarm metresmAb AnticòsmonoclonalMAGUK MembraneAssociatedGuanylateKinaseMAPK Mitogen‐ActivatedProteinKinaseMCS MultipleCloningSiteMEF‐2 FactordetranscripcióMyocyteEnhancerFactor‐2min MinutsMRE MeanResidueEllipticityMPB MaltoseBindingProteinMTT 3‐(4,5‐dimetiltiazol‐2‐il)‐2,5‐difeniltetrazolmN‐U Diferènciaenl’accessibilitatalsolvententrel’estatnatiuieldesplegatN EstatNatiuoPlegatNAA Non‐essentialAminoacidsNMDA N‐metil‐D‐aspartatnNOS Sintasaneuronald’ÒxidNítricN‐terminal Amino‐terminalORI Origendereplicació

xxiii

PA Persulfatamònicpb ParelldebasesPCR Reaccióencadenadelapolimerasa(PolymeraseChainReaction)PDB ProteinDataBankPDVF PolyvinylidenedifluoridepI PuntIsoelèctricPiB‐PET PittsburghcompoundB‐Tomografiad’emissiód’electronsPSD‐95 PostSynapticDensityprotein‐95PSEN Presenilina(oγ‐secretasa)RL Fibresrod‐likeRMN RessonànciamagnèticanuclearRNA ÀcidRibonucleic(RibonucleicAcid)ROS Espèciesreactivesd’oxigen(ReactiveOxygenSpecies)rpm RevolucionsperminutSARS SevereAcuteRespiratoriSyndromesAPPα Fragmentd’APPextracellularsolublegeneratperl’α‐secretasasAPPβ Fragmentd’APPextracellularsolublegeneratperlaβ‐secretasascFv Fragmentvariabledecadenasenzilla(single‐chainvariableFragment)SDS DodecilsulfatsòdicSDS‐PAGE ElectroforesiengeldepoliacrilamidaenpresènciadeSDSSEC Cromatografiad’exclusiómolecular(SizeExclusionChromatography)seg SegonsSEM StandardErroroftheMeanSH3 SRCHomology3DomainSNC SistemanervióscentralssDNA DNAdecadenasenzilla(single‐strandDNA)ssNMR RessonànciamagnèticanuclearenfasesòlidaT TemperaturaTA TemperaturaambientTa Temperaturad’hibridaciódefragmentsdeDNA(annealing)TEM MicroscòpiaelectrònicadetransmissióTEMED N,N,N’,N’‐tetrametilè‐diamíTEV TobacoEtchProteinThT TioflavinaT(ThioflavineT)Tm Temperaturaenlaqualel50%delapoblacióestrobadesplegadaTm TemperaturadefusiódefragmentsdeDNA(melting)trx ProteïnadefusiótioredoxinaTTR ProteïnaTranstiretina(TransthyretinProtein)U EstatDesplegatUE Unitatsd’endotoxinaUPR UnfoldedProteinResponseUV Ultravioladav/v Relacióvolum/volumv/p Relacióvolum/pesVC VolumdecolumnaVH Dominivariabledecadenapesada

xxiv

VL DominivariabledecadenalleugeraWL Fibresworm‐likeWT Wild‐Type

ZO ProteïnaZònulaoccludensΔ IncrementG EnergialliuredeGibbsH EntalpiaS Entropia

[D]50%Concentraciódedesnaturalitzantenlaqualel50%delaproteïnaestrobadesplegada

1H IsòtopradioactiuHidrogen13D Tridimensional15N IsòtopradioactiuNitrogen15Å Armstrongsε Coeficientd’extinciómolarλ Longitudd’onak‐ Quilo‐m‐ Mil·li‐n‐ Nano‐ɵ El·lipticitatμ‐ Micro‐°C GrausCentígrads% Tantpercent

xxv

Taulad’abreviaturesdelsaminoàcidsproteïnogènics.

Nom Coditreslletres Codiunalletra

Alanina Ala A

Arginina Arg R

Asparagina Asn N

ÀcidAspàrtic Asp D

Cisteïna Cys C

ÀcidGlutàmic Glu E

Glutamina Gln Q

Glicina Gly G

Histidina His H

Isoleucina Ile I

Leucina Leu L

Lisina Lys K

Metionina Met M

Fenilalanina Phe F

Prolina Pro P

Serina Ser S

Treonina Thr T

Triptòfan Trp W

Tirosina Tyr Y

Valina Val V

Taulad’abreviaturesdelsnucleòtidsdeDNA/RNA.

NomdelaBase

Nitrogenada

Codiuna

lletra

Adenina A

Citosina C

Guanina G

Timina T

Uracil U

I. RESUM.

I‐Resum

3

Aquesta Tesi Doctoral es centra en l’estudi molecular de tres proteïnes

relacionadesambmalaltiesconformacionalshumanes,oAmiloïdosis.Mitjançanttècniques

espectroscòpiques,s’handescritelsmecanismesdeplegamentnatiuid’agregacióenfulla‐

βordenada,duesviesqueestrobenencompetènciaatravésdelapresènciadediferents

estatsintermediarisal’espaiconformacional.Elsintermediarisd’agregació,precursorsde

lesfibresamiloides,sónconsideratselsprincipalscausantsdelacitotoxicitatcel·lularen

moltesdelesmalaltiesamiloidogèniques,pertant,elseuestudiéscrucialperaprofundir

enl’etiologiad’aquestespatologieshumanes,moltesd’ellessensetractamentcuratiu.

Perunabanda,s’haobtingutunfragmentd’anticòsrecombinantespecíficperaβ‐

oligòmersdelpèptidAβ1‐42 causantde l’Alzheimer, l’scFv‐h3D6.El seuestudihaestatel

primerendescriureelmecanismepelqualunscFvretiraelpèptidAβ1‐42delaviaamiloide

ievitalasevatoxicitatneuronal,talicoms’hademostratenassajosdeviabilitatencultius

cel·lulars.Amés, l’obtenciód’unmodel tridimensionalde l’scFv‐h3D6,perhomologiade

seqüències,hapermès ferunredissenyracionalde lamolèculaper taldemillorar‐ne la

sevaestabilitat,augmentarlasevaproducció,idisminuirladosiefectivajademostradaen

ratolinsmodeld’Alzheimer.

Per altra banda, s’ha treballat amb un domini variable (VL) d’immunoglobulina,

extret d’una pacient amb Amiloïdosi de cadena lleugera, l’AL‐12. Aquest domini

amiloidogènicpresenta7mutacionsrespectelasevalíniagerminalκIO18/O8.L’obtenció

delespropietatstermodinàmiquesdel’AL‐12,aixícomdequatremutantsrestauratius,ha

servitperestudiarl’efectedelesmutacionssomàtiquessobrel’estabilitatdelsdominisVL.

Així, larestauracióderesiduspuntualsdel’AL‐12capalaseqüènciagerminal,implicala

desestabilització del domini i un augment de la tendència a l’agregació i, per tant, s’ha

demostratqueunaúnicamutaciósomàticanoseria lacausadelpotencialamiloidogènic

de l’AL‐12, sinóque seria la combinaciódevaris factorsdesestabilitzantsdelplegament

natiu, donant lloc a canvis conformacionals susceptibles a l’agregació amiloide, i la seva

deposicióendiferentsòrgansiteixitscel·lulars.

I per últim, s’ha estudiat el domini PSD95‐PDZ3, unamolècula reguladora de la

sinapsis neuronal, i relacionada amb malalties com l’Alzheimer o l’Autisme. El domini

PDZ3 segueix una via d’agregació amiloide reversible, una particularitat rellevant de la

qualsen’handeterminatelscanvisconformacionalsquelapromouen.Amés,eldissenyde

6 variants del PDZ3 han servit per determinar les regions implicades en l’estabilitat i

plegamentglobaldeldomini,aixícomelseupaperenlaregulacióal·lostèricadel’activitat

deldomini.

Aquest treball demostra la importància dels estats intermediaris a l’espai

conformacional de les proteïnes, la seva relació amb les malalties conformacionals, i

l’aplicabilitat del seu coneixement en el desenvolupament de teràpies efectives.

II. INTRODUCCIÓ.

II‐Introducció EstructuraiPlegamentdeProteïnes

7

1. ESTRUCTURAIPLEGAMENTDEPROTEÏNES.

Elplegamentdeproteïneséselprocéspelqualunacadenapolipeptídica,amesura

que és sintetitzada pels ribosomes, adopta la seva conformació tridimensional nativa i

funcional.Elplegamentnatiuestrobaestabilitzatgràciesa interaccions intramoleculars,

tant locals (estructura secundària) com distants (estructura terciària). Principalment

s’estableixen interaccions no covalents (electrostàtiques, hidrofòbiques i ponts

d’hidrogen) entre les cadenes laterals dels aminoàcids de la seqüència primària, encara

quetambéendonenentrelescadeneslateralsilacadenaprincipal.Lesinteraccionslocals

donenllocaestructuressecundàriesregulars(hèlix‐αicadenes‐β)oirregulars(hèlix‐310,

loops i girs‐β), i parlem de motius estructurals quan es considera una combinació

d’estructures secundàries. L’estructura terciària s’assoleix per aproximació en el espai i

interacció de residus distants dins la seqüència, de forma que la proteïna s’empaqueta

sobre si mateixa, enterrant el nucli hidrofòbic i adquirint una conformació globular,

compactaiestable,denominadadomini(FiguraI.1).

FiguraI.1.Representaciódel’estructuradeproteïnes.Detalldel’estructurasecundàriaenhèlix‐αifulla‐β,

estabilitzadesperpontsd’hidrogen locals.El seuempaquetamenta l’espaidóna lloca l’estructura terciària,

estabilitzadaperinteraccionsentrediferentsmotiusestructurals(groc)distantsdinslamolècula.


8

En el cas de proteïnes multidomini, aquests s’uneixen mitjançant estructures

secundàries irregulars, i l’estructura terciària global s’estabilitza per interaccions

interdomini que expulsen l’aigua de l’interior de la molècula. S’anomena estructura

quaternàriaalacombinaciódediversescadenespolipeptídiques.

El plegament natiu és dinàmic, és a dir, presenta diversitat d’espècies

conformacionalsquefluctuenentreelles,adquirintlaflexibilitatnecessàriaperadaptar‐se

al entorn i interaccionar amb d’altres molècules, complint d’aquesta manera les seves

funcions.Aquestaestabilitatcompromesadelestatnatiuhaesdevingutuntemaclauenels

darrersanys,degutaqueésundelsdesencadenantsdemoltesmalaltiesconformacionals.

1.1. Antecedentshistòrics.

Alsanys60,ChristianAnfinsenvaaconseguirinvitroelreplegamentdelaproteïna

RibonucleasaA,unexperiment clauquevademostrarque tota la informaciónecessària

peraquèunaproteïnaadquireixi la sevaestructura tridimensionalnativa, es trobaa la

seqüència aminoacídica (Anfinsen et al. 1961). Amb aquest experiment, Anfinsen va

postularque,encondicionsfisiològiques, l’estatnatiud’unaproteïnarepresentaelnivell

mínimd’energiaglobaldelsistema,iquelatermodinàmicaéseldeterminantprincipalen

elprocésdeplegament.Méstard,CyrusLevinthalvademostrarqueelplegamentproteic

nopotseraleatoripereltempsinfinitqueestardariaenassolirl’estatnatiu,argumentant

que lacontribució termodinàmicanopotser laúnicadurantelprocés(Levinthal1968).

Cap als anys80, es va a formular la teoriade les viesdeplegament, segons laqual una

proteïnadesplegadasegueixunesviesdeplegamentespecífiques,regidaperunnombre

limitat de conformacions cinèticament possibles i termodinàmicament favorables

(Bryngelsonetal.1995).Llavors,l’objectiuvaserentendrecomlaproteïnasegueixlavia

“correcta”ievitalaresta.

Inicialmentesvandesenvolupardosmodelsdeviesdeplegamentque tenienen

comptelapresènciad’intermediarisdeplegamentiquelimitarienlareorganitzaciócapa

l’estat natiu (Baldwin 1989) (Figura I. 2, panell superior). El model seqüencial (o

framework),segonselqualprimeresformenelselementslocalsd’estructurasecundàriai

seguidament, per acoblament d’aquestes estructures al espai, s’adquireix l’estructura

terciàriafinal(Kim,Baldwin1982,Kim,Baldwin1990).Ielmodeldelcol·lapsehidrofòbic,

quedefensalaideadequelaproteïnacol·lapsaràpidamentsobreelsresidushidrofòbics

donantllocaunintermediariparcialmentcompacte(molten‐globule).Encontraposicióes

va proposar elmodel del trencaclosques (o jigsaw), que nega la necessitat d'una via de

plegamentúnicaipostulaquecadamolèculadeproteïnapotseguirunarutadiferentper

arribaral’estatnatiu(HarrisonandDurbin,1985)(FiguraI.2,panellinferior,esquerra).


9

Tanmateixlanecessitatd’intermediarisalesviesdeplegamentvaserqüestionada

alsanys90,quanesdemostràqueproteïnespetitessegueixenviesdedosestats(Jackson,

Fersht1991,Villegasetal.1995).Elmodeldenucleació‐condensació,unificaelsmodels

seqüencial i de col·lapse hidrofòbic postulant que les interaccions a llarga distància i

d’altresinteraccionshidrofòbiquespresentsal’estatnatiuesformenal’estatdetransició

de la vía de plegament, estabilitzant d’aquesta manera les altrament poc estables

estructuressecundàries(FiguraI.2,panellinferior,dreta)(Itzhaki,Otzen&Fersht1995,

Fersht1997,Villegasetal.1998).Aquestmodelvaprendreforçaquanvarisestudisvan

revelarque,jaal’estatdesplegat,existeixencertesinteraccionsnativesquemarquenlavia

de plegament i guien a la proteïna cap al estat natiu (Mok et al. 1999, Daggett, Fersht

2003).

Figura I. 2Models de vies de plegament de proteïnes. A partir dels experiments d’Anfinsen, que van

demostrar que les proteïnes pleguen espontània i reversiblement, es van descriure diferents models

mitjançantelqualunaproteïnaadoptaelseuplegamentnatiu.FiguraadaptadadeRadford,S.E.(2000).

1.2. Energèticadeplegament.

Energèticament,elprocésdeplegamentdeproteïnessegueixunareaccióons’ha

de traspassarunabarreraenergèticademajor energiaque l’estatdesplegat (U) i plegat

(N) (Figura I. 3). Aquesta alta barrera energètica correspon als anomenats estats de

transició(I‡),ambunaestructuraitermodinàmicacaracterística,peròquelasevaelevada

inestabilitatelsfadifícild’estudiar.L’estatdetransicióésdefineixcoml’etapalimitantdel


10

procés de plegament, i determina la cinètica o velocitat del procés, i la formació

d’intermediarisdeplegamentmeta‐estables(I)(Radford2000).

FiguraI.3.Diagramaenergèticdelplegamentproteic.U:estatdesplegat,I‐I’:intermediarisdeplegament,

I‡:estatintermediari,N:estatnatiu,∆G:energialliuredeGibbs,∆GU‡:energialliuredelpasdelestatdesplegat

alestatdetransició,∆GN‡:energialliuredelpasdelestatdetransicióalestatnatiuFiguraadaptadadeFersht,

A.R.(1993).

L’estabilitat termodinàmicad’unaproteïnaesdefineixper ladiferènciad’energia

lliure,odeGibbs,entrel’estatplegatieldesplegat ∆ i,generalment,estrobaentre

elsvalorsde5‐15kcal·mol‐1 (21‐63kJ·mol‐1) (Creighton1992,Dobson,Evans&Radford

1994, Fersht 1993, Chan, Bromberg & Dill 1995). Assolir l’estat natiu implica una

disminucióde l’energia lliuredelsistema(∆GN‐U<0).Entenentque∆ ∆ ∆ ,

llavorsl’entalpiai l’entropiadelareacciócontribueixenal’energiaglobal.Lacontribució

entròpica (∆S) durant el plegament acostuma a ser desfavorable, ja que implica un

augment de l’ordre en el sistema. Tot i això, existeix el que s’anomena penalització

entròpica,sovintatribuïdaaproteïnesintrínsecamentdesordenadesoqueperdenpartde

l’estructuranativaperaserfuncionals.Tambés’hapostulatquealgunesproteïnespoden

seguirunplegamentdown‐hill, sensebarreresenergètiques,quanelsvalorsd’entropia i

d’entalpiaessincronitzen(Eaton1999,Sadqi,Fushman&Munoz2006).Apartd’aquests

casos, el plegament de proteïnes es regeix, principalment, per un canvi favorable

d’entalpia (∆H), associat a l’establiment d’interaccions natives que estabilitzen l’estat

natiu.


11

1.3. Embutsdeplegament.

Gràciesalacombinaciód’unagranvarietatdetècniquesexperimentalsimètodes

teòrics (com per exemple, l’stopped‐flow, l’RMN, l’intercanvi protó‐deuteri, i

aproximacions computacionals), s’hapogut estudiar, anivell de residu i a una escalade

tempsdemilisegons,elprocésdeplegamentdeproteïnesdediferentcomplexitat.Aquest

avanç tecnològic ha permès la caracterització i l’obtenció de valors d’equilibri cinètic i

termodinàmic dels diferents estats que poblen una reacció de plegament, inclòs l’estat

intermediari(Serrano,Matouschek&Fersht1992,Brockwell,Smith&Radford2000).

Actualment s’entén que no existeix una via de plegament lineal, sinó que la

proteïna desplegada es troba dins un mapa energètic multidimensional, o embut de

plegament (Figura I. 4), en el que la proteïna pot seguir múltiples trajectòries de

plegament, podent passar per diferents estats intermediaris, fins a convergir en l’estat

natiu demínima energia (Bryngelson et al. 1995,Wolynes,Onuchic&Thirumalai 1995,

Dill,Chan1997,Radford2000).

FiguraI.4.Representaciód’unembutdeplegamentdeproteïnes.U:estatdesplegat,I: intermediaris,N:

estatnatiu,M:proteinamalplegadaomisfolded,Q:nombredecontactesnatius.FiguraadaptadadeSchultz,C.P.

(2000).

A l’estat desplegat, s’estableixen contactes entre residus clau de la seqüència,

formantunnuclideplegamentquemarcalatopologiailaviaaseguirdelaproteïna,fent

queelprocésresultiràpidieficient(Daggett,Fersht2003,Koehl,Levitt2002).


12

S’ha de tenir en compte que, en una proteïna desnaturalitzada, encara poden

persistir certes interaccions natives, o no natives, tot i haver perdut la seva estructura

terciària. Per tant, cal diferenciar entre un estat totalment desplegat (o estructura en

random‐coil)idesnaturalitzat(Blanco,Serrano&Forman‐Kay1998,Klein‐Seetharamanet

al.2002).

Elperfildel’embutdeplegamentésúnicperacadaproteïna,variabledepenentde

lescondicionsdelentorn,iésdeterminatperlespropietatscinètiquesitermodinàmiques

de la seqüènciapolipeptídica.Enelprocésdeplegament, elnivelldemínimaenergiaés

ocupat per l’estat natiu, però poden existir espècies intermediàries transitòries que

marquenmínimsenergèticslocals(Jahn,Radford2005).

1.3.1. Intermediarisdeplegament.

Elsdominisproteicsiproteïnesglobularspetites(demenysde100residusisense

pontsdisulfur)solenplegarcooperativament,seguintunatransiciódedosestats,plegat‐

desplegat, ambuna cinètica ràpida i sensenecessitat de passar per cap intermediari de

reacció (Villegas et al. 1995). El primer, demolts exemples descrits, va ser la proteïna

inhibidoradelaquimotripsina2(CI2),de64residus(Jackson,Fersht1991).Encanvi,les

proteïnes de grandàriamajor de 100 residus, acostumen a seguir una transició de tres

estats,implicantunintermediaricinèticestable.Laraóseriaquelesproteïnesgranstenen

tendènciaacol·lapsarenelsolvent,donant llocaestatscompactesambcertaestructura

nativa,lareorganitzaciócapaalplegamentnatiupassariapertravessarunaaltabarrera

energètica,donantllocaestatsintermediarisparcialmentplegats(Jahn,Radford2005).

Elplegamentdeproteïnesésunprocéscooperatiu,deformaqueelplegamentd’un

dominipotdesencadenariestabilitzarelplegamentd’unaltredemenysestable,enaquest

cas,passantperunestat intermediari.Encanvi, sielsdominisque formenunaproteïna

tenenunaestabilitat similarentreells, llavorsplegaransimultàniamentsensenecessitat

depoblarintermediaris(Tsytlonok,Itzhaki2013).

Segons la seva naturalesa, els estats intermediaris poden dividir‐se en a)

intermediaris termodinàmics o metastables, que es troben en equilibri, i per tant

s’acumuleniespodenaïllar;ib)intermediariscinètics,queapareixendegutauncanvide

velocitatdurantlatransicióentrel’estatplegatieldesplegat,iqueespodendetectarperò

noaïllar,jaquenos’acumulen.

El paper dels estats intermediaris encara provoca certa controvèrsia. Per una

banda, representen una etapa important de la via de plegament (on‐pathway), establint

contactes natius crucials per arribar a l’estat plegat; aquests intermediaris es poden

considerartransitorisomínimsenergèticslocals.Peròencertesocasions,l’estatdesplegat


13

estableix interaccions no natives, s’acumula en una trampa cinètica en forma

d’intermediariparcialmentplegatquedifícilmentrevertiràcapalaviadeplegamentnatiu.

Aquests intermediaris es consideren fora de la via de plegament (off‐pathway) i, en els

darrersanys,hanestatidentificatscomaprincipalsprecursorsdel’agregacióproteica.A

partdelsagregatsamorfs, rebenespecial importànciaelsagregatsβ‐amiloides jaquees

troben altament relacionats amb moltes malalties humanes. (Jahn, Radford 2008,

Tsytlonok,Itzhaki2013).

II‐Introducció AgregacióAmiloide

15

2. AGREGACIÓAMILOIDE.

L’agregacióamiloideéselprocéspelqualunpèptidoproteïnasolubleifuncional,

pateixunareestructuracióconformacionaldonantllocalasevaauto‐associacióiformació

d’agregats fibril·lars insolubles altament ordenats en estructura‐β creuada. Aquests

agregats es troben implicats en un gran nombre de patologies humanes, anomenades

malalties amiloidogèniques, conformacionals, o amiloïdosi. Entendre el mecanisme

d’agregaciódeproteïnesésclauperapoderarribaradesenvoluparteràpiesefectivesper

aquestespatologies.

Engeneral,lesproteïnesglobularstenenpocatendènciaal’agregacióperò,certes

mutacions o canvis en l’entorn proteic poden desestabilitzar l’estat natiu i desplaçar

l’equilibricapaintermediarissusceptiblesal’agregació.Amés,lesproteïnesgrans,iamb

unplegamentpoccooperatiu,tenenmésriscd’agregar(Chiti,Dobson2009).

Avuiendiaéssabutquel’estabilitzaciód’espèciesintermediàriesnonativesésel

desencadenantsdel’agregacióamiloide.Aquestesespèciesexposenregionshidrofòbiques,

queestrobarienenterradesenelplegamentnatiu,fent‐lesaccessiblesalsolventipertant

propiciant l’establiment de interaccions intermoleculars i l’auto‐associació. En el cas de

l’enzim lisozimode laproteïna transtiretina (TTR),mutacionspuntualsen la seqüència

desestabilitzen l’estat natiu i la seva cooperativitat de plegament. La β2‐microglobulina

resulta amiloidogènica degut a canvis locals en l’entorn proteic. La sobreproducció de

proteïna amiloidogènica és la causa de determinades amiloïdosis, com la de cadena

lleugera(AL).Enelcasdel’Alzheimer(AD),unadesregulacióenelprocésproteolíticdela

proteïnaprecursoraamiloide(APP)desencadenal’acumulacióamiloidedelpèptidAβ1‐42.

D’altra banda, l’al·lel APOE4 incrementa el risc de patir AD esporàdic plausiblement

perquè s’uneix al pèptid Aβ1‐4 amb unes 20 vegades menys afinitat que l’al·lel més

freqüentenhumans,l’APOE3,i,pertant,noelretiraambl’eficàcianecessària(LaDuetal.

1994). No obstant això, encara s’ha d’aprofundir molt en el mecanisme específic de

formacióamiloide(Blancas‐Mejia,Ramirez‐Alvarado2013).

Malgrat la directa relació entre amiloidogènesi i patologia, existeixen un gran

nombred’organismesqueconverteixen,durantelseuciclefisiològic,unaomésproteïnes

endògenes en fibres amiloides funcionals, anomenades proteïnes amiloid‐like, per

diferenciar‐lesde lespatogèniques.Unexemplen’és laproteïnaCurlin, de labactèriaE.

coli, que té com a funció colonitzar superfícies inertes i mitjançar la unió a proteïnes

hostes. O bé, la proteïna Chaplins, de la bactèria S. coelicolor, que disminueix la tensió

superficialde l’aigua ipermeteldesenvolupamentde leshifesaèries.Algunesproteïnes

podenexistir,dinsdesistemesbiològicsfuncionals,tantenformasolublecomd’agregats

amiloides,actuantcomelementsgenèticsextracromosomals,capaçosd’autopropagar‐sei


16

transmetre’s,iquesónanomenatsprionsnopatogènics,comaralaproteïnaSup35p,del

llevatS.cerevisiae,ilaHET‐s,delfongP.anserina(Chiti,Dobson2006).

Aquestfetfapensarquelaformaciódefibresamiloidesésunapropietatinherenti

genèrica de les cadenes polipeptídiques, i que es poden formar sota unes condicions

específiques altament controlades. A més, gràcies a tècniques computacionals, com ara

l’algoritme TANGO, s’han identificat les regions de la seqüència polipeptídica amb

tendènciaa l’agregació(Fernandez‐Escamillaetal.2004).L’evolució,però,haafavoritel

plegament natiu per davant de l’agregació, mitjançant la presència d’altes barres

cinètiques de desplegament, xaperones moleculars que ajuden a assolir l’estat natiu, i

mecanismesdeidentificacióidegradaciód’agregatsproteics(Stefani2012).

2.1. Mecanismedeformaciódefibresamiloides.

In vitro, les fibres amiloides es poden formar en presencia d’agents

desnaturalitzants (com la urea o el GdnHCl), a pHs àcids, a elevada temperatura, o sota

canvisd’aminoàcids,deformaques’incrementalapoblaciódeconformacionsparcialment

desplegadessusceptiblesal’auto‐associació.

Toticonèixerelsdesencadenants invitro,encaraestàperclarificarquinssónels

mecanismesinvivoqueprovoquenqueunaproteïnaesdesviïdelasevaviadeplegament

nativaientrialaviad’agregació.Semblaserqueelsprocessosdeplegamentiagregacióes

trobenencompetència,deformaqueessolapaundobleembutdeplegament(FiguraI.5),

onlesespèciesprecursoressóncapacesdesuperarlabarreraenergèticaquedónapasal

plegamentamiloide,unaviaambunaestabilitatglobalmajorquelanativa,ionlesfibres

representen l’estat de mínima energia de tot el sistema (Bucciantini et al. 2002, Jahn,

Radford2008,Fandrich2012,Stefani2012).

De forma general, el procés de fibril·lació segueix un patró jeràrquic on

determinadesmodificacionsdel’entorniestructuralscausenlacombinaciódemonòmers

parcialment desplegats cap a oligòmers més o menys compactes, i la subseqüent

reorganització d’aquests donant lloc a estructures fibril·lars complexes i ordenades en

fulla‐βcreuada(Fitzpatricketal.2013).

PerFTIRespotdiferenciarlafulla‐βnativadel’amiloide,queésgeneradadesprès

d‘aquestareorganització(Zandomeneghietal.2004).

Teòricament, la desestabilització i pèrdua del estat natiu, o bé l’augment de la

tendència a l’agregació d’espècies parcialment desplegades, és la justificació més

apropiada per almecanisme d’agregació amiloide, però s’han descrit casos d’associació

entreespèciesencaranatives,isónelsoligòmersambestructuranativaelsquepateixenla

reorganització conformacional cap a l’estructura rica en fulla‐β ordenada, com per


17

exempleelprocésd’agregacióamiloidedelainsulina,odel’ataxina3associadaal’atàxia

espinocerebel·lar(Chiti,Dobson2006).

Figura I.5.Representacióesquemàticade l’embutdeplegament id’agregació.La superfíciemostra la

varietatdeconformacionsquecondueixencapal’estatnatiu,atravésdecontactesintramoleculars;obécapa

laformaciódefibresamiloides,atravésdecontactesintermoleculars.Cadaunadelesvieséspobladaapartir

dediferentsintermediarisdeplegament.Elpasd’unaviaal’altreencaraestàperdefinir.Figuraadaptadade

Jhan,T.R.&Radford,S.E.(2005).

El mecanisme d’agregació esdevé tan complex com la multitud d’estats

conformacionalsquepotadoptarunacadenapolipeptídicadesplegada,queestrobenen

equilibri ique,pertant,sóninterconvertiblesentreells.Talicomindical’esquemadela

figura I.6,dinsd’aquesta complexadinàmicamolecularnoésd’estranyarquequalsevol

errordelsistemaderegulació(xaperonesmoleculars,sistemesdedegradacióidecontrol

de qualitat), canvis en l’entorn cel·lular, o en condicions patològiques, desencadenin

l’acumulacióilareestructuracióenagregats‐βd’algunad’aquestesespècies,jasiguil’estat

plegat,eldesplegattotaloparcial,elsagregatsamorfs,oelsoligòmersfuncionals.Malgrat

tot, clarament, les espècies total o parcialment desplegades són més susceptibles a

l’agregacióquenopasl’estatnatiu(Chiti,Dobson2006).


18

Figura I. 6. Representació esquemàtica dels possibles estats conformacionals que pot adoptar una

cadena polipeptídica i les principals interconversions entre ells. Totes aquestes interconversions es

trobenreguladesperl’entorncel·lular,xaperonesmoleculars,sistemesdedegradacióiprocessosdecontrolde

qualitat. Molts dels estats conformacionals poden ser biològicament funcionals, incloses les proteïnes

desplegades i les fibres. Però, determinats errors en el sistema de regulació propiciarien l’acumulació

d’espèciesiagregatsnofuncionals,desencadenantsdemalaltiesconformacionals.FiguraadaptadadeChiti,F.

&Dobson,C.M.(2006).


19

2.1.1. Determinantsamiloidogènics.

A part de l’estabilitat del plegament proteic i l’acumulació d’intermediaris no

natius, les propietats de la seqüència polipeptídica influeixen notablement sobre la

capacitat intrínseca d’una proteïna per formar agregats. A continuació és detallen tres

propietatsqueesdevenendeterminantsperal’auto‐associació:

‐ El grau d’hidrofobicitat de les cadenes laterals. La presència d’illots hidrofòbics

facilita l’agregació d’espècies total o parcialment desplegades. Evolutivament, les

seqüènciesproteiquesevitengrupsdetresomésresidushidrofòbicsconsecutius.

‐ La càrrega neta de la seqüència. De forma general, una elevada càrrega neta, ja

sigui global o local, dificulta l’agregació degut a la repulsió electrostàtica entre

residus.

‐ Iperúltim,latendènciaaformarestructuresenfulla‐β.L’elevadaconservacióde

residus prolina i glicina, dos residus que trenquen les cadenes‐β, i la menor

freqüènciadeplegamentsnatiusenconformaciótot‐β,podrienserunmecanisme

evolutiuperadisminuirlatendènciaal’agregació.

2.2. Estructuradelesfibresamiloides.

Leprimeresdescripcionsdefibresamiloidesvanrealitzar‐semitjançanttècniques

comTEM,AFMidifraccióderaigs‐X.Enselsdarrersanys,lacaracteritzaciódelesfibres

ha fet un gran salt gràcies a la tècnica de ressonànciamagnètica nuclear en fase sòlida

(ssNMR), i l’obtenció de nano i micro‐cristalls de fragments de pèptids amb

característiquesamiloides.

Lesfibresamiloidesrepresentenunestatd’organitzaciódiferental’estatnatiu.Tot

iquelesforcesd’interacció(pontsd’hidrogeniinteraccionshidrofòbiques,principalment)

sónlesmateixesentotesduesvies,enelmecanismed’agregacióesperdenelscontactes

natiusis’estableixencontactesintermoleculars,dependentsdeconcentració.

Les fibresamiloidessónagregats insolubles imoltestables.Malgratqueelsseus

precursors són, seqüencial i estructuralment, molt diversos, totes elles adopten una

estructura altament ordenada en fulla‐β creuada, on les cadenes‐β es disposen

perpendicularsaleixdelafibra,deixantenterratelnuclialtamenthidrofòbic(FiguraI.7).

Presenten un diàmetre d’entre 7 i 13 nm, i estan formades per un conjunt de 2 a 6

protofilaments,de2‐5nmdediàmetre,associatslateralmentiformantunahèlixsobresi

mateixos (Serpell et al. 2000).Aquestpatró canònic, fa pensarque lespropietats físico‐

químiquesdelacadenapolipeptídicasónundelsprincipalsdeterminantsdel’estructura


20

fibril·lar. Una altra característica comuna de les fibres amiloides, és que uneixen

específicamentelsfluoròforsCongoRediTioflavinaT(ThT),totiques’havistqueelsseus

precursors oligomèrics també són capaços d’establir aquesta interacció (Maezawa et al.

2008).

Figura I. 7. Model de l’organització estructural de les fibres amiloides. La imatge obtinguda per

microscòpiaconsisteixenuna fibra formadaper4protofilaments,associats lateralment i formantunahèlix

sobre si mateixos. Cada protofilament creix formant un nucli hidrofòbic en fulla‐β disposada

perpendicularmentaleixdelafibra.FiguraadaptadadeStefani,M.(2004).

Lescadenes lateralsde laseqüènciapolipeptídicaexerceixenunagran influència

sobrel’empaquetamentamiloide,provocantcertesdiferènciesestructuralsentrediferents

fibres, com ara, la llargada de les fulles‐β, la disposició paral·lela o antiparal·lela de les

cadenes‐β,ilasevadistanciad’empaquetament,aixícomelnombredeprotofilamentsque

les formen També trobem diferències en la llargada i conformació de les estructures

irregularsqueestrobenforadelnuclihidrofòbicdelafibra.Amés,lapresènciadeponts

disulfur,oderegionsdepoliglutamina,tambépodenpertorbarl’estructuracanònicadela

fibra(Chiti,Dobson2006).

2.3. Tipusdeviesamiloidogèniques.

L’estudi d’agregació de la proteïna β2‐microglobulina va ser el primer en

identificar i classificar diferents tipus d’agregats‐β (Kad et al. 2003, Gosal et al. 2005).

Inicialment, la intenció era classificar les fibres amiloides en funció de les seves


21

característiques conformacionals, però certes propietats cinètiques van revelar la

existènciadeduesviesamiloidogèniquesdiferents,laviaamiloideilaviaworm‐like(WL).

2.3.1. Viadefibril·lacióamiloide.

Aquestaviaamiloidogènicarepresentarial’estructuraclàssicadelsagregatstipus‐

β.Sónfibresrígides,senseramificacions,iformenungirsobresimateixes.Enfunciódel

número de protofilaments que les componen i de la distància de gir, aquestes fibres es

subdivideixenendiferentstipus(Kadetal.2003,Gosaletal.2005).

Figura I.8.Modeld’agregacióamiloidedependentdenucleació.Elprocés consisteix endues fases que

donenllocauncreixementsigmoïdal(corbaverda):a)lafasedenucleació,termodinàmicamentdesfavorablei

lenta,enlaqualelsmonòmerspateixenuncanviconformacionalsis’associenformantunnuclioligomèric,ib)

la fased’elongació,onelnuclicreixràpida i favorablementperaddiciódemonòmersa la fibra.L’addicióde

fibres pre‐formades escurça el temps de nucleació i indueix la formació d’agregats ràpidament (corba

vermella).Asota, imatgesdeTEMdeA)espèciesoligomèriques,B)protofilaments, iC) fibresamiloides.La

barracorrespon20nm.Figuraadaptadade(Kumar,Walter2011).


22

Cinèticament, la formaciódefibresamiloidessegueixunmecanismedepenentde

nucleació(FiguraI.8),enelqueelsmonòmerssolublesformenunnuclienergèticament

desfavorable (fase lag). A partir d’aquí la fibra creix ràpidament per associació de

monòmers i oligòmers al nucli pre‐format, sent un creixement exponencial i altament

favorable. In vitro, l’addició de formes prefibril·lars prèviament formades (o seeding),

redueix la barrera de nucleació de la fase lagde forma que s’accelera la seva formació

(Serio et al. 2000). Per TEM i AFM, s’han identificat espècies oligomèriques i

protofilamentspoblatsdurantlaformaciódelesfibres(FiguraI.8,A‐C).

2.3.2. Viadefibril·lacióworm‐like.

Les fibres WL són més curtes, de menys de 600 nm, flexibles, de 2.5 nm de

diàmetre, i exhibeixenunamorfologianodularambunadistanciade repeticióal voltant

dels30nm,sovintconfosesambprotofilaments.

LacaracterísticamésimportantdelesfibresWLésquesegueixenunacinèticade

fibril·lacióindependentdenucleació,pelquelasevaelongacióésràpidailineal,enlaqual

hihaunadirecteassociaciódelsmonòmersperaformarlafibra(FiguraI.9).

Figura I. 9.Model de competència entre via d’agregació amiloide i viaWL. Les fibresWL es formen

seguintunprocés independentdenucleació, favorablecinèticament, ipassantperunestat inicial identificat

com a fibres Rod‐like (RL). En competència per els mateixos monòmers, es troben les fibres amiloides,

dependentsdenucleació,ifavorablestermodinàmicament.Lesimatgespresesmitjançantmicroscòpiad’AFM,

mostra les característiques diferencials entre tots dos tipus d’agregats‐β. Figura adaptada de Jhan, T.R. &

Radford,S.E.(2008).

Unaaltraparticularitatde les fibresWLésque,sovint, tenencaràcterreversible,

fetquepotanar lligat laconservaciódegranpartde la fulla‐βnativa,adiferènciadeles

fibres amiloides, les quals pateixen una important reorganització de l’estructura


23

secundària,caientenmínimsenergèticsirreversibles.Lamancadenucleaciódelesfibres

WLresultaambunafibril·laciómoltmésràpidaquel’amiloide.Invitro,laviaWLinhibeix

laformacióamiloide,jaquecompeteixenpercaptarestatsmonomèrics.Totplegatindica

que les fibresWLsónespècies estabilitzades cinèticament,mentreque les amiloidesho

sóntermodinàmicament(Kadetal.2003,Gosaletal.2005).

2.4. Oligòmerssolubles.

A diferència de les fibres amiloides, poc és sabut sobre les característiques

estructurals dels oligòmers, degut a que són espècies meta‐estables, poblades

transitòriament durant la via de fibril·lació, i que adopten diverses morfologies.

Recentments’haaconseguitlesprimerescristal·litzacionsd’espèciesoligomèriques,iper

DinàmicaMoleculars’hasimulatlareorganitzacióestructuralquepateixenelsoligòmers,

ajudantaentendreelpasdelaviadeplegamentnatiualad’agregacióamiloide(FiguraI.

10).(Ahmedetal.2010,Laganowskyetal.2012,Neudeckeretal.2012).

Figura I.10.Estructuracristal·linade l’oligòmerK11V‐TR i formacióamiloide. L’estructuracristal·lina

del oligòmer cilindrinaK11V‐TR és formada per tres fulles‐β (blau, verd, vermell), estabilitzades per ponts

d’hidrogen, que adopten una conformació en barril‐β cilíndric. La simulació, per DinàmicaMolecular, de la

transició estructural cap a la formació amiloidemostra un trencament inicial de la interfície (punts 2 i 3),

seguidament el cilindre es desplega per la completa dissociació dels ponts d’hidrogen febles (punts 4 i 5),

mentrequelesinteraccionsfortesesmantenen(punt6).Finalment,lesformesestesesenfulla‐βantiparal·lela


24

(punt7)s’associenicauenenunmínimenergèticmésbaixquel’estatinicial.FiguraadaptadadeLaganowsky,

A.(2012).

Ésnecessariuncertgraudedesplegamenti flexibilitatdelsprecursorsamiloides

per a reorganitzar‐se en estructures fibril·lars en fulla‐β creuada, així com una elevada

hidrofobicitatiuncàrreganetapetita(Uversky,Fink2004,Fandrich2012,Stefani2012).

Igualquelesfibres,elsoligòmerssolublestambéuneixenelsfluoròforsCongoRediThT

(Maezawaetal.2008).

Degutalpolimorfismedelesespèciesoligomèriques,resultadifícildescriure’lsde

formagenèrica.Depenentdel tipusdecadenapolipeptídica,o finshi totdelprotocolde

oligomerització utilitzat in vitro, s’han detectat diferents tipus d’oligòmers. A nivell

d’estructura secundària, existeixen oligòmers rics en estructura‐β i d’altres d’estructura

secundàriairregular.Semblaaserqueelpolimorfismedelsoligòmerséstrobarelacionat

amb el seu potencial citotòxic, així com amb la tendència a formar fibres amiloides

(Fandrich 2012). Seguint les evidències de que existeixenmúltiples vies d’agregació en

competència entre elles, els oligòmers es poden considerar intermediaris on‐pathway o

off‐pathwaydelaviaamiloide,donantlloc,perexempleafibresWL,talicoms’haexplicat

anteriorment(Gosaletal.2005,Jahn,Radford2008,Wuetal.2010).

2.4.1. Toxicitatdelsoligòmerssolubles.

Aproximadament20anysenrere,s’enteniaquelesfibresamiloideserenelfactor

citotòxic principal en les malalties amiloidogèniques. Avui en dia, és acceptat que les

espèciesoligomèriquessónpotencialmentméstòxiquesquelesfibresmadures,sobretot

pelquefaamalaltiesneurodegeneratives.Finsitot, lesfibrespodrientenirunafinalitat

protectoradinslescèl·lules,atrapantoligòmerstòxics,totiquecertsautorslesdescriuen

com a font d’espècies citotòxiques mitjançant la seva fragmentació (Bucciantini et al.

2002).Encertesamiloïdosissistèmiques,però,l’acumulaciódefibressegueixsentunfort

desencadenantdedisfuncióorgànica(Fandrich2012).

Elsintermediarisoligomèricsexerceixenefectesimportantssobrelaviabilitatiel

metabolismecel·lular.Elsoligòmersinteraccionenambregionsd’elevadacàrreganegativa

de lamembrana lipídica i la desestabilitzen, de forma que esmodifica la permeabilitat

cel·lular,perjudicantlesproteïnesdemembranaiviesdesenyalització(Houetal.2005).

Lacomposicióirigidesadelamembranalipídicajugaunpaperimportantenlainteracciói

internalitzacióde les formesoligomèriques,concretamentquesiguinpobresoriquesen

colesterollesfamésomenysvulnerables,respectivament(Stefani2012).Lahipòtesidels

canals de membrana proposa que els agregats tòxics formen porus inespecífics a la

membranacel·lular,alterantcondicionscel·lularsfonamentals,comaraelsnivellsdeCa2+


25

o l’equilibri redox i, finalment, provocant apoptosi mitjançada per caspases, estrès

oxidatiu, i disfunció mitocondrial (Fandrich 2012, Stefani 2012). A nivell

neurodegeneratiu, la interacciódelsoligòmerssobre lesmembranesplasmàtiquesafecta

directamentalesxarxesneuronalsialasevaplasticitat,jaques’alterencanalsireceptors

de membrana importants per a l’homeòstasi de ions, el flux d’informació i respostes

neuronals.

Endefinitiva, lavarietatmorfològicadelesfibresamiloidei l’existènciadevaries

vies amiloidogèniquesdemostra la complexitatdelprocésd’agregació en fulla‐β.Encara

està per clarificar com les característiques moleculars del precursor monomèric i les

diferentsrutescinètiquesinfluenciensobrelareacciód’assemblatgeinvivoilamorfologia

final de la fibra, així com la possibilitat d’interconversió entre diferents vies

amiloidogèniques.Amés,s’hadetenirencompteelpotencialtòxicdecadaunad’aquestes

varietats amiloides, com es troben representades a les diferents patologies

amiloidogèniques,il’efectequetenenencadaunad’elles.

II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques

27

3. AMILOÏDOSIOMALALTIESAMILOIDOGÈNIQUES.

En humans, les amiloïdosis, o malalties amiloidogèniques, són el conjunt de

patologiesconformacionalsrelacionadesambunincorrecteplegamentproteic,toteselles

associades a l’acumulació de fibres amiloides insolubles a diferents òrgans o teixits

cel·lulars,causantlamortcel·lulariladisfuncióorgànica.Lesmalaltiesamiloidogèniques

sónungrupmoltheterogeniquederivendefinsa27proteïnesdiferents(Taula1).Toti

que l’estructura i funció de la forma nativa de cada una d’elles és diferent, totes

comparteixen el mateix patró amiloide en fulla‐β creuada (Blancas‐Mejia, Ramirez‐

Alvarado2013).

Clínicament,lesamiloïdosispodendividir‐seendosgransgrupsenfunciódesila

proteïna precursora és expressada i secretada al mateix o a diferent lloc de la seva

deposicióamiloide:lesamiloïdosislocalsilesamiloïdosissistèmiques.

Les amiloïdosis sistèmiques afecten a diferents òrgans (cor, ronyó, fetge, nervis

perifèrics, tracte intestinal, etc.) i són causades per una gran varietat de proteïnes

precursores. Totes elles coincideixen en que la proteïna precursora és expressada i

secretada en una regió diferent del lloc de deposició, s’acumulen extracel·lularment i, a

partdelsefectesrelacionatsacadaundelsòrgansafectats,comparteixenmoltssímptomes

inespecífics,comarafatiga,debilitat,lapèrduadepesidelagana.

Lesamiloïdosislocalssónlesanomenadesmalaltiesneurodegenerativesjaquees

localitzenalcervellicausendesordresdegeneratiusprogressius,comperexemplel’AD,el

Parkinson o la malaltia de Huntington. A diferència de les sistèmiques, la proteïna

patogènicaéssintetitzada idipositadaa lamateixaregió, ielsagregatsamiloidespoden

serintra‐oextracel·lulars.

Un aspecte important que diferencia l’amiloïdosi sistèmica de la local és que la

proteïna amiloidogènica sempre és sintetitzada per cèl·lules especialitzades en síntesi i

secreciódegransquantitatsdeproteïnaalplasmasanguini,comperexemplelescèl·lules

plasmàtiquesenelcasdel’Amiloïdosidecadenalleugera(AL),oelshepatòcitsenelcasde

laPolineuropatiaamiloidefamiliar(FAP).Cadatipusdecèl·lulasecretoratéelseupropi

mecanisme per actuar sobre proteïnesmal plegades, l’UPR (UnfoldedProteinResponse),

produeixenxaperonesielementsdelproteosoma.Amés,elreticleendoplasmàticjugaun

papercrucialenelcorrecteplegamentdelesproteïnessintetitzadesperaquestescèl·lules

(vanAnken,Braakman2005).Lasobreexpressiódeproteïnapotarribarasaturaraquests

sistemesdereparació,acumulantprecursorsamiloidogènics.Enlesamiloïdosislocals,en

canvi, les neurones produeixen proteïnes depenent de les seves necessitats funcionals,

pèptidsoproteïnesdecurtadurada, iquenorequereixendemecanismesdecontrolde


28

plegament.Podriaentendre’squel’agregacióintracel·lularésunmecanismecompensatori

delesneuronesperaïllarelspèptidsmalplegatsinoeliminats.

Taula I. 1. Exemples demalalties humanes amiloidogèniques o amiloïdosi.Malgrat que esdevenen a

partir de proteïnes precursores, amb característiques físico‐químiques i un plegament natiu diferent, totes

ellesdonenllocalaformaciódedipòsitsamiloidesextraointracel·lulars.Depenentdelllocdesíntesiiellloc

dedeposicióamiloidedelaproteïnaprecursora,esdiferencienenamiloïdosissistèmiquesolocals,aquestes

últimessónrelacionadesambprocessosneurodegeneratius.TaulaadaptadadeChiti,F.&Dobson,C.M.(2006).

Amiloïdosi Proteïna precursora

Causa Òrgans afectats

Amiloïdosis Sistèmiques

Amiloïdosi de cadena lleugera (AL) Cadena lleugera

d’Ig Mutació o

sobreproducció Cor, ronyó, fetge

Amiloïdosi de cadena lleugera (AH) Cadena pesada d’Ig Associada a Mieloma Ronyó, fetge

Amiloïdosi senil sistèmica (SSA) Transtiretina (TTR) Acumulació Cor, vasos

sanguinis, teixits tous

Polineuropatia amiloidòtica familiar (FAP)

Transtiretina (TTR) Mutació hereditària

Cor, ronyó, SNC

Amiloïdosi secundària (ΑA) Proteïna amiloide A

del sèrum Sobreproducció

Ronyó, fetge, melsa

Amiloïdosi relacionada amb diàlisi (Aβ2M)

Microglobulina‐β2 Diàlisi crònica Articulacions, cor, intestí, pulmó

Amiloïdosi del lisozim (ALys) Lisozim Mutació Hereditària Ronyó, fetge,

melsa

Apo AI amiloïdosi (AApo AI) Fragment d’Apo AI Mutació Hereditària Ronyó, cor,

fetge Apo AII amiloïdosi (AApo AII) Fragment d’Apo AII Mutació Hereditària Fetge

Apo AIV amiloïdosi (AApo AIV) Fragment d’Apo

AIV Mutació Hereditària Fetge

Amiloïdosi del fibrinogen Cadena‐α del fibrinogen

Mutació Hereditària Fetge

Amiloïdosi de la cistatina Cistatina‐ C Mutació Hereditària Capil∙lars sanguinis

Cataractes γ‐Cristal∙lina

Amiloïdosis Locals o Neurodegeneratives

Malaltia d’AD Pèptid Aβ (1‐40, 1‐

42) Errors en processos

proteolítics SNC

Malaltia del Parkinson α‐Sinucleïna SNC Malaltia de Huntington Huntingtina Mutació Genètica SNC Amiloïdosi familiar Transtiretina (TTR) Mutació Hereditària SNC Atàxia espinocerebel∙lar Ataxina‐3 Mutació Genètica SNC

Síndrome de Creutzfeldt‐Jacob Proteïna priònica

(PrP)

Propagació de canvis conformacionals no

natius SNC


29

Lesamiloïdosissóncomplicadesd’estudiaridiagnosticarjaquesovintinvolucren

diferentsòrgans,enelcasdelessistèmiques,ialgunssímptomespodenpassarfàcilment

desapercebuts o no diagnòstics fins ja avançada la patologia. En els darrers anys, s’ha

avançatmoltenl’estudidelsmecanismesmolecularspatogènics,deformaques’hapogut

millorartanteldiagnòsticprecoç,comelstractamentsterapèutics,obtenintunpronòstic

mésfavorableperalspacientsdemoltesamiloïdosis.Totiaixò,malgratlesnovesteràpies

emergents i esperançadores, sobretot en el camp de la immunoteràpia, encara cal

aprofundirenmoltsaspectesd’aquestesmalalties.Caldriabuscarunavisiómésglobalque

destapi nous mecanismes interconnectats tan a nivell local i molecular, com fisiològic,

ambientalment,finsitotemocionaldelpacient,pertald’assolirelnivelldecomplexitatde

l’organismehumàidel’amiloïdosi,iaixíaspirar,enunfutur,aunstractamentscuratiusi

ambunsefectessecundaris, sien tenen,queno limitin l’esperançani laqualitatdevida

delspacientstractats.

3.1. Malaltiad’Alzheimer.

Lamalaltiad’Alzheimer(AD)vaserdescritaperprimercopl’any1906pelmetge

alemany Alois Alzheimer i, actualment és la malaltia neurodegenerativa més comuna

mundialment,afectantamésde35milionsdepersonesatotelmón,irepresentantel70

%delcasosdedemència.Segonsl’InformeMundialsobrel’AD,s’esperaqueenelspropers

40 anys augmentin els casos dràsticament, sobretot en els països en desenvolupament,

arribant als 115milions el 2050 (Wimo, Prince 2010). Amb la excepció dels pocs casos

d’AD familiar detectats en individus menors de 60 anys, la prevalença de la malaltia

augmentaambl’edat,afectantal40%delapoblaciómajorde85anys.Peraquestesraons,

actualmentl’estudidelADesdevéunanecessitatprimordial,juntamentambelcàncer.

L’ADconsisteixenundesordreneurodegeneratiuiprogressiuqueescaracteritza

per la pèrdua de memòria i capacitats cognitives (Figura I. 11‐A). A nivell anatòmic,

s’observaunaimportantatròfiacerebral i, fisiològicament,esrelacionaamblapresència

d’agregats insolubles extracel·lulars (les fibres amiloides) i intracel·lulars (els cabdells

neurofibril·lars), formats majoritàriament pel pèptid Aβ1‐42 i la proteïna Tau

hiperfosforil·lada,respectivament(FiguraI.11‐B)(Solomon2006).Lapatologiadel’ADés

complexa i segueixunmecanismequeencara,avuiendia,estàperdefinir.Tot i això, la

granquantitatd’estudisrealitzatsfinsarafanevidentquel’agregaciódelpèptid‐Aβésel

procés desencadenant de deposició amiloide i la progressiva neurodegeneració (Arbel,

Solomon2007).


30

Figura I. 11. Reducció d’activitat cerebral i depòsits fibril·lars en l’AD. A) Imatges adquirides per

tomografiad’emissiód’electrons(PiB‐PET).Laimatgedel’esquerracorresponauncervellsa,mentrequeel

deladretaauncervellafectatd’AD.Lesàreesblavesinegresalaimatgedeladretaindiquenunareduccióde

l’activitatcerebraldegutalamalaltia.B)Imatgesobtingudespermicroscòpiaelectrònicadeplaquesamiloides

icabdellesneurofibril·larspresentsalcervelldepacientsd’AD.Imatgesextretesdecoloradodementia.org.

3.1.1. Proteïnaprecursoraamiloide,APP.

ElpèptidAβ resultadelprocessamentproteolíticde laproteïnaAPP, laproteïna

precursora amiloide. L’APP és una glicoproteïna de membrana, de 695‐770 residus,

depenent del procés de modificació post‐transcripcional que pateix abans de la seva

síntesi,iactuacomareceptortantencèl·lulesneuronalscomnoneuronals.Elseuextrem

C‐terminal es troba en el citoplasma, mentre que l’extrem N‐terminal es localitza cap

l’exteriorcel·lular.Lasevafuncióbiològicasegueixdesconeguda,totiqueescreuquepot

estar relacionada amb l’adhesió cel·lular, la plasticitat neuronal, així com també la de

sensordeconcentraciódecolesterolalescèl·lulesneuronals(Beeletal.2008).

L’APPesprocessadaespecíficamentpelsenzimsanomenatssecretases.Tal icom

mostralafiguraI.12,depenentdel’acciódelstrestipusdesecretases(α,βiγ),existeixen

duesviesdeprocessament(Haass,Selkoe2007):


31

‐ Via no amiloidogènica. En condicions normals, i la més freqüent, l’α‐secretasa

alliberael fragmentextracel·lularsolublesAPPα.Posteriorment, laγ‐secretasa(o

PSEN)processalapartencaraintegradaalamembrana,alliberantelpèptidP3iel

dominiAICD(APPIntracellularC‐terminalDomain)capalcitosol.

‐ Viaamiloidogènica.Encondicionspatològiques,enllocdel’α‐secretasa,actualaβ‐

secretasa, generant el fragment extracel·lular sAPPβ. Llavors, el tall de la γ‐

secretasageneraelpèptidAβieldominiAICD.

El llocdetallde laγ‐secretasaésvariable, ipotdonar‐sedesprésdelaminoàcids

38,40i42,generantpèptidsdediferentgrandàriaihidrofobicitat.Aquestpuntdetallés

especialmentrellevantperalasubseqüenttendènciaal’agregaciódelpèptidAβ,sentl’1‐

42elmésamiloidogènic.

FiguraI.12.TallproteolíticdelaproteïnaAPPiformaciódelpèptidAβ.L’APPéslaproteïnaprecursora

del pèptid amiloide.Depenent de l’acció de proteases específiques, la seva proteòlisis donarà lloc a la via

amiloidogènica.L’accióde l’α‐secretasaevita la formaciódelpèptidamiloide,alliberantelpèptidP3 iAICD,

mentre que quan l’APP és tallada per la β‐secretasa, i posteriorment per la γ‐secretasa, s’allibera a l’espai

extracel·lularelpèptidAβ.FiguraadaptadadeSaraceno,C.(2013).

Mutacions hereditàries en els gens APP i PSEN, són les responsables de l’AD

familiar. És interessant citar que el gen APP es troba al cromosoma 21, fet que explica

perquèelsindividusambSíndromedeDownmanifestenADdemaneraprecoç.


32

Deformanatural,enellíquidcerebroespinalhumàienelplasmad’individussans,

hisónpresentsanticossoscontraelpèptidAβ39‐42,elsnivellsdelsquals,però,esredueixen

significativament en pacients d’AD, suggerint que la patologia pot tenir una base

immunodeficient(Solomon2009).

3.1.2. Hipòtesidelacascadaamiloide.

Lahipòtesimésacceptadaactualmentéslacascadaamiloide(FiguraI.13),laqual

s’inicia amb una sobreexpressió del pèptid Aβ, sobretot la forma Aβ1‐42, on la seva

incapacitat d’eliminar‐lo, donaria lloc a l’auto‐associació progressiva en espècies

oligomèriques,provocantl’incrementdelarespostainflamatòriaidelefectedegeneratiu

sobre les cèl·lules neuronals, i la deposició final en formade fibres amiloides i cabdells

neurofibril·larscaracterísticsdelademència(Solomon2006,Haass,Selkoe2007).

Recentment,s’hadefinitunanovavisiódelaetiopatologiadel’AD,laqualintegra

lacascadaamiloidedinsdelques’enténperciclededeposicióamiloide(FiguraI.13), ja

queperelquepodríemdirretroalimentació,l’agregaciódelpèptid‐Aβestimulalaresposta

inflamatòria, i aquesta estimula l’agregació del pèptid‐Aβ. Aquesta nova visió vincula

fortament l’agregació amiloide amb les forces que desencadenen la demència (Herrup

2010,Stefani2012).

Igual que per la gran majoria de malalties amiloidogèniques, anys enrere

s’assumienelsagregats insolublesd’Aβcomelscausantsdelapèrduadesinapsis imort

cel·lular,jaquecreavenunabarrerafísicaalvoltantdelescèl·lules,bloquejantl’intercanvi

denutrients,iatraientelsmacròfags(Lorenzo,Yankner1994).Undelprimersindicisque

posava en qüestió la toxicitat de les fibres amiloides va ser la localització, al còrtex

cerebral, d’espècies monomèriques, dimèriques i trímers d’Aβ, tan solubles com

insolubles,ilafortacorrelacióentrelesformessolublesiladensitatdeplaquesamiloidesi

de cabells neurofibril·lars (McLean et al. 1999). Més tard, es van separar les diferents

espèciesdepèptid,monòmerioligòmer(dímeritrímer),iesvaninjectararatolinsmodel

d’AD (Lorenzo, Yankner 1994,McLean et al. 1999,Dodart et al. 2002). Es vademostrar

queelsdèficitscognitiusestrobendirectamentrelacionatsamblaconcentraciód’espècies

oligomèriquessolublesdelpèptidAβ,noamblesmonomèriquesniamblesfibril·lars,tali

coms’haviapensatfinselmoment(Dodartetal.2002).


33

Figura I.13.Esquemade lahipòtesisde lacascadaamiloideacobladaalciclededeposicióamiloide.

Tan la l’AD familiar com l’esporàdic donen lloc a la sobreproducció del pèptid Aβ, un cop aquesta espècie

tòxicacomençaaagregar,esdesencadenalacascadadeprocessosqueprodueixenelssímptomesbiològicsi

neurològics del AD. L’activació de la resposta inflamatòria forma part del cicle de deposició amiloide, i

connecta tots dos processos. Tot i que són processos independents, el l’AD es troben connectats i

retroalimentatspositivament.FiguraadaptadadeHerrup,K.(2010).

3.1.3. Immunoteràpiacontral’Aβ.

Finsavuiendiaiencarasegueix,s’haninvestigatmoltesestratègiesdetractament

contra l’AD, com ara, la inhibició dels enzims β i γ‐secretases, la reducció d’agregat

amiloide, l’ús de pèptids trencadors de l’estructura en fulla‐β (β‐breakers), l’alliberació

d’Aβdelcervelloladisminuciódelainflamacióassociadaalsdepòsitsd’Aβ(Schenk2002).

Peròsemblaa serque la immunoteràpiaés l’estratègiamésesperançadora i laqueestà

guanyantmésforçaenelsdarrersanys,detalmanera,quevariesvacunesambanticossos

monoclonalshanarribatfinsafasesclíniquesavançades.

Laprimerademostracióinvivodequelaimmunoteràpiaanti‐Aeraefectivaesva

realitzarenratolinstransgènicsPDAPP,el1999.Laimmunitzacióactiva,administrantel


34

pèptid A, reduïa dràsticament la deposició en còrtex i hipocamp, les dues regions

principalsd’acumulaciódelpèptid(Schenketal.1999).

Pel que fa a la immunització passiva, l’administració d’anticossos monoclonals

(mAb) específics contra l’Aβ, en absència d’activació de la resposta cel·lular, també

reverteix la pèrdua dememòria en ratolins PDAPP. En aquest cas però, l’anticòs uneix

específicamentelpèptidAβsoluble,enllocdel’agregatinsoluble.Amés,nonomésuneix

Aβcerebral, sinóque tambéreconeixAβsolubleenplasma i, anivellsmésbaixos,enel

líquidcerebroespinald’animalsimmunitzats(Mohajerietal.2002).

Després dels resultats obtinguts en ratolinsmodel, es va prosseguir a iniciar les

fasesclíniquesenhumans.Totilesbonesexpectatives,laprovad’immunitzacióactivaAN‐

1792 (Ellan Phamaceuticals) va ser parada l’any 2002 en fase clínica IIa degut als

símptomes de meningoencefalitis asèptica en el 6 % dels casos (Nicoll et al. 2003).

L’anàlisipost‐mortem, però, va demostrar la reducció de fibres amiloides al cervell dels

pacients (Schenk 2002,Hock et al. 2003). A part de lameningoencefalitis, un altre dels

efectes secundaris d’administrar l’mAb sencer, és que agreuja la angiopatia amiloide

cerebral (CAA), un trastorn dels vasos sanguinis del SNC caracteritzada pel depòsit de

materialβ‐amiloidesobrelesparetsdelsvasos(Pfeiferetal.2002).Apartdequelaregió

constant (Fc) de l’anticòs podria ser la responsable d’activar la resposta complement

donantllocalaneuroinflamacióimicrohemorràgia,elcoadjuvantutilitzatalassaignoera

elmésadient.

Desprésdenombrososestudisperaprevenirels efectes secundarisnodesitjats,

lesprovesclíniquesqueméshanavançatsónlesdelavacunaACC‐001,queconsisteixen

underivatdelpèptidAβ,ilesdelanticòsAAB‐001,oBapineuzumab,unanticòsmAbmurí

dirigitcontraelsresidus1‐5del’extremN‐terminaldelpèptidAβ(mAb‐h3D6),elqualés

específicdelsoligòmersd’Aβ (Jacobsen2006,Wisniewski,Konietzko2008,Nitsch,Hock

2008). Malgrat les grans expectatives, aquest últim tractament ha estat aturat en fase

clínica III, degut a resultats inesperats (Thomas 2012). En fase clínica II, els efectes

adversosdelBapineuzumabhanestatlleusitransitoris,peròhancausatedemavasogènic

(Rinneetal.2010).Aquestefectes’harelacionatambladosidefàrmac, i lamajoriadels

casoscorresponienaportadorsdell’al·lelAPOE4.Desafortunadament,lesrestriccionsde

dosi i el reclutamentde pacients amb l’al·lelAPOE3 nohan estat suficientsper a seguir

amblafaseIII(Thomas2012).Calmencionarqueaquestesproveshanestatrealitzadesen

pacients amb un diagnòstic de lamalaltiamassa avançat, tal i com reivindica la revista

WorldADReport2011(Prince,Bryce&Ferri2011).


35

3.1.3.1. Fragmentsrecombinantsderivatsd’anticossos,scFv.

Actualment, la immunitzaciópassivaamb fragmentsvariablesde cadena senzilla

(single‐chainvariableFragment,scFv),ésadir,anticossosmancatsdelaregióFc(FiguraI.

14), resulta serunaestratègia terapèuticamolt esperançadoraper a lamalaltiad’AD, ja

quenoactivenlamicròglia,noprodueixenhemorràgiacerebral,niedemavasogènic,ihan

mostrat ser tanpotents i específicscomelsmAbdelsqualderiven (Fukuchiet al.2006,

Zameeretal.2008,Robertetal.2009).

Els fragmentd’unióa l’antigend’Ig(Fab,antigen‐bindingFragment), tambéestan

agafantforçacomapossibleimmunoteràpiacontral’AD(FiguraI.14).Encomparacióamb

elsscFv,tenenunamenoreficiènciad’expressióenE.colidegutaquetenendobledepes

moleculariquelesduescadenespolipeptídiquesestrobenunidesperunpontdisulfur,fet

quedificultaelseuplegamentcapal’estatnatiu.Amés,tenentendènciaaformarhomo‐

dímers entre les cadenes lleugeres (LC), coneguts coma proteïnes Bence‐Jones.Malgrat

això,elsFab,presentenunamajorestabilitatiafinitatqueelsscFv,quetendeixenaformar

agregatsisónrelativamentinestablesallargtermini(Hustetal.2007).

FiguraI.14.Esquemadelsdominisd’IgivariantsrecombinantsS’hirepresentaunanticòssencer(IgG),el

fragmentd’unióal’antigen(Fab)ielfragmentvariabledecadenasenzilla(scFv).CH,cadenaconstantipesada;

CL,cadenaconstantilleugera;VH,cadenavariableipesada;VL,cadenavariableilleugera.Imatgeextretade

www.aapsj.org.

L’estratègiadelsscFvhaagafatforçaaldemostrarquelapartFcdel’anticòsnoés

necessàriaquanladianaantigènicasónelsoligòmersd’Aβsolubles.Amés,mostrenmajor

afinitatperalsoligòmersd’Aβ1‐42,isóncapaçosd’inhibirtotalmentl’agregaciódel’Aβ1‐42


36

(Figura I. 15‐A). Amés, tenen capacitat de desfer, almenys fins lameitat, la càrrega de

fibres ja formades (Figura I. 15‐B), entenent que l’scFv també seria específic per als

agregatsinicialsencarasolubles(Bacskaietal.2002,Zameeretal.2008).

Figura I. 15. Cinètica d’agregació del pèptid Aβ1‐42. La cinètica ha estat mesurada per intensitat de

fluorescènciadelfluoròforThT(excitacióa450nmiemissióa482nm),enpresenciaoabsènciadel’scFv‐A4.

A)Co‐incubacióAβ1‐42+scFv‐A4.B)Efectedel’scFvenmostrapre‐agregada.AdaptadadeZameer,A.(2008).

Enresum, lesprincipalsavantatgesdels fragmentd’anticossosscFvcoma futura

estratègiaterapèuticacontral’ADsón,entred'altres:

‐ Lamancade la regióFc evita l’activacióde la resposta inflamatòriaque esdóna

ambelsanticossossencers.

‐ Mantenenunaafinitatperalantigenequiparablealsanticossossencers.

‐ Els gens dels scFv poden ser manipulats de forma racional per a millorar

l’especificitatiafinitatperalsoligòmerssolublesd’Aβ.

‐ Sónmoltmés petits que els anticossos convencionals i, a banda demostrar una

millorfarmacocinètica,podensermodificatsperafacilitarelseupasperlabarrera

hematoencefàlica,obé,serinternalitzatsennanopartículescapacesdesuperar‐la

(Gomez,DiMauro2012).


37

3.2. AmiloïdosisdeCadenaLleugera.

L’amiloïdosi de cadena lleugera (AL) és una de les amiloïdosis sistèmiques

humanes més complexes, on la proteïna precursora és la cadena lleugera (LC)

d’immunoglobulines(Ig).L’ALésl’amiloïdosisistèmicaméscomunaenelmónoccidental,

ambunaincidènciade10pacientspermilióperany.Lamajoriad’afectatssónmajorsde

45anysi lamitjaestrobaal’edatde67anys,ambunamitjanadesupervivènciad’entre

12‐40mesosdesprésdeserdiagnosticada(Blancas‐Mejia,Ramirez‐Alvarado2013).

Figura I. 16. Amiloïdosi de cadena lleugera (AL). Les cèl·lules plasmàtiques són les encarregades de

secretaralplasmatetràmersd’immunoglobulines(Igs)formatsperduescadenespesades(HC)iduescadenes

lleugeres(LC)idèntiquesunidesperpontsdisulfur.Encondicionspatològiques,esdónaunasecrecióaberrant

decadeneslleugeres(LC),perpartdecèl·lulesplasmàtiques,donantllocaladeposiciódedímersdeLCsen

òrgansvitals.FiguraadaptadadeBlancas‐Mejía,L.M.&Ramírez‐Alvarado,M.(2013).


38

L’ALés causadaperunaanormalproliferacióde cèl·lulesplasmàtiquesmonoclonalsdel

mollde l’os,quealliberenunagranquantitatdeLCs lliuresencirculació,sovint formant

dímers de LCs (proteïnes Bence‐Jones). A diferència de l’AH (amiloïdosi de cadena

pesada), no existeix una evident relació amb processos tumorals com ara el mieloma

múltiple. Aquestes cadenes agreguen formant fibres amiloides a l’espai extracel·lular de

diferents òrgans, sobretot ronyons, cor, fetge, tracte gastrointestinal i nervis perifèrics,

provocant la seva fallida (Figura I. 16). Els tractaments actuals específics contra

l’amiloïdosi ALno són curatius (Ramirez‐Alvarado2012). La presència de LCs lliures al

sèrumi/oorinaésfreqüentenindividusmajorsde50anys,peròtansolsunbaixnombre

desencadenaràl’AL.Ladeposicióamiloideésconseqüènciadelespropietatsestructuralsi

biofísiques de la proteïna amiloidogènica i de l’entorn fisiològic del teixit implicat

(Ramírez‐Alvarado,Kelly&Dobson2010)

3.2.1. VariabilitatdeseqüènciadelesLCiamiloidogènesi.

Lagranvariabilitatdeseqüènciade lesLCss’obtéper recombinacióaleatòriade

fragmentsdegensgerminalsd’Ig:elsgensIgV,IgJiIgC,iperhipermutacionssomàtiques,

conservades i no‐conservades, que milloren l’afinitat per l’antigen. En funció de la

recombinació d’aquests gens, existeixen dos tipus de LCs: кLCs i λLCs. Estudis

comparatius,revelenquelesseqüènciesgerminalsκI,λ1,λII,λIII, iλVI(especialmentles

línies κI O18/O8 i λVIa) es troben més representades en pacients d’amiloïdosi AL,

contenen més mutacions no conservatives i són intrínsecament més propenses a

l’agregacióquelesseqüènciesd’LCsnormals(Comenzoetal.2001,Abrahametal.2003).

Lacombinaciódegensimutacionsfanquecadapacientd’ALpresentiunaúnicaseqüència

proteicaambdiferent tendènciaa formar fibresamiloides,queesdipositaranenòrgans

diferents, variant el rang de severitat de lamalaltia, fet que complica el diagnòstic i el

posteriortractament.(Ramirez‐Alvarado2012).

S’hanrealitzatmoltsestudisambl’objectiudetrobarpatronsdemutaciócomuns

entre el gran nombre de seqüències d’AL, així com característiques estructurals que

impliquin més o menys tendència amiloidogènica (Stevens 2000). Tot i ser molt útil,

l’anàlisideseqüèncianoresultasuficient.UnexempleserialaproteïnaJto,depacientde

mielomamúltiple, que conté una seqüència quasi idèntica a la proteïnaWil, de pacient

d’AL. Totes dues deriven de la mateixa línia germinal λVI, però la primera no causa

disfuncióorgànicaniagregatsamiloides,talicomhofalaamiloidogènicaWil(Walletal.

1999).


39

Sembla a ser que, enlloc del nombre de mutacions, seria la seva localització

respecte la seqüència germinal i comafecten al plegament de laproteïna, el quepodria

ajudaraentendreelsdeterminantsamiloidogènicsiferpronòsticavançatdel’evolucióde

lamalaltia(Poshustaetal.2009).

3.2.2. EstabilitatiagregaciódelescadenesLC.

Per a les proteïnes en general, ha estat demostrat que no hi ha una correlació

directaentrelapèrduad’estabilitatiunamajortendènciaal’agregació(Cerda‐Costaetal.

2009). Tot i això, estudis inicials d’estabilitat termodinàmica de LC implicades en AL,

apuntencapaunacorrelacióentremutacionsnoconservades,desestabilitzaciódelestat

natiu iaugmentde lacapacitatamiloidogènica(Hurleetal.1994,Stevensetal.1995).A

més, totsells coincideixenenque lamajoriadeLCssegueixenuna transiciódeequilibri

plegat‐desplegatdedosestatsdepenentdenucleacióireversible,enlaques’acumulaun

intermediaricinèticparcialmentdesplegat,capaçdedesviarlaviadedesplegamentcapa

l’amiloide(Walletal.1999,Qinetal.2007,Blancas‐Mejiaetal.2009).

Aquestintermediaricinèticésconsideratelprecursordelaviaamiloide,jaqueés

capaç d’adoptar una estructura no nativa rica en fulla‐β, autoassociar‐se i, finalment,

formar fibres β‐amiloides. (Blancas‐Mejia, Ramirez‐Alvarado 2013). És interessant citar

queKhurana et al. van descriure la presència, depenent de les condicions, de dos tipus

d’intermediariscinèticsdiferents:l’intermediarinatiu(IN)queseriaprecursord’agregats

amorfs, i l’intermediari desplegat (IU) que promouria la via amiloide. Caldria però,

aprofundirmés en les cinètiquesde formació i d’equilibri conformacional d’aquestsdos

estats(Khuranaetal.2001).

És sabut que les fibres amiloides no es formen sota condicions que afavoreixen

l’estat natiu o el totalment desplegat. Això suggereix que, a condicions fisiològiques, és

necessariqueesdonin canvis conformacionalsde l’estatnatiuperpoderentrar a la via

amiloide(Blancas‐Mejiaetal.2009).Pertant,esdedueixquecertesmutacionssomàtiques

afectendirectamentalaconformaciónativadelaproteïna,iafavoreixenl’estabilitzaciódel

estatintermediari,fentquelaproteïnaadquireixiunaltpotencialamiloidogènic.

3.2.3. DeterminantsestructuralsdelesproteïnesLCsamiloidogèniques.

κI O18/O8 i λ6a són les dues línies germinalsmés abundants en pacients d’AL.

Totesduestendeixenintrínsecamentaformarfibresamiloidesipresentenunaestabilitat

termodinàmica semblant, tot i que la λ6a segueixuna cinèticade fibril·laciómés ràpida

quelaκIO18/O8(Blancas‐Mejia,Ramirez‐Alvarado2013).Encaracalenmésestudisper


40

explicar perquè aquestes dues línies germinals, i les proteïnesAL derivades d’elles, són

mésamiloidogèniquesqueleslíniesgerminalsd’Igdepacientssans.

Partintd’aquestatendèncianatural,aquestesduesproteïneshanestatcomparades

exhaustivament amb les seves corresponents proteïnes AL mutades, amb la finalitat

d’entendrelacontribuciód’unaúnicamutacióenl’estructurail’estabilitattermodinàmica

delaproteïnaielperquèaquestesestrobenmésdesestabilitzadesrespectelagerminal.

Les proteïnes amiloidogèniques AL‐09, AL‐12 i AL‐103 (amb 7, 8 i 4mutacions,

respectivament), comparteixenmésd’un90%d’identitatamb lasevaproteïnagerminal,

κI O18/O8, i totes adopten el plegament canònic de les Igs (Figura I. 17). Tot i això, la

proteïnagerminaléstermodinàmicamentmésestableisegueixunacinèticadefibril·lació

méslentaquelesamiloidogèniques(Badenetal.2008b,Sikkink,Ramirez‐Alvarado2008,

Randlesetal.2009).DelamateixamanerasucceeixamblalíniagerminalλVIailaproteïna

Wil,queenderivad’aquestaipresenta11mutacionssomàtiques(delPozoYauneretal.

2008).

Dinsdelheterotetràmerd’Igsambunplegamentcorrecte,eldominiVLieldomini

VH es trobenunitsno‐covalentment formantuna interfíciedimèrica ambuna estructura

terciària i quaternària molt conservada. En el cas d’AL, el 85% del pacients amb AL

secretendímersdeLCslliuresenelplasma(proteïnesBence‐Jones),onelsdominisVL‐VL

s’associenformant lamateixainterfíciequeelsdímersVL‐VHd’Ig(Novotny,Haber1985).

Pertant,l’estudid’aquestsdominisvariablesilasevaconformaciódimèricaésnecessària.

Figura I.17.AlineamentmúltiplededominisVL amiloidogènics i la seva línia germinal κIO18/O8.

L’alineamentmúltiplerespectelalíniagerminalκIO18/O8mostraladiversitatdemutacionssomàtiquesdins

delesseqüències.AL‐12conté8mutacions,delesquals7nosónconservatives,mentrequel’AL‐103conté4i

totesnoconservades,inclosalainserciódelaprolina95ProIns.L’AL‐09conté7mutacions,3delesqualsno

sónconservatives.GranpartdelesmutacionseslocalitzenalCDR1iCDR3,iregionsFR.Totesellessegueixen

lanomenclaturaKabat(Kabat1983).Sindicafulla‐β.


41

3.2.3.1. InterfíciedelsdímersVL‐VLiamiloidogènesi.

Els dominis VL d’Igs adopten un plegament de tipus barril‐β, format per nou

cadenes (A,B,C,C’,C’’,D,E,F, iG)empaquetadesendues fulles‐β iunidesperunpont

disulfur, deixant enterrat el nucli hidrofòbic. Les cadenes B‐C, C’‐C’’ i F‐G estan

connectadespels loops CRD,quees trobenexposatsa la superfíciedeldomini (Figura I.

18).

FiguraI.18.Estructurad’immunoglobulinesidominisVL.A)Estructuraderaigs‐Xdel’anticòsк‐IgG[codi

PDB1IGT].Duescadenespesades(verd)iduescadeneslleugeres(groc)s’associenformantl’heterotetràmer.

B)Estructuradelacadenalleugerasencera(LC),taneldominiCL(vermell)comeldominiVL(groc)presenten

el plegament característic d’Igs. C) Alineament estructural de les estructures cristal·lines de les línies

germinals amiloidogèniques λVL 6aJL2 (groc) i κVL κ1 O18/O8JK2 (vermell) [codi PDB 2W0K i 2Q20,

respectivament].LesregionsFRmostrenunaestructurasimilar,mentrequelesregionsCDRs(blau)mostren

diferènciessignificantsdegutal’elevadavariabilitatdeseqüència.TotesdueslíniescontenenelresiduTrp35

conservat (barresnegres), ies localitzamoltproperalpontdisulfur típicdelsdominisd’Igs (barresgrises).

FiguraadaptadadeBlancas‐Mejía,L.M.&Ramírez‐Alvarado,M.(2013).

Estudis demodelatge estructural amb seqüències VL de pacients d’AL, realitzats

perRamírez‐Alvaradoicol·laboradors,reportenquelamajoriademutacionseslocalitzen

en la interfíciedimèrica (cadenes‐βC, F iG), sobretotmutacions cap residusd’histidina

(Poshustaetal.2009,Petersonetal.2010).


42

En aquest sentit, la proteïna germinal κIO18/O8 cristal·litza en formadedímer

canònicmentrequelaproteïnaamiloidogènicaAL‐09,ambtresmutacionsnoconservades

dins o properes a la interfície, adopta una estructura de dímer alterat, ambuna rotació

entredominisde90°respectelagerminal(FiguraI.19‐A,B)(Badenetal.2008a).Elresidu

Tyr87 es troba conservat en més del 95% de les seqüències germinals λ i к. La seva

mutaciórestaurativa,capalresiduconservatdelaseqüènciagerminalenaquestaposició

(AL‐09H87Y),mostra que aquest únic canvi estabilitza la proteïna, retarda la formació

amiloideirecuperalaconformacióperapoderadoptarlainteracciódimèricacanònicade

κIO18/O8.

Figura I.19.Diferenciesen la interfíciedimèricaentreeldímerd’AL‐09 ide κIO18/O8.L’estructura

cristal·linadeldímerVL‐VLdelaproteïnagerminalκIO18/O8(a)adoptalainterfíciedimèricacanònicad’Igs,

mentrequelaproteïnaamiloidogènicaAL‐09mostraunainterfíciedimèricarotada90°Crespectelagerminal.

FiguraadaptadadeBaden,E.M.(2008).

Un altre exemple d’alteració de la interfície de dímers VL‐VL és la proteïna LEN,

implicada en mieloma múltiple. La proteïna LEN, amb dues mutacions puntuals, forma

dímers rotats 180° respecte la seva proteïna nativa degut a canvis electrostàtics en la

interfície (Pokkuluri et al. 1998). Resultats similars han obtingutDel PozoYauner et al.

comparantlaproteïnagerminalλ6aambelmutantpuntualλ6aR25G(delPozoYauneret

al. 2008). Sembla a ser que les cadenes LCs monomèriques interaccionen entre elles

adoptant diferents conformacions dimèriques, convertibles entre elles. Per fluctuacions

conformacionalsadopten la interfíciemés favorableenergèticament, ja sigui la interfície

canònica o alterada (Figura I. 20). Els residus situats a la interfície determinen quina

d’elles és més favorables, o si varies interfícies poden existir al mateix temps ja que

presentenunpanoramaenergèticsemblant(Petersonetal.2010).Pertant,determinades

mutacions en la interfície dimèrica estabilitzen dímers no canònic, fet que pot estar

relacionatambpotenciarl’amiloïdosi.


43

Figura I. 20. Promiscuïtat de la interfície dimèrica dels dominis VL amiloidogènics. Les mutacions

somàtiquesalsresidus34i87generenquatrepossiblesconformacionsdelainterfíciedimèrica.A)Malgratla

febleKd,lamutaciórecíprocaeneldominiκIO18/O8Y87Hpoblatansolsunaúnicaconformaciórotada180°

respectelacanònica.B)LainterfícieN34/Y87delalíniagerminalκIO18/O8permetmúltiplesconformacions,

onlacanònicaésmésfavorablequelesaltres(groc).C)EldominiamiloidogènicAL‐09(interfícieN34/H87)

també presenta diferents conformacions, sent favorable la rotada 90 ° respecte la canònica. D) Lamutació

restaurativadeAL‐09H87Y recupera la conformació canònicade la interfíciedimèrica.Figuraadaptadade

Peterson,F.C.(2010).

Pel que fa a cinètiques de fibril·lació, no existeix una clara correlació entre la

promiscuïtat a un tipus de interfície dimèrica i una major tendència amiloide. Tot fa

pensarquelescadenesLCsamiloidogèniquesadquireixenunaestructuradedímeralterat

exposant regions més propenses a l’agregació. Seria necessari estudiar els residus que

formenpartdenuclihidrofòbicdelesfibresd’ALperdeterminarquinscontactessónmés

amiloidogènics(Petersonetal.2010).

3.2.4. Futuresestratègiesterapèutiques.

Actualment,els tractamentscontra l’ALnosóncuratius (Blancas‐Mejia,Ramirez‐

Alvarado2013).Undiagnòsticacurat,determinarquinsòrgansestrobenafectats,ielrisc

associat a les diferents modalitats de tractament, és el primer pas per a poder fer un

tractamentadequatdelamalaltia.L’objectiudelstractamentscontral’amiloïdosid’ALés

aconseguirreduir laconcentraciódeLC lliureencirculació; sinoéscompletament, siel

mínimperaturarlaprogressiódelamalaltiaimillorarlafuncionalitatorgànica(Ramírez‐

Alvarado,Kelly&Dobson2010).

Els tractaments que es duen a terme inclouen la quimioteràpia i l’auto‐

trasplantament de cèl·lules mare, dirigits contra la població de cèl·lules plasmàtiques


44

malignesdelmollde l’os, secretoresenexcésde lesLCs lliures.Tot iqueresulten força

eficaços,partdelspacientsd’ALmostrenintolerànciaidesencadenendisfuncióorgànica.

Totieltractamentactual,laimmunoteràpiacadacopestàagafantmésforçacoma

futuraestratègiaenlesmalaltiesamiloidogèniquesengeneral.Pelquefaal’AL,jahaestat

desenvolupada i avaluada, en ratolins model de l’AL, l’eficàcia terapèutica del anticòs

monoclonal murí mAB‐11‐1F4, que reconeix específicament les fibres amiloides de LC,

disminueix la quantitat total dipositada i millora el funcionament dels òrgans afectats

(Solomon,Weiss &Wall 2003, O'Nuallain et al. 2007). Tot i ser un avanç terapèutic, el

tractament requereix combinar‐se amb la quimioteràpia o l’auto‐trasplantament per a

podereliminarlescèl·lulesplasmàtiquesmalignes.

Delamateixamaneraqueenl’ADilamajoriadelesmalaltiesamiloidogèniques,en

elsdarrersanyss’hademostratquel’estatmonomèricol’intermediarioligomèricsoluble

sónlaprincipalespèciecitotòxicaenl’AL,mésquelesfibresinsolubles.Pelquefaal’AL,

les cadenes LC solubles són internalitzades dins de les cèl·lules renals o cardíaques, de

forma que s’altera l’homeòstasi, l’estat redox de la cèl·lula, i s’incrementa les espècies

reactives d’oxigen (ROS) i l’estrès cel·lular. Amés, també s’ha observat un dèficit en la

contraccióirelaxaciódelscardiomiòcits(Brenneretal.2004,Trinkaus‐Randalletal.2005,

Sikkink,Ramirez‐Alvarado2010).Recentments’havistque,lesproteïnesLCsderivadesde

pacientsd’AL,indueixenapoptosidelescèl·lulesdecardiomiòcitsatravésdelaviap38‐

MAPK. El tractament per inhibir selectivament aquesta via atenua, significativament,

l’estrèsoxidatiu,ladisfunciócel·lularil’apoptosidesencadenadaperlescadenesLCs(Shi

etal.2010).

Malgratqueelstractamentsactualscontral’ALesbasenenlaquimioteràpiacontra

les cèl·lules plasmàtiques secretores de LCs, o bé, en mAb específics de les fibres

amiloides, les futures estratègies terapèutiques han d’anar enfocades cap al

reconeixement específic de les espècies solubles, segrestant‐les per evitar la seva

citotoxicitat i evitar la seva associació en fibres amiloides. Malauradament, la ciència

actual encaraes troba llunyd’un tractament terapèutic curatiu.Per a aconseguir‐ho, cal

entendremillor la correlacióentre fibrogènesis i estabilitat termodinàmicadelsdominis

VL, així com unamillor identificació de les espècies citotòxiques i el seumecanisme de

danycel·lularitissular.Amés,pocesconeixsobreelpaperquejugal’entorncel·lularenla

modulaciódelgraudedeposicióamiloideilasevaespecificitatdeteixit.

II‐Introducció InteractomaiMalaltiesHumanes

45

4. INTERACTOMAIMALALTIESHUMANES.

Les patologies humanes en general, entre elles l’amiloïdosi, tenen un origen i

segueixenunmecanismemolecularpatològicespecíficquelescaracteritza.Elseuestudia

nivell local i molecular és indispensable per tal d’esbrinar l’etiopatologia de cada una

d’elles. Però, és evident, que dins de la complexitat del organisme humà,molts són els

processosqueparticipenadesencadenarelgranventalldepatologieshumanesoaferque

aquestesprogressiniafectinnegativamentalconjuntdelsistemahumà.Apartdelpuntde

vistamolecular, tal i coms’hadescrit enel casde l’ADo l’AL, ésnecessari adquirir una

visiómés general de com aquestes patologies alteren el perfecte entramat biològic que

sosté i regulaelsprocessosbiològicsessencialsqueesdonendins lacèl·lula, comara la

divisió cel·lular, l’obtenció d’energia o la transducció de senyals. Aquest entramat és

conseqüència de múltiples interaccions entre un gran nombre de biomolècules que es

trobeninterconnectadesentresiformantxarxesd’interaccióointeractomes.Lescèl·lules

demamíferscontenen,aproximadament,1biliódemolèculesproteiques,delesqualsun

10%es troben implicades enprocessos de transducció de senyal. (Good, Zalatan&Lim

2011). Entendre com les proteïnes interaccionen entre elles i realitzen funcions dins la

cèl·lula,alhoraquesónaltamentreguladesimodulades,ésessencialperacomprendreel

funcionamentglobaldelacèl·lulai,apartird’aquí,traçarnovesviesbiologiesiaprofundir

enlesmalaltiesrelacionades,sovintestudiadesanivellmolecular,sensetenirencompte

la repercussióo l’origenque tenendins la xarxa cel·lular o interactoma.És emergent la

necessitatd’entendrelesdiferentspatologieshumanesanivelldexarxesinterconnectades

a diferents estrats (proteòmic, genòmic, ambiental...), un punt de vista actualment

nomenatcomadiseasome,enanglès(FiguraI.21).Ienaquestsentit,laproteòmicahijuga

unpapermoltimportant(Rainetal.2001,Goh,Choi2012).

4.1. Proteïneshubidominismodulars.

La característica principal dels mapes d’interacció proteïna‐proteïna és la

presència de grans nodes centrals (o hub proteins) que actuen com a plataformes

d’interaccióentreelsdiferentsmòdulsenelsqualsestàorganitzatelproteoma(Zhang,Xu

&Xiao2013).Lesproteïneshubnoacostumenapresentaractivitatenzimàticaespecífica,

sinóquesónelementscentralsalvoltantdelsqualss’organitzatotelproteomacel·lular,

regulant i connectant els processos biològics entre si, tan física com temporalment

(Uversky2013).Esdevenenproteïnesdesuport(oscaffold)quecoordinenl’assemblatgei

l’especificitat del flux d’informació intracel·lular (Good, Zalatan & Lim 2011). A més,

aquestes proteïnes es troben molt conservades evolutivament (Vallabhajosyula et al.


46

2009).UnexempledeproteïnadesuportserialaproteïnadellevatSte5olademamífer

KSR,essencialsenlaviadesenyalitzacióMAPK(Mitogen‐ActivatedProteinKinase)(Figura

I. 22‐B), o bé la proteïna post‐sinàptica PSD‐95 de la família de proteïnes MAGUK

(MembraneAssociatedGuanylateKinase)(FiguraI.22‐A).

Figura I. 21.Representació de l’organització del flux d’informació cel·lular . A) El domini PDZ de la

proteïnapost‐sinàpticaPSD‐95controlaelsreceptorsdeglutamatNMDAiAMPAdelasinapsisneuronal.B)

LesproteïnessuportSte5,enllevats,iKSR,enmamífer,controlenlaviadesenyalitzacióMAPKintracel·lular.

FiguraadaptadadeGood,M.C.(2011).

Lesproteïneshubsovintexhibeixen regionsdesestructuradesomodulables,ésa

dir,noadoptenunplegamenttridimensionaldeterminatenelespai,raóperlaqualseles

pot classificar com a proteïnes o regions intrínsecament desestructurades (IDPs,

IntrinsicallyDisorderedProteins),onl’estatnatiuésdesordenat,ambunagranplasticitati

adaptabilitatestructural,crucialsperadaptar‐sealadiversitatfuncionalnecessàriapera

participariregulardiferentsviesd’informacióbiològica.(Huse,Kuriyan2002,Dunkeret

al.2008).Tendeixenaunatransicióconstantordenat‐desordenatcomaresultatd’unir‐se

i separar‐se del seu lligand altament específic i amb una constant d’afinitatmolt baixa.

Així,lesIDPsfàcilmentpodenunir‐seadiferentsproteïnescanviantlamanerad’associar‐

seambcadaunad’elles(Good,Zalatan&Lim2011).


47

4.2. DominisPDZ.

Les proteïnes hub estan organitzades en varis dominis associats,

conformacionalment independents, i units entre ells per diferents tipus de connectors

(Good,Zalatan&Lim2011).

Aquests dominis modulars deixen accessible la superfície de unió a les seves

dianes específiques i reconeixen una regió o motiu estructural específic que els fa

característic.

ElsdominisPDZsónundelsmòdulsd’interaccióproteïna‐proteïnamésabundant

enmamífers(FiguraI.22).Enhumans,mésde250tipusdedominisPDZformenpartde

150proteïneshubdiferents,esdevenintelementsessencialsdins lesxarxesd’informació

cel·lular(Ivarsson2012).

FiguraI.22.ExempledeproteïnesmultidominiquecontenendominisPDZ.ElsdominisPDZsónundels

mòdulsmésabundantsenproteïneshubdemamífers,esdevenintelementsessencialsperalesxarxesdeflux

d’informaciócel·lular.

Elseunomprovédelestresprimeresproteïnesenlesquevanseridentificats,farà

més de 20 anys:Post SynapticDensity protein‐95 (PSD‐95),Disc Large tumor supressor

(DLG),iZonula‐Occludens‐1(ZO‐1).Totesellessónproteïnesqueorganitzenprocessosde

transducciódesenyal,adhesióitràficcel·lular(Zhang2013).

Els dominis PDZ reconeixen els extrems C‐terminals d’una gran varietat de

proteïnes.Prenenespecialimportànciaenelmantenimentdelapolaritzaciócel·lularien

processos de transducció de senyal a través de la membrana plasmàtica, com ara la


48

sinapsis (Sierralta, Mendoza 2004). I recentment, s’han descrit certs aspectes

conformacionalsd’aquestsdominisquepodrienestar implicatsen la regulaciódenoves

funcions. Com per exemple, el segon domini PDZ de la proteïna ZO (zònula occludens)

regulalal’adhesiócel·lularatravésdelasevadimerització(Umedaetal.2006,Wuetal.

2007),oeltercerdominiPDZdelaproteïnaPSD‐95,quemodulal’afinitatil’especificitat

de la butxaca d’unió des de regions distants de la molècula, a través d’interaccions

al·lostèriquesintra‐domini(Lockless,Ranganathan1999,Jemth,Gianni2007).

4.2.1. CaracteritzacióestructuraldelsdominisPDZ.

ElsdominisPDZsónproteïnesglobularsrelativamentpetites,d’aproximadament

90residus.L’estructuracanònicadelsPDZconsisteixenunbarril‐β,formatpercincosis

cadenes (β1‐β6), rodejat per dues hèlix‐α, l’α1 més curta que l’α2 (Figura I. 23). Dins

l’estructura,elsextremsNiC‐terminalessituenmoltpropersentreells,facilitantlaseva

inserciódins laproteïna, ioposatsa la conservadabutxacad’unióal lligand,unacavitat

situadaentre lacadena‐β2i l’hèlix‐α2(Lee,Zheng2010).Tot icompartirelmateixnucli

estructural, els dominis PDZ difereixen entre ells per a la variabilitat de les regions

estructurades en loop, i poden presentar estructures secundàries addicionals (Ivarsson

2012).

FiguraI.23.RepresentaciódelplegamentcanònicdelsdominisPDZ.A)DominiPTP‐BLPDZ2(codiPDB

1GM1).B)DominiPDZde laproteasaD1(codiPDB1FC7).C)DominiGRASP55PDZ1(codiPDB3RLE).Les

cadenes‐βsituadesenelsextremsN‐iC‐terminalsestrobenmarcadesenblauivermell,respectivament.

Inicialment,elsdominisPDZhanestatclassificatssegonslanaturalesadelsquatre

últims aminoàcids C‐terminals dels lligands que reconeixen (Songyang et al. 1997, Lee,

Zheng2010).LataulaI.2resumeixelstrestipusdeclassescanòniquesdelsdominisPDZ.


49

TaulaI.2.ClassificaciódedominisPDZenfunciódelasevaespecificitatd’unió.DepenentdelmotiuC‐

terminaldelslligandsespecíficsquereconeixenelsdominisPDZ,aquestshanestatclassificatsenclasseI,IIi

III.(Xrepresentaqualsevolaminoàcid,iɸtansolsresidushidrofòbics).

Motiu C‐terminal Exemple de domini PDZ

Classe I [X‐(S/T)‐X‐(V/I)COOH] PSD95‐PDZ3 Classe II [X‐Ф‐X‐ФCOOH] GRIPP1‐PDZ3 Classe III [X‐(D/E)‐X‐ФCOOH] nNOS‐PDZ

Aquestaclassificació,però,noexplicalagranheterogeneïtatselectivadelsdominis

PDZ per a reconèixer extrems C‐terminals. L’existència d’altresmecanismesmoleculars

necessarisperamodularl’afinitatil’especificitatd’aquestsdominis,comaralaregulació

al·lostèrica intra‐domini, complementarien aquesta classificació inicial (Petit et al. 2009,

Camara‐Artigasetal.2010,Mostarda,Gfeller&Rao2012).

4.3. LaproteïnaPSD‐95.

La proteïna PSD‐95 (Post Synaptic Density protein‐95), també coneguda amb el

nom de SAP90 o Dlg4, és un exemple de sistemamultimodular hub i forma part de la

família de proteïnes MAGUK (Membrane Associated Guanylate Kinase). Es localitza a la

regió de densitat post‐sinàptica de les espines dendrítiques, on hi trobem un complex

supramolecular electro‐dens, d’aquí el seu nom, format per una gran concentració de

receptorsdeglutamatNMDAiAMPA.

LaPSD‐95organitza latransducciódesenyals icoordinaeltràficmoleculardela

sinapsis neuronal (Figura I. 24). La seva funció principal és la d’agrupar i localitzar

receptorsdemembranaNMDAiAMPA,icanalsiònicsdeNa+(Elias,Nicoll2007).També

interaccionaambvariesproteïnescitoplasmàtiques,comperexemplelaSintasaneuronal

d’Òxid Nítric (nNOS) implicada en la excitotoxicitat neuronal, o la proteïna CRIPT

(Cysteine‐Rich Interactor Protein); com també interactua amb proteïnes associades al

citoesquelet,comlaF‐actina(Passafaroetal.1999,Sheng,Sala2001).

LaproteïnaPSD‐95éslaproteïnahubmésabundantdeladensitatpost‐sinàpticai,

com totes les de la famíliaMAGUK, està formada per tres dominis PDZ, un domini SH3

(SRC Homology 3 Domain) i un domini GK (Guanilat Kinasa). Tots cinc actuen com a

dominis moduladors d’interacció proteïna‐proteïna. Els dominis SH3 i GK, es troben

implicatsen ladimeritzacióde laproteïnaPSD‐95.Launióde lligandsal loop entre tots

dosdominisprovocaelseucanviconformacionalipromoulaformaciód’homodímersde

PSD‐95(Nixetal.2000,McGeeetal.2001,McGee,Bredt2003).


50

FiguraI.24.Localitzaciópost‐sinàpticaiinteraccionsmolecularsdelaproteïnaPSD‐95.A)Laproteïna

PSD‐95eslocalitzaaladensitatpost‐sinàpticadelesespinesdendrítiques(S).Lafletxasenyalalapresenciade

receptorsNMDAmarcatsambpartículesd’or.B)Alaterminalpost‐sinàptica,laproteïnaPSD‐95interacciona

ambreceptorsdemembrana,canalsdesodi,iproteïnescitoplasmàtiquesnNOSiCRIPT.

PelquefaalsdosprimersdominisdelaproteïnaPSD‐95,PDZ1iPDZ2,presenten

una estructura i propietats d’uniómolt similars, i es troben separats per una seqüencia

d’aminoàcidsmoltcurta, inferiora5residus,rígidaimoltconservadaentrelesdiferents

especies.Elsdosdominisestableixencontactesentresi,formantuntàndemquepromoula

dimerització de receptors o canals iònics, necessària per a ser funcionals, o bé com a

mètodeselectiudel’especificitatd’unióamblamolèculadiana(Longetal.2003).

4.3.1. DominiPDZ3delaproteïnaPSD‐95.

EltercerdominidelaproteïnaPSD‐95,d’araenendavantanomenatPDZ3,ésuna

de les tresproteïnespresentadesenaquestaTesiDoctoral.Aquestdomini, igualqueels

altres dos, té la funció d’interaccionar amb diferents molècules diana. Però, el cas del

dominiPDZ3ésunclarexempledemodulaciódel’afinitatil’especificitatd’uniómésenllà

de laregiód’unióa lligands,a travésde interaccionsal·lostèriques intra‐domini.Laseva

plasticitat estructural i les propietats dinàmiques de plegament han fet que el domini

PDZ3hagi estatobjectedenombrososestudis termodinàmics a la fi d’aprofundir en les

característiques conformacionals dels dominis PDZ en general. La seva estructura

cristal·linavaserlaprimeradetotselsdominisPDZenserresolta(Doyleetal.1996).


51

4.3.1.1. Hèlix‐α3addicionaldeldominiPDZ3.

Anivelld’estructuraciócanònicadelsdominisPDZ,elPDZ3(residus302‐402)rep

especial atenció ja que conté unahèlix‐α addicional (α3, residus394‐402) a l’extremC‐

terminal, empaquetada contra l’estructura central del domini, concretament contra les

cadenesβ2iβ3d’unadelesduesfulles‐βqueformenelbarril‐β(FiguraI.25‐B)

Finsfapoc,elscristallsdelPDZ3erenmancatsd’aquestahèlix‐αaddicional,degut

a que la seqüència proteica contenia un artefacte de clonació a l’extrem C‐terminal

(residus403‐415),queadoptavaunaconformacióenβ‐hairpinantiparal·lel(cadena‐β5),

tal i coms’observaa la figura I.25‐A.Entred’altres,Cámara‐Artigas,A. i col·laboradors,

vanresoldre l’estructurarealdeldominiPDZ3(codiPDB3K82).Alcomparar‐loambels

resultatanteriors,vanveurequeaquestadiferènciaconformacionalmodificalaplasticitat

i funcionalitat de la proteïna PSD‐95, ja que l’hèlix‐α3 està totalment implicada en el

plegamentil’afinitatdeldomini(Petitetal.2009,Camara‐Artigasetal.2010).

Figura I.25.Estructuracristal·linadeldominiPDZ3.A)Primeraestructuraadquirida (residus302‐415)

ambl’artefactedeclonacióal’extremC‐terminalqueadoptaunaestructuraenβ‐hairpin(cadena‐β5).Figura

adaptadadeDoyle,D.A.(1996).B)EstructurarealdeldominiPDZ(residus302‐402)ambl’hèlix‐α3addicional

l’extremC‐terminal(blau)ilesdistànciesmésproperesalpèptidlligand(5.8ÅlaTyr397i6.9ÅlaPhe400).

Figura adaptada de Petit, C.M. (2009). Detall del pèptid lligand a la butxaca d’unió (β2‐α2) en groc (A) i

magenta(B).

Aquesta tercera hèlix‐α es localitza distant del centre actiu del domini i no

estableixuncontactedirecteambelC‐terminaldelpèptidaunir,elsresidusdel’hèlixmés

propersalpèptid,sonlaTyr397ilaPhe400,queessituena5.8Åi6.9Ådelpèptid,massa

distància per a establir algun tipus d’interacció (Petit et al. 2009). Recentment, ha estat


52

demostratquelafosforilaciódelaTyr397desestabilitzal’hèlix‐α3,desempaquetant‐ladel

dominiglobal.Conseqüentment, l’afinitatperal lliganddisminueix finsaquatrevegades

(Zhangetal.2011).Encaramés,ladeleciódelsúltims7residusdel’hèlix‐α3redueixfinsa

21 vegades l’afinitat per al lligand. La taula I. 3 mostra els paràmetres termodinàmics

obtingutsdelmutant∆7ct‐PDZ3.

Taula I. 3. Paràmetres termodinàmics de la interacció del domini PDZ3 i el pèptid lligand CRIPT. Dades

extretes de Petit, C.M (2009).

Proteïna Kd (μM) ∆Hd (kcal/mol) ‐T∆Sd (kcal/mol)

PDZ3303‐402 1.2 (0.1) ‐9.70 (0.12) 1.66 (0.06) ∆7ct‐PDZ3 25.7 (3.6) ‐10.27 (0.68) 4.00 (0.59)

A part del descens de l’afinitat respecte el domini sencer, el fet que els valors

d’entalpia(∆H)siguinpràcticamentigualsentreells,indicaqueladeleciódel’hèlixtéun

efecte purament entròpic (∆S), sense afectar les interaccions i el plegament natiu de la

proteïna.Ique,pertant,l’afinitatdinàmicadeldominiPDZ3estàreguladaal·lostèricament

perl’hèlix‐α3addicional(Petitetal.2009).

4.3.1.2. Loopβ2‐β3deldominiPDZ3.

A part de l’hèlix-α3, s’han identificat altres regions del domini PDZ3 que també

influeixendirectamentsobrelacapacitatd’unióapèptids.

Per simulació deDinàmicaMolecular, s’ha identificat quepart del pèptid lligand

interaccionadirectamentambelloopqueconnectalescadenesβ2iβ3,formatpelsresidus

Gly329‐Gly335 (GGEDGEG). Concretament, dos residus de Lys del pèptid lligand

estableixeninteraccióelectrostàticaambelGlu331il’Asp332(FiguraI.26‐A).

Aquests contactes són dinàmics, s’intercanvien entre ells en una escala de

nanosegons,raóperlaqualhaestatdifícildetectar‐les(Mostarda,Gfeller&Rao2012).


53

FiguraI.26.Representaciódelsresidusdelloopβ2‐β3deldominiPDZ3implicatsenlainteraccióamb

pèptids i l’hèlix‐α3addicional.A)ModeldeldominiPDZ3(groc)onesdetalla labutxacad’unióapèptids

(blau)ilainteraccióentreelsresidusAsp332iGlu331(loopβ2‐β3)amblaLys‐4delpèptid.B)Interaccions

iòniquesde l’hèlix‐α3(Glu401 iArg399)ambel loopα1‐β4(Lys355), iambel loopβ2‐β3(Glu334). Imatges

adaptadesdeMostarda,S. (2012). C)Detall de l’anell de succinimidina formatper el residuAsp332. Imatge

adaptadadeCámara‐Artigas,A.(2010).

Tot plegat demostra que el loop β2‐β3,molt proper a la butxaca d’unió, juga un

papercentralenl’afinitatdeldominiPDZ3iestrobaregulatal·lostèricamentperlaregió

distantiaddicionalα3,iquel’afinitatdeldominiPDZ3estrobaestabilitzatperunaxarxa

de contactes dinàmics intra‐domini i amb el pèptid, tan al·lostèrics com iònics i que

impliquendiferentspartsdelamolècula.

4.4. MalaltiesrelacionadesambelsdominisPDZ.

Elfetqueexisteixiungrannombredeproteïneshubiquejuguenunpapercrucial

en els processos biològics, no fa inesperat que moltes d’elles es trobin implicades en

patologieshumanes.Lapèrduadelseusrolsdónallocaunaextensavarietatdemalalties,

com ara càncers, malalties neurodegeneratives (l’AD i Parkinson), malalties

cardiovasculars, o diabetis tipus‐II (Rezaei‐Ghaleh, Blackledge & Zweckstetter 2012).

Totes elles relacionades amb proteïnes de reconeixement, regulació i/o senyalització


54

cel·lular, funcions que, tal i com s’ha descrit anteriorment, solen implicar regions o

proteïnesIDPs(Uversky,Fink2004,Uversky2013).

La gran quantitat de proteïnes humanes que contenen dominis PDZ, es troben

distribuïdes en regions especialitzades de la cèl·lula, principalment en els contactes

epitelials intracel·lulars. La estricta localitzaciód’aquestesproteïnes i les seves funcions

de regulació de la transducció de senyal i polaritat cel·lular, implica que qualsevol

alteració a nivell estructural o d’expressió resulti en el desenvolupament de malalties

humanes,sobretotpelquefaunagranvarietatdecàncers(Facciutoetal.2012).

En els darrers anys s’han identificat varietats de virus humans que codifiquen

proteïnesqueinteraccionenipertorbenlafunciódelsdominisPDZ,comaestratègiapera

lasevareplicació(Focant,Hermans2013).Unexempleéselcasdelvirusdelpapil·loma

humà, que expressa la proteïna oncogènica HPV‐E6, la qual conté, en el seu extrem C‐

terminal,elmotiudereconeixementdelsdominisPDZ(Pimetal.2012).

En el cas concret de la proteïna post‐sinàptica PSD‐95, s’ha vist implicada en

malaltieshumanes,comaral’Autismeol’AD.

Enelcasdel’Autisme,existeixundèficitdelfactordetranscripcióMEF‐2(Myocyte

Enhancer Factor‐2), el qual s’encarrega de regular el nombre de sinapsis neuronals

mitjançant la ràpida i selectiva eliminació de la proteïna PSD‐95, que estabilitza els

receptors AMPA, i afavoreix al pas d’informació augmentant el nombre d’espines

dendrítiquesespecialitzadesenrebre impulsossinàptics.Per tant, lasevanodegradació

selectivaesreflexaenunahiperexcitacióneuronal,hipersensibilitatsensorial i, finsitot,

enatacsepilèptics, totsells símptomesenpacientsdeSíndromeX fràgil (FXS), la forma

hereditàriaméscomunaderetràsmentaliautisme(Tsaietal.2012).

Pel que fa a la malaltia d’AD, recentment s’ha detectat una co‐localització de la

proteïnaPSD‐95amboligòmersdelpèptid‐Aβ,l’espèciecitotòxicacausantdel’AD.Amés,

laconcentraciódeproteïnaPSD‐95alcervelldepacientsd’ADéssignificamentmenorque

enindividussans,degutaqueelsoligòmersd’Aβ1‐42indueixenunadisminuciódelsnivells

dePSD‐95alhipocampicòrtexneuronal,sentunadelescausesdeladisfunciósinàpticai

la discapacitat cognitiva de l’AD (Deshpande et al. 2006, Cascella et al. 2013). Per al

contrari,altresautorsdefensen lahipòtesideque lasobreexpressióde laproteïnapost‐

sinàpticaPSD‐95, ino la sevamancança,ésunmarcadorde lamalaltiad’AD,que indica

unareorganitzacióestructuralenelscompartimentspre‐ipost‐sinàptics,comaresposta

compensatòriaalesdisfuncionssinàptiques(Preissmannetal.2012).

Tambéenl’AD,éssabutquel’α‐secretasa,laproteasaquetallalaproteïnaAPPde

formanoamiloidogènica,interaccionadirectamentamblaproteïnaSAP97,paràlogadela

PSD‐95(oSAP90)(Mulleretal.1995).Aquestainteraccióésnecessàriaperalocalitzarla


55

secretasa a la membrana post‐sinàptica i digerir l’APP. Així, interferir el complex α‐

secretasa:SAP97,redueixl’activitatdel’α‐secretasaidesplaçalaproteòlisisdel’APPcapa

la via amiloidogènica donant lloc a la formació del pèptidAβ. Així, la inhibició d’aquest

complexmolecularesdevéunanova i interessantestratègiapera treballarambratolins

model d’AD sense la necessitat de ser transgènics, imimetitza els primers estadis d’AD

esporàdic, ja que després de dues setmanes, els ratolins presenten patrons

neurodegeneratiu típics d’AD, un augment dels agregats d’Aβ i de proteïna Tau

hiperfosforil·lada,aixícomunapèrduaselectivadereceptorsglutamatdelaterminalpost‐

sinàptica(Saracenoetal.2013).

III. OBJECTIUS.

III‐Objectius

59

L’objectiugenerald’aquestatesidoctoralhaestat:

L’estudide lareorganitzacióconformacionaldelestatnatiu i l’agregacióen

fulla‐β ordenada de proteïnes implicades en diferents malalties

conformacionalshumanes.

Eltreballescentraenl’estudidetrestipusdeproteïneshumanesdiferents:

‐ unfragmentvariabled’immunoglobulinadecadenasenzilla,l’scFv‐h3D6.

‐ undominivariabled’immunoglobulina,l’AL‐12.

‐ undominimodulardelaproteïnahubPSD‐95,elPDZ3.

, en funció de cada proteïna, la tesi es troba dividida en diferents capítols, els objectius

específicsdelsqualssónelssegüents:

‐ scFv‐h3D6.

‐ Capítol1:

Expressió i purificació de l’scFv‐h3D6 natiu, i separació de les seves

diferentsformesscrambled.

Estudide lesdiferentsviesd’agregaciódelpèptidAβ1‐42 idelscFv‐h3D6,

aixícomladelcomplexAβ1‐42:scFv‐h3D6.

Caracterització de la reorganització estructural del scFv‐h3D6 cap a

l’agregacióenfulla‐βcreuadaaltamentordenadadetipusWL.

Estudidelefectedelfragmentd’anticòsscFv‐h3D6sobrelaviad’agregació

amiloide i la toxicitat del pèptid Aβ1‐42 en cultius cel·lulars de

neuroblastomahumàSH‐SY5Y,peravaluarelseupotencialterapèuticala

malaltiad’Alzheimer

‐ Capítol2:

Obtenció d’un model tridimensional de l’estructura de l’scFv‐h3D6 per

homologiadeseqüències.

Avaluació i caracteritzacióde l’estructurasecundaria i terciàriade l’scFv‐

h3D6.

Redisseny racional, a partir del model 3D, de la molècula per tal

d’incrementar la seva estabilitat i disminuir la tendència intrínseca a

III‐Objectius

60

l’agregació. Això ha de permetre millorar la producció recombinant i

disminuirladosiefectivajademostradaenratolinsmodelsd’Alzheimer.

‐ AL‐12.

‐ Capítol3:

Obtenció dels paràmetres termodinàmics de l’AL‐12, domini VL obtingut

d’una pacient amb Amiloïdosi de cadena lleugera, i dels seus mutants

restauratius.

Comparaciódelsparàmetrestermodinàmicsdel’AL‐12idelsseusmutants

restauratius amb la proteïna germinal кI O18/O8 i altres dominis VL

amiloidogènics.

Estudidelaviad’agregaciódelAL‐12idelsseusmutantsrestauratius.

Determinar l’efecte de les mutacions no‐conservatives en dominis VL

amiloidogènics mitjançant la caracterització de la bateria de mutants

restauratiusdel’AL‐12.

‐ PDZ3.

‐ Capítol4:

Estudidelaviad’agregaciódeldominiPDZ3idelseuefectecitotòxicsobre

cultiuscel·lularsdeneuroblastomahumàSH‐SY5Y.

AnàlisimoleculardelprocésdereorganitzacióestructuraldeldominiPDZ3

capal’agregacióenfulla‐βcreuadaaltamentordenada.

Estudidelpaperdel’hèlix‐α3addicional,presenteneldominiPDZ3,enel

plegamentil’agregaciódeldomini,mitjançantlacaracteritzaciódelmutant

∆10ct‐PDZ3mancatd’aquestmotiuestructural.

Estudi dels determinants estructurals implicats en el procés d’agregació

del domini PDZ3, mitjançant la caracterització d’una bateria de mutants

simples.

Determinació de la importància de la regió de regulació al·lostèrica del

dominiPDZ3,l’hèlix‐α3ielloopβ2‐β3,sobreelplegamentil’agregacióde

domini.

IV. MATERIALSIMÈTODESGENERALS.

EnelsegüentapartatdeMaterialsiMètodesGeneralss’hidescriuenelsfonamentsde

lesdiferentstècniquesdelaboratoriempradesenaquestatesidoctoral,aixícomelsprotocols

generals.Peraltrabanda,al’apartatdeMaterialsiMètodesdecadacapítols’hidetallenles

tècniquesielsprotocolsexactesdutsatermeamblesmostrespertinents.

IV‐MaterialsiMètodesGenerals AparellsGenerals

65

1. APARELLSGENERALS.

‐ AgitadorvòrtexHEIDOLPHReaxTop

‐ AgitadorsmagnèticsStuartStirCB161

‐ Agitadorplaquesd’elisaIKAMS3digital

‐ AutoclauP‐SELECTAAutoester‐E

‐ BalançaMETTLERTOLEDOPJ300

‐ BalançaMETTLERTOLEDOAB204‐S

‐ BanytermostàticP‐SELECTATectronBio

‐ BanytermostàticP‐SELECTATectron3000543

‐ BombaperistàlticaP‐1GE

‐ CabinadefluxlaminarCRUMA870FL

‐ Cabinad’extracciódegasosCRUMA

‐ CabinadebioseguretatITELSTARBV‐30/70

‐ CentrífugaBECKMANCOULTERJ2‐HS.RotorJA‐20

‐ CentrífugaBECKMANCOULTERAllegra6R.RotorGH‐3.8

‐ CentrífugaBECKMANCOULTERAvantiJ26‐XP.RotorJA25.50/JA‐14

‐ CentrífugaHERAEUSMegafuge1.0RThermo‐Scientific

‐ UltracentrífugaBECKMANCOULTEROptimaL‐100XP.RotorSTrp55Ti

‐ Congelador‐20ºC,‐80ºCSANYO

‐ Cubetesd’electroforesiperagelsd’acrilamidaMini‐ProteanBIO‐RAD

‐ Cubetesd’electroforesiperagelsd’agarosaECOGEN

‐ EspectrofotòmetreUV‐VisVarianCary100

‐ Espectròmetred’InfrarroigVarian660‐IR.Equipatambmòduldetermostatització

Peltier

‐ EspectrofotòmetreUV‐VisNanodrop2000ThermoScientific

‐ EspectropolarímetreJ‐715,JASCO.EquipatambmòduldetermostatitzacióPeltier

‐ Estufaincubadora37°Cdecultiuscel·lularsFormaScientific3111

‐ Estufaincubadora37ºCHERAEUS

‐ Estufaincubadora100ºCP‐SELECTA

‐ Fontd’alimentacióperaelectroforesisBIO‐RAD

‐ FluorímetreVarianCaryEclipse.EquipatambmòduldetermostatitzacióPeltier.

‐ FPLCAKTAPurifier

‐ Incubadord’aireambagitacióINFORS‐HTEcotron.

‐ Incubadord’aireambagitacióINNOVA43

‐ Lectorplaquesd’elisaVictor3PerkinElmer

‐ LiofilitzadorBenchtopSLCVirtis

IV‐MaterialsiMètodesGenerals AparellsGenerals

66

‐ LupabinocularOLYMPUS‐CK2

‐ MicrocentrífugaEPPENDORF5424

‐ Micropipetes0.2‐2,1‐10,10‐100,100‐200,100‐1000,500‐5000μlGILSON

‐ Micropipetesmulticanal2‐20μlGILSON

‐ Micropipetesmulticanal20‐200μlHTDiscoveryConfort

‐ MicroscopielectrònicdetransmissióHITACHI,modelH‐7000

‐ pHmetremicropH2000CRISON

‐ PipetaelectrònicaPipetboyINTEGRA

‐ SistemadedigitalitzacióiquantificacióperlàserEscànerGS‐800,BIO‐RAD

‐ Sistema d’exposició de quimioluminescència Molecular Imager Chemi Doc XRS,

BIO‐RAD

‐ SonicadorSONIFIER450BRANSON

‐ Speed‐VacThermoSAVANTVLP80

‐ TermocicladorTECHNETC‐512

‐ TermoblocTECHNEDri‐BlockDB‐2A

‐ TC10™AutomatedCellCounterBIO‐RAD

IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesdeDNARecombinant

67

2. TÈCNIQUESDEDNARECOMBINANT.

2.1. Reaccióencadenadelapolimerasa,PCR.

LatècnicadePCR(reaccióencadenadelapolimerasa)vaserdesenvolupadal’any

1987 per KaryMullis (Mullis, Faloona 1987) i actualment és una de les tècniquesmés

emprades en la Biologia Molecular. És una tècnica ràpida i senzilla que permet

l’amplificació de DNA in vitro, amb l’objectiu de realitzar processos de clonatge o

mutagènesidirigidadeproteïnes.

LaPCRconsisteixen lahibridaciódeseqüènciescomplementaries(encebadorso

primers) a un fragment específic del DNAmotlle, del qual s’han separat prèviament les

dues cadenes, i la elongació d’aquestes seqüenciesmitjançant l’enzimDNA‐polimerasa i

els componentsnecessaris (dNTPs iel cofactorMg2+,principalment).Ésunprocés cíclic

controlat per canvis de temperatura adients per a cada fase . El correcte disseny dels

encebadorséscrucialperaquelatècnicaresultieficient.Laincorporaciódepolimerases

termostables així com aparells termocicladors capaços de realitzar canvis cíclics de

temperaturaaelevadavelocitathanpermèsoptimitzarelprocés.

2.1.1. Dissenyd’encebadorsdePCR.

Amb la finalitat d’obtenir el millor rendiment i minimitzar els productes

inespecífics,caltenirencompteunasèriedefactorsrespecteeldissenydelsencebadors:

‐ El reemplaçament d’aminoàcids ha d’implicar els mínims canvis de nucleòtids

possibles,sempretenintencomptel’úsdecodód’E.coliperacadaaminoàcid(ja

queaquestahaestatlasocausadaperalclonatgedeDNAiexpressiódeproteïna

alllargd’aquesttreballdoctoral).

‐ Laespecificitatieficàciadepèn,enpart,delalongituddelsencebadors,quehade

serd’entre20‐30nucleòtids.

‐ Latemperaturad’hibridació(Ta,od’annealing)d’ambdósencebadorshandeser

similars,amésd’igualosuperiora50°C.LaTasolconsiderar‐se5°Cpersotadela

temperaturadefusió(Tm,odemelting)delsencebadors;ipotcalcular‐sesegons

lafórmula:

4 2

on G, C, A i T indiquen, respectivament, el nombre de nucleòtids de guanina,

citosina,adeninaitiminaenlaregiódesolapament.


68

‐ Els encebadors han de contenir un 45‐60 % en G/C, sobretot a l’extrem 3’,

intentantevitarquatreomésA/Tconsecutives.Aquestdetallés importantpera

l’estabilització del híbrid de DNA i la unió de la polimerasa, ja que aquests dos

nucleòtidsestableixenuntripleenllaçd’hidrogenentreells,mentrequelaparella

A/Ttansolsdos.

‐ Els encebadorshande complementaris a una seqüènciaúnica en elDNAmotlle,

peraixíevitarinespecificitats.

‐ Minimitzarlesestructuressecundariesintramolecularsilespossibleshibridacions

entreambdósencebadors.

2.1.2. MutagènesiDirigida.

2.1.2.1. Reacciódemutagènesi.

LamutagènesidirigidaésunadelesmúltiplesaplicacionsdelaPCR,laqualpermet

introduir canvis específics dins la seqüència de nucleòtids d’un determinat gen, amb la

finalitat d’obtenir una proteïna mutant en un o més residus. El procés es realitza

directament sobre un DNA plasmídic sencer com amotlle, de forma que s’estalvien els

passosdelligacióposterior.

Per a realitzar mutagènesi dirigida s’ha fet ús del kit Quikchange® Multi Site‐

DirectedMutagenesi(Agilent).Adiferènciad’altresmètodes,aquestkitutilitzatansolsun

únicencebadorquecontéelcanvinucleotídic,elqualestraduiràenelcanvid’aminoàcid

desitjat,iquehibridasobreunDNAplasmídicdecadenasenzilla(ssDNA).

Seguint les instruccionsdelManualQuikchange®, s’ha realitzat la següentmescla

dereacciódePCRmutagènica:

2.5 μl de tampó de reacció 10x QuikChange Multi reaction buffer

0.75 μl de QuikSolution

x μl de dsDNA motlle (100 ng)

x μl d’encebador mutagènic (100 ng)

1 μl de barreja de nucleòtids trifosfats (dNTPs) QuickChange

x μl d’aigua Milli‐Q estèril (fins a un volum final de 25 μl)

1 μl de polimerasa QuikChange® Multi enzyme blend


69

Acontinuació,lareacciós’incubaaltermocicladorsseguintelcicledePCRsegüent:

Fase n° de cicles Temperatura (°C) Temps (min) Descripció

1 1 95 1 Desnaturalització inicial

2 30

95 1 Desnaturalització

55 1 Hibridació

65 2/Kb plasmidi Elongació

3 1 65 5 Extensió final

És necessari, sobretot al realitzar per primera vegada una mutagènesi dirigida,

realitzarcontrolspositiusdelareaccióidelatransformació.Elmateixkitdemutagènesi

conté DNAmotlle i encebadors control per a verificar l’eficiència de la PCR i dels seus

components.

2.1.2.2. DigestióambDpnI.

Uncopfeta lamutagènesi,és importanteliminar lescadenesdeDNAparental, ja

queaquestesnocontenenlamutaciói,totisermínimalaquantitatrespecteelproducte

de PCR final, podrien donar lloc a colònies transformants nomutades. El DNA parental

difereixende lessintetitzadesperPCRen lametilació, jaque lesmetilasescel·lulars(els

enzimsencarregatsdelametilació)nosónpresentsalareacciódePCR,demaneraqueles

cadenessintetitzadesinvitro(imutades)noestrobaranmetilades.L’enzimendonucleasa

DpnI reconeix i talla el DNA metilat, evitant falses colònies en la transformació dels

productesdePCRaE.coli.

Segons les instruccions del manual de Quikchange, es realitza la digestió dels

productesdePCRindicada:

‐ Afegir1uLdel’enzimderestriccióDpnIacadareacciód’amplificació.

‐ Pipetejarsuaumentlamesclaiincubar‐laimmediatamenta37°Cdurant1h.

2.1.2.3. TransformacióproductesdePCR.

El kit Quikchange® Multi Site‐Directed Mutagenesi conté, també, les cèl·lules

utracompetents XL10‐Gold® ja preparades per a rebre el ssDNA producte de PCR. De

maneraque, invivo,es forma i s’estabilitza la doble cadenadeDNAplasmídic (dsDNA),

obtenintcolòniestransformantsapuntperseranalitzadesoperextraure’nelDNAmutati

prosseguirambelprocésd’expressióipurificaciópertinent.


70

Elprotocoldetransformacióésmoltsemblantaldescrital’apartatsegüent(2.2.2),

exceptealgunpetitcanvidetallatenelManualQuikchange®.

2.2. IntroducciódeDNAforaniacèl·lulesbacterianes.

Existeixenvarismètodes(conjugació,transducció...)peraintroduirunvectoramb

elgend’interèsdinsd’unasocabacteriana,peròlamésempradaéslatransformació,degut

a la seva senzillesa i varietat de controls a realitzar. La transformació consisteix crear

porus a la paret bacteriana que permetran l’entrada del DNA forani a l’interior de la

cèl·lula.

2.1.3. Preparaciódecèl·lulescompetentsd’E.coli.

Peralatransformació,calquelescèl·lulessiguincompetents,ésadir,hand’estar

preparades per a poder introduir elDNA extern i s’aconsegueixdebilitant la sevaparet

cel·lular,elmètodemésutilitzatésdelCaCl2(Hanahan1983)iconsisteixen:

1. Picarunacolòniaenplacadelasocamareiinocularen5mLdemediLBestèril.

2. Incubarmàxim15henagitacióforta(250rpm)a37°C,perpromoureuncultiusaturat.

3. Inocular,enunvolumfinalde50mL,unadilució1:100enmediLBiincubaralesmateixes

condicionsanteriorsfinsarribaraunaDO600̴0.4,puntdecreixementexponencial.

4. Transferirelcultiuauntubdepropilèestèrilirefredatprèviament.Deixarengelmínim15

min.

5. Centrifugarelcultiua3000gdurant15min,a4°C.

6. Eliminarelsobrenedantperdecantacióiassecarelprecipitatperinversiódurant5min.

7. Resuspendre el precipitat suaument amb 25mL de CaCl2 100mM, estèril i prèviament

refredat.Deixarengelmínim15min.

8. Centrifugarelcultiurepetintelspassos5i6.

9. Resuspendre el precipitat suaument amb 2.5mL de CaCl2 100mM, estèril i prèviament

refredat.Deixarengelmínim1h.

10. Aliquotar 100 μl de competents en eppendorfs estèrils on s’hi ha afegit, prèviament,

glicerolestèrilperaobtenirunaconcentraciófinaldel15%.

11. CongelarambN2‐líquidiguardaralíquotesa‐80°C.

2.1.4. Transformaciódecèl·lulescompetentsd’E.coli.

En aquest treball de tesi s’ha utilitzat el mètode de xoc tèrmic, basat en canvis

bruscs de temperatura per a afavorir l’entrada del vector dins la cèl·lula competent. El

protocolaseguiréselsegüent:


71

1. Descongelar les alíquotes de competents necessàries (cada alíquota servirà per a una

transformació)deixant‐lesengelaproximadament20min.

2. Afegiral’alíquota50ngdeDNAimesclarperinversiósuaument.

3. Incubarengeldurantmínim30min.

4. Xoctèrmic:

‐ Transferirl’alíquota2minalbanya42°C.

‐ Transferirràpidamentagelimantenir‐lesdurant5min.

5. Afegirun1mLdemediLBestèril,escalfatprèviamenta37°C,acadaalíquotaiincubar1h

albanya37°Ciambagitaciósuau.

6. Plaquejar100μldelasolucióenplacadeLBsòlidambl’antibiòticadequatideixarreposar

atemperaturaambient(TA).

7. Incubarlaplacaa37°Cdurantaproximadament16h.

Encasd’esperarunbaixrendimentdetransformació,ésaconsellableconcentrarla

solució10vegadesabansdeplaquejar‐la.Perfer‐ho,centrifugarlasolució30sega6000g

iextraurelaquantitatnecessàriadesobrenedantpertalderesuspendrelescèl·lulesenun

volumde100μl,iplaquejar.

A més, és recomanable realitzar controls de transformació. Un control negatiu

senseafegirDNAalescèl·lulescompetents,iuncontrolpositiutransformantambunDNA

jacomprovatprèviament.

2.2. ExtracciódeDNAplasmídicdecèl·lulesd’E.coli.

Unaminiprepésl’extracciódeDNAplasmídicdel’interiordecèl·lulesbacterianes,

en aquest cas d’E. coli, partint d’un volum de cultiu petit. Per a fer‐ho, es parteix d’un

inòculde5mLdemediLBestèril,incubatmàxim15henagitacióforta(250rpm)a37°C,

per promoure la saturació del cultiu. A partir d’aquí, s’ha utilitzat el kit RealMiniprep

TurboKit(REALLaboratory),basatenelmètodedellisialcalina(Birnboim,Doly1979).

2.3. SeqüenciaciódelDNA.

LaseqüenciaciódeDNAs’harealitzatamblafinalitatdecomprovarlesmutacions

introduïdespermutagènesidirigida, ielclonatgesatisfactoridegenscodificantsdinsde

diferentsvectorsd’expressió.

La seqüenciació s’ha dut a terme per el Servei de Genòmica de la UAB o de la

ClínicaMayo(USA),totsdosmitjançantelmètodedeSanger(Sanger,Coulson1975).


72

2.4. DeterminacióespectrofotomètricadelaconcentraciódeDNA.

La concentració d’una mostra de DNA es pot mesurar mitjançant

l’espectrofotòmetre,utilitzantunacubetadequars,obémitjançantelnanodrop,enelque

s’aplica2μldemostra.L’espectred’absorbàncias’enregistrade200a320nm.Unaunitat

d’absorbànciaa260nmequivalaproximadamenta50μg/mLdeds‐DNAia30μg/mLde

ss‐DNA.LapuresadelDNAespotvalorarambelscoeficientssegüents:

Coeficient Valor Indicador de puresa

260/280

1.8 DNA pur

< 1.8 Contaminació per proteïnes

> 1.8 Contaminació per RNA

260/230 1.8 – 2.2 DNA pur

< 1.8 Contaminació per sals.

IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació

73

3. SISTEMESD’EXPRESSIÓIPURIFICACIÓ.

3.1. Soquesd’Escherichiacoli.

Totes les soquesd’E. coliutilitzadesper a l’expressióheteròlogade lesdiferents

proteïnes treballades durant aquesta tesi doctoral són sistemes del tipus DE3, que

contenenelgendelaRNApolimerasadelbacteriòfagT7(DE3)inseritalseugenomasota

el control del promotor de l’operó lac, induïble per IPTG. D’aquesta manera, s’evita

l’expressió basal del gen d’interès i la inducció és iniciada externament a condicions

òptimes.

3.1.1. Soquesd’E.coliperalclonatgeiextracciódeDNAplasmídic.

‐ XL‐1blue.

Genotip:recA1endA1gyrA96thi‐1hsdR17supE44relA1 lac [F´proAB lacIqZΔM15

Tn10(TetR)].

AquestasocaésdeficientenlaendonucleasaendA,elqualmilloramoltlaqualitat

delesminiprepsdeDNA.TambéésdeficientenelgenderecombinaciórecA,augmentant

l’estabilitatdelsinserts.LamutacióhsdRpreveul’acciódelaendonucleasaEcoKsobreel

DNAclonat.Presentaresistènciaatetraciclina.

‐ XL10‐Gold.

Genotip: TetR Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB‐hsdSMR‐mrr)173 endA1 supE44 thi‐1 recA1

gyrA96relA1lacHte[F´proABlacIqZΔM15Tn10(TetR)AmyCamR].

Aquesta soca ha estat dissenyadaper a transformarmolècules deDNAambuna

elevadaeficiència,gràciesalfenotipHte(Hightransformationefficiency).Sónidealspera

la construcció de llibreries de DNA plasmídic. Presenten resistència a tetraciclina i

cloramfenicol; i, com la XL1‐blue, és deficient en endA i mutada en hsdR, millorant la

qualitatdelesminiprepsiestabilitzantelDNAclonat.

3.1.2. Soquesd’E.coliperal’expressióheteròlogadeproteïnes.

‐ Origami2(DE3).

Genotip:Δ(ara‐leu)7697ΔlacX74ΔphoAPvuIIphoRaraD139ahpCgalEgalKrpsL

F′[lac+lacIqpro](DE3)gor522::Tn10trxB(StrR,TetR).


74

Aquesta soca derivada de l’E. coli K12 presenta mutacions en els gens de la

tiorredoxina reductasa (trxB) i de la glutatió reductasa (gor). Ambdós deficiències

afavoreixen un ambient oxidatiu en el citoplasma d’E. coli, beneficiant el correcte

plegamentdeproteïnesquepresentenpontsdisulfur.Presentaresistènciaalatetraciclina

i l’estreptomicina, però a diferència de la soca Origami(DE3) original, és sensible a la

kanamicinadegutalamutaciógor.

‐ soluBL21(DE3).

Genotip:F‐ompThsdSβ(rβ‐mβ‐)galdcm(DE3).

AquestasocacontédelecionsdelesproteasesOmpT i lon,reduintelpotencialde

degradació de proteïnes recombinants dins la cèl·lula. A diferència de l’original

BL21(DE3), conté mutacions no caracteritzades que afavoreixen la solubilització de

proteïnesquehabitualments’expressendeformainsoluble.

‐ C41(DE3).

Genotip:F‐ompThsdSβ(rβ‐mβ‐)galdcm(DE3).

AquestasocaderivadelaBL21(DE3),tambépresentalesdelecionsalesproteases

Ion i OmpT; i, com a mínim, té una mutació no caracteritzada, la qual preveu la mort

cel·lularassociadaal’expressiódeproteïnesrecombinantstòxiques.

3.2. Mantenimentsoquesbacterianes.

Lessoquesbacterianes,jasiguintransformadesono,espodenconservarenplaca

demediLBsòliddurantunperíodede15diesa4°C.

3.2.1. Glicerinats15%.

Peraconservar‐lesllargsperíodesdetemps(mésde2anys),ésnecessariguardar

les soques en forma de glicerinats al 15%. Així, en un crio‐vial esmesclen 300 μL de

glicerol 50% estèril i 700 μL de cultiu saturat. Es barreja suaument i es congela

ràpidamentenN2‐líquidperaguardar‐hoa‐80°C.Al’horadenecessitar‐ne,sensearribar

adescongelarlasolució,espicaelglicerinatambunanansadeKolleestèrilis’inoculaen

mediLBlíquid.


75

3.3. Medisdecultiu.

Peralcreixementbacteriàs’usaunmedidecultiu,sòlidoensolució,apHfisiològic

iquecontéelsnutrientsnecessarisperaladivisiócel·lular.

3.3.1. Medilíquid.

3.3.1.1. MediLB.

Elmedidecultiuméshabitual i empratde formageneralenaquesta tesi és l’LB

(Luria‐Bertani).Peralapreparaciód’1Ld’LB:

10 g de triptona

5 g d’extracte de llevat

10g de NaCl

900 mL d’aigua Milli‐Q

Agitarfinsadissoldrecompletament,ajustarapH7.4ienrasarfinsa1Lambaigua

Milli‐Q. Seguidament s’esterilitzaper un cicled’autoclau i, si cal, es guarda a4 °C fins a

usar‐lo.

3.3.1.2. Medi2xYT

Adiferènciadel’LB,l’2xYTésmésricennutrients,resultantenunamajordensitat

cel·lulariperíodesdecreixementd’E.colimésllargs.Peraixò,l’2xYTésútilperaobtenir

majorsrendimentsd’expressiódeproteïnes.Lasevareceptaperaun1Léslasegüent:

16 g de triptona

10 g d’extracte de llevat

5g de NaCl

900 mL d’aigua Milli‐Q

Agitar fins a dissoldre’s, ajustar a pH 7.4 i enrasar fins a 1 L amb aiguaMilli‐Q.

Seguidaments’esterilitzaperuncicled’autoclaui,sical,esguardaa4°Cfinsausar‐lo.

3.3.2. Medisòlid.

Per aïllar colònies d’E. coli després de ser transformades o crescudes en medi

líquid,ésadequatl’úsdeplaquesdepetriambmedidecultiusòlidd’LB.Elprocedimentés

elmateixqueelprotocoldemedilíquidd’LBperòs’hiafegeixagaral15%(p/v),insoluble

a TA. Seguidament, la mescla s’autoclava aconseguint la dissolució de l’agar i


76

l’esterilització. Al temperar‐se, s’afegeixen els antibiòtics pertinents i es plaqueja en

condicionsestèrils.Uncopelmedis’harefredatigelificat,esdesenlesplaquesa4°Cfinsa

ser usades. Es recomana no guardar les plaquesmés enllà dels 20 ‐ 30 dies de la seva

preparació.

3.3.3. Antibiòtics.

Elsantibiòticssónsubstànciesquímiquesqueinhibeixenelcreixementbacteriào

directamentcausenlasevamort,jaqueinterfereixensobreprocessoscel·lularsvitals.Els

DNA plasmídics de clonatge i expressió contenen un gen de resistència per a un

determinatantibiòtic,deformaquepermetenunaselecciópositivad’aquellessoquesque

hanintroduïtoexpressenelgenforani.

Elsantibiòticsmésutilitzatsenlabiologiamolecularestrobendetallatsalataula

següent,aixícomelseumecanismed’acció:

Antibiòtic Concentració de

treball (μg/ml) Dissolvent Mecanisme d’acció

Cloramfenicol

(Cm) 170 Etanol 100%

Inhibició del ribosoma per unió a la

seva subunitat 50s.

Kanamicina

(Kn) 50 Aigua Milli‐Q


seva subunitat 30s.

Tetraciclina

(Tet) 50 Etanol 50%


seva subunitat 30s.

Ampicil∙lina

(Amp) 50 Aigua Milli‐Q Inhibeix la síntesi de peptidglicà.

Estreptomicina

(St) 60 Aigua Milli‐Q


seva subunitat 30s.

3.4. Vectorsd’expressió.

Els vectors d’expressió usats en aquestes tesi doctoral són DNA plasmídics

optimitzatsperaunafàcilinsercióiexpressiódegensespecíficsdinslacèl·lulahoste.Els

vectors solen ser de grandària petita (de 3 a 6 kb), i contenir poc més que els gens

essencialsperalclonatgedeDNA:unorigendereplicació(ORI),ungenderesistènciaa

antibiòtic (per exemple TetR), la regió d’inserció de DNA exogen (MCS,MultipleCloning

Site),iunterminadordelatranscripció.

Tots els vectors utilitzats per a l’expressió heteròloga de les diferents proteïnes

treballadesdurantaquesta tesidoctoralsónderivatsdelsistemadevectorspET(origen

de replicació pBR322), sent compatibles per a ser expressats en soques DE3 ja que el


77

sistemapETcontéelpromotorT7il’operólac,específicsdelgendelaRNApolimerasaT7,

inclòsenelgenomadelasoca.

‐ pETtrx_1a.

El vector pETtrx_1a (FiguraM. 1‐A) és relativament gran, de 6401 pb, i permet

seleccionarelsclonstransformantsgràciesa lasevaresistènciaa l’antibiòtickanamicina

(KnR).Aquestplasmidipermetl’expressiócitoplasmàticadelaproteïnarecombinantscFv

coma fusió a la tioredoxina (trx), la qual presenta, amésd’activitat disulfur‐isomerasa,

activitatxaperona(Jurado,deLorenzo&Fernandez2006).Amésdelmòdulproteic trx,

conté un cua d’histidines (His6) i la diana específica de la proteasa Tev, necessària per

obtenirlaproteïnascFvfinal.Elgensintèticcodificantperal’scFv‐h3D6,de750pb,vaser

clonatenNcoI‐NotI,reemplaçantelgenGFPnaturaldelvectoridonantllocalconstructe

gènicdelaproteïnaprecursora:(His6)‐trx‐dianaTEV‐scFv.

‐ pET‐12a.

El vector pET‐12a (Figura M. 1‐B), de 4674 pb, permet seleccionar els clons

transformantsgràciesalasevaresistènciaal’antibiòticampicil·lina(AmpR).Aquestvector

contéel genompT, que codificaperunmòdulproteic, fusionata l’extremN‐terminalde

l’AL12, i potencia l’exportació cap a l’espai periplasmàtic, on la proteïna és soluble. A

diferència de la proteïna precursora d’scFv‐h3D6, aquest constructe no necessita una

dianaderestricció jaqueompTeseliminadaper lasevaproteasaespecíficaalcreuar la

membranacitoplasmàtica.

FiguraM.1.Mapadelsvectorsd’expressiópET‐trx1aipET‐12a.


78

‐ pMHTΔ238.

Aquest vector, derivat del plasmidi pQE30, també amb origen de replicació

pRB322,iambresistènciaal’antibiòticKn,contélaregiócodificantMHT,quesintetitzala

proteïna MPB‐dianaTEV‐(His)7‐TEV. Δ238 indica que tots els residus del extrem C‐

terminaldelaMPB(MaltoseBindingProtein),apartirdelresidu238,hanestateliminats

pertald’augmentarlaquantitatdeproteïnasoluble.Amés,contélamutacióS219Vpera

limitarlasevaauto‐inactivació(vandenBergetal.2006).

3.5. Expressióheteròlogadeproteïnes.

Depenent de les propietats de cada tipus de proteïna, el protocol d’expressió

heteròlogaésdiferent.Elpasde creixementdel cultiu cel·lular i la sevaexpressióésun

delspassos limitantspertald’obtenirunbonrendimentfinalenelprocésdepurificació

deproteïnes.Al’hd’expressarunaproteïnaexògena,s’hadetenirencomptesilaproteïna

es dirigeix al citoplasma, periplasma, o a l’exterior de la cèl·lula, i sobretot, si esmanté

solubleoinsoluble.Inclús,certesproteïnesexpressadespodenarribarasertòxiquespera

les cèl·lules. Depenent d’aquests factors, i dels constructes emprats, la temperatura i el

tempsdecreixementiinducciódelcultiucel·lularvariaranentreproteïnes.

Els protocols d’expressió i purificació de les diferents proteïnes treballades en

aquesta tesi doctoral es troben detallades a l’apartat de Materials i Mètodes de cada

capítol.

3.5.1. Inducciódel’expressió.

Malgrathaverprovatsistemesd’expressióenmedisauto‐induïbles,l’expressióde

les proteïnes d’aquesta tesi doctoral ha estat induïdamitjançant IPTG (Isopropil β‐D‐1‐

tiogalactopiranòsid), un substrat químic capaç d’unir‐se al repressor lac, permeten

l’expressiódelsgensqueestrobensotacontroldelpromotorlac.Elmomentòptimperala

inducció és quan el cultiu d’E. coli ha assolit la fase exponencial de creixement, i és

determinada espectroscòpicament quan laDO600 és de 0.6‐0.8. És llavors quan s’afegeix

l’inductor IPTGaunaconcentració finalgeneralmentde0.5‐1mM, iesdeixaenagitació

constant(unes200rpm)finsunmàximde15h,incubantalatemperaturarequerida(20‐

37°C).


79

3.5.2. Obtenciódelextractecel·lular.

Capdelesproteïnesamblesqualss’hatreballatésexpressadaextracel·lularment,

pertant,uncopinduïdal’expressió,calrecuperarl’extractecel·lulardelcultiud’expressió

percentrifugacióa5520gdurant30mina4°C,idescartarelsobrenedantperdecantació.

El pellet de cèl·lules serà resuspès en el tampó adient per a seguir amb el procés de

purificació,obépotsercongelatambN2‐líquidiguardata‐20°C.

3.6. Tècniquesdecromatografialíquida.

Per a la purificació de les diferents proteïnes s’ha emprat una o varies de les

tècniquescromatogràfiquesdescritesacontinuació.Cadacolumnaesbasaenunmètode

de separaciódiferent, algunesmés indicadesper apassos inicialsdepurificació, i altres

mésindicadesperarefinarlapuresadelamostra,obé,preparar‐laperalsexperiments

posteriors. Les cromatografies d’alta resolució estan optimitzades per ser usades en

aparells d’FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography). L’acoblament de les columnes a

aquestssistemespermetl’automatitzaciódelprocés,aixícomlapossibilitatdetreballara

pressionssuperiorsal’atmosfèrica,definirprotocolsespecíficsoncontrolarelsfluxosiels

temps de les corregudes, com també indicar els volums de recol·lecció de mostra

automàtica.Altrescolumnessónacobladesaunabombaperistàtica(P‐1)peracontrolar

elfluxdelacolumna,obé,simplements’utilitzenapressióatmosfèrica.

Elsprotocols,condicionsitamponsempratsperalesdiferentscromatografieses

trobendetallatsal’apartatdeMaterialsiMètodesdecadacapítol,enfunciódelprocésde

purificaciódecadaunadelesproteïnestreballadesenaquestatesidoctoral.

3.6.1. Cromatografiad’afinitat

3.6.1.1. Cromatografiad’afinitatambhistidines.

La tècnica d’IMAC (ImmobilizedMetal ion Affinity Chromatography) es basa en

l’afinitatde cadenes lateralsespecífiquesderesidusproteicsper interaccionaramb ions

metàl·lics immobilitzats a la reïna cromatogràfica. Aquestes columnes són ràpides i

senzillesd’usar,iresultenmoltútilsenelsprimerspassosdepurificació,jaqueenunsol

pass’eliminengranpartdeproteïnescontaminants.

Peradiferentsprocessosdepurificaciódescritsalllargdelatesi,s’haempratles

columnesd’IMACHisTrapTMHP‐5mLambunareïnadeSepharosequecontéionsNíquel

immobilitzats (GEHealthcare), que interacciona específicament amb residus d’histidina.

Sovint, a les proteïnes recombinants, se’ls hi afegeix una cua d’histidines (His6‐tag)


80

normalmental’extremN‐terminal,pertald’assegurarunafortainteraccióamblacolumna

i, així, facilitar la sevapurificació respecte la restadeproteïnesdel extracte cel·lular.La

capacitatd’uniód’aquestescolumnesésde40mgd’(His)6‐tag/mLdereïna.Uncopfetala

separació,lacuad’histidinesseràeliminadaperproteòlisiespecífica.

La recuperacióde lesproteïnesunides específicament a la reïna, esduua terme

mitjançant l’aplicació de tampons amb concentracions creixents d’imidazol, l’anell

aromàticpresentalescadeneslateralsd’histidinaielquecompeteixperelsionsmetàl·lics

delareïna.

Aquestatècnicahaestatempradaperalapurificaciódelfragmentd’anticòsscFv‐

h3D6ilaproteasaTEV,ielseuprotocolexacteestrobadetallatal’apartatdeMaterialsi

MètodesdelCapítol1.

3.6.1.2. Cromatografiaatmosfèricad’afinitatperlipopolisacàrids.

Peral’extracciódelipopolisacàrids(LPSs)delesmostresproteiques,s’hanemprat

lescolumnesd’afinitatd’LPSsDetoxi‐gelendotoxinremovingcolumns(ThermoScientific).

Aquestescolumnescontenenunareïnad’agarosaenlaqueestrobaimmobilitzatellligand

polimixinaB, el qual uneix la porció de lípidAdels LPSs. La columna és capaçd’unir ≥

9995UE (unitatsd’endotoxina)d’unvolumdemostrade5mLqueconté10000UE.La

quantitatd’LPSpermLdemostraproteicadepèndelvolumdecultiud’expressiócel·lular

inicial, i s’haurà de tenir en compte en el moment de la seva extracció. La columna es

regeneraambeldetergentsodidesoxicolatal1%, iéstambéambaquestambelquales

trencalainteraccióentreelsLPSsilareïna,extraient‐losdelacolumna,uncoplamostra

ja ha passat per la columna sense interaccionar i ha alliberat els LPSs. Un dels

inconvenientsd’aquestacromatografiaésladificultatdequantificarelsLPSs,pertant,s’ha

deseguirunprotocolestricteirepetitiuperassegurarquelamostraéstroballiured’LPSs

isensetracesdeldetergentques’usapertald’equilibrarlacolumnainicialment.


h3D6,ielseuprotocolexacteestrobadetallatal’apartat3.6.1deMaterialsiMètodesdel

Capítol1.

3.6.2. Cromatografiadebescanviiònicd’altaresolució.

La cromatografia de bescanvi iònic separa biomolècules en funció de la seva

càrrega neta superficial. És una de les tècniques més usades per a la purificació de

proteïnes,tanenetapesinicialscomfinals,jaquetéunaelevadacapacitatd’unióiésmolt


81

resolutiva.Lesproteïnes,enfunciódelcontingutenresidusàcidsobàsics,presentenuna

granvarietatdecàrregasuperficial,iexhibeixendiferentsgrausd’interaccióamblareïna

cromatogràfica,carregadapositivaonegativament.Cadaaminoàcidionitzableposseeixun

valordepKadiferent,per tant, lacàrregasuperficiald’unaproteïnadependrà totalment

delpHdelentorn.Segonsaixò,quanelpId’unaproteïnaés igualalpHdelmedi, llavors

aquestanopresentaràcarrega.QuanelpHestrobapersotadelpI,laproteïnapresentarà

unacàrregaglobalpositiva,iviceversa.

FiguraM.2.Cromatografiadebescanviiònic.Exempleil·lustratiud’unacolumnadebescanvianiònic,onla

proteïnacarregadanegativamentinteraccionaamblareïnadecargapositiva.PergradientdeNaCl,aquestes

seraneluïdes.DepenentdelpHdelmedi, i delpIde laproteïna, aquesta tindràunacàrreganetapositivao

negativai,enfunciód’aquesta,caldràempraruntipusdeterminatdecromatografiaiònica.

Depenent de la càrrega de la proteïnad’interès, utilitzaremun cromatografia de

bescanvi catiònic o CEX (Cation EXchange chromatography), amb reïna carregada

negativament que uneix proteïnes de carga positiva; o bé al contrari, una columna de

bescanvi aniònic o AEX (Anion EXchange chromatography), amb reïna carregada

positivamentqueuneixproteïnesdecarganegativa(FiguraM.2).

L’elució de proteïnes unides s’aconsegueix incrementant la força iònica (o

concentraciód’NaCl)deltampó,obé,canviantelseupH.Alaugmentarlaforçaiònica,els

ionsNa+oCl‐competeixenperlescàrreguessuperficialsdelesproteïnesunides,trencant


82

la interacció amb la reïna i eluint‐les. Mitjançant diferents formes de gradient de força

iònica (lineal, escalat...), les proteïnes seran eluïdes diferencialment, sent les de menor

càrreganetalesprimeresensortirdelacolumna.Unacaracterísticaimportantd’aquestes

cromatografiesésquelamostras’elueixconcentradarespecteelsvolumsinicials.


h3D6(CEX)ideldominivariableAL‐12(AEX),ielseuprotocolexacteestrobadetallata

l’apartatdeMaterialsiMètodesdelCapítol1i3,respectivament.

3.6.3. Cromatografiad’exclusiómolecular.

3.6.3.1. Cromatografiad’exclusiómoleculard’altaresolució.

La cromatografia d’exclusió molecular (Size Exclusion Chromatography, SEC),

tambénomenadadegel filtració,esbasaen la separaciódemolèculesen funciódel seu

pesmolecular.Adiferènciade les altres cromatografies, lesmolècules no s’uneixen a la

reïna per afinitat ni interacció iònica, sinó que lamostra de proteïna avança dins d’una

matriuporosaformadaperpartículesesfèriquesinertes.

FiguraM.3.Cromatografiad’exclusiómolecular.Exemple il·lustratiude la fasesòlidaamb lespartícules

porosesatravésdelesqualslesproteïnesavancen,idepenentdelseupesmolecularsóneluïdesmésomenys

ràpidament.

Lesproteïnesdegrandàriapetitapodenpassarperdinselsporusdelespartícules,

deformaqueelseupasperlacolumnaésretingut,mentrequelesproteïnesgranseviten


83

els porus i elueixenmés ràpidament. Les columnes de SEC difereixen en la grandària o

límit d’exclusió dels porus de les partícules, per tant, depenent del pesmolecular de la

proteïna d’interès, caldrà emprar un determinat tipus de columna (Figura M. 3). La

columnaestrobaequilibradaambelmateixtampódelamostra,omplintelsespaisdela

matriu (fasemòbil) i l’interior de les partícules (fase estacionaria). Lamostra és eluïda

isocràticament,pertant,noésnecessaril’úsdediferentstamponsdurantlaseparació.La

composiciódeltampónoafectadirectamentalaresoluciódelacromatografia,sempreque

tingui una certa força iònica que eviti la interacció inespecífica de les proteïnes amb la

reïna. S’obté una resolució òptima quan la mostra ha estat prèviament purificada amb

altres tècniques cromatogràfiques, de forma que ja s’han eliminat gran part de les

proteïnes de pes similar. Per tant, és recomanable usar la SEC en els últims passos de

purificació,jaqueambellaespodensepararmonòmersd’agregatsiobtenirlaproteïnaen

el mateix tampó de magatzematge. Els únics inconvenients d’aquest tipus de

cromatografiasónquelamostras’had’aplicarenunvolumpetitiéseluïdaenunvolum

major.

AquestatècnicahaestatempradaperalapurificaciódeldominivariableAL‐12,i

elseuprotocolexacteestrobadetallatal’apartatdeMaterialsiMètodesdelCapítol3.

3.6.3.2. Cromatografia atmosfèrica d’exclusió molecular per intercanvi de

tampó.

Perarealitzarcanvisdetampód’unamostradevolumpetit,obédessalar‐la,s’han

emprat les columnes d’exclusió molecular PD‐10 Desalting columns (GE, Healthcare).

Aquestes columnes contenen una matriu de Sephadex G‐25 Medium, la qual permet

separargrupsdepesmoleculargran(majorsde5kDa)desubstàncies inferiorsa1kDa

(enelnostre cas, eldetergent sodidesoxicolat1%queprovéde l’eliminaciódelsLPSs),

mitjançantuncanvidetampó.

LaPD10ésunatècnicasenzilla,ambunprotocolestàndardontansolsvariaràel

tampó per el que es vol intercanviar lamostra, i és el següent, expressat en volums de

columna(1VC=5mL):

1. Rentarlacolumnaamb5VCd’aiguaMilli‐Qpertald’eliminarl’etanolempratperalaseva

conservacióa4°C.

2. Equilibrarlacolumnaamb5VCdetampód’elució.

3. Afegirunvolummàximde2.5mLdemostra(sielvolumdemostranoéssuficient,afegir

finsa2.5mLambtampóPBSpH7.4).


84

4. Pergravetat,eluiridescartarlafracciódemostranoatrapadaalacolumna(corresponent

almateixvolumdemostraafegit).

5. Pereluirlamostra,afegir3.5mLdetampód’elucióirecol·lectar‐laenfraccionsd’1mL.

6. Rentarlacolumnaamb5VCd’aiguaMilli‐Qiconservarlacolumnaa4°Cenetanolal25%.

3.7. Mètodesd’intercanvidetampóoextracciódesals.

Sovint és necessari realitzar un canvi de tampó o extraure les sals de lamostra

(NaCl, Imidazol...) entre les diferents tècniques del procés de purificació, o bé, per a

guardarlamostraproteicapuraeneltampóadequat.

Ambaquesta finalitats’hanempratdosmètodesdiferents,depenentdelprotocol

de purificació: la cromatografia atmosfèrica d’exclusió molecular (PD‐10), explicada a

l’apartatanterior,iladiàlisi.

3.7.1. Diàlisi.

Ladiàlisi consisteix en aplicar lamostradinsd’un sacdediàlisi omembranade

cel·lulosa,ambporusdegrandàriainferioraldelamostraproteica,deformaquepermet

l’intercanvidetampómentre lamostraquedadinselsac.Ladiàlisiesrealitzaa4°C,en

agitaciósuau,ienfrontunvolumdetampó500copselvolumdelamostra,durantmínim

3h.Perassegurarunabonadiàlisi, es recomana fer‐neduesen sèrie jaqueel factorés

multiplicatiu.

Lesproteïnesempradesenaquest treball sónmajorsde12kDa,així, els sacsde

diàlisiempratshanestatd’unamidad’exclusióde12‐14kDa(MedicellMembranesLtd).

Peradialitzarmostresdevolumsinferiorsa200μl,s’hanempratelstubsdediàlisi

MINIDialysisUnits(G‐Biosciences),ambunamidad’exclusióde8kDso15kDa,depenent

delaproteïnadialitzada.

3.7.1.1. Pretractamentdelssacsdediàlisi

Els sacs de diàlisi han de ser preparats abans de ser emprats. Per a fer‐ho es

segueixelprotocoldescritacontinuació:

1. Albunsen,bullir2‐3mdesacdediàlisidinsd’unerlenmeyeramb2LdetampóEDTA5

mM,pH8.0.

2. Arribaralpuntd’ebullicióimantenir‐lodurantuns5min,deixarrefredar.

3. Decantareltampóirepetirelprocés.

4. RentarelssacsambaiguaMilli‐Qabundant.

5. Guardarelssacspretractatsa4ºCen1Ld’aiguaMilli‐Q,afegir‐hi5gotesdecloroform.

6. Abansd’usar,rentarelssacsambaiguaMilli‐Qiambeltampóenelqualesfaràladiàlisi.


85

3.8. Concentraciódelvolumdelesmostresproteiques.

Per a treballar amb volums de mostra més manejables, o bé, per arribar a la

concentració de proteïna necessària per a realitzar diferents tècniques, s’han usat els

concentradorsperacentrífugaCentrifugalFiltersUnitsAmiconUltra‐15mLoUltra‐4mL

(Millipore).Elsconcentradorssóntubsquecontenenal’interiorunamembranaambuna

mida d’exclusió de 10 kDa, on s’aplica lamostra. Per centrifugació, normalment a 2500

rpm i a 4 °C, es concentra la mostra de proteïna. El temps de centrifugació depèn del

volumdemostrainicialidelasevaconcentració.

3.9. ElectroforesienSDS‐PAGE.

L’electroforesienSDSésundelsmètodesmésusatsenl’anàlisideproteïnes, ies

basaenlaseparaciódeproteïnessegonselseupesmolecular,dinsd’uncampelèctric.És

unaelectroforesidesnaturalitzant, jaqueeldetergentSDS,carregatnegativament, forma

una pel·lícula al voltant de les proteïnes, emmascarant la seva càrrega intrínseca i

desplegant‐les(Shapiro,Vinuela&Maizel1967).Comquelaquantitatdedetergentunités

proporcionalalagrandàriadelamolècula,aquestesavançarandinsdelgelenfunciódela

sevamassamolecular,sentlesproteïnesméspetiteslesdemajormobilitat.L’electroforesi

es realitza sobre un suport o gel d’acrilamida, una substància que polimeritza gràcies a

l’addició de Persulfat amònic (PA) i TEMED (N, N, N’, N’‐tetrametilè‐diamí), creant una

mallaporosa,eldiàmetredelqualdependràdelpercentatged’acrilamidausat.

El geld’acrilamidamésusatéseldiscontinu, formatperdues fases (ogels) amb

percentatgesd’acrilamidaipHdiferents:

‐ Gel separador o inferior: conté un percentatge d’acrilamida depenent de la

mostraasepararienellessepararanlesmolèculessegonselseupesmolecular:

% Acrilamida Rang de separació (kDa)

7 50 ‐ 500

10 20 – 300

12 10 – 200

15 3 ‐ 100


86

‐ Gelconcentradorosuperior:contéuntantpercentd’acrilamidaestàndard,del

4‐5%,iunpHmésàcidqueelgelseparador.Enellesformenelspousdecàrrega

deproteïna,permetlaconcentraciódelamostracarregadaiproporcionaunpunt

departidaigualperatoteslesmostresalaplicarelcampelèctric.

3.9.1. Preparaciódelgeld’acrilamida.

Peralapreparaciódelsgelss’utilitzenlessolucionssegüents:

‐ SolucióA:40%acrilamida/bisacrilamida37.5/1

‐ SolucióB:Tris/HCl1.5M,SDS0.4%,pH8.8

‐ SolucióC:Tris/HCl0.5M,SDS0.4%,pH6.8

‐ PA:Persulfatamònical10%(p/v)

‐ TEMED

Perapreparardosgelsd’acrilamidaal12,essegueixlareceptasegüent:

Gel separador A B H2O TEMED PA

12% 4 mL 2,5 mL 3.5 mL 10 μl 100 μl

Gel concentrador A C H2O TEMED PA

4% 0.65 mL 1.25 mL 3 mL 5 μl 50 μl

Lasoluciós’abocadinsd’unsuportdevidre,de0.75mmd’espaibuit, iposterior

ampladadelgel.Primers’afegeixelgel separador, seguitd’unesgotesd’isopropanolper

tald’eliminarpossiblesbombolles,evitarelcontacteambl’oxigenatmosfèric,iassegurar

queelgelinferiorpolimeritzirecte.UncoppolimeritzataTA,esdescartal’ispropanolper

decantacióivarisrentatsambaiguaMilli‐Q,is’afegeixasobreelgelconcentradorambla

pintacomamotlledelspousdecàrrega.UncopelgelhapolimeritzataTA,escol·locadins

lacubetad’electroforesi,laquals’had’omplirdetampód’electroforesi(TE)adientperala

circulaciódelcorrentelèctric:

‐ Tampód’electroforesiTE10x,1L:

30 g de Tris/HCl 0.25 M

140 g de Glicina 2 M

10 g d’SDS 1 % (p/v)


87

Abansdecarregarlesmostresalgel,espreparenambtampódecàrregais’incuben

5mina100°C,pertaldedesplegarcompletamentlesproteïnes.

‐ Tampódecàrrega4x,5ml:

0.12 g de Tris/HCl 0.2 M

2.5 g de Glicerol 50 % (p/v)

0.5 g d’SDS 10 % (p/v)

0.02 g de blau de bromofenol 0.4 %

(p/v)

300 μl β‐mercaptoetanol 15 % (v/v)

, que conté l’SDS (dodecilsulfat sòdic) per carregar negativament les proteïnes i

desplegar‐les, β‐mercaptoetanol per reduir possibles ponts disulfur, glicerol per a

introduir lamostradinsdelgelaugmentant ladensitat, ielcolorantblaudebromofenol

peraseguirelfrontd’avançamentdel’electroforesi.

Un cop carregades les mostres, s’aplica un amperatge constant de 25 mA/gel,

aproximadamentdurant1h,finsqueelfrontarribialfinaldelgel.

3.9.2. Tincióidestinciódelgeld’acrilamida.

Quan la separació ja ha finalitzar, es retira el gel de la cubeta i es disposa a ser

tenyit.Elsgelsd’acrilamidaes tenyeixenambel colorantblaudeCoomassie,enagitació

suaudurantaproximadament15min,aTA.

‐ TampódeTinció:

45 % de metanol

10 % d’àcid acètic

45 % d’aigua destil∙lada

0.2 % (p/v) de Coomassie Brilliant Blue

Per a destenyir el gel, es deixa en agitació en àcid acètic 10 %, o bé, en aigua

destil·lada,finsaobservarbélesbandesdeproteïnes.

IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesEspectroscòpiques

89

4. TÈCNIQUESESPECTROSCÒPIQUES.

4.1. Determinaciódelaconcentraciódeproteïna.

La concentració de proteïna, igual que la de DNA, es pot mesurar mitjançant

l’espectrofotòmetre,utilitzantunacubetadequarsd’1mL,obémitjançantelnanodrop,en

el que s’aplica 2 μl demostra. Les proteïnes absorbeixen llum al ultraviolat gràcies als

anellsaromàticsdelsresidustriptòfan,fenilalaninaitirosina,iunacertacontribuciódels

cadenescistinil,ambunmàximd’absorbànciaalvoltantde280nm,enfunciódelnombre

deresidusTrp,TyriPhequecontécadaproteïna.Coneixentelcoeficientd’extinciómolar

de la proteïna (ε) a 280 nm, i aplicant la llei de Lambert‐Beer, es pot determinar la

concentracióensoluciódeproteïnapura.

,oncés laconcentraciódeproteïna,enmols/L; i léselpasdellumdelacubeta

emprada,encm.

Enfunciódelaproteïna,elscoeficientd’extinciómolarusatshanestat:

‐ scFv‐h3D6: ε 45330u. Abs. M cm

‐ scFv‐h3D6experimental: ε 39997u. Abs. M cm

‐ VL‐AL12imutants: ε 13610u. Abs. M cm

‐ ProteasaTEV: ε 13840u. Abs. M cm

4.2. DicroismeCircular.

El Dicroisme Circular (CD) és una de les tècniques espectroscòpiques emprades

per a determinar l’estructura de proteïnes. Freqüentment, s’utilitzen longituds d’ona

corresponents al ultraviolat llunyà (de 260 a 190 nm), obtenint l’espectre d’estructura

secundària. Però també es pot determinar l’estructura terciària si s’utilitzen longituds

d’onadelultraviolatproper.

La tècnica de CD utilitza un espectrofotopolarímetre, el qual incideix llum

polaritzada circularment sobre lamostraproteica.Depenentde la geometriadel l’enllaç

peptídic de la mostra, aquesta absorbirà la llum i la dispersarà donant un espectre de

plegamentdeterminat (Johnson1988).Amés, el contingut en residus aromàtics i ponts

disulfur d’una proteïna, també contribueixen, de forma important, a l’espectre de CD


90

(Sreeramaet al. 1999). Ladesnaturalització tèrmicaperCD llunyà consisteix enobtenir

l’evoluciód’unpuntdeterminatdel espectre en funcióde la temperaturade25a90 °C,

relacionant‐se amb canvis en l’estructura secundària. Un cop la proteïna es troba

desplegada, es pot determinar el seu grau de reversibilitat registrant l’espectre de

renaturalitzacióatemperaturade25°C,obétotalacorbasencera.

LafiguraM.4mostral’espectredeCDtípicdel’estructurasecundàriadeproteïna

enhèlix‐α,fulla‐β,orandom‐coil.

FiguraM.4.EspectredeCDdediferentsestructuressecundàriesdeproteïnes.Hèlix‐α (negre), fulla‐β

(vermell)irandomcoil(verd).Figuraadaptadadewww.ap‐lab.com.

La tècnica de CD ha estat emprada per l’estudi de l’estructura secundària del

fragmentd’anticòsscFv‐h3D6ideldominivariableAL‐12,lescondicionsdelamostraiels

paràmetres d’adquisició dels diferents espectres es troben detallats a l’apartat de

MaterialsiMètodesdelCapítol1i3,respectivament.

4.3. Fluorescènciadelsresidusdetriptòfan.

La fluorescència consisteix en l’emissió de radiació electromagnètica per part

d’una molècula que passa d’un estat d’energia excitat, produït per l’absorció a una

determinadalongitudd’ona,alestatfonamental.

La fluorescència intrínseca dels residus aromàtics (Trp, Tyr i Phe) és una de les

propietats proteiques més emprades per a monitoritzar, mitjançant un fluorímetre,

processosdeplegament idesplegamentdeproteïnes.Concretament, la fluorescènciadel


91

residu triptòfan resulta molt sensible a pertorbacions en l’estructura terciària de

proteïnes, ja que sovint es troba força enterrat dins el nucli hidrofòbic. El seu anell

aromàtic,alserexcitataunalongitudd’onade290nm,emetfluorescènciaaunalongitud

d’onad’entre335i355nm.Deformageneral,esconsideraqueelmàximd’emissiódelTrp

al’estatnatiuésa240nm,mentrequeal’estatdesplegatésa255nm,degutal’exposició

del residu al solvent. La magnitud de desplaçament del màxim depèn de com estava

d’enterrat el Trp a l’estat natiu, i de si la proteïna arriba a desplegar completament, o

nomésparcialment.Totiaixò,laintensitatdel’emissiódefluorescènciadepèndel’entorn

localdelsresidusTrpdinsl’estructuraproteica,i,peraquestaraó,noespotpredirenquin

sentit variarà la fluorescència de cada residu Trp de la proteïna durant el procés de

desplegament.Degutaqueunresiduconcretpotaugmentar la seva intensitatdurantel

procésdedesplegament,mentrequeunaltrelapotdisminuir,quanenunaproteïnahiha

més d’un residu Trp la mesura de la intensitat de fluorescència no pren sentit, i és el

desplaçamentdelmàximcapalvermellelqueensdonaràinformacióútil(Royer1995).

Així com la desnaturalitzacióper CDens aporta informació anivell de canvis en

l’estructura secundària, la fluorescència ens permet seguir els canvis que pateix

l’estructuraterciàriadurantelprocésdedesnaturalitzacióorenaturalització.

Latècnicadefluorescènciahaestatempradaper l’estudide l’estructuraterciària

delfragmentd’anticòsscFv‐h3D6ideldominivariableAL‐12,lescondicionsdelamostrai

els paràmetres d’adquisició dels diferents espectres es troben detallats a l’apartat de

MaterialsiMètodesdelCapítol1i3,respectivament.

4.3.1. Desnaturalitzacióquímicaiobtenciódeparàmetrestermodinàmics.

Ladesnaturalitzacióquímica,mitjançanturea,ésundelsprincipalsmètodespera

estudiarl’estabilitatproteicaielprocésdedesplegamentdeproteïnes,ilapossibilitatde

detectar estats intermediaris de la via de plegament. La corba de desnaturalització

química pot ser adquirida mitjançant l’espectroscòpia de fluorescència o de CD,

enregistrant l’efecte de la urea sobre l’estructura terciària i secundària de la molècula,

respectivament.

A partir del ajust de corba de desnaturalització, seguida per fluorescència dels

residus Trp, a una equació de dos o tres estats, per exemple, es poden extraure els

paràmetres termodinàmics de la proteïna, com ara el valor de [D]50% (concentració de

desnaturalitzantenlaqualel50%delaproteïnaestrobadesplegada),de∆GN‐U(energia

lliuredeplegament),ielvalordemN‐U(diferènciaenl’accessibilitatalsolvententrel’estat

natiuieldesplegat,idirectamentrelacionatamblacooperativitatdelamolècula).


92

Totiserd’úsgeneral,labasemolecularperlaquallaureadesnaturalitzaproteïnes

ésdesconegut.Existeixenduesvessantsteòriques,laprimeradefensalainteracciódirecte

entre la urea i lamolècula, on la urea competeix amb les interaccions natives per pont

d’hidrogen i salines, afavorint el desplegament i estabilitzant l’estat desnaturalitzat. Per

altra banda, la segona teoria proposa que la urea afecta indirectament a la proteïna

alterantelseuentornosolvent,segrestantl’aiguadesolvatació,ifacilitantl’exposicióde

residushidrofòbicsenterrats(Bennion,Daggett2003,Das,Mukhopadhyay2009).

La tècnica de fluorescència ha estat emprada per a registrar la corba de

desnaturalització química del domini variable AL‐12. Les condicions de la mostra i els

paràmetresd’adquisiciódelsdiferentsespectres,aixícomelsajustosperal’obtenciódels

diferentsparàmetrestermodinàmics,estrobendetallatsal’apartatdeMaterialsiMètodes

delCapítol3.

4.4. FluorescènciadelsfluoròforsTioflavinaTiANS.

A part de la fluorescència intrínseca de les proteïnes, deguda als seus residus

aromàtics, és possible estudiar els canvis conformacionals de les proteïnes mesurant

l’emissió de fluoròfors que interaccionen específicament amb certes regions o estats

conformacionalsdelesmolècules.

Enaquestatesis’hanempratelsfluoròforsTioflavinaTiANS.

‐ Tioflavina‐T(ThT).

La ThT incrementa la seva intensitat de fluorescència al unir‐se a agregats

amiloides, per això és dels reactius més usats per a estudiar cinètiques de formació

amiloide.Elfluoròforésexcitataunalongitudd’onade450nm,elseuespectred’emissió

vade470a530nm,ambunmàximdefluorescènciaa482nm.

‐ ANS.

L’ANS (àcid 8‐anilin‐naftalè‐sulfònic) és un compost aromàtic que interacciona

amb regions hidrofòbiques exposades al solvent, donant lloc a un augment de la seva

fluorescència. La longitud d’ona d’excitació del ANS és a 388 nm, donant un espectre

d’emissióde400a600nm,ambelmàxima470nm.

La tècnica de fluorescència per ThT i ANS ha estat emprada per als assajos

d’agregació del fragment d’anticòs scFv‐h3D6. Les condicions de la mostra i els


93

paràmetres d’adquisició dels diferents espectres es troben detallats a l’apartat de

MaterialsiMètodesdelCapítol1.

4.5. Espectroscòpiad’infraroigambtransformadadeFourier(FTIR).

L’espectroscòpia d’infraroig és un dels mètodes clàssics per a determinar

l’estructurademolècules,degutalasevasensibilitatalacomposicióquímicaivariacions

en l’entorn. L’absorció de radiació infraroja dóna lloc a transicions vibracionals dels

enllaços covalents de les molècules. Per a l’estudi de proteïnes és treballa a l’infraroig

mitjà, concretament a la regió de vibració del enllaç amida I, situada entre els nombres

d’ona1700i1600cm‐1.Lafreqüènciavibracionaldel’amidaIésdeguda,principalment,al

grup carbonil (C=O) de cada enllaç peptídic de la proteïna, i la seva força depèn

directament de la conformació de l’esquelet polipeptídic, relacionat amb l’estructura

secundària.

La tècnica de FTIR és de les poques que permet estudiar l’estructura d’agregats

insolubles, com ara la de les fibres amiloides. Degut a que la conformació en fulla‐β és

característicadelsdiferentstipusd’agregatsproteics,monitoritzarelsseuscanvisdurant

elprocésd’agregaciópermetdescriureelpanoramaconformacionaldelaviad’agregació.

De forma general, durant el procés d’agregació, la posició del màxim de l’amida I es

desplaçacapanombresd’onamésbaixos,degutal’incrementdepontsd’hidrogen,dela

longituddelafulla‐βestesa,odelnúmerodecadenes‐β(Zandomeneghietal.2004).Per

aquestaraó,aquestatècnicaésmoltapropiadaperadiferenciarfulles‐βambdiferentgrau

d’empaquetamentiseguirprocessosd’agregació.

Un dels passos limitants del FTIR, és l’assignació dels components de la banda

d’amida I’ als diferents elements d’estructura secundària de la proteïna, sent molt

importantperaunacorrecta interpretaciódelsresultatsobtinguts(Arrondoetal.1993,

Arrondo,Goni1999).

L’espectroscòpiad’infraroig requereixd’una gran concentraciódemostraper tal

dequelarelaciósenyal/sorollsiguisuficientmentelevadaisignificativa.Amés,labanda

de vibració de l’enllaçO‐Hde lesmolècules d’aigua, localitzada a l’amida II (centrada a

1545 cm‐1), emmascara la zona d’absorció del enllaç amida I, dificultant l’obtenció de

informaciósobrelesconformacionsproteiques.Peraquestaraó,calintercanviarelsàtoms

d’hidrogen per deuteri, o aigua deuterada (D2O), mitjançant els tubs de diàlisi MINI

DialysisUnits (G‐Biosciences),obé, liofilitzant lesmostres iresuspesesenD2O.Labanda

amida Iobtingudaapartirdemostresdeuteradesesdenominaamida I’.Lesmostreses

col·loquen entre dos finestres de CaF2, separades mitjançant un espaiador de 50 μm

(ReflexAnalytical).


94

Peral’obtenciódelsespectress’haempratl’espectròmetreVarianResolutionsPro,

registrantl’espectrede4000a400cm‐1,aunavelocitatde95cm−1/min,unaresolucióde

2 cm‐1, i fent la mitjana de 1000 acumulacions. L’espectre va ser inicialment corregit

contraelsorolldefons(obackground),ilasenyaldeltampóidelvaporvanserrestades

abansdeprocedirambeltractamentdelesdades.

La tècnica de FTIR ha estat emprada per l’estudi de l’estructura i agregació del

fragment d’anticòs scFv‐h3D6, del domini variable AL‐12, i del domini PDZ3. Les

condicionsde lamostra,elsparàmetresd’adquisiciódelsdiferentsespectres,aixícomel

tractament de les dades i la deconvolució de la banda d’amida I’, es troben detallats a

l’apartatdeMaterialsiMètodesdelCapítol1,3i4,respectivament.

4.6. Microscòpiaelectrònicadetransmissió(TEM).

Lamicroscòpiaelectrònicapermetmagnificarmostres finsaunmiliódevegades

ambun límitde resolucióde2nm.Aquestamagnificació s’aconsegueixemprantun feix

d’electrons, modulat per una sèrie de lents electromagnètiques, de forma que incideix

sobre lamostraque es vol visualitzar. Part dels electrons seran capaçosde travessar la

mostra,mentrequealtresserandispersats,obtenintlaimatgeamplificada.Pertaldeque

elselectronsnosiguindispersatspermolèculesd’aire,totelsistemahad’estartotalment

albuit.

4.6.1. TinciónegativadelesmostresdeTEM.

Lesmostres han estat preparades amb tinció negativa d’acetat d’uranil al 1% i

disposades sobre reixetesde coure recobertesd’una capade carboni. La tinciónegativa

recobreixlamostraidispersaelselectrons,obtenintunboncontrastenlaimatge.

Elprotocolseguitperlapreparaciódemostres,haestatelsegüent:

1. Siconvé,diluirlamostra(1/10),ambelmateixtampó,pertaldevisualitzarcorrectament

lesestructuresd’interès.

2. Aplicar5μldemostrasobrelacapadecarbonidelareixeta,deixar‐horeposar2minaTA.

3. Absorbirl’excésdemostratocantlagotamitjançantpaperdefiltre.

4. Tenyirlamostraamb5μld’Acetatd’Uranil1%,deixarreposar2minaTA.

5. Absorbirl’excésd’acetatd’uraniltocantlagotaambunpaperdefiltre.

6. Assecar lamostra2minaTA.Lesmostrespodenservisualitzadesimmediatament,obé,

guardadesencondicionsdebuit.


95

Lesmostres han estat visualitzades al microscopi Hitachi H‐7000, del servei de

microscòpiadelaUABianalitzadesambelsoftwareDigitalMicrograph(Gatan).

La tècnica de TEM ha estat emprada per a l’estudi de l’agregació del fragment

d’anticòsscFv‐h3D6ideldominiPDZ3.Lacondicióieltractamentdelesmostresprevia

ser dipositades a la reixeta, es troben detallats a l’apartat de Materials i Mètodes del

Capítol1,i4,respectivament.

IV‐MaterialsiMètodesGenerals CultiusCel·lulars

97

5. CULTIUSCEL·LULARS.

Treballar ambcultius cel·lularsésunade lesopcionsmésempradesactualment,

comaprimeraaplicacióbiomèdica.Totique,realment,consisteixenunmètode invitro,

els cultius cel·lular és la primera aproximació real als experiments in vivo, com per

exemple, els models ratolins, i els seus resultats són considerats necessaris abans de

passarasistemesinvivo.

Lescondicionsde treballambcultiuscel·lularshandeser totalmentestèrils,per

aixòs’hatreballatdinslasaladecultiusdenivelldebioseguretatII,iencabinadecultius

denivelldebioseguretatI(DepartamentdeBioquímicaiBiologiaMoleculardelaUAB).

5.1. Líniacel·lulardeneuroblastomahumàSH‐SY5Y.

Perarealitzarelsdiferentsexperimentsdeviabilitat,s’hausatlalíniacel·lularde

neuroblastoma humà SH‐SY5Y (Cell Line Services, GmbH). Aquesta línia prové d’una

pacientambmetàstasialmolldel’os,ieslocalitzàalcervell.Lescèl·lulessónadherentsi

creixenformantagregats(oclústers),ambmúltiples,curtesifinesneurites;sensearribara

formarunamonocapaconfluent.

Peralseumantenimentipropagació,lescèl·luleshanestatincubadesa37°C,en

un5%deCO2,enflasconsde75cm2desuperfície(Sarstedt)ienmedidecultiuDMEM/F‐

12(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium/NutrientMixtureF‐12Ham); complementatamb

un10%deFBS(FetalBovineSerum),un1%deNAA(Non‐essentialAminoacids),iun1%

d’antibiòtics penicil·lina/estreptomicina (tot ells adquirits a Sigma‐Aldrich). El canvi de

medi s’ha fet cada 2 dies, realitzant dos rentats amb tampó PBS, pH 7.4, estèril, abans

d’afegirmedide cultiu fresc. És important temperar, al bany a37 °Cdurant20‐30min,

toteslessolucionsabansdeserusades.

5.2. Subcultiucel·lular.

Elsubcultiucel·lular,opassatge,esrealitzaquans’assoleix,aproximadament,el70

%deconfluència al flasc (pera la línia cel·lular SH‐SY5Y,uns4‐5dies).Al seruna línia

adherent, cal desenganxar les cèl·lules amb1mLdeTripsina‐EDTA1X (Sigma‐Aldrich),

incubant‐les durant 3min a 37 °C. La tripsinització s’inhibeix afegint 4mL demedi de

cultiufresc.Peradesferpossiblesagregatscel·lulars,esresuspenenlescèl·lulessuaument

iespassenaunflascnou,aunadiluciód’entre1/20i1/50.


98

5.3. Reservoridelalíniacel·lular.

Les línies cel·lulars poden ser conservades durant més de 2 anys congelades i

guardadesentancsdeN2‐líquid.Ésimportantmantenirunreservoridecèl·lules,jaqueles

característiques neuronals es van perdent a mesura que augmenta el nombre de

passatges.Amés,ésunrecanvinecessarienpossiblescasosdecontaminació.

‐ Criopreservació.Calpartird’unaelevadaconfluènciaperassegurarunamínima

viabilitataltornar‐lesadescongelar.Uncoplescèl·luleshanestatdesenganxades

del flasc i diluïdes amb medi de cultiu, es centrifuguen (5 min, a 1280 g), es

descartaelmediperaspiració, iesresuspenenamb1mLdemedidecultiufresc

complementat amb un 5 % de DMSO. Cada mL de cèl·lules, es disposa en un

criotubsde2mL,escongelena‐80°C,iméstardsónemmagatzemadesaltancde

N2‐líquid.

‐ Descongelació. Per a recuperar una línia congelada, s’extrau un criotub de

cèl·lulesguardades, esdeixa temperar2minaTA i seguidamentesdescongelen

completament al bany a 37°C. El mL de cèl·lules descongelades, es passa

automàticament a un flasc nou (recomanable que sigui de 25 cm2, per facilitar

l’adhesió) diluint‐les 1/10 en medi de cultius fresc. Quan les cèl·lules s’hagin

adherit(unes5h),aspirarelmediiafegir‐nedenoupereliminartoteslesrestes

deDMSO.

5.4. Comptatgedecèl·lules.

Sovintésnecessariquantificarelnombredecèl·lulesenunvolumdeterminatpera

prosseguirambexperimentsdecultius,comenelnostrecasdedeterminaciódeviabilitat

cel·lular.Inicialments’haviaempratlaCambradeNeubauer,peròelcomptatgeautomàtic

mitjançantl’aparellTC10™AutomatedCellCounterresultamoltútilpersersenzill,fiablei

ràpid.

Per a experiments de viabilitat, cal partir d’una elevada confluència cel·lular per

assegurar una concentració de mostra suficient. Un cop les cèl·lules han estat

tripsinitzadesidiluïdesambmedidecultiu,escentrifuguen(5min,a1280g),esdescarta

el medi per aspiració, i es resuspenen en un volum estimat per assolir la concentració

mínima(uns10mL).Esmesclen100μLdecèl·lulesresuspesesamb100μLdecolorant

Trypan‐blue,iesdisposen10μLalportadelecturaautomàtica,quetéunrangdedetecció

de 5·104 – 1·107 cèl·lules/mL. A partir del resultat obtingut, es calcula la dilució de la

mostranecessària.


99

5.5. Experimentsdeviabilitatcel·lulardeSH‐SY5Y.

Per als experiments de viabilitat s’han emprat plaques d’ELISA de 96 pous

(Sarstedt),enelsques’hihaafegit2·104cèl·lules/pou,en100μLdemedidecultiu.Les

plaquess’handeixatincubant24ha37°Cpera latotaladhesiódelescèl·lules.Deguta

quel’FBSpotinterferirenelsresultatsdeviabilitatcel·lular,abansdetractarlescèl·lules,

s’hareemplaçatelmediamb90μldemedidecultiuambnomésun2%d’FBS.Decada

una de les condició experimentals, s’han realitzat rèpliques de 6 pous, afegint 10 μl

mostra/pou(diluciómostra1/10).Lesplaquess’handeixat,denou,incubantdurant24ha

37 °Cper tald’assegurar l’efecte sobre les cèl·lules.Mitjançant elmètodede l’MTT, s’ha

mesuratlaviabilitatcel·lular.

5.5.1. AssajosdeviabilitatperMTT.

L’assaig per MTT quantifica l’activitat de l’enzim mitocondrial succinat

deshidrogenasa,mesurantdirectamentlaviabilitatcel·lular.L’MTTésunasoluciógrogosa

que,peractivitatdel’enzimmitocondrial,ésprecipitadaenformadeformazaninsoluble,

decolorblaufosc.

Acadaundelspousdelaplacad’ELISA,s’hiafegeixen10μld’MTT,a5mg/mLen

PBS (0.5 mg/mL al pou) i filtrat amb filtres estèrils de PDVF de 0.22 μm . La reacció

s’incuba4ha37°C.Peraspiració,s’eliminaelsobrenedant,ielscristallsdeformazansón

solubilitzatsamb100μldeDMSO,agitantdurant10minaTA.Laintensitatdecadapoués

mesuradacolorimètricamenta540nmia620nm,mitjançantellectordeplaquesd’ELISA

Victor3(PerkinElmer).Ladiferènciaentretotesduesmesureshaservitperacalcularel

tant per cent de viabilitat, fent la mitjana de les 6 rèpliques per placa i de, mínim, 2

experimentsindependents,indicantl’errorSEM(StandardErroroftheMean).

Els experiments de viabilitat per MTT han estat emprats per a l’estudi de

citotoxicitat del pèptid Aβ1‐42 i l’efecte del fragment d’anticòs scFv‐h3D6, així com del

dominiPDZ3.Lacondicióieltractamentdelesmostrespreviaserafegidesalcultiud’SH‐

SY5Y, es troben detallats a l’apartat de Materials i Mètodes del Capítol 1, i 4,

respectivament.

IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesBioinformàtiques

101

6. TÈCNIQUESBIOINFORMÀTIQUES.

6.1. Modelatgetridimensionaldel’scFv‐h3D6.

Elmodelatge tridimensional de proteïnes esdevé unamolt bona alternativa a la

cristal·lització,quesovintresultadifícild’aconseguir(Bramuccietal.2012),ialaresolució

d’estructuresperressonànciamagnèticanuclear(RMN),quetélalimitaciódelagrandària

de la cadenapolipeptídica (màximuns200 residus) i és incompatible amb la presència

d’agregats (Wuthrich 2001). A partir d’un modelatge proteic s’obté una fiable

caracteritzaciódelaproteïna,tananivelld’estructurasecundària icomterciària,encara

que els residus que no tenen identitat amb el motlle del model poden quedar en una

orientació inadequada. Determinar residus conservats, exposats o enterrats, reconèixer

interaccions locals o distants dins la molècula, o localitzar, dins de l’estructura

tridimensionaldelamolècula,lesregionsambtendènciaal’agregaciópreditesapartirde

la seqüència, són dades molt útils per a entendre el comportament de la molècula i

millorar‐ne l’experimental.Amés, la sevapossibilitatde rotacióen3Dpermet localitzar

cadenes lateralsquepodensercausadebaixaestabilitat i/osolubilitatde lamolècula, i

facilitaeldissenydepossiblesmutantsdelaproteïna.

En el nostre cas, s’ha construït un model de l’estructura tridimensional del

fragmentd’anticòsrecombinantscFv‐h3D6.Peralseudissenys’hafetúsdelestècniques

bioinformàtiquesdescritesal’apartatdeMaterialsiMètodesdelCapítol2.

6.2. ExPASy.

L’ExPASyésunportalderecursosbioinformàtics(SwissInstituteofBioinformatics,

SIB)elqualdónaaccésadiversesbasesdedadesieinescientífiques.Algunsexemplessón:

‐ ProtParam. Consisteix en una eina que permet obtenir varis paràmetres físics i

químicsapartird’unadeterminadaseqüènciaproteica,comaraelpesmolecular,

elpI,elcoeficientd’extinciómolar,etc.S’hadetenirencompte,però,queaquests

sónvalorsteòricsiaproximatsquepodenservircomaideageneraliinicial.

‐ Reverse/Translate.Permetferanàlisideseqüènciadenucleòtidsid’aminoàcids,

sobretotal’horadecomprovarresultatsdeseqüenciaciódeDNA.

‐ BLAST.Empratperalarecercad’homologiadeseqüènciesdipositadesenelPDB

(ProteinDataBank).

V. CAPÍTOLS.

CAPÍTOL 1: Un fragment variable de cadena senzilla

(scFv‐h3D6) anti‐Aβ impedeix la formació de fibres

amiloides i la citotoxicitat del pèptid Aβmitjançant la

retiradad’oligòmersdelaviaamiloide.

ARTICLESRELACIONATS:

Ananti‐Aβ(amyloidβ)single‐chainvariablefragmentpreventsamyloidfibrilformationandcytotoxicitybywithdrawingAβoligomersfromtheamyloidpathway

Marin‐Argany,M.*,Rivera‐Hernández,G.*,Martí‐Clua,J.&Villegas,S.

BiochemicalJournal437,25–34(doi:10.1042/BJ20101712)2011

*Firstco‐author

Earlyinterventioninthe3xTg‐ADmicewithanamyloidβ‐antibodyfragmentamelioratesfirsthallmarksofAlzheimerdisease.

Giménez‐Llort,L.,Rivera‐Hernández,G.,Marin‐Argany,M.,Sánchez‐Quesada,JL.&Villegas,S.

mAb5:5,665–677(doi:10.4161/mabs.25424)2013

V‐Capítol1 Resum

107

1. RESUM.

La immunoteràpia anti‐Aβ s’ha revelat com una eina esperançadora en el

tractament de la malaltia de l’AD. L’administració de fragments variables de cadena

senzilla(single‐chainvariablefragment,scFv)noprodueixelsefectesadversosobservats

en l’administració d’anticossos complets. En el següent capítol, es presenta l’expressió

recombinantdelscFv‐h3D6,derivatd’unmAbhumanitzatespecíficperaβ‐oligòmers,així

comlademostraciódelasevacapacitatperanul·larlatoxicitatinduïdaperelpèptidAβ1‐42

a la línia cel·lular de neuroblastoma humà SH‐SY5Y. Per a conèixer els canvis

conformacionals de l’scFv‐h3D6 relacionats amb la prevenció de tal toxicitat, es descriu

l’espaiconformacionaldel’scFv‐h3D6sotapertorbaciópertemperatura.L’escalfamentdel

estatnatiunocondueixacapgraudedesplegamentdelaproteïna,sinódirectamentaun

estatintermediarireorganitzatqueiniciaunaviad’agregació.Aquestaviad’agregacióno

és una via amiloide, com la que segueix el pèptid Aβ, sinómés aviat una via en la que

apareixen fibres worm‐like que, notablement, resulten ser no tòxiques. En condicions

fisiològiques, aquesta via es troba termodinàmica i cinèticament afavorida quan l’scFv‐

h3D6 i elsoligòmers‐Aβ1‐42 formenuncomplex, elqueexplica com l’scFv‐h3D6retirael

pèptidAβdelaviaamiloide.Aquestaéslaprimeradescripciód’unmecanismemolecular

pelqualunscFvevitalatoxicitatdelsoligòmersformatspelpèptidAβ.

V‐Capítol1 Introducció

109

2. INTRODUCCIÓ.

Des del primer indici de neurotoxicitat induïda pel fragment C‐terminal, de 105

residus, de la proteïna APP (Amyloid Precursor Protein) (Yankner et al. 1989), fins a

l’actualitat,moltessónlesevidències,ivanenaugment,dequeelsoligòmerssolublesdel

pèptidamiloideAβsónlacausadelapèrduadesinapsisideldanyneuronalcaracterístic

delamalaltiadel’AD(AD)(Lansbury,Lashuel2006).Conseqüentment,s’havistquecerts

problemescognitiusapareixenabansdequeelsdipòsitsamiloidess’haginformat(Dineley

etal.2002).Amésamés, laseveritatd’aquestsdèficitsestrobencorrelacionatsambels

nivells d’Aβ soluble, i no amb la presència de plaques amiloides (McLean et al. 1999).

Ambduesobservacionsindiquenquelaneurodegeneracióésprèviainocomaresultatde

ladeposicióamiloide.D’acordambaixò,existeixlanecessitatdetrobarnovesteràpiesque

capturinelsoligòmersd’Aβenllocdelesfibresamiloides.

Deformanatural,enellíquidcerebroespinalhumàienelplasmad’individussans,

hisónpresentsanticossoscontraelpèptidAβ39‐42,elsnivellsdelsquals,però,esredueixen

significativament en pacients d’AD, suggerint que la patologia pot tenir una base

immunodeficient (Solomon 2009). Les primeres descripcions respecte el potencial

terapèutic dels anticossos anti‐pèptid Aβ es basaven en la inhibició de la fibril·lació in

vitro,ienlaprevenciódelaneurotoxicitatdelpèptidAβ1‐40encultiuscel·lulars(Solomon

et al. 1997). Laprimerademostracióde l’efectivitat de la immunoteràpia contra l’Aβ, in

vivo, es va obtenir en ratolins PDAPP transgènics, els quals sobreexpressen la proteïna

humanaAPPmutadaenelresiduVal717perFenilalanina(V717F)(Schenketal.1999).En

aquestcas, la immunitzacióactiva,ambelpèptidAβ1‐42, redueixdràsticament lacàrrega

amiloide del còrtex cerebral i del hipocamp. Subseqüentment, l’efectivitat de la

immunoteràpia passiva (comper exemple, administrant anticossos dirigits contra l’Aβ),

tambévasertestadaenelsmateixosratolins(Bardetal.2000).Uncopesvaaconseguir

superarlesdiferentsfasesclíniquesambmodelsanimals,esvaprosseguiramblesproves

ambhumansvacunatsactivamentambelpèptidAβ1‐42(Schenk2002).Noobstant,lafase

clínica, nomenadaAN‐1792, va ser aturada degut a l’aparició de complicacions de tipus

meningoencefalítiques (Nicoll et al. 2003). Tot i que el tractament va ser parat, aquells

pacients que van ser inicialment immunitzats van continuar sent monitoritzats, i es va

detectarunimportantretarddeladavalladacognitiva,finsitotunanydesprèsdel’última

dosi (Hocket al.2003).Apartde lameningoencefalitis,unaltredelsefectes secundaris

d’administrar l’anticòs sencer, és que agreuja la angiopatia amiloide cerebral (CAA), un

trastorn dels vasos sanguinis del SNC caracteritzada pel depòsit dematerial β‐amiloide

sobrelesparets(Pfeiferetal.2002).


110

Desprésdenombrososestudisperaprevenirels efectes secundarisnodesitjats,

lesprovesclíniquesqueméshanavançatsónlesdelavacunaACC‐001,queconsisteixen

un derivat del pèptid Aβ, i les del anticòs AAB‐001, o Bapineuzumab, un anticòs

monoclonal(mAb)murídirigitcontraelsresidus1‐5del’extremN‐terminaldelpèptidAβ

(mAb‐h3D6), el qual és específic dels oligòmers d’Aβ (Jacobsen 2006, Wisniewski,

Konietzko 2008, Nitsch, Hock 2008). Malgrat les grans expectatives, aquest últim

tractamentvaseraturatenfaseclínicaIII,degutaresultatscontradictoris(Thomas2012).

En faseclínica II,elsefectesadversosdelBapineuzumaberen lleus i transitoris,peròva

causaredemavasogènic(Rinneetal.2010).Aquestefectevaserrelacionatambladoside

fàrmac, i lamajoria dels casos eren portadors de l’al·lelAPOE4. Desafortunadament, les

restriccions de dosi i el reclutament de pacients amb l’al·lelAPOE3, elmés freqüent en

humansinorelacionatambl’ADesporàdic,novansersuficientsperaseguiramblafase

III (Thomas 2012). Cal mencionar que aquestes proves van ser realitzades en pacients

ambundiagnòsticde lamalaltiamassaavançat, tal icomreivindica larevistaWorldAD

Report2011(Prince,Bryce&Ferri2011).

Per aquests raó, la immunització passiva amb fragments variables de cadena

senzilla (single‐chain variable Fragment, scFv), és a dir, anticossos mancats de la regió

costant Fc, resulta ser una estratègia terapèutica molt esperançadora per a la malaltia

d’AD,jaquenoactivalamicròglia,noprodueixhemorràgiacerebral,niedemavasogènic,i

ha estat demostrat ser tan potent i específica com la realitzada amb elsmAb parentals

(Fukuchietal.2006,Zameeretal.2008,Robertetal.2009).Noobstant, laquantitatde

proteïnascFvrecombinantobtingudadesprésde lasevapurificació,és,engeneral,molt

baixa,degutalessevespropietatsdeplegamentiestabilitat(Zheng,Baumann&Reymond

2003). De forma habitual, la producció de les diferents variants d’scFv és realitzada en

sistemes dephage‐display (Fukuchi et al. 2006, Zameer et al. 2008), o bé per expressió

periplasmàticaenE.coli(Wall,Pluckthun1999,Robertetal.2009).Pocssónelscasosque

aconsegueixen una expressió soluble d’scFv i, per a fer‐ho, l’expressen en forma

precursora o, altrament dit, l’scFv unit a una proteïna fusió (o protein tag), dins del

citoplasmad’Origami(DE3),untipusdesocad’E.coliqueafavoreixl’ambientoxidatiuen

elcitoplasma,beneficiantelcorrecteplegamentdeproteïnesquepresentenpontsdisulfur

(Zheng,Baumann&Reymond2003,Jurado,deLorenzo&Fernandez2006).

Enelsegüentcapítols’exposaparttreballrealitzatdurantaquestatesidoctoral,en

elques’hafetservirlaseqüènciadelanticòsmAb‐h3D6.v2peraconstruirungensintètic,

consistent enundomini variablede cadenapesada (VH) i undomini variablede cadena

lleugera (VL) units per un connector del tipus (Gly4Ser)3, l’scFv‐h3D6. L’expressió de la

proteïna precursora, (His)6‐trx‐dianaTEV‐scFv‐h3D6, s’ha realitzat en la soca


111

Origami2(DE3).Laproteïnadefusió,latioredoxina(trx),haestateliminadaeficientment

perlaproteasaTEV(TobaccoEtchVirus)(Nallamsettyetal.2004).

L’efectivitatdelscFv‐h3D6perarevertir la toxicitatde l’Aβ,haestatdemostrada

enlalíniacel·lulardeneuroblastomahumàSH‐SY5Y.Seguidament,s’haobtingutelperfil

conformacionalde l’scFv‐h3D6un cophaestatpertorbatper temperatura, ladescripció

delqualenshapermèscomprendremillorelmecanismemolecularperelquel’scFv‐h3D6

és capaç de capturar oligòmers d’Aβ1‐42. El tractament amb temperatura indueix la via

d’agregació de l’scFv‐h3D6, caracteritzada per un estat intermediari ric en estructura‐β

queagregaenformadefibresworm‐like(WL).Aquestesfibressóndiferentsdelesfibres

amiloides formades pel pèptidAβ, especialment a nivell de citotoxicitat i de precursors

oligomèrics.Amés,laformaciódefibresWL,perpartdel’scFv‐h3D6,ésafavoridacinètica

i termodinàmicamentquan s’uneix específicament als oligòmersd’Aβ1‐42, fet que explica

com l’scFv‐h3D6 retira els oligòmers d’Aβ1‐42 de la via amiloide i, conseqüentment, com

evitalasevacitotoxicitat.

En referència a la tesi doctoral en redacció de Rivera‐Hernández, G. (Rivera‐

Hernandez 2013), els bons resultats obtinguts en experiments de cultiu cel·lulars, ha

portatalnostregrupderecercaainvestigarelpotencialpreventiudel’scFv‐h3D6invivo,

mitjançant l’administració intraperitoneal de l’scFv‐h3D6 en ratolins 3xTg‐AD de cinc

mesos d’edat, un treball recent del nostre grup de recerca en el que s’han obtingut

resultatsmoltesperançadors(Gimenez‐Llortetal.2013,Esquerda‐Canalsetal.2013).

V‐Capítol1 MaterialsiMètodes

113

3. MATERIALSIMÈTODES.

3.1. Expressióipurificaciódel’scFv‐h3D6.

Lasocad’E.coliempradapera l’expressió intracel·lularde l’anticòsrecombinant

scFv‐h3D6haestat l’Origami2(DE3),mitjançantelvectord’expressiópETtrx‐1a(veure

apartats3.1i3.4deMaterialsiMètodesGenerals).Apartirdel’expressió,s’hapurificatla

proteïna de fusió (His)6‐trx‐dianaTEV‐scFv‐h3D6 (40.6 kDa) de la fracció citosòlica

insolublei, finalment,s’haobtingutl’scFv‐h3D6pur(26.4kDa)mitjançanteltallambla

proteasaTEVicromatografiesd’afinitatidebescanviiònic.Ésimportantmencionarque,

unapartde laproteïna s’obtinguédirectamentde la fracció soluble, encaraqueambun

rendimentmoltbaix.Peraquestaraós’hatreballatúnicamentamblafraccióinsoluble.

3.1.1. Expressióheteròlogadel’scFv‐h3D6.

Peral’expressiódelfragmentd’anticòsscFv‐h3D6s’haseguitelsegüentprotocol:

1. Transformació de les cèl·lules competents Origami2(DE3) amb DNA vector

pETtrx_1a::scFv‐h3D6(veureapartat2.2MaterialsiMètodesGenerals).

2. Picarunacolòniaen5mLdemediLBlíquidsuplementatambelsantibiòticsTet(selecció

delasoca)iKn(selecciódelvector).


4. Pre‐inocular, enunvolum finalde50mLdemediLBambantibiòtics,unadilució1:10 i

incubaralesmateixescondicionsanteriorsfinsarribaraunaDO600de0.2‐0.4.

5. Inocular,enunvolumfinald’1LdemediLBambantibiòtics,unadilució1:100iincubara

les mateixes condicions anteriors fins arribar a una DO600 de 0.6‐0.8. (Per a obtenir

suficientquantitatdeproteïna,normalments’hanexpressat4erlenmeyersde2Lamb1L

deLBpererlenmeyer)

6. Disminuirlatemperaturadelincubadora20°Ciinduirl’expressióambIPTG0.5mM.

7. Incubar15ha20°C,enagitacióconstantde200rpm.

3.1.2. LLisiCel·lular.

Un cop s’ha recuperat l’extracte cel·lular (veure apartat 3.5.2 de Materials i

Mètodes Generals), s’ha prosseguit amb el protocol de llisi cel·lular següent, per tal de

recuperarlafracciócitosòlica:

1. Resuspendreelpelletdecèl·lulesamb40mLdeTampódellisi(Tris/HCl160mM,NaCl4

M, pH 8.5, prèviament refredat a 4 °C) per L de cultiu expressat, fins a ser totalment

homogeni.

2. Sotmetrelescèl·lulesa3ciclesdecongelacióambN2‐líquididescongelacióaTA


114

3. Sonicarlasoluciómitjançant6ciclesde45segons,apotència9iunafreqüènciadel50%,

mantenintlamostrasempreengelireposant3minentrecicles.

4. Centrifugar a 43700 g durant 40min a 4 °C, per a separar la fracció total soluble de la

insoluble.

5. Descartarelsobrenedantperdecantacióimantenirelpelletengel.

3.1.3. Solubilitzaciódelafraccióproteicainsoluble.

Totiquepartdelaproteïnaexpressadaestrobaenlafracciócitosòlicasoluble,el

rendimentobtingutdepurificaraquestafraccióésbaixis’haoptatperarecuperartansols

la fracció insoluble. Per a fer‐ho, es resuspèn el pellet amb 10 mL de Tampó de

Solubilització (Urea 8 M en Tris/HCl 100 mM, Glutatió reduït (GSH) 10 mM, pH 8.5,

prèviamentrefredata4°C)perLdecultiuexpressat,finsaserpràcticamenthomogeni.El

pellets’acabaderesuspendreperagitacióorbitala4°Cdurantmínim2h.Acontinuacióes

centrifuga a 43700 g durant 40min a 4 °C, per a separar la fracció solubilitzada de la

insoluble, es recupera el sobrenedant per decantació, i es filtra la mostra per un filtre

PVDFde0.45μm.

3.1.4. Replegamentgotaagotadelafraccióproteicasolubilitzada.

Peral replegament, la fracciósolubilitzadaenurea, iquees trobadesplegada,es

dilueix(dilució1:10)en90mLTampódeReplegament(Tris/HCl100mM,L‐Arginina100

mM,Glutatióoxidat(GSSG)0.15mM,pH8.5,prèviamentrefredata4°C)perLdecultiu

expressat.Ladilucióesrealitzaa4°C,perdegoteiglentambunapipetaPasteur,iagitació

suaudeltampó;iaixíafavorirelreplegamentdelaproteïnaenelnouentornoxidatiu.Un

copreplegatdurantunes36h,a4°Ciagitaciósuau,escentrifugaa43700gdurant40min

a4°C,perasepararlafracciósolublereplegadadel’encarainsoluble.

3.1.5. DigestióambproteasaTEV.

Uncoptenimlafraccióreplegadaisolubilitzada,calrealitzareltallespecíficamb

laproteasaTEV(Nallamsettyetal.2004),pertald’aïllarlaproteïnascFv‐h3D6delaseva

forma precursora, o de la proteïna fusió (His)6‐trx. Per a realitzar el tall amb TEV cal

dialitzarlamostraaTampódeDigestióambTEV(Tris/HCl20mM,NaCl100mM,EDTA

0.5mM,pH8.3).Enaquestpuntsovintcalcentrifugarlamostraa43700gdurant40mina

4°C,pertald’eliminarpossiblesprecipitats.


115

ReacciódeTallambTEV:

‐ Lareaccióde tall es faenpresènciadelpar redoxGSH/GSSGaunaconcentraciófinalde3mMi0.3mM,respectivament.

‐ Larelacióproteïna:proteasaésde1:50.

‐ AjustarelpHa8.3.

‐ Incubara30°C,durant4henagitaciósuau.

3.1.6. Cromatografiad’afinitatambhistidines.

PertaldesepararelsproductesdeltallambTEV,s’hautilitzatunacolumnad’IMAC

HisTrap(veureapartat3.6.1.1deMaterialsiMètodesGenerals).Deformaquelaproteïna

precursoranotallada,laproteïnadefusió(His6‐trx)ilamateixaTEV,quedenatrapadesa

lacolumnaperafinitatdelacuad’histidines;mentrequel’scFv‐h3D6éseluïtirecuperat

directament de la columna juntament amb altres proteïnes del cultiu cel·lular. Per tant,

caldrà un pas més de purificació (columna de bescanvi catiònic, CEX) per a obtenir el

fragmentd’anticòstotalmentpur.

Elstamponsutilitzatsperalacromatografiasónelssegüents:

‐ TampódeCàrrega:NiSO450mM.

‐ Tampód’UnióideRentat:Tris/HCl20mM,NaCl150mM,pH8.3.

‐ Tampód’Elució:Tris/HCl80mM,NaCl4M,Imidazol2M,pH8.3.

ElfluxdelacromatografiahaestatcontrolatmitjançantunabombaperistàlticaP‐

1,onmanualmentescanvia lamostra,oel tampó, i lavelocitatd’injecció,quehadeser

d’entre 1 i 2mL/min. Per tal d’assegurar que tota la fracció de proteïna que conté cua

d’histidiness’uneixialacolumna,s’hanacoblatduescolumnesd’IMAC,obtenintunvolum

decolumnafinalde10mL(1VC=5mLx2)iunadoblecapacitatd’unió.

Elprotocolseguitperarealitzarl’IMAC,expressatenvolumsdecolumna(VC),és

elsegüent:


conservacióa4°C.

2. Regenerar la columna amb10VC deNiSO4 50mM i rentar‐ne l’excés amb5VC d’aigua

Milli‐Q.

3. Equilibrarlacolumnaamb10VCdetampód’unió.

4. Filtrar la mostra amb filtres de PVDF de 0.45 μm i injectar‐la a un flux constant de 2

mL/min.


116

5. Recollirlafracciódeproteïnanounidaacolumnaiguardar‐laa4°C.Aquestafraccióconté

la proteïna scFv‐h3D6 aïllada de la forma precursora, juntament a altres proteïnes

contaminants.

6. Rentar lacolumnaamb5VCdetampód’unió,perarecuperar la totalitatdeproteïnano

unidaiguardar‐laa4°C.AquestafracciócontélaproteïnascFv‐h3D6aïlladadelaforma

precursora,juntamentaaltresproteïnescontaminants.

7. Eluiridescartarlafracciódeproteïnaunidaamb5VCdetampód’elució.Aquestafracció

contélaproteïnafusióHis6‐trx.

3.1.7. Cromatografiadebescanvicatiònic.

Per a l’últim pas de purificació de l’scFv‐h3D6, s’ha emprat una columna de

bescanvicatiònic(CEX)ResourceS‐6mL(GEHealthcare)(veureapartat3.6.2deMaterials

iMètodesGenerals),mitjançant laqual es separen la fracciód’scFv‐h3D6nativa de les

formes scrambled. Les formes scrambled són totes aquelles combinacions en que es

podenformarelspontdisulfur,tantnatiuscomnonatius.Alaseqüènciadel’scFv‐h3D6hi

trobemquatrecisteïnes,pertantexisteixenfinsanouformesscramblesteòriques.LaCEX

és capaçde separar lesdiferents espècies scrambled quepresenta l’scFv‐h3D6,obtenint

finalmentl’scFv‐h3D6100%natiuipur.

Peralacromatografia,caldialitzarlamostraaTampód’UniódeCEX(Na2HPO48.3

mM,pH6.5).


‐ Tampód’UnióideRentat(A):Na2HPO48.3mM,pH6.5.

‐ Tampód’Elució(B):Na2HPO48.3mM,NaCl1M,pH6.0.

ElpIteòricdelaproteïnaésde8.3,alutilitzaruntampóapH6.5,lamostraestarà

carregadapositivamenti interaccionaràamblareïnanegativa.Peral’eluciódeproteïna,

s’hautilitatungradientlinealambunincrementdelaforçaiònicadeΔ10%B/28CV(o

bé,0.06%B/mL).Lacapacitatd’uniódelacolumnaésde270mg(BSA,67kDa),pertant,

elvolumdemostrainjectatdependràdelaquantitatdeproteïnaenella.

ElprotocolseguitperarealitzarlaCEX,expressatenvolumsdecolumna(1VC=6

mL),éselsegüent:


conservacióa4°C.

2. Equilibrarlacolumnaamb5VCdetampóA.

3. Filtrar lamostraperunfiltrePVDFde0.45μmi injectar‐la,via loopde50mL, aunflux

constantde2mL/min.


117

4. Rentar lacolumnaamb5VCdetampóA,peratald’eliminarcompletament lafraccióde

proteïnanounidaacolumna.

5. Aplicar un gradient d’elució de Δ 10% B/28 VC, a un flux constant de 1 mL/min, fins

arribaral100%d’aquesttampó.Recol·lectarfraccionsd’1mL.

6. Rentarlacolumnaa100%detampóBdurantun1VC,aunfluxconstantde2mL/min,per

acabard’eluirtotalafracciódeproteïnaunida.

7. Re‐equilibrarlacolumnaal100%detampóAamb1VC,aunfluxconstantde2mL/min.

La proteïna scFv‐h3D6 elueix a un 7‐9% de tampó B (aproximadament 80mM

d’NaCl),donantllocadospicsforçasolapats.Elprimerpiccorresponalafracciód’scFv‐

h3D6natiu, ielsegonalafraccióscrambled;alesfraccionscorresponentsalsolapament

de pics hi trobem una mescla d’ambdues poblacions. És molt important separar

correctamentelsdospics,perassegurarqueelpooldeproteïnascFv‐h3D6estroba100%

plegada nativament. La fracció scFv‐h3D6‐h3D6 pura es dialitza a tampó PBS pH 7.4,

s’aliquotaeneppendorfsd’1mL,iescongelaambN2‐líquidperaguardar‐laa‐20°C.

3.2. ExpressióipurificaciódelaproteasaTEV.

Lasocad’E.coliempradaperal’expressióintracel·lulardelaproteasaTEVhaestat

la C41(DE3), mitjançant el vector d’expressiópMHTΔ238 (veure apartats 3.1 i 3.4 de

Materials i Mètodes Generals). De l’expressió, s’ha purificat la proteïna de fusióMBP‐

dianaTEV‐(His)7‐TEVdelafracciócitosòlicasoluble,laquals’auto‐digeriràdonantlloca

laproteïna(His)7‐TEV,purificadamitjançantunpasdecromatografiad’afinitat.

3.2.1. ExpressióheteròlogadelaproteasaTEV.

Peral’expressiódelaproteasaTEVhaestats’haseguitelsegüentprotocol,extret

deBlommel,P.G.etal.(Blommel,Fox2007):

1. Transformació de les cèl·lules competents C41 amb DNA vector pMHTΔ238::TEV (veure

apartat2.2MaterialsiMètodesGenerals).

2. Picar una colònia en 5 mL de medi LB líquid suplementat amb l’antibiòtic Kn (selecció del

vector).


4. Inocular,enunvolumfinald’1LdemediLBambantibiòtics,unadilució1:100,iincubarales

mateixes condicions anteriors fins arribar a una DO600 de 0.6‐0.8. (Per a obtenir suficient

quantitatdeproteïna, normalment s’hanexpressat4 erlenmeyersde2L amb1LdeLBper

erlenmeyer).

5. Disminuirlatemperaturadelincubadora25°Ciinduirl’expressióambIPTG0.5mM.

6. Incubarunmàxim4ha25°C,enagitacióconstantde200rpm.


118

3.2.2. PurificaciócitoplasmàticadelaproteasaTEV.

Elprotocoldellisicel·lularperalapurificaciódelaproteasaTEVéselmateixque

l’emprat per a llisar les cèl·lules Origami2(DE3)+pETtrx_1a::scFv (veure apartat 3.1.2),

ambl’únicadiferènciaqueelvolumdetampódellisiusatsegueixunarelacióde6mLde

tampópergrd’extractecel·lularrecuperatdel’expressió.

3.2.3. Cromatografiad’afinitatambhistidinesd’altaresolució.

Un cop s’ha separat i recuperat la fracció citoplasmàtica soluble, es purifica la

proteasa(His)7‐TEV,jaauto‐digeridaialliberadadelaproteïnadefusióMBP,mitjançant

2 columnesd’IMAC‐Histrapde5mL, acoblades al sistemad’FPLCper a l’automatització

(veureapartat3.6.1.1deMaterialsiMètodesGenerals).

Elstamponsusatsperaquestacromatografiahanestat:

‐ Tampód’UnióideRentat(A):Na2HPO420mM,NaCl500mM,pH7.5.

‐ Tampód’Elució(B):Na2HPO420mM,NaCl350mM,500mMImidazol,pH7.5.

Un cop injectada la mostra, s’ha utilitat un gradient d’elució no lineal amb 4

increments escalats d’imidazol, on la proteïna TEV pura eluirà al 100 % de Tampó

d’Elució:

‐ Rentatdecolumna:0%B/4VC

‐ Elució1:15%B/8VC

‐ Elució2:100%B/10VC

‐ Re‐equilibratdecolumna:0%B/4VC

Posteriormentalapurificació,s’hanusatlescolumnesd’exclusiómolecularPD‐10

Desalting columns (veure apartat 3.6.3.2deMaterial iMètodesGenerals)per a extraure

l’imidazol de lamostra i guardar la proteïna alTampódeDigestiódeTEV (Tris/HCl20

mM,NaCl150mM,Glicerol10%,pH7.3).

3.3. Determinaciódel’estructurasecundàriadel’scFv‐h3D6.

Aquests experiments han estat desenvolupats per el meu company de laboratori

Rivera‐Hernández, G., i es troben detallats a la seva tesi en redacció (Rivera‐Hernandez

2013). Els resultats obtinguts ha estat necessari detallar‐los en aquest capítol per tal

d’entendrecompletamenteltreballseguidamentexposat.


119

Pelque faals fonamentsde les tècniquesdescritesacontinuació(espectroscòpia

de CD, de fluorescència i de infraroig) es troben detallats a l’apartat 4 de Materials i

MètodesGenerals.

3.3.1. EspectredeCDalUV‐llunyà.

Peraobtenirl’espectredeCDd’estructurasecundàriadel’scFv‐h3D6,s’hautilitzat

l’espectrofotopolarímetre Jasco J‐715.Laconcentracióexperimentaldeproteïnahaestat

de 20 μM (0.54 mg/mL), disposada en una cubeta de quars de 0.2 cm. Per a mesurar

l’espectre de 260 a 190 nm, s’han enregistrat 20 acumulacions a una velocitat de 50

nm/min,unarespostade2seg,unaampladadebandad’1nm,iunaresolucióde0.1nm.

L’espectre del plegament natiu de l’scFv‐h3D6 ha estat determinat a 25 °C. Amés, s’ha

registrat l’espectre de l’estat desplegat (a 90 °C) i, tornant a la temperatura inicial, s’ha

determinat si la desnaturalització tèrmica de la proteïna és reversible completa,

parcialmentonul·la.

3.3.2. Espectred’infraroigambtransformadadeFourier.

Peral’estudid’agregaciódel’scFv‐h3D6perFTIR,lesmostreshanestatdialitzades

enfrontPBS‐D2O,pH7.4,aunaconcentracióde100μM(2.6mg/mL).Esvanadquirirels

espectresa25,37i60°C,temperantlesmostresdurant5min.Eltractamentdedadesila

deconvolució de la banda d’amida I’ s’ha realitzat segons descrit per Arrondo i

col·laboradors (Arrondo, Goni 1999). Resumidament, el nombre i posició de les

componentsdelabandahanestatobtingutsperdeconvoluciósobrecorbesLorentzianes

ambunaampladaentre16‐20cm‐1iunaapoditzaciódetipusBesselambunaconstant(K)

entre1.6‐2.5.Elsajustosdelescomponentss’hanrealitzatsobrecorbesGaussianesis’han

obtingutperduesetapesd’iteració:laprimerafixantlaposiciódelesbandesi,lasegona,

alliberant‐les.Lesdadesfinals,s’hanexpressatentantpercentd’estructurasecundària.

3.3.3. Desnaturalitzaciótèrmica.

La desnaturalització tèrmica s’ha seguit per espectroscòpia de CD al UV‐llunyà i

per fluorescència dels residus de triptòfan (fluorímetre Varian Cary Eclypse), a una

concentraciód’scFv‐h3D6de20i2μM,respectivament,disposadesencubetesdequarsde

0.2 i 1 cm, respectivament. Els experiments s’han registrat des de 25 °C a 90 °C, a una

velocitatde1°C/min,seguintl’el·lipticitata218nm,ilafluorescènciadeltriptòfana338

nm (longitud d’ona d’excitació a 290 nm, i una obertura de les finestres d’excitació i

d’emissióde5nm).Alesdesnaturalitzacions,perCDifluorescència,esvanenregistrarels

espectresa25°C,90°Ci,tornantarefredarlamostra,a25°C.


120

3.4. PreparaciódelpèptidAβ1‐42.

El pèptid sintètic Aβ1‐42, purificat amb HCl com a contraió (Caslo Laboratories,

ApS), es va dissoldre a 200 μM en HFIP (1,1,1,3,3,3‐hexafluoro‐2‐isopropanol), un pre‐

tractamentquepermetdesferestructuresenfulla‐βitrencarforceshidrofòbiques,donant

lloc a preparacions de pèptid monodisperses (Dahlgren et al. 2002). Es van preparar

alíquotes de 150 μl, l’HFIP va ser eliminat per evaporació al buitmitjançant l’SpeedVac

(Savant Instruments), i el film resultant va ser guardat a ‐80 °C fins a ser utilitzat. Al

moment de requerir‐lo, el film de pèptid va ser resuspès en 6 μl de DMSO (5 mM de

pèptid),idiluït,seguidament,finsa300μlambtampóPBSpH7.4(100μMdepèptid).

DegutalmètodedepreparaciódelpèptidAβ,lesmostresinicialscontenienun2%

(v/v)deDMSO,pertant,toteslesmostresutilitzadesperaestudiarl’efectedel’scFv‐h3D6

sobrel’agregacióilacitotoxicitatdelpèptidAβ,incloseslesmostrescontrols,contenienel

mateixtantpercentdeDMSO.Calremarcarque,desprésdelaincubació,lesmostresvan

serdiluïdes10vegadesperaprosseguirambelsexperimentsdeviabilitat,unióaThT i

ANS, i TEM. Per tant, les mostres finals contenien un 0.2 % de DMSO. A més, vam

corroborarqueun2%DMSOnotéefectesobre l’espectredeCDalUV‐llunyàde l’scFv‐

h3D6.

3.5. AgregaciódelpèptidAβ1‐42il’scFv‐h3D6.

Laoligomerització,tantdelpèptidAβ1‐42,del’scFv‐h3D6,comdelcomplexAβ1‐42‐

scFv‐h3D6, en tampó PBS pH 7.4 i 2% deDMSO, va ser induïda per incubació a 37 °C

durantdiferentsperíodesdetemps,mentrequelafibril·lacióvaserinduïdaescalfantles

mostresa90°Cdurant5min.

3.6. Assajosdecitotoxicitat.

Els assajos de citotoxicitat es van realitzar mitjançant la línia cel·lular de

neuroblastomahumàSH‐SY5Y(veureapartat5.5deMaterialsiMètodesGenerals).

Primerament,esvanrealitzarassajosdeviabilitatperadeterminarlaconcentració

òptima de pèptid Aβ1‐42 per a generar màxima toxicitat cel·lular. Es va induir la

oligomeritzaciódelpèptidaconcentracionscreixents,de0a200μM,iesvaaddicionar10

μLacadapou,deformaquelaconcentraciófinaldepèptidvaserde0a20μM.

Per a determinar la capacitat del fragment d’anticòs scFv‐h3D6 per a inhibir la

citotoxicitatdelpèptidamiloideAβ1‐42,esvancoincubarmostresaconcentracióconstant

depèptid(100μM)ambconcentracionscreixentdelfragmentd’anticòsscFv‐h3D6(0,1,

10,50i100μM),tractadesiassajadestalicoms’hadescrital’apartatanterior.


121

Per ambdós casos, es van extraure els valors de toxicitat seguint el protocol

d’assaig per MTT (veure apartat 5.5.1 de Materials i Mètodes Generals). Cada condició

consistiaen6rèpliquesperexperiment,i4experimentsindependentsvanseranalitzats

estadísticament per nivell de significança (test de rangs signats de Wilcoxon, SPSS),

desprésdenormalitzar lesdadesusant la concentracióde la condició tampóPBScoma

referència.Elsresultatsrepresentenl’errorSEM(StandardErroroftheMean).

3.6.1. Preparaciómostresd’scFv‐h3D6peralsassajosdecitotoxicitat.

Elslipopolisacàrids(LPSs)sónbiomolèculesqueformenpartdelaparetcel·lular

d’E.colii,durantelprocésdepurificaciódel’scFv‐h3D6,sónarrossegatsjuntamentambla

proteïna.ElsLPSssónlesprincipalsendotoxinesdelesbactèriesgram‐negativesipoden

provocar resposta cel·lular en cultius (s’ha detectat una viabilitat superior al 300% en

assajosd’MTT).Ésperaixòque,abansderealitzarexperimentsdeviabilitatcel·lularen

cultius de neuroblastoma humà SH‐SY5Y, cal extraure la fracció lipopolisacàrida de la

mostrad’scFv‐h3D6ievitar,així,falsospositiusenelsresultatsobtinguts.

De la mateixa manera, també s’han extret els LPSs de la mostra d’scFv‐h3D6

injectada en ratolins triple‐transgènics 3xTg‐AD, models d’AD. Els resultats dels

experiments in vivo han estat estudiats per Rivera‐Hernández, G. (Gimenez‐Llort et al.

2013,Rivera‐Hernandez2013).

Pera l’extracciódelsLPSs,s’hanemprat lescolumnesd’afinitatd’LPSsDetoxi‐Gel

Endotoxin Removing Columns (Thermo Scientific) (veure apartat 3.6.1.2 de Materials i

Mètodes Generals). La quantitat d’LPS per mL de mostra proteica depèn del volum de

cultiud’expressió cel·lular inicial, i s’hauràde tenir en compte en elmomentde la seva

extracció.Així, per cadaLde cultiu expressat s’apliquen5mLdemostraproteica auna

columnad’afinitat.


‐ TampódeRegeneracióid’Eluciód’LPSsunits:detergentsodidesoxicolatal1%enaiguaMilli‐Q.

‐ Tampód’Equilibratid’Eluciód’scFv‐h3D6nounit:tampóPBS,pH7.4.

Elprotocolseguitperal’eliminaciód’LPSs,expressatenvolumsdecolumna(1VC

=1mL),éselsegüent:


conservacióa4°C.


122

2. Regenerarlacolumnaamb5VCdedetergentsodidesoxicolatal1%.

3. Rentarl’excésdedetergentamb4VCd’aiguaMilli‐Q.

4. Equilibrarlacolumnaamb4VCdetampóPBSpH7.4.

5. Afegir a la columna, un volummàxim de 5mL demostra (provinent d’ 1 L d’expressió

cel·lular),aunaconcentracióde0.5mg/mLaproximadament.

6. Per gravetat, recol·lectar, en fraccionsd’1mL, lamostra sortintde la columna, ja que la

proteïnanoésretinguda.DescartarelprimermLd’elució.

7. Per assegurar la completa recuperació de la mostra d’scFv‐h3D6 lliure d’LPSs, afegir el

mateixvolumdetampóPBSpH7.4quedemostraafegida;irecol·lectar‐laenfraccionsd’1

mL.

8. Rentarlacolumnaamb2VCdetampóPBSpH7.4peracabard’eluirtotalamostrad’scFv‐

h3D6,recol·lectar‐laenfraccionsd’1mL.

9. Per a eluir els LPSs units a columna, rentar la columna amb 5 VC de detergent sodi

desoxicolatal1%.

10. Conservarlacolumnaa4°Cenetanolal25%.

És recomanable realitzar una columna d’exclusió molecular PD‐10 cap a tampó

PBSpH7.4,pertald’eliminarrestesdedetergentsodidesoxicolatal1%arrossegatamb

la mostra d’scFv‐h3D6 eluïda, que poden afectar l’estructura de la proteïna així com

interferirenelsmètodesdequantificacióodeviabilitatcel·lular(veureapartat3.6.3.2de

MaterialiMètodesGenerals).


PerTEM, s’ha visualitzat la viad’agregaciódel pèptidAβ1‐42, de l’scFv‐h3D6, així

comdelcomplexAβ1‐42‐scFv‐h3D6, totesellesaunaconcentració finalde100μM.Pera

induirlaoligomerització,lesmostreshanestatincubadesa37°C,durant0,3i48h;pera

la formació amiloide, s’han seguit incubant a 90 °C, durant 5 min. A més, també s’ha

visualitzat lamostraincubadaa60°C,durant10min,pertald’obtenir informaciósobre

l’estatintermediariinduïtpertemperatura.

Lesmostresvanserdiluïdes1/10entampóPBS,absorbidesenreixetesdecoure

recobertesdecarboni,itenyidesnegativamentambacetatd’uranilal1%(veureapartat

4.6.1 deMaterials iMètodes Generals). Lesmostres van ser visualitzades almicroscopi

Hitachi H‐7000, del servei de microscòpia de la UAB, i analitzades amb el software

DigitalMicrograph(Gatan).


123

3.8. Assajosd’agregacióperfluorescència.ThTiANS.

Els fluoròfors ThT (Tioflavina‐T) i l’ANS (àcid 8‐anilo‐1‐naftalè‐sulfònic) van ser

empratsperaquantificarl’agregaciódelesmostresvisualitzadesperTEM(veureapartat

4.4deMaterialsiMètodesGenerals).

Mostresde10μlvansermescladesamb90μldeThTa27.78μM(concentració

final de 25 μM), o bé, amb 90 μl d’ANS a 56 μM (concentració final de 50 μM), i

monitoritzadesa25 °C.La longitudd’onad’excitacióde laThTvaser450nm(espectre

d’emissióde470a530nm),idel’ANSvaserde388nm(espectred’emissióde400a600

nm).Laoberturadelesfinestresd’excitacióiemissió,entotsdoscasos,vaserde10nm,i

esvanregistrar10espectres,obtenint‐nelamitjana.Lesintensitatsvanserquantificades

a482nmperlaThT,ia470nmperal’ANS.Cadacondicióconsistiaentresrèpliquesper

experiment, i sis experiments independents van ser analitzats, obtenint‐ne la mitjana,

desprésdenormalitzarlesdadesusantlamesuraatemps0comareferència.

Durantladesnaturalitzaciótèrmicadelestresmostresaunavelocitatde60°C/h,

esvaseguinlescinètiquesd’unióaThTiANSaunmàximd’emissióde482nmi470nm,

respectivament.

El grapat de bons resultats obtinguts en aquest capítol de la tesi doctoral han estat assolits

gràcies al treball en conjunt amb el meu company de laboratori i futur doctor Geovanny Rivera‐

Hernández. Una col∙laboració mútua, i inicialment necessària per arrencar de zero i tirar

endavant la primera línia d’investigació del nostre grup de recerca, Protein Folding & Stability

Group, sota direcció de la Dra. Sandra Villegas. Els resultats aquí exposats es troben

íntimament lligats, i alguns en formen part, amb la tesi doctoral del meu company Rivera‐

Hernández, G., i, per tant, aquesta serà referenciada al llarg del capítol.

V‐Capítol1 Resultats

127

4. RESULTATS.

4.1. Expressióipurificaciódel’scFv‐h3D6.

Esvadissenyar i sintetitzar (GenScript) el fragment codificantper a l’scFv‐h3D6

(VH‐(Gly4Ser)3‐VL)apartirdelaseqüènciadelanticòsmonoclonalhumanitzath3D6.v2.El

genconsisteixenunfragmentde750pb,amblesdianesdetallespecífiquesdelsenzims

derestriccióNcoI‐NotIalsextrems,peralseuclonatgeavectors.

La quantitat de proteïna scFv recombinant obtinguda després de la seva

purificació, és, en general, molt baixa, degut a les seves propietats de plegament i

estabilitat(Zheng,Baumann&Reymond2003).Seguintamblamateixaproblemàticaenel

nostre grup de recerca, al final del procés depurificació de l’scFv‐h3D6, la quantitat de

proteïnaextretadelafracciócitoplasmàticasolubleerad’aproximadament1mg/mLperL

decultiu.Peraquestaraó,iambladificultatd’iniciarunalíniaderecerca,inicialmentesva

provarunagranvarietatdesistemesd’expressióendiferentssoquesd’E.coli,subclonata

diferents vectors d’expressió, i fusionat a diferents proteïnes tag (Rivera‐Hernandez

2009).Resumidament,elfragmentgènicd’scFv‐h3D6,vaserclonatdinsdevarisvectors

derivatsdel sistemapET,elsquals conteniencuesd’histidines (His‐tag),pèptidssenyals

(DsbA, DsbC o PelB), o bé proteïnes fusió [MBP (maltose‐binding protein), Ztag, GB1

(proteinGB1domain),GST(glutathionetransferasa),trx(tioredoxina),oNusA],aixícomla

dianaespecíficaperalaproteasaTEV.Pelquefaalstipusdesoquesd’E.coli,esvausarla

socaBL21(DE3)perasecretarlaproteïnarecombinantalperiplasma,mentrequelasoca

Origami2(DE3)vaserempradaperalcorrecteplegamentdelaproteïnaalcitoplasma,ja

que afavoreix l’ambient oxidatiu en el citoplasma i facilita el correcte plegament de

proteïnes que contenen ponts disulfur, com ara l’scFv‐h3D6, que enpresenta un a cada

domini.

Malgratlagranvarietatdesistemaprovats,capd’ellsdonavallocaunaproducció

final d’scFv‐h3D6 alta. De totes les possibles construccions, es van seleccionar les dues

següents,totsduesexpressadesenOrigami2(DE3):

‐ (His)6‐trx‐dianaTEV‐scFv‐h3D6de40.6kDa.

Inicialment, es va treballar amb aquesta construcció, obtenint un rendiment d’1

mg/mLperLde cultiude la forma soluble, i aproximadament4mg/mLperLde cultiu

obtingutsapartirdelreplegamentdelafraccióinsoluble.Totiaixò,esvaobservarcerta

proteòlisi inespecíficadurant lapurificació, seguramentdegutaunmalempaquetament

deldomini trx i l’scFv‐h3D6, iquepermetia l’acciód’algunametal·loproteasad’E.coli, ja

queaquestaactivitaterainhibidaambEDTA.


128

‐ (His)6‐NusA‐dianaTEV‐scFv‐h3D6de83.4kDa

Comaalternativa,esvatreballarambelconstructedeNusA,ambelqualnoesva

observar cap proteòlisi inespecífica, i es va obtenir un rendimentmés alt a partir de la

fracció soluble, 7 mg/mL per L de cultiu, fent innecessari el replegament de la fracció

insoluble.

4.1.1. Dimeritzacióiformesscrambleddel’scFv‐h3D6.

Es sabut que les molècules d’scFv, en general, tendeixen a dimeritzar per

intercanvi de dominis (o swapping) (Arndt, Muller & Pluckthun 1998). Aquests dímers

cauenentrampescinètiquesdurantelprocésd’expressiódelaproteïnarecombinant,de

formaque,apartdedisminuirelrendimentfinal(alvoltantd’un15%),vasernecessari

unúltimpasdepurificaciópercromatografiad’exclusiómolecular(SEC,Superdex‐75)per

asepararlaformadimèricadelamonomèrica.

Abandadelsdímersd’scFv‐h3D6,undelsprincipals inconvenientsquehahagut

d’afrontar el grup de recerca, i que es troba detallat a la tesi doctoral en redacció de

Rivera‐Hernández, G., i en el treball demàster deBlasco‐Moreno, B. (Rivera‐Hernandez

2009,Blasco‐Moreno2011,Rivera‐Hernandez2013),éslaformaciódeformesscrambled

perpartde l’scFv‐h3D6aïllat. Les formes scrambled són totesaquelles combinacionsen

quèespodenformarelspontsdisulfur,tantnatiuscomnonatius.Enelcasdel’scFv‐h3D6,

trobemquatre cisteïnes susceptiblesde formarpontsdisulfur, per tant existeixen fins a

nouformesscrambledteòriques,talicomesrepresentaalafigura1.1.

Figura1.1.Representacióde lesdiferents formesscrambledde l’scFv‐h3D6.L’scFv‐h3D6, ambquatre

residuscisteïna,dosperdomini(VH,blauiVL,verd),potformarfinsanouformesdiferentsdepontsdisulfur,

sentlaprimera(N)laformanativa.Envermellesrepresentaelconnectorentretotsdosdominis.


129

A partir del model 3D de l’scFv‐h3D6, descrit en el Capítol 2 d’aquesta tesi

doctoral,esvaveurequeelspontsdisulfurnatiuss’estableixenentreunacadena‐βmolt

exposada i una altra de molt enterrada, cadascuna situada a una de les fulles‐β que

conformenelbarril‐β, compactanteldomini.Les formesscrambledmodifiquenaquestes

interaccionsintradomini,alterantdràsticamentl’estabilitatglobaldelamolècula,mentre

que el plegament globular no es veu quasi afectat. La presència de formes scrambled

explica les diferents tendències a l’agregació obtingudes amb el mateix scFv‐h3D6,

depenent del sistema d’expressió i purificació emprat. D’altra banda, aquest fet també

explicalaimportantprecipitaciódelamostraalllargdelprocésdepurificació.

Totiquevamsercapaçosdeseparalesformesscrambledobtingudesapartirdel

constructe (His)6‐NusA‐dianaTEV‐scFv‐h3D6, finalment es va optimitzar el protocol de

purificació de l’scFv‐h3D6, evitant la proteòlisi inespecífica, i separant les formes

dimèriques iscrambled,utilitzantel constructe (His)6‐trx‐dianaTEV‐scFv‐h3D6, tal i com

s’haexplicatal’apartatdeMaterialsiMètodes3.1.delCapítol,obtenintunrendimentfinal

de proteïna scFv‐h3D6 pura i nativa de 4 mg/mL per L de cultiu, gràcies a la seva

purificaciópercromatografiadebescanvicatiònic(CEX).La figura1.2‐Amostra l’elució

de l’scFv‐h3D6, el qual està format per dos pics solapats, el primer consisteix en l’estat

natiu iel segonen les formesscrambled.Perdesnaturalització tèrmica(figura1.2‐B)es

pot observar la diferència en la tendència a l’agregació entre totsdos; com tambéde la

fracciósolapada,quemostrauncomportamentintermedi.

Figura1.2. Identificacióde l’scFv‐h3D6natiu i les formes scrambled.A) Separació per cromatografia

d’intercanvicatiònicdelesformanativa(primerpic)ilesscrambled(segonpic),mitjançantungradientlineal

deNaCl.B) Identificació,per fluorescènciadels triptòfans,de la fracciónativa (blau) i les formes scrambled

(vermell).Laregiódesolapamentdepics(verd)téunatendènciaalaagregaciómitja,sentl’estatnatiuelque

necessitamajortemperaturaperagregar.


130

Identificar i aïllar les formes scrambled ha estat indispensable per a obtenir uns

resultats físico‐químics raonables i fiables, i per evitar la gran variabilitat experimental

obtingudafinsaleshores.

4.2. Identificaciódel’intermediarid’agregacióWLdel’scFv‐h3D6.

A partir dels anàlisi d’estructura secundària i la desnaturalització tèrmica de

l’scFv‐h3D6,desenvolupats,principalment,pelcompanydelaboratori, idetallatalaseva

tesidoctoralenredacció,Rivera‐Hernández,G.,esvaidentificar,durantlaviad’agregació

induïda per temperatura de l’scFv‐h3D6, l’existència d’un estat intermediari ric en

estructura‐β, i el qual serà determinant en l’estudi de l’efecte de l’scFv sobre la via

d’agregacióamiloidedelpèptidAβ1‐42.

Deformaresumida,l’obtenciódelsespectresdeCD‐llunyàideFTIRvanpermetre

determinarquel’scFv‐h3D6natiuadoptalaestructurasecundàriaenfulla‐βtípicad’Ig.A

mésd’unmínimd’el·lipticitata218nmiunmàxima200nm(Figura1.3), l’espectrede

CD‐llunyàmostraunsegonmínima230nmiunmàxima237nm.Aquestesparticularitats

del espectre poden correspondre a la contribució de les cadenes laterals dels residus

aromàticsi/ocistinil(Byler,Susi1986,Sreeramaetal.1999,Waltheretal.2010).Enelcas

de l’scFv‐h3D6però, ha quedat demostrat que són els residus triptòfan conservats dels

nuclis hidrofòbics els responsablesd’aquestes anomalies (Rivera‐Hernandez et al. 2013,

Montoliu‐Gaia2013)

Figura 1. 3 Espectrede CD alUV‐llunyà de l’scFv‐h3D6 a diferents temperatures. L’espectre a 25 °C

mostra dosmínims d’el·lipticitat (218 nm i 230 nm), i dosmàxims a 200 nm i a 237 nm. Aquest espectre

particularesperdapartirdels60°Cafavordelaconformaciódefulla‐βcanònica(mínima215nm),elquales

mantéa90°Cidesprésdelarenaturalitzacióa25°C(dadesnomostrades).


131

Apartirdels60°Cl’espectredeCDnatiuesperdafavordelaconformacióenfulla‐

βcanònica,queésmantéals90°Cialretornarals25°C(dadanomostrada).Elfetdeque,

enlloc d’adoptar el patró de proteïna desplegada (o random coil), s’adopti l’estructura

canònica en fulla‐β (mínim a 215 nm), fa pensar en una agregació ordenada i rica en

estructura‐β,característicadel’agregacióamiloide.

DegutalparticularespectreobtingutperCD,nohaestatpossibledeconvolucionar

loperaobtenirel%d’estructurasecundària.Peraquestaraó,s’harealitzatunanàlisiper

FTIR a diferents temperatures. La figura 1. 4 mostra la deconvolució de l’espectre

d’infraroig a la regiód’amida I’. A25 °C, apareixen tresbandesprincipals localitzades a

1681,1660,i1636cm‐1;iunabandamenora1612cm‐1(figura1.4‐A).Lescomponentsde

fulla‐βantiparal·lelad’altaibaixafreqüència,típiquesdelplegamentd’Igs,éscorresponen

alesbandesde1681i1636cm‐1,respectivament;ielsgirs‐βiloopsescentrena1660cm‐1

(Byler,Susi1986,Waltheretal.2010).

Figura 1. 4. Deconvolució de l’espectre de FTIR de la regió d’amida I’ de l’scFv‐h3D6 a diferents

temperatures.A)L’espectrea25°Cgeneraquatrebandesprincipals,mentrequel’espectrea60°C(B)genera

finsavuitbandesdiferents.Labandavermelladiscontinuaindicalacomponentenagregats‐βa1626cm‐1.

L’espectredeFTIRa60°C(Figura1.4‐B),generabandesaddicionalsalestípiques

delplegamentd’Igadquiridesa25°C,quedisminueixenelseutantpercent,sobretot la

component en fulla‐β antiparal·lela nativa (1636 cm‐1) i els loops/girs‐β (1660 cm‐1). El

canviméssignificatiua60°C,ésl’apariciódelabandaa1626cm‐1, laqualjahaviaestat


132

reportada com a correspon a les fibres WL (Jahn, Tennent & Radford 2008). A part,

l’incrementdelabandaa1615cm‐1,corresponentafibresamiloides(Zandomeneghietal.

2004),vafernecessaricomprovarperassajosd’agregació(ThTiANS)iperTEMeltipus

d’agregatsdel’scFv‐h3D6.

Lafigura1.5‐Amostraladesnaturalitzaciótèrmica,seguidaperCD,iquedescriu

una transició conformacional de l’scFv‐h3D6 als 60 °C. Elmínim a 218 nm, augmenta a

partir dels 45 °C, de talmanera que el plegament guanya contingut en fulla‐β. A 60 °C,

però,esdevéunatransicióenlaqualesperdpartd’aquestaestructura‐βadquiridaapartir

del’estatnatiu,ielsenyals’estabilitzapersobredels65°C.Lamodificacióconformacional

descritapertemperatura,s’associaaunareestructuraciódelafulla‐βnativa,sensepassar

per un estat desplegat, donant lloc a una agregació parcial i la conseqüent pèrdua del

senyal. Aquesta reestructuració dóna lloc a l’aparició, als 60 °C, d’un estat intermediari

d’unaviad’agregació,elqualseràelprecursordelsagregatsdel’scFv‐h3D6.

Figura 1. 5. Desnaturalització tèrmica de l’scFv‐h3D6. A) Desnaturalització tèrmica per CD seguint el

mínim d’el·lipticitat a 218 nm. B) Desnaturalització tèrmica seguint el desplaçament del màxim de

fluorescènciaa338nm,aunaconcentracióde20μM(negre)i2μM(gris).

Les fibres amiloides i lesWLsón formadesapartirdediferentsviesd’agregació

que porten a un estat final diferent: les amiloides són rectes i llargues, i segueixen una

cinèticadepenentdenucleació,mentrequelesfibresWLsóncorbadesicurtes,iesformen

seguint una cinètica independent de nucleació (Gosal et al. 2005). La desnaturalització

tèrmica (Figura 1. 5‐B), seguida per fluorescència, a dues concentracions de proteïna


133

diferents(2 i20μM),mostra lamateixatransicióa60°C, i lespendentsabansidesprés

d’aquestpuntnoesveuenalteradesperlaconcentraciódeproteïna,laqualcosaimplica

que l’agregacióde l’scFv‐h3D6 segueixuna cinèticanodepenentde concentració , o, dit

d’unaaltramanera,denucleació, i,pertant, les fibres formadesper l’scFv‐h3D6,sóndel

tipusWL.

Uncopidentificatelplegamentnatiudel’scFvilasevaviad’agregacióiniciadaper

un intermediari tèrmic, ja es pot assajar i entendre el seu efecte sobre la toxicitat del

pèptidAβ1‐42acondicionsfisiològiques.

4.3. Prevenciódelatoxicitatdel’Aβ1‐42perl’scFv‐h3D6.

Primerament, es va determinar la concentració òptimadepèptidAβ1‐42, en estat

oligomèric,peragenerarmàximatoxicitatenlalíniacel·lulardeneuroblastomahumàSH‐

SY5Y,determinatpelmètoded’MTT.Lafigura1.6‐Amostraque10i20μMdepèptidAβ1‐

42sónlesconcentracionsmésefectivesperareduirlaviabilitatdelcultiucel·lular, finsa

un60%.

Figura 1. 6. Assaig de viabilitat perMTT de la línia cel·lular de neuroblastoma humà SH‐SY5Y. A)

ToxicitatinduïdaperdiferentsconcentracionsdepèptidAβ1‐42.*P≤0.068comparatambel0μMd’Aβ1‐42.B)

Recuperació de la viabilitat cel·lular en presencia de 10 μM de pèptid Aβ1‐42 per addició de diferents

concentracionsd’scFv‐h3D6.S:10μMscFv‐h3D6sensepèptidAβ1‐42;B:tampó(sensescFv‐h3D6niAβ1‐42).*P

≤0.068comparatambel0μMd’scFv‐h3D6.Lesbarresd’error signifiquen±S.E.M.La significançahaestat

calculadausanteltestderangssignatsdeWilcoxonperaquatreexperimentsindependents,isisrepliquesde

cadacondicióperexperiment.


134

Amesuraquedisminueixlaconcentraciódepèptid,laviabilitatcel·lularaugmenta

quasiproporcionalment,assolintjael100%aconcentracionsmoltbaixes(0.01μM),ones

podriaconsiderarqueelpèptides trobaen formamonomèricano tòxica,malgrathaver

induïtlaoligomerització.

Elfetdequelaconcentraciódepèptida20μMnosiguiméstòxicaquea10μM,pot

resultar contradictori,peròcobra sentit si s’observadesdel puntdevista cinètic.Auna

major concentració, la via d’agregació és troba desplaçada cap a la formació de fibres

amiloides, enlloc de poblar espècies oligomèriques citotòxiques, ja que la cinètica de

formació de fibres amiloides segueix un procés depenent de nucleació, i per tant, de la

concentracióinicialdeformesmonomèriques.

Apartird’aquestprimerresultat,s’haempratlaconcentraciódepèptid10μMamb

l’objectiuderevertir la toxicitatdelpèptidAβ1‐42.Per incubacióa37°C,durant3h,s’ha

induïtlaoligomeritzaciódelpèptidAβ1‐42,coincubatambconcentracionscreixentsd’scFv‐

h3D6.Amés,comacontrolpositiu, i conscientsde la tendènciaa l’agregaciódelmateix

scFv‐h3D6, aquest també ha estat sotmès, individualment, a les condicions

d’oligomerització,pertaldedemostrarquenogeneratoxicitat.

Talicommostralafigura1.6‐B,l’scFv,aunaconcentracióigualaladelpèptid(10

μM), no produeix cap efecte citotòxic sobre les cèl·lules, donant lloc a un 100 % de

viabilitatrespecteelblancdePBS.Lacombinaciódetotesduesmolècules,elcomplexAβ1‐

42‐scFv‐h3D6, recupera la viabilitat cel·lulard’unamaneradepenentde concentració. La

relació2:1,ésadir,10μMd’Aβ1‐42/5μMd’scFv‐h3D6,éssuficientperaobservarunefecte

significatiudel’scFvsobrel’Aβ1‐42.Aconcentracionsequimolars,pràcticaments’anul·lala

toxicitatinduïdapelpèptidAβpercomplet.

Degutalpotencialterapèuticdell’scFv‐h3D6,ésnecessariaprofundirenelscanvis

conformacionalsqueprovoquen laprevencióde la toxicitatde l’Aβ1‐42perpartd’aquest

fragment d’anticòs. Donat que l’Aβ1‐42 segueix la via amiloide, i l’scFv segueix la via de

fibresWL,talicoms’hadescritanteriorment,resultaindispensableestudiarambduesvies

demisfoldingperseparat,iaixípoderestudiarientendredetalladamentqueesdevéquan

esformaelcomplexAβ1‐42‐scFv‐h3D6.


135

4.4. MisfoldingdelpèptidAβ1‐42.

A partir de que va ser establert que l’anticòs monoclonal sencer mAb‐h3D6

reconeixespecíficamentelsoligòmersd’Aβ(Jacobsen2006,Wisniewski,Konietzko2008,

Nitsch, Hock 2008), els quals són els precursors de les fibres amiloides i les espècies

citotòxiques,vamdecidirtreballarsotacondicionsenlesqualss’induísl’estatoligomèric

delpèptidAβ1‐42.Laidead’arribaratractarratolinsinvivo,ensvaacabardedecantarper

optimitzaraquestescondicionsalesfisiològiques.Finalment,l’agregaciódelpèptidabans

deserafegitalcultiucel·lular,odemesclar‐loambl’scFv‐h3D6,haestatentampóPBS,pH

7.4, durant 3 h a 37 °C. Mitjançant TEM, es va demostrar que, en aquestes condicions,

realmentesformenelsoligòmersd’Aβ(Figura1.7‐A).

TalicomesveuperlesimatgesdeTEM,elsoligòmersd’Aβsónvisualitzatsdesdel

momentenqueelfilmdepèptidésresuspèsenDMSOitampóPBS(veureapartat3.4de

MaterialsiMètodesdelcapítol),iesmantenenalllargdelaincubacióa37°Csenseindicis

de formació amiloide. Això no vol dir que ens trobem fora de la via amiloide, ja que el

tractamentdelamostraaelevadatemperatura,60i90°C,indueixlaformaciódefibres.

ElstractamentsadiferentstemperaturesutilitzatsperalesimatgesdeTEM,també

vanserempratsperaquantificaciól’agregaciódelpèptidperfluorescència,atravésdela

sevaunióals fluoròforsThTiANS.LaThTésconsideratunmarcadorespecíficdefibres

amiloides (Naiki et al. 1989), mentre que l’ANS és usat, extensament, degut a la seva

capacitatd’unir‐searegionshidrofòbiquesdeproteïnes(Ray,Singh&Balaram2001).

Enlescondicionsenlesques’hatreballat,elpèptidAβ1‐42inicialmentjauneixcerta

ThT, i augmenta la fluorescència d’aquesta a mesura que s’allarga la incubació a 37 °C

(Figura1.8‐A).A60°C, tot iqueperTEMjas’haviadetectat lapresènciadecomponent

fibril·lar,launióaThTsegueixsentlamateixaquea48ha37°C.Ésambeltractamenta

90°C,quanaugmentalafluorescènciapràcticamenteldobledelsenyalanterior.Pelquefa

alafluorescènciadel’ANS,esdetectennivellsd’uniómoltbaixos,inclúsdesprésd’escalfar

elpèptid(Figura1.8‐B).Aquestsresultatsindiquenque,efectivament,elpèptidAβ1‐42,es

trobadinslaviad’agregacióamiloide.


136

Figura1.7.FormaciódefibresamiloidesiWLperpartdel’Aβ1‐42,l’scFv‐h3D6ielcomplexAβ1‐42:scFv‐

h3D6,en funcióde la temperatura i lapresenciadeDMSO. Imatges adquiridesper TEMdeA) 100μM

d’Aβ1‐42, B) 100 μMd’scFv‐h3D6, C) 100 μMd’scFv‐h3D6 en absència deDMSO,D) 100 μMd’Aβ1‐42:scFv‐

h3D6,adiferentstempsi temperaturesd’incubació.A)Elsoligòmerscitotòxicsd’Aβ1‐42sónvisualitzatsa37

°C,iescalfantamajorstemperaturess’indueixlaformaciódefibresamiloides.B)L’scFv‐h3D6noformafibres

WLenpresenciadeDMSO.C)L’scFv‐h3D6enabsènciadeDMSOformapetitsoligòmersa37°C,ia60°C(onla

població de l’intermediari tèrmic és més màxima) s’inicia la formació fibres WL, que es troben més

estructuradesa90°C.D)ElcomplexAβ1‐42:scFv‐h3D6formadirectamentfibresWLa37°C,iatemperatures

majorséstrencaelcomplex,donantllocaprotofilamentsamiloidesioligòmers.Labarraindica20nm.


137

4.5. Misfoldingdel’scFv‐h3D6.

Talicoms’hamencionatanteriorment,pertractamenttèrmic,l’scFv‐h3D6iniciala

viad’agregaciócaracteritzadaperunintermediariricenestructura‐β,elqualdónalloca

agregatsenformadefibresWL.Inesperadament,aquestesfibresWLnosónvisualitzades

per TEM, quan l’scFv‐h3D6 és assajat individualment, sinó que apareixen espècies

oligomèriquesentoteslescondicionstractades(Figura1.7‐B).

Ésimportantmencionarque,totselsexperimentsrealitzatsperdeterminarl’efecte

del’scFv‐h3D6sobrelatoxicitatil’agregaciódelpèptidAβ1‐42,contenenun2%deDMSO

durantlaincubació(0.2%DMSOalesmostresfinals),amblafinalitatdepodercomparar,

adequadament, els resultats obtinguts amb el pèptid Aβ, el qual, inevitablement, conté

aquesttantpercentdeDMSO(veureapartat3.4deMaterialsiMètodesdelcapítol).Pera

comprovarfinsaquinpuntelDMSOpotinterferiralaviad’agregaciódel’scFv‐h3D6,esva

decidir visualitzar perTEM el procés en absència deDMSO. Com era d’esperar, quan el

DMSOnoéspresentalamostrad’scFv‐h3D6,lesfibresWLapareixenuncoplamostraha

estatincubadaa60°C,iresultenmésevidentdesprésdeltractamenta90°C(Figura1.7‐

C). Aquest resultat, a més, concorda amb l’anàlisi de FTIR discutit anteriorment, on la

bandacaracterísticadefibresWLapareixals60°C(Figura1.4‐B).

Figura1.8.Assaigd’agregacióper fluorescènciadeTioflavinaT iANS.Estudide l’agregaciódelpèptid

Aβ1‐42,l’scFv‐h3D6,idelcomplexAβ1‐42:scFv‐h3D6peruniódelfluoròforTioflavinaT(A)iANS(B),adiferents

tempsitemperaturesd’incubació.Lesbarresd’errorsignifiquen±S.E.M.


138

Pelquefaalafluorescència,l’scFv‐h3D6sol,nouneixThT,ilatemperaturaindueix

uncertaugmentdelsenyal,especialmentalatemperaturaenlaquals’indueixlaformació

de l’estat intermediari (Figura 1. 8‐A). L’ANS, en canvi, emet fluorescència en totes les

condicions,tambédeformamésnotòriaquanl’intermediariéspresent(Figura1.8‐B).El

comportament d’ambdues fluorescències és pràcticament igual en absència de DMSO

(dadesnomostrades),dadaque fapensarque tant laThTcom l’ANSnosóncapaçosde

distingirentreoligòmersifibresWLformadesperl’scFv‐h3D6.

Figura1.9.Assajosd’agregacióinduïdapertemperaturaperfluorescènciadeTioflavinaTiANS.Estudi

del’agregaciódelpèptidAβ1‐42,l’scFv‐h3D6,idelcomplexAβ1‐42:scFv‐h3D6seguintelmàximdefluorescència

delaTioflavinaTa482nm(A),ielmàximdel’ANSa470nm(B),amesuraqueaugmentalatemperatura.

Amb la intenció de confirmar la importància de l’intermediari, induït per

temperatura,dins laviad’agregacióde l’scFv‐h3D6,s’haassajat launiódeThT iANSen

funciódelatemperatura,isenseagitació(Figura1.9‐A,B).Efectivament,a60°C,totsdos

fluoròforsuneixenl’estatintermediarii,amajortemperatura,elsenyalesperddegutala

formaciód’agregatsinsolubles.

4.6. MisfolgingdelcomplexAβ1‐42‐scFv‐h3D6.

La coincubació del fragment d’anticòs scFv‐h3D6 amb el pèptid Aβ1‐42, en una

relacióequimolar,preveulaformaciód’oligòmersd’Aβi,alseulloc,inicialaformacióde

fibresWL,talicoms’observaperTEM(Figura1.7‐D).Ales3ha37°C,lesfibresWLja

sónformades,pertant,aquestahaestatlacondicióusadaperalsassajosdecitotoxicitat,i


139

onlatoxicitatdelsoligòmersd’Aβhaestatrevertida(Figura1.6‐B).QueelcomplexAβ1‐

42:scFv‐h3D6 segueix la via d’agregació WL, resulta més evident a llargs períodes

d’incubació(48ha37°C).

Quanelcomplexassoleixels60°C, temperaturaen laqualapareix l’intermediari

d’agregaciódelscFv‐h3D6quanaquestésincubatenabsènciadepèptidAβ1‐42,elcomplex

esdissocia,ials90°C,apareixentantprotofilamentsamiloidescomoligòmers.Teninten

compteque les fibresWLsónespèciesatrapadescinèticament, la temperaturadespobla

aquestestat,alliberantoligòmersd’AβlliuresipermetentqueelpèptidAβ1‐42retorniala

sevaviaamiloide.

Al contrari del que passa amb l’scFv‐h3D6 aïllat, quan es mesclen totes dues

molècules, la unió a ThT i ANS augmenta progressivament a mesura que augmenta la

temperatura, especialment als90 °C (Figura1. 8‐A,B).Aquest resultat concordaamb la

presènciadefibresWLabansd’escalfar,lesqualséssabutqueuneixentotsdosfluoròfors

(Ray, Singh& Balaram 2001, Gosal et al. 2005); i amb la presència d’oligòmers i fibres

amiloides,uncopescalfats.

Per tant, sembla a ser que, tot i que la formació de fibresWL és una propietat

intrínseca de l’scFv‐h3D6, aquelles que resulten del complex Aβ1‐42‐scFv‐h3D6 sónmés

estables que les formades per l’scFv‐h3D6 sol, perquè apareixen sense necessitat de

tractamentambtemperaturai,amés,esformensotalapresènciadeDMSO.

V‐Capítol1 Discussió

141

5. DISCUSSIÓ.

EnaquestCapítol1,s’hadescritlaproduccióiladeterminaciódelaviad’agregació

de l’scFvdissenyatapartirde la seqüènciad’unmAbd’interès terapèuticpera l’AD.La

immunitzaciópassivaambscFvesdevéunaestratègiaterapèuticaatractivadegutaqueno

produeixelsefectessecundarisinesperatsqueprovocal’administraciódelanticòssencer

i,al’hora,mantél’efectivitatd’aquest.

5.1. Expressiódel’scFv‐h3D6il’activitatdelaxaperonatrx.

Avui endia, laproducció recombinantde fragmentsd’scFvesdevépocefectiva, ,

deguta ladificultatdeplegamentdelsdosdominisambpontdisulfur ia lapresènciade

cincresidustriptòfan.Enaquest treball s’hanobtingut, finalment,quantitatsacceptables

d’scFv‐h3D6 a partir del replegament de la fracció insoluble obtingudadins del sistema

d’expressiód’E.coliOrigami2(DE3)ilaproteïnadefusiótrx,posteriormenteliminadaper

la proteasa específica TEV. La tioredoxina (trx), ha estat emprada satisfactòriament per

l’expressió ipurificaciód’altresmolèculesd’scFv, i lasevacapacitathaestat relacionada

amblasevaactivitatxaperona,mésqueambl’activitatcomadisulfur‐isomerasa(Jurado,

deLorenzo&Fernandez2006).Altressistemesd’expressió,comara,laproteïnadeNusA,

han donat alts rendiments de proteïna scFv‐h3D6 citoplasmàtica soluble, tal i com

s’explica a la tesi en redacció de Rivera‐Hernández (Rivera‐Hernandez 2009, Rivera‐

Hernandez2013),obtenintfinsa7mg/mLperLdecultiu.Peròlapresènciadelesformes

scrambleddifícilsdeseparardelaformanativaemprantaquestsistemad’expressió,hafet

queelreplegamentdelafraccióinsolubleapartirdetrxsiguilamanerad’obtenirl’scFv‐

h3D6 totalment pur i en el seu estat natiu, necessari per a una alta fiabilitat i

reproductivitatdelsexperimentsdutsaterme.

5.2. Perfildeplegamentdel’scFv‐h3D6sotapertorbaciótèrmica.

L’scFv‐h3D6mostralatípicaestructurasecundàriadelplegamentd’Ig,ambun60

%decomponentenfulla‐βantiparal·lelaiun30%deloops/girs‐βsegonsladeconvolució

dels espectres de FTIR, i mostra un espectre de CD anòmal, també reportat en altres

estudis d’scFv o dominis VL (Sreerama et al. 1999, Baden et al. 2008a, Jahn, Tennent&

Radford2008).

La desnaturalització tèrmica de l’scFv‐h3D6dóna lloc a agregació, tal i com s’ha

pogut veure per CD i fluorescència dels triptòfans. En el punt mig de la transició del

espectre de CD, que correspon als 60 °C, es pobla un estat intermediari amb una


142

conformació similar a l’adquirida per l’estat agregat, a 90 °C. Aquest intermediari és

generatperunareorganitzaciódirectadel’estatnatiu,pertant,noésnecessaripassarper

un estat desplegat per tal de saltar de l’embut de plegament natiu al d’agregació.

L’intermediari,ricenestructura‐β,s’acumulaindependentmentdelaconcentració,seguint

unacinèticanodepenentdenucleació.Amés,perTEMs’hacomprovatquel’agregacióper

temperaturade l’scFv‐h3D6esdevéen la formacióde fibresWL,enllocde formar fibres

amiloides.És sabutque les fibresWLsegueixenunacinètica independentdenucleació i

queuneixen tantThTcomANS (McParlandet al.2000,Gosal et al.2005).L’espectrede

FTIRcorroboralaformaciódefibresWL,ambl’apariciódelabandaa1626cm‐1,similara

la de 1622 cm‐1 característica de les fibresWL de la proteïna β2‐microglobulina (Jahn,

Tennent&Radford2008).

Latendènciaal’agregaciópertemperaturadelsscFvhaestatprèviamentreportat

peraltresestudis(Worn,Pluckthun1999,Pedrosoetal.2002).Altresproteïnes,ambun

plegamentsimilaral’scFv,tambéagregueninvivoformantfibresamiloides,coméselcas

de les cadenes lleures d’Ig, especialment aquelles que es troben en forma de domini

variable aïllat (VL) (Baden et al. 2008a), o bé la ja mencionada β2‐microglobulina

(McParland et al. 2000), que per a que formi fibres WL, enlloc d’amiloides, requereix

d’unescondicionsdepHàcidod’elevadaforçaiònica(Gosaletal.2005).

L’apariciódelagregatsWLformatsacondicionsfisiològiqueshaestatdescritaper

primeravegadaenaquesttreballdetesi.

5.3. Efectedel’scFv‐h3D6sobrelafibril·lacióicitotoxicitatdelpèptidAβ1‐42.

Jaavuiendia,ésevidentqueuntractamentterapèuticqueredueixilesfibresd’Aβ

a costa d’augmentar les espècies no fibril·lars, incloent els β‐oligòmers, pot resultar

perjudicial(Chengetal.2007).L’anticòsmonoclonalapartirdelquals’haderivatl’scFv‐

h3D6reconeixespecíficamentelsoligòmersd’Aβ(Jacobsen2006).

Quanelcultiucel·lularéstractatambmostresinduïdesal’oligomerització,l’scFv‐

h3D610μMnoprodueixcapefecte,elpèptidAβ1‐4210μMredueixlaviabilitatal60%,ila

coincubaciódel’scFv‐h3D6ambelpèptidAβanul·laelseuefectetòxicsobrelescèl·lules

d’unamaneradepenentdeconcentració.Enlescondicionsempradesenaquestestudiper

alsassajosdecitotoxicitat, elsoligòmersd’Aβsón formats, tal i coms’hacomprovatper

TEM.ElfetdequelesfibresWLesformenalmesclarelpèptidAβambl’scFv‐h3D6,sense

lanecessitatdequel’scFv‐h3D6jaestrobienlaviaWL(perprèviaincubacióa60°C),ien

presència de DMSO, implica que les fibres WL són cinètica i termodinàmicament més

favorablesquanl’scFv‐h3D6atrapaelsoligòmersd’Aβ.


143

Figura1.10.Diagramaenergèticdelaviad’agregaciódelpèptidAβ1‐42,del’scFv‐h3D6,idelcomplex

Aβ1‐42:scFv‐h3D6.A)A37°C(→),elpèptidAβ1‐42segueixlaviaamiloideatravésdelaformaciód’oligòmers

tòxics(O),il’scFv‐h3D6(S)segueixlaviaWLatravésdelaformaciód’oligòmersnotòxics(sO).Ésnecessari

un tractament amb temperatura (⇢) per a convertir els oligòmers d’Aβ en fibres amiloides (AF), i els

oligòmersde l’scFv‐h3D6 (sO) en fibresWL, en aquestúltim cas en absènciadeDMSO.B)El complexAβ1‐

42:scFv‐h3D6directament forma fibresWL, i lasevadisrupcióper temperatura(⇢)generasOpera l’scFv‐

h3D6,mentrequeelpèptidAβ1‐42retornacapalaviaamiloide,formantoligòmers(O)ifibres(AF).

Pertemperaturaelevada,lesfibresWLesdevenendespobladesperdissociaciódel

complexi,llavors,apareixenfibresamiloidesioligòmers.Aixòimplicaquelatemperatura

desplaçaalpèptidAβ1‐42capaforadelaviaWL,retornantcapa laviaamiloide;mentre

que l’scFv‐h3D6 segueix a la viaWL en forma d’oligòmers (Figura 1. 10). Com ha estat

demostrat en aquest treball, la presència de traces deDMSO, inherents al pèptidAβ1‐42,

evitaquel’scFv‐h3D6formifibresWL.

Apartdelsdetallsdelaviad’agregació,laconclusiómésrellevantd’aquesttreball

de tesidoctoralésque,encondicionsnatives, l’scFv‐h3D6 inhibeix la formacióde fibres

amiloidesilacitotoxicitatdelpèptidAβ1‐42mitjançantlaretiradadelsoligòmersd’Aβdela

viaamiloide.Ladescripciódelmecanismepelquall’scFv‐h3D6actuacontralatoxicitatdel

pèptidAβobreunanovaviaperamillorar,enunfutur,elseupotencialterapèutic.

5.4. Efectedel’scFv‐h3D6invivo.

Pelquefaalefectedel’scFv‐h3D6invivo,uncopdemostradal’efectivitatdel’scFv‐

h3D6encultiuscel·lularsilanecessitatd’eliminarlafracciód’LPSsdelamostra,elnostre

grupderecercaencol·laboracióamblaDra.Giménez‐Llort,L.(Gimenez‐Llortetal.2013),

va testarel seupotencial terapèuticenratolins triple‐transgènics3xTg‐AD,modelsd’AD

de5mesosd’edat,quecorresponaestadisinicialsdelamalaltia.Elsresultatsobtinguts,


144

detallats en la tesi doctoral en procés de Rivera‐Hernández, G., demostren que el

tractament amb l’scFv‐h3D6 s’ha de considerar una potent estratègia terapèutica en el

futurdel’AD.L’scFv‐h3D6milloralacapacitatcognitiva,reverteixelssímptomesBPSD‐like

(Behavioral and Psychological Symptoms of Dementia) (Gimenez‐Llort et al. 2007), i

eliminaelsoligòmersd’Aβdel còrtex idelbulbolfactoridels ratolins3xTg‐AD, lesdues

àrees cerebrals més sensibles a acumular β‐oligòmers durant els primers estadis de la

demència. Amés a més, l’scFv‐h3D6 restaura els nivells de la xaperona clusterina i de

l’ApoE, augmentats en el còrtex dels ratolins 3xTg‐AD. Cal remarcar que l’augment dels

nivells d’ApoE es troba directament relacionat amb els processos neuroinflamatoris

diagnosticats en pacients d’AD tractats amb l’anticòsmAb sencer (Kim et al. 2011). La

clusterina (o ApoJ), inhibeix la formació de fibres amiloides, unint‐se a ells

hidrofòbicament, i forma complexes estables amb els oligòmers d’Aβ (Humphreys et al.

1999).Amés, recentmenthemdemostratqueel nombredemacroneuronesdel cerebel

delsratolins3xTg‐ADestàmoltreduït,iquel’scFv‐h3D6protegeixaquestesneuronesde

lamort(Esquerda‐Canalsetal.2013,Esquerda‐Canals2013).

Pel que fa als mutants C‐terminals de l’scFv‐h3D6, descrits en el Capítol 2

d’aquesta tesi doctoral, i la seva futura administració en ratolins 3xTg‐AD, s’espera que

l’incrementdel’estabilitatiladisminuciódelatendènciaal’agregacióincrementinlavida

mitjai,conseqüentment,quel’scFv‐h3D6siguiefectiuadosisencaramésbaixesqueladel

WT.

CAPÍTOL 2: Modelatge tridimensional d’un fragment

variablede cadena senzilla (scFv‐h3D6)específic contra

elpèptidAβ1‐42iredissenyracionaldelamolècula.


ElongationoftheC‐terminaldomainofananti‐amyloidAβsingle‐chainvariablefragmentincreasesitsthermodynamicstabilityanddecreasesitsaggregation

tendency

Rivera‐Hernández,G.*,Marin‐Argany,M.*,Blasco‐Moreno,B.,BonetJ.,OlivaB.&Villegas,S.

mAb5:5,678–689(doi:10.4161/mabs.25382)2013

*Firstco‐author

V‐Capítol2 Resum

147

1. RESUM.

Laprimerareferènciaescritasobrel’efectivitatdel’immunoteràpiaAβenratolins

PDAPP va obrir la possibilitat de tractar la malaltia de AD. Els fragments variables

d’anticossosdecadenasenzilla(scFv),formatsperlauniódelsdominisVHiVLd’Ig,també

semblen ser una teràpia efectiva en models animals, amb l’avantatge de no activar la

micròglia.Amés,comparant‐losambl’anticòssencer,mostrenunamillorfarmacocinètica

ipodenserre‐dissenyatsracionalment.

Comalternativainicialal’obtenciódelcristalliperincompatibilitatamblatècnica

deespectroscòpiad’RMNensolució,degutalagrandàriadelamolècula,s’haobtingutun

model de la estructura tridimensional de l’scFv‐h3D6 específic contra el pèptid Aβ, un

treball presentat a la memòria del màster en Bioquímica i Biologia Molecular (Marin‐

Argany 2009). Com a estructura motlle s’ha emprat un scFv humanitzat, d’estructura

cristal·litzada i dipositada al Protein Data Bank, i amb la major homologia seqüencial.

L’scFvcontraelreceptordelcoronavirusSARS(pdb2GHTrp:B)mostraun70%d’identitat

seqüencial, i un94%d’homologia, amb l’scFv‐h3D6.AmbMODELLER s’han obtingut les

coordenadesde5possiblesmodelsi,ambProsa,esvaescollirelmodelòptim.Lapseudo‐

energia és mínima en les regions FR i màxima en les CDRs, en concordança amb la

flexibilitatnecessàriaperaformarelcomplexantigen‐anticòs.

Amblescoordenadesdelmodel,se’nhaderivatinformaciósobrel’accessibilitatal

solvent dels diferents residus, els contactes intramoleculars i un scanning de totes les

mutacions possibles a les diferents posicions. A més, amb la seqüència primària, s’ha

obtingut un perfil de la tendència a l’agregació i un alineament amb altres molècules

d’scFv. Tota aquesta informació ens ha permès proposar una sèrie de mutacions,

dissenyades per augmentar la solubilitat de la molècula i/o per trencar la tendència a

l’agregació,quehandepermetreaconseguirunaltrendimentenl’obtenciód’aquestscFv

depossibleaplicacióterapèuticaenhumans.


149

2. INTRODUCCIÓ.

La cristal·lografia de raigs‐X és l’eina més poderosa per a obtenir l’estructura

tridimensionaldeproteïnes.Totiquehamilloratmoltdesdequeesvaobtenirelprimer

cristalldemioglobina (Phillips, Schoenborn1981), l’any1969, l’obtencióde cristalls i la

interpretaciódelsresultatsfandifícilaquestatècnica(Jones,Thirup1986).D’altrabanda,

la tècnica de espectroscòpia d’RMN en solució, molt útil tant per a obtenir l’estructura

tridimensional de proteïnes comper amesurar la seva dinàmica conformacional, té les

limitacionsdelagrandàriailapertorbacióperpartdelsagregats(Wuthrich2001).

En els últims anys, la proteòmica estructural (cristal·lografia de raigs‐X i

l’espectroscòpia d’RMN a gran escala) han permès avançar notablement en el camp de

l’estructuraterciàriadeproteïnes.Actualment,s’handipositatmésde90.000estructures

enelProteinDataBank(PDB),labasededadesinternacionalperacol·lecciód’estructures

proteiquesobtingudesperdifraccióderaigs‐XiperRMN(Bermanetal.2007)(figura2.

1).Totiaixò,elnombredeproteïnescristal·litzadesésdosvegadesinferioralnúmerode

seqüènciestrobadesalesbasesdedadesdeSwiss‐protiTrEMBL(Kopp,Schwede2004).

Davant d’aquest dèficit d’informació, els mètodes computacionals per a la predicció

d’estructuraterciàriahanpermèsferunsaltenl’estudideproteïnes.

Figura2.1.EvoluciódelesestructuresproteiquesdipositadesenelPDB,iquehanestatdeterminades

mitjançantlestècniquesdecristal·lografiaderaig‐X,RMNimicroscòpiaelectrònica(dadesextretesde

http://www.wwpdb.org).


150

La semblança estructural entre proteïnes diferents es troba íntimament

relacionadaamblasevafunció.Malgratqueexisteixenmésfamíliesdeproteïnesquetipus

deplegaments,cadaunad’ellesescaracteritzaperadoptarunplegamenttridimensional

adaptat a les funcions que realitzen. Un exemple seria la família d’Igs, els dominis dels

quals es pleguen en conformació barril‐β. També és possible, peròmenys freqüent, que

proteïnessensecaprelacióbiològica,presentinunaconformaciótridimensionalsemblant.

Elplegamentd’unaproteïnavedeterminatperlespropietatsdelaseqüènciad’aminoàcids

que la composen i, per tant, proteïnes amb una seqüència semblant tendeixen a una

estructuratridimensionalsimilar(Chothia,Lesk1986).Percomparaciódeseqüènciesde

diferentsproteïnes,espodenidentificarcombinacionsparticularsd’aminoàcidsquesovint

impliquendeterminatspatronsestructuralsAixòsignificaque,alapràctica,sil’estructura

d’unaproteïnahaestatdeterminadaexperimentalment(percristal·lografiaidifraccióde

raigs‐X), llavors larestademembresde lamateixa famíliapodensermodeladesapartir

d’aquesta.

L’alineamentmúltipleilarecercadeseqüèncieshomòloguesenelPDBéslabase

del modelatge tridimensional de proteïnes, amb el qual es comparen multitud de

seqüènciesd’estructuraconegudais’identificalademajorgraud’identitat,laqualservirà

com amotlle de la proteïna problema. Existeixen diferents tipus d’alineamentmúltiple

però elmés habitual és elmètode heurístic, com ho són els algoritmes BLAST i FASTA

(Altschuletal.1990,Pearson1990).Aquestmètodeesbasaendelimitarelrangderecerca

dedadesmitjançant l’aplicacióde filtresdeselecció,de formaques’optimitza larecerca

d’homologiadinslaimmensitatdeseqüènciesdepositadesenlesbasesdedades,iqueva

enaugment(Leach2001).

La predicció d’estructura per homologia de seqüència resulta molt útil com

alternativa a l’obtenció del cristall de proteïna, o per proteïnes que no poden ser

analitzadesperRMNen soluciódegut a la seva grandària, comés el casdels fragments

variablesd’anticossosdecadenasenzilla(scFv).Laqualitatdelmodelatgetridimensional

ésequiparablealacristal·lografiaderaigs‐Xdebaixaresolucióoalsespectresd’RMNde

resolució mitja. Aproximadament, el 70 % de les seqüències conegudes es poden

comparar, comamínim,ambunade lesproteïnesd’estructuraconegudadepositadesal

PDB.

Unmodelcomparatiuimplicaassignaruntipusdeplegamental’objected’estudia

partir dels ja dipositats en el PDB. Un cop seleccionades les proteïnes d’estructura 3D

coneguda,calrealitzarunalineamentmúltipled’aquestesseqüenciesamblaproblemaper

taldedeterminarlamillorcorrespondènciaentreresidus.Ambl’alineamentil’estructura

motlle,esconstrueixunmodelteòrictridimensionaldelaproteïnaenqüestiófentúsde


151

mètodes bioinformàtics, com ara el softwareMODELLER9v2. Finalment, elmodel ha de

ser avaluat, refinat i caracteritzat considerant els criteris estructurals i energètics

necessaris(Sanchezetal.2000,Fenyö2010).

Existeixenunagranquantitatdeprogramescomputacionalsiservidorsd’internet

queautomàticamentprocessenmodelatgetridimensional.Tot isermoltútils,elsmillors

resultatss’obtenenemprantmètodesdeprogramacióbioinformàtica.

En aquest capítol, i en relació amb el capítol anterior, s’ha modelat l’estructura

tridimensionald’unscFvespecíficcontraelpèptidAβ,l’scFv‐h3D6(Marin‐Argany2009).

Els experiments i resultats aquí exposats, han estat realitzats en col·laboració, i durant

l’estadad’unmes,ambelgrupderecercadeBioinformàticaEstructural,dirigitperelDr.

Oliva,B.,delCentredeRecercaBiomèdicdeBarcelona(GRIB‐IMIM‐PRBB).

Peralmodelatgedel’scFv‐h3D6,s’haempratcomamotllel’scFvespecíficcontrael

receptor del coronavirus SARS, d’estructura cristal·litzada i dipositada al Protein Data

Bank (codi PDB2GHTrp:B), ambun 70%d’identitat i un 94%de semblança seqüencial

ambelnostrescFv‐h3D6.Apartirdel’aplicacióbioinformàticaMODELLERs’hanobtingut

lescoordenadesde5possiblesmodels,d’entreelsques’haseleccionatelmodelmésòptim

energèticament.

D’aquesta manera s’ha obtingut un model teòric fiable que ha servit com a

caracteritzacióvisualdelaproteïna,tananivelld’estructurasecundàriaiterciària,comde

residu, així com per a localitzar regions ambmajor tendència a l’agregació. Dadesmolt

útilsperaentendreelcomportamentdelamolècula imillorar‐nel’experimental.Amés,

ha permès al nostre grupde recerca fer undisseny racional demutants del scFv‐h3D6,

augmentant l’estabilitat de la molècula, i disminuint la seva tendència a l’agregació

(Rivera‐Hernandez et al. 2013). Finalment, esperem, enun futur immediat, que aquesta

millora incrementi la vidamitja de l’scFv‐h3D6 i, conseqüentment, aconseguir reduir la

dosiefectivadelamolèculaobtingudaprèviamentenelsratolins3xTg‐AD(Gimenez‐Llort

et al. 2013). Que tot i ja ser baixa (una única injecció intraperitoneal de 85 μg resulta

efectiva als 5 dies), disminuir‐la per disseny racional del plegament i l’estabilitat de la

molècula ha d’ajudar en el pas cap a proves clíniques a d’altres mamífers no murins,

desitjablement,aassajosclínicsenhumans.


153


L’obtenciódelmodeltridimensionaldel l’scFv‐h3D6esvarealitzarmitjançantun

seguit de tècniques bioinformàtiques descrites a continuació, totes elles emprant el

llenguatge de programació Python (Van Rossum 1991), capaç de llegir i reproduir els

scripts (llistat de comandaments que s’executen amb un ordre determinat i de forma

automàtica)delsdiferentsprogramesutilitzatsenaquesttreball.

3.1. Recercadeproteïnamotlleperhomologiadeseqüència.

El model parteix d’una recerca d’homologia de seqüència per a cada un dels

dominisVHiVLperseparat,emprantl’aplicacióBLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)

(Altschuletal.1990),apartird’estructuresjaresoltesidipositadesalPDB(ProteinData

Bank).Esvan filtrar les regionsdebaixa complexitatde cadaalineamentno redundant,

pertaldedescartatfalsosresultats.Laseqüènciademajorvalordecoincidència,comuna

peralsdosdominis,vaserseleccionadad’entre les24possibles.L’estructuracristal·lina

del fragment d’anticòs scFv‐h3D6 específic contra el domini d’unió del receptor de la

proteïnaSARS(codiPDB:2GHTrp‐B),ambun70%d’identitat(94%desemblança)iun

valord’homologia (E‐score)de2e‐84, va ser seleccionat comamotlleper a construir el

model3Ddel’scFv‐h3D6,mitjançantelprogramaMODELLER9v2(Sali,Blundell1993).

3.2. ModelatgetridimensionaldelscFv‐h3D6.

Inicialment, es van dissenyar cinc possibles conformacions per al scFv‐h3D6.

L’elevadaflexibilitatdelconnector,(Gly4Ser)3,nopermetunpatródedifracciódefinitenel

motlle, per tant, les seves coordenades per al model van ser optimitzades per mínims

energètics (LoopRefining, MODELLER 9v2), obtenint deu possibles estructures del

connector,encaixadesambelscincprimersmodelsseleccionatsdelscFv‐h3D6.

MitjançantelprogramaProSa2003(Wiederstein,Sippl2007),esvatraçarunperfil

de mínims energètics de cada model i connector proposats. Es van analitzar finestres

consecutives de 25 residus, prenent lamitjana de cada una, per assignar un valor d’∆G

teòrica(pseudo‐energia)acadaundelsresidus,deformaqueesvaescollirelmillormodel

demínimaenergia.

LesimatgesdelmodelfinalesvanobtenirambelprogramaPyMol(DeLano2002),

elqualpermetvisualitzarmodelsmolecularsen3D.


154

3.3. Numeracióestàndarddel’scFv‐h3D6ilocalitzaciódelesregionsCDR.

Peraseguirlanumeraciócanònicadelsresidusd’Ig,iunacorrectaidentificacióde

les regions CDRs (Complementary determining regions), es va emprar l’esquema de

numeracióKabat(Wu,Kabat1970,Kabat1983,Johnson,Wu2001).Aquestaclassificació

aportaun seguitde reglesquedefineixen cadaundels sisCDRs (tresper cadadomini),

comaral’aminoàcidinicial,elsresidusanteriorsiposteriorsalCDR,ielnombrederesidus

queelformen.

3.4. Caracteritzacióestructuraldelmodeld’scFv‐h3D6perDSSP.

L’algoritme bioinformàtic DSSP (Definition of Secondary Structure of Proteins)

(Kabsch, Sander 1983) resulta molt útil per assignar l’estructura secundària i altres

característiquesgeomètriquesdelmodelapartirdelescoordenadesatòmiquesenformat

PDB,comara:

‐ Exposiciódels residusal solvent. Per a cada residu de la seqüència s’obté un

valor teòricque indica lasuperfíciede l’àreadelresiduquees trobaexposadaal

solvent, en Å. De forma que se’n extrau si el residu es troba encarat cap a la

superfíciedelamolèculaobé,formapartdelnuclihidrofòbicd’aquesta.

‐ Contactesentreresidusdedistànciamenora5.5Å. S’obté,de formageneral,

els valors mínims per a establir interaccions entre residus, definint així les

interaccions secundàries i terciàries intradomini, així com les interaccions

interdomini que conformen la interfície. A l’hora d’estudiar contactes específics

s’ha realitzat, amb el programa Pymol, un anàlisi manual més concret de les

regionsd’interès.

3.5. Predicciódetendènciaal’agregacióperTANGO.

TANGO és un algoritme computacional dissenyat per a predir la tendència a

l’agregacióenfulla‐βdepèptidsiproteïnesdesplegades(Fernandez‐Escamillaetal.2004,

Lindingetal.2004).Esbasaenelsprincipisfisicoquímics(pH,temperatura,forçaiònica,

concentració de TFE, estabilitat proteica, protecció N‐terminal i C‐terminal, etc.) de la

formació de fulla‐β estesa, entenent que les regions internes dels agregats es troben

completamententerrades.TANGOdiferènciaentretendènciaafulla‐βnativail’amiloide.


155

3.6. AlineamentMúltipleiResidusConservats.

És necessari establir un alineament múltiple entre l’scFv‐h3D6 modelat i altres

seqüències scFv humanes o humanitzades d’elevada homologia per tal de determinar

aquells aminoàcids conservats evolutivament i que juguen un paper important dins la

molècula, ja sigui per a la seva funció, estabilitat o solubilitat, i que per tant no es

convenientmutar‐losquancoincideixenamblanostraseqüència.

Amb el programa ClustalTrp2 (Thompson, Higgins & Gibson 1994), s’ha fet un

alineament múltiple de les 24 seqüències d’scFv humanitzades obtingudes prèviament

amb el programa BLAST. Aquesta informació és molt important a l’hora de dissenyar

futursmutantsdel’scFv‐h3D6.

3.7. AminoàcidScanning‐Mutation.

Mitjançant l’aplicació ProSa 2003 (Wiederstein, Sippl 2007) s’ha realitzat un

anàlisiAAScanning‐mutationambelqualesmuta,teòricament,cadaundelsresidusdela

seqüènciad’interèsperels20aminoàcidsproteïnogènics.Comaresultats’obtéunvalor

demutació (z‐score)perresidu iaminoàcidsubstituent.Comparantaquestvalorambel

delwild‐type(WT),esclassificacadamutaciócoma:

‐ estabilitzadora(zwt–zmut>0),

‐ desestabilitzadora(zwt–zmut<0),

‐ oneutre(zwt–zmut=0).

El valor z‐score deriva de la distribució d’energies de la proteïna problema

comparadaambunaproteïnapatró,sentσladesviacióestàndard.

Per a determinar els z‐score s’ha tingut en compte la combinació de dos tipus

d’energia:

‐ l’energiasuperficial,associadaalCβdecadaresidu.

‐ l’energiadeparells,associadaal’energiaentreCβ‐Cβdedosresiduspropers.


157

4. RESULTATS

4.1. Proteïnamotlle:l’scFvespecíficcontradelvirusSARS.

El model tridimensional de l’scFv‐h3D6 s’ha dissenyat a partir de la seqüència

motlle amb codi PDB 2GHTrp:B, corresponent a un scFv dirigit contra el receptor d’un

coronavirus causantdel Síndromerespiratoriagut sever (SARS,SevereAcuteRespiratori

Syndrome),obtingudaperrecercadeseqüencieshomòloguesaldominiVLiVHmitjançant

elprogramaBLAST.

Comespot veure en la figura2. 2, lesdues seqüències sónmolt semblant entre

elles,comparteixenun70%d’identitati,delsresidusnocoincidents,el81%corresponen

acanvisconservatius,ésadir,entreaminoàcidsdecaracterístiquesmolecularssemblants

i,pertant,noalterensignificativamentl’estructuradonadaperlaseqüènciamotlle.Un2%

(7/246)del’alineamentcorresponagaps,degutaunprocésdeinsercióodeleciód'algun

delsresiduenalgunadelesseqüències.

Figura2.2AlineamentdelaseqüènciascFv‐h3D6(query)amblaseqüènciamotlle2GHTrp:B(subject).

L’alineament,perpBLAST,delaseqüènciadelnostrescFvamblacadenaBdelscFvdirigitcontraelreceptor

delcoronavirusSARS(codiPDB:2GHTrp:B),quetéun70%d’identitat.+:canvisconservatius;gap:posicióen

blancdegutaunainsercióodeleciód’unresidudeterminat.


158

En aquest cas, el connector utilitzat en la seqüència motlle és idèntic al nostre

(Gly4Ser)3, el més usat en la bibliografia per al disseny de molècules scFv, però, al no

trobar‐sebenresoltalsmapesdedifracció,noespotusarcomamotlleestructural.

4.2. Possibilitatsdemodels3Dperal’scFv‐h3D6.

Les coordenades atòmiques de la seqüència motlle 2GHTrp:B, dipositades en el

PDB, van ser introduïdes al programa MODELLER 9v2 juntament amb l’alineament de

totesduesseqüències.Així,esvandissenyar5modelsteòricsdel’estructura3Ddel’scFv‐

h3D6,sempretendintaconstruccionsenergèticamentfavorables.

Tal i com es pot observar a figura 2. 3‐A, els 5 models teòrics obtinguts són,

estructuralment, molt semblants entre ells. Tan sols variarà mínimament l’orientació a

l’espai de l’estructura secundària, concretament dels angles Φ (phi) i Ψ (psi),

corresponentsal’enllaçrotacionalNH‐CαiCα‐COrespectivament(resultatsnomostrats).

Alnodisposardelescoordenadestridimensionalsdelconnector,vasernecessari

refinar l’estructura3Dd’aquestaregióde l’scFv‐h3D6 fentúsde l’aplicacióLoopRefining

del programa MODELLER 9v2. Per a cada un dels cinc models, es van obtenir deu

conformacionsespacialsperalconnector(figura2.3‐B).

Figura2.3.Modelsteòricsdel’estructura3Ddel’scFv‐h3D6A)AmbMODELLER9v2esvanobtenirles5

construccionsmésfavorablesenergèticamentapartirdelescoordenadesdelmotlle2GHTrp:B.Totisemblar

iguals, es diferencien per petits canvis d’orientació en les estructures secundàries. B) Per a cada un dels 5

models construïts, es van dissenyar, permínims energètics i dinàmicamolecular, 10models de connector

diferents.Apartirdelperfilenergèticesdescartarenelsmenysfavorablesiesseleccionàelmodelòptim.


159

Algunes d’elles, mostren connectors molt desfavorables energèticament,

generadorsd’inestabilitatmolecularpelfetd’unirelsdosdominis,VHiVL,perlainterfície

hidrofòbica,suposantunxocestèricquedónallocalareorientacióderesidusjaestables.

Altresmodelsestrobentallatsenalgunpuntdelaseqüència,jaquelaconformacióglobal

delaproteïnanopermetlapresenciadedeterminatsresidusenunpuntconcret,jasigui

pelseuvolumespacialolasevacarrega,operquèl’angledegirdelsseusenllaçosestroba

foradel’espaiconformacionalpermès.

4.3. Determinaciódelmodeldemínimaenergia.

L’obtenció dels perfils energètics, mitjançant el programa ProSa 2003, de cada

modelambelsdeuconnectorsteòricsvapossibilitarlaselecciódelmodelmésfavorable

energèticament(Figura2.4).

Laconformaciódecadaundelsconnectorsprovocaunareestructuraciódelaresta

delamolècula,modificant,deformaespecífica,l’estructuratridimensionaldelmodel,fent‐

lamésomenysestable.Engeneral,laconformaciódeldominiVHesveumésalteradaque

ladeldominiVL.Comerad’esperar,elspicsdemàximaenergiadelperfilescorresponena

les regions CDR de la proteïna que, igual que el connector, són loops flexibles. Els seus

extrems, però, cauen en pics de mínima energia i formen part de fulles‐β, mostrant la

necessitat dels CDR per aferrar‐se a l’estructura global i estable de la proteïna, i així

compensar l’entropianecessàriaperamantenirels loopsdeCDRexposats.Obtingutsels

perfils,esvandescartarelsconnectorsambuna∆Gteòricagranfinsaconseguirunmillor

perfildemínims.Percomparaciódepics,esvaseleccionarelmodelambméstendènciaa

valorsglobalsmínimsde∆G.


160

Figura2.4.Perfils energèticsde cadaundels5models.Amb Prosa2003 es van obtenir els perfils de

mínims energètics de cadamodel amb els 10 connectors. De dalt a baix,model 1‐5; columna dreta, perfils

inicials; columna esquerra, perfils on s’han eliminat els connectorsmenys favorables energèticament. En

vermell,model2seleccionatcomaòptim,ambeltercermodeldeconnector.

4.4. NumeracióKabatdel’scFv‐h3D6ilocalitzaciódelesregionsCDR.

L’esquemadelaseqüènciadel’scFv‐h3D6espotveurerepresentatalafigura2.5.

La primera seqüència representa el domini VH i la segona al domini VL, separades pel

connectorflexible(Gly4Ser)3.ElsresidusCysestrobenmarcatsengroc,elsTrpenvermell,

elsVH‐CDRenverd,ielsVL‐CDRenblau.Tambés’aprecienles9cadenes‐βdecadadomini,

5cadenes‐βd’unafulla‐βi4cadenes‐βdel’altrefulla‐β,queconformenelbarril‐β.


161

Figura2.5.Esquemadelaseqüènciadel’scFv‐h3D6inumeracióKabat.EldominiVHestàformatper119

residus,ambsisinsercionsrespectelanumeracióKabat(a,b,c,d…)i,pertant,finalitzaenelresidu113dela

numeracióKabat;itresresidustriptòfan(vermell).EldominiVLconté112residus,ambcincinsercionsi,per

tant, finalitzaenel residu107de lanumeracióKabat; idos residus triptòfan.Totsdos formen9 cadenes‐β

canòniques(VH‐βA,B,C,C’,C’’,D,E,FiG)ipresentenlesduescisteïnesqueformaranelpontdisulfurdecada

domini (groc). Les sis regions CDR (VH, verd i VL, blau) corresponen, principalment, a regions de loops

irregulars.Ennegreelconnectorflexible(Gly4Ser)3queuneixtotsdosdominis.

Per a una correctanumeraciódels residusde la seqüènciade l’scFv‐h3D6, es va

emprarlanumeracióestàndardd’immunoglobulines(Igs)definidaperKabat(Wu,Kabat

1970, Kabat 1983, Johnson, Wu 2001), i desenvolupada a partir d’homologia de

seqüènciesd’Igs.Cadaunadelescadenes,pesadailleugera,téunanumeraciópròpia.La

numeració Kabat és molt rígida per a cada aminoàcid conservat, de forma que les

possibles insercions de seqüència són introduïes mitjançant lletres, conservant la

numeracióestàndard.

Amés amés, gràcies a la definiciódeCDRsperKabat, es vanpoder classificar i

delimitarlessisregionsCDRdel’scFv‐h3D6(tresperacadadomini),aixícomlesregions

entreelles(FRs,oFrameworkRegions).Repespecialatenció,elVH‐CDR3,elmésdifícilde

classificar (Oliva et al. 1998) i el que, a més, potencia les interaccions sinèrgiques

(cooperatives, o avidity) dels anticossos per a reconèixer i unir l’antigen específic

(Manoutcharianetal.2004).Totique,enfunciódel’especificitatperl’antigen,cadaCDR

té una seqüència diferent, determinats paràmetres o patrons són conservats entre les

diferents Igs, com ara l’aminoàcid inicial, els residus anteriors i posteriors al CDR, i el

nombrederesidusqueelformen.


162

Comparant informació,hemvistquetanelsVL‐CDR1,VL‐CDR2iVL‐CDR3comels

VH‐CDR3iVH‐CDR2presentenlescaracterístiquestípiquesdelsCDR.TansolselVH‐CDR1

s’allunyadelconsensgeneral,perlasevallargàriailocalitzacióeneldomini;sielsquatre

primersresidusdelaFRanteriorformessinpartdelaregió,elVH‐CDR1jacompliriaamb

elsrequisitsestablerts.

4.5. Caracteritzaciódelmodeltridimensionaldel’scFv‐h3D6.

Adoptant el plegament canònic dels dominis d’Igs, cada un dels dos dominis

variables de l’scFv‐h3D6 conté dues fulles‐β antiparal·leles empaquetades estretament,

unacontral’altre,adoptantunaconformaciócompactaenbarril‐β(Figura2.6).L’extrem

N‐iC‐terminaldecadadominiestrobenoposatsentreellsisituatsalsextremsdelbarril‐

β.Unadelesfullesconté5cadenes‐β(A,B,C,C’iC’’)il’altreenconté4(D,E,FiG).

Figura2.6.Modeltridimensionaldel’estructuradel’scFv‐h3D6.L’scFv‐h3D6contédosdominisvariables

(VHiVL)formats,cadaund’ells,perduesfulles‐βqueadoptenunaconformacióenbarril‐β.Cadadominiconté

tresregionsCDR(verd) iunpontdisulfur (groc).L’scFv‐h3D6contécincresidus triptòfan(vermell), tresal

dominiVHidosaldominiVL.Elconnector(negre),moltexposatalsolvent,uneixtotsdosdominis.


163

Els loops de CDR es localitzen entre les cadenes B‐C, C’‐C’’ i F‐G, i es disposen

propers entre ells, encarats cap a lamateixa cara del barril‐β, i exposats a la superfície

globular.Elplegamentdeldominiestrobaestabilitzatper:

‐ pontsd’hidrogenentrelescadenes‐βdecadafulla.

‐ interaccionshidrofòbiquesentreresidusdelesduesfulles‐β.

‐ unpontdisulfurentrelacadenaBd’unafulla‐βilacadenaFdel’altre:

‐ dominiVH:Cys22(B)‐Cys92(F)

‐ dominiVL:Cys23(B)‐Cys88(F)

L’scFv‐h3D6 conté cinc residus de triptòfan molt conservats (figura 2.6, en

vermell),tresendominiVHidoseneldominiVL:

‐ dominiVH:Trp36(C),Trp47(C’)iTrp103(G)

‐ dominiVL:Trp35(C)iTrp89(F,iéselprimerresidudelCDR3)

El VH‐Trp36 i el VL‐Trp35 es localitzen en el nucli hidrofòbic de cada un dels

dominis,mentrequeelsVH‐Trp47,VH‐Trp103,iVL‐Trp89formenpartdelainterfíciedels

dosdominis.Pera teniruna ideade la importànciade les interaccionshidrofòbiquesen

aquestainterfície,ladistànciaentreVH‐Trp103‐CZ2iVL‐Trp89‐CH2ésde3.3Å,ilad’entre

VH‐Trp47‐CD1iVL‐Trp89‐CZ2ésde5.7Å.

4.6. Exposiciódelsresidusalsolvent.

Els valors de DSSP, mostrats a la figura 2. 7, donen informació rellevant per al

disseny de possibles mutants de l’scFv‐h3D6. Aquesta informació representa un dels

primerspassosperadecidirquinresidu,d’unaregiódeterminada,éselmésadientpera

ser mutat. En un principi, és aconsellable no mutar residus enterrats cap a l’interior

proteic.

Estructuralment,elDSSPmostraquelesregionsplegadesenfulla‐βtenencaràcter

amfipàtic, és a dir, alternen residus exposats amb residus enterrats de forma molt

marcada.Encanvi,elsβ‐turnsnosegueixenunpatróamfipàtic.Inicialmentesperàvemque

els residus de les regions CDR tinguessin una elevada exposició al solvent, disposició

òptimaperaunir l’antigen,guanyarestabilitat idisminuïr la∆G,quesense la interacció

ambl’antigenéselevada.


164

Tot i això, els resultats obtinguts no ratifiquen aquesta hipòtesi, ja que tant es

trobenorientatscapalasuperfíciecomcapal’interior.Laexplicacióaaquestaobservació

és que el loop de CDR ha d’adoptar una conformació tridimensional que encaixi

específicamentambl’estructura3Ddel’antigencomplementari.

Figura 2. 7. Superfície d’exposició al solvent. La gràfica, obtinguda per DSSP, mostra la superfície

d’exposicióalsolvent(Å)decadaundelsresidusdelaseqüènciadel’scFv‐h3D6.Elsresidusambvalorinferior

a25Åesconsiderenmoltenterrats.

4.7. Predicciódetendènciaal’agregació.

La figura 2. 8, juntament amb la taula, mostra els resultats obtinguts per

l’algoritmeTANGO,elqual identificaquatreregionsambfortatendènciaa l’agregacióen

fulla‐βdinslaseqüènciadel’scFv‐h3D6,iquecorresponenalescadenes‐βFiGdeldomini

VH,iC’iFdeldominiVL.Elspicsambvalorsinferiorsa8s’hanconsideratfalsospositius,i

nos’hantingutencompte(Cerda‐Costaetal.2009).


165

Figura2.8.Prediccióde la tendènciaa l’agregacióde l’scFv‐h3D6.Mitjançant l’algoritmeTANGO, s’han

determinatlesregionsambmajortendènciaal’agregaciódel’scFv‐h3D6.Elsresultatsesmostrenenformade

gràfica (dalt) o com a taula de valors específics (baix). Es diferencien clarament quatre regions, dues per

domini,ambfortatendènciaenagregar.Elsvalorsinferiorsa8hanestatdescartats.

Justament,lesduescadenesdecadadominiambtendènciaal’agregacióestroben

empaquetades entre elles per contactes hidrofòbics, contrarestant el possible efecte de

nucleaciódecadaunadelesfulles‐aïllades.L’exposiciód’aquestesregionsalsolvent,pot

desencadenarl’agregaciódelaproteïnailaconseqüentinsolubilitatdel’agregat,apartde

resultarunpuntcríticcapalaviaamiloide.

4.8. AlineamentMúltiple.

L’alineamentmúltipleésunaeinamésperapoderdeterminarresidusmutables.

Comparantentreseqüènciess’hanreconegutelsaminoàcidsmésconservatsi,enprincipi,

nomutables jaque implicariacanvisen laestabilitat, solubilitato funcióde lamolècula.

Residu TANGO Residu TANGO Residu TANGO Residu TANGO

VH‐βF VH‐βG VL‐ βC’ VL‐ βF

A88 36.34 T107 8.08 L47 35.50 V85 24.27

V89 39.80 L108 9.60 I48 36.18 Y86 24.34

Y90 39.80 V109 9.60 Y49 36.18 Y87 24.34

Y91 39.80 T110 9.60 L50 36.18 C88 23.98

C92 39.65 V111 9.60 V51 36.18 W89 23.87

V93 36.89


166

Ambl’alineament,esdeterminal’aminoàcidmésabundantenunaposicióamutar isies

corresponambeldelaseqüènciadelnostrescFv(Figura2.9).

Figura 2. 9. Alineamentmúltiple de l’scFv‐h3D6. Alineament de la seqüència de l’scFv‐h3D6 amb 23

seqüènciesscFv.Lesdiferentstonalitatsdeblauressaltenlaconservaciódelresiduencadaposició,desdemés

conservada(blaufort),jasiguielmateixaminoàcidounaltreamblesmateixespropietatsfísico‐químiques,a

menys conservada (blanc). La numeració dels residus no segueix la numeracióKabat emprada per al scFv‐

h3D6.

LesregionsCDRs, tot inoserconservadesentre lesdiferentsseqüènciesdeguta

que cada scFv és específic d’un antigen determinat, no sónmutables. Fer‐ho suposaria

perdreafinitatambl’antigen,enelnostrecaselsoligòmersformatspelpèptidAβ1‐42.Els

mutantsdeCDRsserienpossiblesuncopobtingutelcristalldelcomplexscFv‐h3D6:Aβ1‐42,

treball pensatper a fer enun futur tot i resultardifícil degut a l’agregaciódel complex.

Ambellescaracteritzarienlesinteraccionsrealsenelcomplexiespodrienmutarresidus

específicsperaoptimitzar‐nel’afinitati,així,aconseguirunamenordosiefectivadel’scFv.


167

4.9. AminoàcidScanning‐Mutation.

Emprant l’eina Aminoàcid Scanning‐mutation (ProSa 2003), es va realitzar una

predicció teòrica de l’efecte de les mutacions sobre l’estabilitat de la molècula. Es

considera que una posició en elWT no és estable, quanmínim 15 dels 20 aminoàcids

possibles no desestabilitzen l’estructura. L’anàlisi dels resultats obtinguts mostra que

11/113 residus del domini VH (~ 10%) i 13/107 del domini VL (~ 12%)millorarien

l’estabilitatdelamolècula.

Taula2.1.Aminoàcid Scanning‐Mutation.A la taula s’hi representen aquells residus de la seqüència del’scFv‐h3D6que,teòricament,sóninestablesjaquemínim15dels20possiblesaminoàcidsaportenestabilitata lamolècula.Tambéesmostrenaquellscanvisquela inestabilitzenielsqueresultenneutres.Amés,peracada residu, esmostra la regióa laqualpertanyendins lamolècula (FRoCDR), la superfícied’exposicióalsolventobtingudaperDSSP,latendènciaal’agregaciópreditaperTANGOielgraudeconservaciódelresidud’entre les 24 seqüències diferents comparades a l’alineament múltiple. En gris es remarquen aquellesposicionsqueserienadientsperamutar.

Residu

VH

Mutacions

estables

Mutacions inestable

Mutacions neutre

Regió Exposició al

solvent (Å)TANGO

Grau de

conservació E6 19 0 1 FR1 6.3 0 18/24 G10 19 0 1 FR1 44.2 0 21/24

F27 15 4 1 FR1 13.0 0 21/24

R38 16 3 1 FR2 1.1 0 23/24

E46 16 3 1 FR2 17.9 0 22/24

Y59 17 2 1 CDR2 28.8 0 22/24

S60 16 3 1 CDR2 9.3 0 1/24

R71 16 3 1 FR3 11.0 0 23/24

D86 15 4 1 FR3 0.6 0 24/24

D101 16 3 1 CDR3 11.2 0 20/24

G106 17 2 1 FR4 19.8 0.65 24/24

Residu

VL

Mutacions

estables Mutació inestable

Mutació neutre

Regió Exposició al

solvent (Å) TANGO

Grau de

conservació

P18 18 1 1 FR1 50.7 0 1/24

L27c 15 4 1 CDR1 41.7 0 3/24

K30 16 3 1 CDR1 36.9 0 1/24

R46 16 3 1 FR2 1.1 0 1/24

L50 17 2 1 CDR2 37.0 36.06 2/24

V58 17 2 1 FR3 13.7 0 7/24

K74 17 2 1 FR3 44.1 0 1/24

D82 15 4 1 FR3 1.2 0 24/24

Q90 15 4 1 CDR3 0.0 1.06 22/24

F94 16 3 1 CDR3 65.7 0 2/24

P95 19 0 1 CDR3 19.3 0 18/24

R96 17 2 1 CDR3 14.1 0 2/24

K103 16 3 1 FR4 45.5 0 24/24


168

Després de mirar la regió (CDR/FR), l’accessibilitat al solvent, la predicció de

TANGO, i el grau de conservació a l’alineament múltiple de cadascun d’aquest residus

(Taula2. 1), teòricamentmillorables, nomésdos eren adientsper a ser realitzats, P18 i

K74 del domini VL. Tanmateix, amb un anàlisi més profund es va veure que la P18 és

necessàriaperquèformapartd’ungir‐β(VLβA‐βB), iquelaK74,amésdeserunresidu

que trenca l’agregació (Pawar et al. 2005), estableix contactes salins que estabilitzen

l’estructurasecundariaalaquepertany(VLβE).

Amés,consideremqueaquestanàlisiéspocfiable,jaque,entred’altres,nodetecta

cap de les regions predites per TANGO com tendents a l’agregació, amb l’excepció del

residuVL‐L50,quepertanyalCDR2ipertantnoésmutable.Labonacorrelacióentreles

prediccions de TANGO i els resultats experimentals s’ha mostrat en diverses ocasions

(Cerda‐Costaetal.2007).

4.10. Redissenydel’scFv‐h3D6apartirdelmodel3D.

4.10.1. Mutacionsenelnuclihidrofòbic.

ApartirdelsresultatsobtingutsperTANGO,esvaproposaridissenyarunabateria

demutantssimplesambl’objectiudedisminuirlatendènciaal’agregaciódel’scFv‐h3D6i,

així,millorarelrendimentdepurificaciódelaproteïnarecombinant.Delesquatreregions

predites amb alta tendència a l’agregació, es van triar les tres amb valors de predicció

superiorsa10:VH‐βF,VL‐βC’,iVL‐βF(figura2.8).

Tot i ser conscients de la gran dificultat que comporta la mutació del nucli

hidrofòbic de qualsevol proteïna, vamdescartarmutacions a la superfície. És important

recordarquelaseqüènciadel’scFv‐h3D6éshumanitzada,jaquelamolèculatéfinalitats

terapèutiques,i,pertant,calanarambcompteal’horad’introduirmutacionsquepodrien

provocar,finalment,unarespostaimmunitàrianodesitjada.

Peraldissenydelsmutantsd’agregaciós’ha tingutencompte,principalment,els

valorsdeDSSP,l’alineamentmúltipleielscanvisderesidusdegutsalahumanitzaciódela

seqüènciadelfragmentd’anticòs(tambérealitzadasobrelesregionsFR).Aldissenyarels

mutants, s’ha tingutmolt en compteque s’estanmodificant regionsquees troben força,

inclús totalment enterrades, fet que comporta una gran dificultat per a triar una

substitucióadequadaperaquestesposicions.

Aixílapropostadesismutantsperadisminuirlatendènciaal’agregaciódel’scFv‐

h3D6vaserlasegüent:


169

‐ RegióVH‐A88‐V93(VH‐βF):MutantV89A/V89N

Aquesta regió conté la Cys92, que no és, en principi, mutable. A més, la Val93

precedeixalVH‐CDR3itampocésconvenientmutar‐la.Aixíquenomésensquedalaregió

A88V89Y90Y91,moltenterrada.ElresidumenysenterratéslaVal89,ambunDSSPde15.

Si considerem l’alineament en aquesta posició trobem 23Val i 1Phe, entre les 24

seqüènciesalineades.Amés, la seqüènciade l’anticòsabansde lahumanització erauna

leucina(Trp02006066171).Lafenilalanina,apartdesermassavoluminosa,tendeixmésa

l’agregacióque la leucina (Pawar et al. 2005).Ésper tot aixòque esdevémoltdifícil de

triarunasubstitucióenaquestaposició.L’únicaopcióplausibleenaquestessituacionsera

provar lasubstitucióaalanina, l’aminoàcidquemillors’adaptaenmultituddeposicions

(Weissetal.2000).Detotesmaneres,visualitzantelscontactesdelaV89dinsdelmodel,

també vam considerar la mutació a asparagina, ja que té poca tendència a l’agregació

(Pawaretal.2005).

‐ RegióVL‐L47‐V51(VL‐βC’):MutantY49T/Y49A

AquestaregiócomprènelVL‐FR2ielVL‐CDR2,quecomençaalaposicióLys50.Així

que sols ens queda permutar la regió L47I48Y49, extremadament enterrada. El residu

menysenterratésTyr49,ambunDSSPde8.Siconsidereml’alineamentenaquestaposició

trobem sempre una tirosina, i aquesta posició no ha estat humanitzada

(Trp02006066171). Degut a que aquesta tirosina ésmolt important per a la interacció

entreelsdosdominisdelScFv,consideremques’hademirardemantenirunresiduamb

característiques semblants, especialment la presència del hidroxil, raó per la qual vam

creurequelatreoninaeraunamutacióaprovar.Lamutacióaalaninaesvarealitzarper

defecte.

‐ RegióVL‐V85‐Trp89(VL‐βF):MutantV85T/V85A

AquestaregióprecedeixlaCys88,quenoés,enprincipi,mutable.Amés,elTrp89

ja formapart del VL‐CDR3 i tampoc és potmutar. Així que sols ens quedapermutar la

regióV85Y86Y87,moltenterrada.ElresidumenysenterratésVal85,ambunDSSPde16.

Siconsidereml’alineamentenaquestaposiciótrobem13Val,9Thr,1Alai1Asp,entreles

24seqüènciesalineades.Amés,laseqüènciadel’anticòsabansdelahumanitzacióerauna

leucina(Trp02006066171).Enaquestcasvamconsiderarquelamutacióatreonina,que

trenca la tendència a l’agregaciómillor que l’alanina (Pawar et al. 2005), era una bona

opció.Lamutacióaalaninaesvarealitzarperdefecte.


170

4.10.1.1. Resultatsexperimentalsdelsmutantsdissenyats.

Alserconscientsdelriscquesuposamutarresiduscompletamententerratsdinsla

proteïna,ialgunsd’ellsimportantsperalcorrecteempaquetamentglobular,erad’esperar

queel rendimentdepurificacióperalgunsdelsmutants fosbaixa, i aixíhaestatperals

mutantsVH‐V89AiVL‐V85A,onelcanvideresiduhadificultatelseureplegamentdeforma

quenohanpogutserextretsdelafraccióinsoluble.Peraquestaraó,aquestdosmutants

hanestatdirectamentdescartatsaseranalitzats.

Figura2.10.Desnaturalitzaciótèrmicaiquímicadel’scFv‐h3D6ilessevesvariants.A)Desnaturalització

tèrmicaperCDseguintelmínimd’el·lipticitata218nm.B)Desnaturalitzaciótèrmicaseguinteldesplaçament

del màxim de fluorescència a 338 nm. C) Desnaturalització química, per urea, on el màxim de l’espectre

d’emissiódelstriptòfansésrepresentatenfunciódelaconcentraciód’urea.WT(negre),VH‐V89N(blau),VL‐

V85T(vermell),VL‐Y49T(verd),VL‐Y49A(taronja).


171

Pelquefaalarestademutacions,tambéharesultatcomplicatextraure’nsuficient

quantitat de proteïna per a la seva posterior caracterització, però tot i així s’ha pogut

seguirendavant.

Lescorbesdedesnaturalitzaciótèrmica,seguidesperCDi fluorescència,mostren

una millora poc significativa o nul·la de la tendència a l’agregació (Figura 2. 10‐A, B).

Concretament,elsdosmutantsdelresiduconservatVL‐Y49T/Acomencenaagregaruns5

grausabansqueelWT,anul·lantdirectamentlahipòtesidedisminuciódelatendènciaa

l’agregació.Encanvi,elsmutantsVH‐V89NiVL‐V85Tsemblaqueretardinl’inicidelprocés

d’agregació,jaqueelsenyala218nmdecreixapartirdels50°C,cincgrausméstardque

elWT, quan s’inicia la reestructuració cap unmajor contingut en fulla‐β. Aquesta dada

seriaconsideradapositivasino fosperquè, tot i començarmés tard,elmutantVH‐V89N

assoleix l’estat agregat ràpidament, abans inclús que elWT. Segons la corba de CD del

mutantVL‐V85T(Figura2.10‐A),podriadir‐seques’hadisminuïtlatendènciaaagregació,

jaquel’intermediaris’assoleixunsdos°CméstardqueelWT,peròperfluorescènciano

s’observendiferènciesrespecteelWT.

Coms’observaalafigura2.10‐C,lescorbesdedesnaturalitzacióquímicaamburea

detotselsmutantssegueixenlamateixatransiciódetresestatsqueladescritaperelWT,

peròcapd’ellssemblamostrarunamilloradel’estabilitat.ElsmutantsVH‐V89NiVL‐V85T

sónpràcticament igualsqueelWTpelque faaldesplegamentdelsdosdominis,mentre

queelsmutantsdelresiduVL‐Try49desestabilitzenclaramenteldominiVLi,encaramés,

semblaquel’estatintermediari,iprecursordelaviaamiloide,estrobaestabilitzat

4.10.2. Re‐dissenydelextremC‐terminaldel’scFv‐h3D6.

Elmodeltridimensionalhapermèsunaexaminaciógràficadel’estructura,aixícom

determinar les distàncies entre cadenes laterals. S’ha vist que l’extremC‐terminal de la

molècula,quecorresponalresiduVL‐K107,segueixformantpartdelacadena‐βG(Figura

2.10). Per tant, les cadenes laterals de VL‐K107 i VL‐E105 es troben orientades cap a la

mateixa cara de la cadena‐β i haurien d’establir una interacció electrostàtica, però la

distanciaentreelles(VL‐K107‐NZiVL‐E105‐OE1),de9.1Å,ésmassagranperaestablir‐la.

Laraód’aquestaexcessivaseparacióésque, lacadenalateraldeVL‐K107estrobaatreta

perOXT107‐O,ladistànciaentrelesqualsésde4.9Å.


172

Figura 2. 11. Detall de l’extrem C‐terminal del scFv‐h3D6. A la imatge es marquen les principals

interaccionsentreels residusVL‐E105 iVL‐K107, i l’efectedelàtomd’oxigende la cadena lateralOXT107‐O

sobreaquestainteracció.

Al examinar l’alineament múltiple entre les 24 seqüències de molècules scFv

diferents(Figura2.9)esvaveureque14d’ellescontenienalextremC‐terminalelresidu

VL‐K107,sisVL‐R108iduesVL‐T109.

Amb la intenció d’estabilitzar la cadena‐β G de la molècula (treball de màster

Blasco,B., tesis en redacciódeRivera‐Hernández,G.), es vadecidir elongar enunodos

residus l’extrem C‐terminal, generant les formes mutants VL‐el‐R108 i VL‐el‐R108T109,

respectivament.Amés,peraconfirmarlahipòtesisdel’efectedeOXT107‐Osobrelafalta

d’interaccióentreVL‐K107iVL‐E105,tambéesvaestendrelacadenaprincipalafeginttan

solsunresidudeGly, formantelmutantVL‐el‐R108G.Pera facilitar la lectura,hanestat

anomenatscomaC1(VL‐el‐R108G),C2(VL‐el‐R108),iC3(VL‐el‐R108T109).


173

5. DISCUSSIÓ.

S’haobtingutunmodeltridimensionaldel’estructurad’unscFvconstruïtapartir

de la seqüència de l’anticòs h3D6.v2 (AAB‐001, Elan Pharmaceuticals), dirigit contra la

seqüència N‐terminal del pèptid A1‐42 (TrpO2006066171). En la cerca d’estructures

homòloguesenelPDBesvantrobarmésde1000seqüènciesambunahomologiasuperior

al30%(resultatsnomostrats);entreaquestes, l’scFvambcodiPDB2GHTrp:Bmostràel

majorgraud’homologia,ambun70%deidentitati,tansols,2%degaps.Amésdel’alt

graud’identitat,el30%restantcontéun81%demutacionsconservatives,esadir,espot

considerarqueelgrauglobald’homologiaésalvoltantdel94%.Comésd’esperar,el6%

demutacionsnoconservativesestrobaenelsCDRjaquel’anticòsdelqualderival’scFv

motlleestàdirigitcontraunantigendiferent(SARS,Spikeproteinreceptorbindingdomain)

delpèptid‐A.El fetqueelmodelatges’hagirealitzatambunmotlleambungrauglobal

d’homologiatantaltfaqueelmodelresultimoltfiable.

Totiaixò,laregiódelconnectornoestàresoltaencapdelspdbshomòlegsdeguta

lasevaaltaflexibilitat.Aquetaflexibilitatésnecessàriaperapermetrel’empaquetamenta

l’espaidelsdosdominisqueconformenlaquimerarecombinant.Peraixò,vasernecessari

refinarl’estructura3Dd’aquestaregió,fetqueimplicàunareestructuraciódelarestadela

molècula.Concretament, laconformaciódeldominiVHesveumésmodificadaque ladel

dominiVL.Laraód’aquestfetresultadifícild’explicarsenseconèixerlaviadeplegament

delsaltres scFvsde l’alineamentmúltiple.Enprincipi,molts scFvspresentenunaviade

plegamentdedosestats (desplegat i natiu)perquèeldominiVH, queésqui contribueix

més a l’empaquetament d’ambdós dominis per contenir més residus triptòfan a la

interfície,ésmenysestablequeelVL(Worn,Pluckthun1998,Worn,Pluckthun2001).En

elnostrecasperò,eldominiVHéselmésestableis’acumulaunintermediarienequilibri,

elquefaquelaviasiguidetresestats(desplegat,intermediariinatiu)(Rivera‐Hernandez

etal.2013,Rivera‐Hernandez2013).

Una vegada seleccionat el model de mínima energia que modifica menys la

conformaciódelsdominisdesprésdelsrefinaments,s’hapogutclassificarlesregionsCDR

(MacCallumetal.,1996).EncaraqueelVH‐CDR3estàdescritcomelmésvariable(Olivaet

al.,1998),ipertanthauriadeseelmésdifícildeclassificar,enelnostrecastansolselVH‐

CDR1s’allunyadelconsensgeneral,perlasevallargàriailocalitzacióeneldomini.Aquest

fetapuntacapaunamajorimportànciad’aquestCDRenlainteraccióambl’antigen.

Elmodelfinalcontéun51%defulla‐β,un29%degirs‐β, iun20%de loops,en

concordançaambelplegament tot‐quecaracteritzaelplegament tipus Ig(Mattuetal.,

1998).Cadaundelsdominisconténoucadenes‐β,disposadesenduesfulles‐βperadoptar


174

laconformacióenbarril‐βcanònicad’Igs.LescadenesβBiβFdecadadominicontenenles

cisteïnesqueconformenelspontsdisulfurcaracterísticsd’aquesttipusdedominis, isón

lescadenesβFlesmésenterradesilesquemostrenunamajortendènciaal’agregació.Els

CDRsd’ambdósdominisestrobenoposatsalconnectoriexposatsalsolvent.Elconnector

uneixtotsdosdominissenseinteraccionaramblamolèculaiambunaaltaflexibilitat,fet

quepotserunadelescauses,encaraquenolaprincipal,delbaixrendimentenl’obtenció

deproteïnarecombinantdurant lasevaexpressióipurificació,tal icomestàdescrita la

bibliografia (Zheng,Baumann&Reymond2003).Lasuperfícied’interaccióentreelsdos

dominisésmoltgran,implicantcontactesterciàrisentreresidusforçaenterrats,comper

exempleelsresidusVH‐Trp47,VH‐Trp103iVL‐Trp89,tresdelscincresidusTrpqueconté

l’scFv‐h3D6iqueestrobensituatsalainterfíciehidrofòbica,desd’onestableixenfinsa5,

7i8interaccionsterciàriesambresidusdeldominioposat,respectivament.

Amb les coordenades del model, s’ha derivat informació sobre l’accessibilitat al

solventdelsdiferentsresidus,ladistànciaentreresidusd’interès,iunrastreigdetotesles

mutacions possibles a les diferents posicions. A més, amb la seqüència primària, s’ha

obtingut un perfil de la tendència a l’agregació i un alineament amb altres fragments

d’anticòs. Tota aquesta informació ens ha permès proposar una sèrie de mutacions,

dissenyades per augmentar l’estabilitat de la molècula i per trencar la tendència a

l’agregació(Rivera‐Hernandez2013).

5.1. Mutacionsalnuclihidrofòbicaugmentenlatendènciaal’agregaciódel’scFv‐

h3D6.

Malauradament, els resultats obtinguts per aquests mutants no han estat els

desitjats,iladisminuciódelatendènciaal’agregaciópermodificacióderesiduspuntuals

nohaestatpossible.D’aquestamanera,esconfirmaladificultatdemutarresidusenterrats

dinslamolècula,comtambélaimportànciadequelesproteïnesadoptinelseuplegament

natiu,pertaldedeixarmenysexposadeslesregionsambméstendènciaal’agregacióiser

menys vulnerables a l’agregació. D’aquests resultats també se’n extrau la necessitat de

dissenyarmutantsmúltiples,jaquealfersubstitucionspuntuals,estrenqueninteraccions

importantsperalplegament iempaquetamentde lamolècula,de formaque laprincipal

parelladelresidumutatquedalliureipotcausarcertarepulsióalinteriordelamolèculao

establirinteraccionsnonativesambaltresresidusdel’entorn,fetqueprovocal’alteració

delesinteraccionsnativesdelaproteïnai,pertant,unamajorexposicióalsolventdeles

regionsambméstendènciaal’agregació.


175

5.2. L’elongació del extrem C‐terminal augmenta l’estabilitat termodinàmica i

disminueixlatendènciaal’agregaciódell’scFv‐h3D6.

El model tridimensional de la molècula d’scFv‐h3D6 ha permès observar que

l’extremC‐terminaldelamolècula,quecorresponalresiduVL‐K107,segueixformantpart

delacadena‐βG.LescadeneslateralsdeVL‐K107iVL‐E105estrobenorientadescapala

mateixacaradelacadena‐βperò,laproximitatdelacadenalateraldelresiduOXT107‐O

afebleix la interacció electrostàtica entre VL‐K107‐NZ i VL‐E105‐OE1. La elongació del

extrem C‐terminal hauria de separar l’OXT107‐O de la cadena lateral de VL‐K107, i

propiciarl’estabilitzaciódel’estructurasecundàriadelamolèculaidisminuirlatendència

al’agregaciódel’scFv‐h3D6.

Mitjançant la desnaturalització química per urea i espectroscòpia de FTIR, s’ha

corroboratlahipòtesidel’elongaciódelextremC‐terminal.Elsexperimentscorresponents

hanestatrealitzatspelscompanysdelaboratoriRivera‐Hernández,GiBlasco‐Moreno,B.

Elsresultatsobtingutsestrobendetallatsenlatesidoctoralenredacciódelprimer,ienel

treballdemàsterdelsegon,aixícomenelrecentarticlepublicatalarevistamAb(Blasco‐

Moreno 2011, Rivera‐Hernandez 2013, Rivera‐Hernandez et al. 2013). Resumidament,

l’elongació de l’extremC‐terminal, a través de les formesmutants C1 (VL‐el‐R108G), C2

(VL‐el‐R108), i C3 (VL‐el‐R108T109), ha permès estabilitzar el plegament global de la

molèculafinsaun20%,resultatquehadonatllocaladesestabilitzaciódel’intermediari

tèrmici,conseqüentment,s’hadisminuïtlatendènciaal’agregaciódel’scFv‐h3D6.Amés,

s’ha comprovat que aquesta modificació no afecta la formació del complex Aβ1‐42:scFv‐

h3D6, que segueix formant fibresWL. Per tant, s’ha optimitzat el plegament de l’scFv‐

h3D6 sense afectar la seva capacitat protectora enfront els oligòmers d’Aβ1‐42 (Blasco‐

Moreno2011,Rivera‐Hernandez2013,Rivera‐Hernandezetal.2013).

En conclusió, no ha estat possible mutar les regions amb major tendència a

l’agregaciódegutaqueestrobenenterradesalsnuclishidrofòbicsd’ambdósdominis,però

si s’ha pogut augmentar l’estabilitat i disminuir la tendència a l’agregació mitjançant

l’elongació de l’extrem C‐terminal, completament exposat al solvent. Aquesta elongació

s’ha realitzat amb residus conservats a l’alineament múltiple, de tal manera que no

s’esperenproblemesdeimmunogenicitatal’horaderealitzarassajosinvivo.

CAPÍTOL 3: Estudi inicial, mitjançant tècniques

espectroscòpiques, de les propietats termodinàmiques

d’un domini variable d’Ig implicat en l’Amiloïdosi de

cadenalleugera.Mutacionsrestaurativesiestabilitat.

V‐Capítol3 Resum

179

1. RESUM.

L’amiloïdosi de cadena lleugera (AL) és causada per una aberrant secreció de

cadeneslleugeresd’Igs(LC)lliuresencirculació,queagreguenformantfibresamiloidesal

espaiextracel·lularsd’òrgansvitals.Elsdominisvariables(VL)delesLCs,estansotmesosa

hipermutacionssomàtiquesi,enelcasdepacientsd’AL,aquestesmutacionsprovoquenla

desestabilització de la molècula. Alguns autors relacionen aquesta pèrdua d’estabilitat

amb una major tendència a formar fibres amiloides, causants del dany tissular

diagnosticat en l’AL, tot i això encara cal aprofundir més en els mecanismes

amiloidogènics pels quals es formen aquests agregats, i en el paper dels intermediaris

oligomèricsenlacitotoxicitat.Enl’AL,el85%delpacientspresentendímersdeLCslliures

en el plasma (proteïnes Bence‐Jones), on els dominis VL de dues cadenes LC s’associen

entreellsadoptantlainterfíciecanònicadelsdímersd’VL‐VHd’Ig.Estudisprevisindiquen

una alteració conformacional de la interfície dimèrica formada per cadenes LCs

amiloidogèniques,respectelaproteïnagerminal;uncanviconformacionalquesemblaser

elresponsabledel’amiloïdosid’AL.

Enaquestcapítols’haestudiat,mitjançantl’úsdetècniquesespectroscòpiques(CD,

fluorescència, i FTIR), les propietats termodinàmiques del domini VL de la proteïna

amiloidogènica AL‐12, extreta d’una pacient d’AL, així com també del seus mutants

restauratius cap la seqüència germinal κI O18/O8, amb unamenor tendència a formar

fibresamiloides.Aquestsresultats inicials,handeservirperadeterminar lacontribució

d’unaúnicamutaciósobrel’estabilitatdeldominiVL,iclarificarsiexisteixunacorrelació

directa entre una menor estabilitat i una major tendència a l’agregació amiloide, una

relacióqueencaracomportamoltacontrovèrsiaentreelsdiferentsautors.


181

2. INTRODUCCIÓ.

L’amiloïdosi de cadena lleugera (AL) és una de les moltes malalties

amiloidogèniques conegudes en humans, on la proteïna precursora de la formació de

fibres amiloides és una cadena lleugera (LC) d’Ig monoclonal (Ig). Normalment, dues

cadenesLCs’associenambduescadenespesades(HC)peraformarl’heterotetràmerd’Igs,

que serà secretat al plasma sanguini per actuar com a anticòs monoclonal (mAb). Les

cadenesLC tambépodensersecretadescomahomodímers, conegudescomaproteïnes

Bence‐Jones. En el cas d’AL, hi ha una secreció aberrant de dímers d’LC, degut a una

anormal proliferació de cèl·lules plasmàtiques del moll de l’os, les encarregades de la

síntesi de LC. L’excés d’aquestes proteïnes lliures en el plasma esdevé amb la seva

agregacióenformadefibresamiloidesideposicióa l’espaiextracel·lulardemoltòrgans

vitals;aquestadeposicióprogressaràpidamentdonant llocauna insuficiènciaorgànica i

mortdelpacient.

Degut a que existeixen múltiples seqüències germinals codificants per Igs, i la

hipermutabilitat somàtica que aquestes pateixenper tal d’obtenir el gran espectre d’Igs

específiques,l’ALésconsideradaunadelesamiloïdosiméscomplexesdecontrolar.Cada

pacient conté una única seqüència proteica, amb diferent grau amiloidogènic i lloc de

deposició amiloide. En aquest sentit, es considera que certesmutacionsno conservades

desestabilitzenelplegamentnatiuidesencadenenl’AL.Mésqueelnombredemutacions

conservadesonoconservades,serialasevalocalitzaciódinslamolèculalaquetindriaun

efectesignificantsobrel’estabilitatproteica(Blancas‐Mejia,Ramirez‐Alvarado2013).

Les cadenes LCs contenen dos dominis: un domini variable (VL) i un domini

constant(VH).Cadaund’aquestsdominisadoptaunaestructuraglobularenbarril‐β,típic

del plegament d’Igs, format per 9 cadenes‐β (A, B, C, C’, C’’, D, E, F, i G), empaquetades

antiparal·lelament,exceptelescadenesβAiβGqueinteraccionendeformaparal·lela.Dins

del domini VL, els loops entre les cadenes‐β B‐C, C’‐C’’, i F‐G, formen les regions CDR

(ComplementaryDetermining Regions), responsables de l’especificitat i unió a l’antigen;

mentrequelarestadelaproteïnaformenlesregionsFR(FrameworkRegions).

En l’AL, ha estat reportat que la majoria de pacients acumulen fibres amiloides

formadesprincipalmentperdominisVL.Peraquestaraó,granpartdelsestudisdecadenes

LC tan sols inclouen aquest domini que, per la seva variabilitat, és el que pateix més

mutacionssomàtiques.Amés,el85%delpacientsd’ALpresentendímersdeLCslliuresen

elplasma(proteïnesBence‐Jones),onelsdominisVLdeduescadenesLCs’associenentre

ellsadoptant la interfície canònicadelsdímersd’VL‐VHd’Ig.Sovint,però, aquestsdímers

d’VLadoptenunaalteració conformacionalde la interfíciedimèrica, respecte laproteïna

germinal;uncanviconformacionalqueestariamoltrelacionatambl’amiloïdosid’AL.


182

En aquest capítol s’ha treballat amb la proteïna AL‐12, un domini variable d’Ig

implicatenl’AL.Lasevaseqüència(codiGenBankAF490912)derivad’unapacientde64

anys amb diagnòstic d’AL cardíaca, després de presentar símptomes de ronquera,

dificultatperempassar,pèrduadepes,fatiga,insuficiènciacardíaca,idolorepigàstric.La

supervivènciadesprésdeldiagnòsticvaserde10anys,ilapresènciadefibresamiloidesal

teixitcardíacvaserconfirmadaenlabiòpsia.ElsnivellsdecadenesLClliuresenelplasma

delapacientnovanserassajatsdurantelprocéspatològic,peròvanserdeterminatsmés

tard,apartirdelreservorideplasmacongelat,obtenintunvalordecadenesк‐LClliuresde

10.1mg/dL,quanelsvalorsnormalsestrobenalvoltantde0.7mg/dL.LaproteïnaAL‐12

té un 87 % d’identitat respecte la seva línia germinal кI O18/O8, una de les més

representadesenpacientsd’AL;iconté8mutacionssomàtiques(Taula3.1),delesquals7

mutacionsnosónconservatives.

Taula 3. 1. Localització de les mutacions somàtiques del domini variable AL‐12. En negreta es ressalten

les mutacions restauratives que han estat dissenyades i caracteritzades en aquest capítol.

Mutació respecte

кI O18/O8 Localització

S30T CDR1 (loop βB‐βC)

Y32H Cadena‐βC/Interfície dimèrica

S65R Cadena‐βD/β‐Hairpin

D70H Cadena‐βE/ β‐Hairpin

E81A Loop entre cadenes‐β E‐F

Q90E Cadena‐βF/Interfície dimèrica

N93Y CDR3 (loop βF‐βG)

/Interfície dimèrica

Y96Q Cadena‐βG/Interfície dimèrica

Lesestructurescristal·logràfiquesdel’AL‐12ilaкIO18/O8hanestatobtingudesi

dipositades prèviament (codi PDB 3DVF i 2Q20, respectivament) (Randles et al. 2009,

Baden et al. 2008b). La figura 3. 1‐Amostra l’estructura de l’AL‐12 amb les respectives

mutacions,ilasevalocalitzaciódinslamolèculaestrobadetalladaalataula3.1.

Tridimensionalment,sisde lesvuitmutacionses trobenproperesentreelles ies

localitzena lamateixacaradelbarril‐β(lamateixaque lesregionsdeCDRs).D’aquestes

mutacions, dues formen part de CDRs, i quatre es localitzen dins la interfície dimèrica,

formadaperlescadenes‐βC,C’,FiG.


183

Per solapament amb la proteïna germinal кI O18/O8 (Figura 3. 1‐B), l’AL‐12

adopta el típic plegament dels dominis к‐VL d’Igs. Així, sembla que aquestes proteïnes

tenen una elevada tolerància a les mutacions, en el sentit de mantenir el plegament

canònic.

Figura 3. 1. Estructura cristal·lina de la proteïna AL‐12 i solapament amb la proteïna germinal кI

O18/O8.A) Estructura cristal·lina de l’AL‐12. Les 8mutacions es troben representades en esferes grises i

marcades.B) Superposició de l’AL12 (groc) i la proteïna germinal кIO18/O8 (blau) remarcant que l’AL‐12

manté la interfície dimèrica canònica, mentre que canvia la disposició dels loops CDR3 i βC‐βC’. Figura

adaptadadeRandles,E.G.(2009).

Tot i l’aparent similitud amb la proteïna germinal, l’AL12 presenta dues regions

loopsubtilmentdesviadesdel’estructuracanònica.ElloopentrelescadenesβC‐βC’,ones

localitza la Pro40, i la regiódel CDR3, on es localitza laPro95.Amés, lesmutacions en

l’AL‐12provoquen,directaoindirectament,lapèrduadecertesinteraccionsintra‐domini,

concretament entre les cadenes‐β A‐B‐E, i una orientació diferent de cadenes laterals

localitzades a les cadenes‐β C‐F (Taula 3. 2). Un canvi conformacional que afecta a

l’estabilitatdeldomini.


184

Taula3.2.Detallilocalitzaciódelesinteraccionsalteradesoperdudesdegutalesmutacionsqueconté

laproteïnaAL‐12.

Prèviament als resultats exposats en aquest capítol, es va estudiar la correlació

entre l’estabilitatde l’AL‐12i la formaciódefibresamiloides(Sikkink,Ramirez‐Alvarado

2008).Enaquestestudiesconclouquelaforçaiònicanoafectaal’estructurasecundària

deldomini,peròaugmentasignificativamentlasevaestabilitattermodinàmicaiaccelerala

cinèticadeformacióamiloide,escurçantlafasedenucleació.Aixòdemostra,uncopmés,

que l’estabilitat i la tendència a l’agregació no sempre es troben directament

correlacionats(Cerda‐Costaetal.2009).

ElsexperimentsiresultatsexposatsenaquestcapítoldelaTesiDoctoral,hanestat

realitzats en col·laboració i durant l’estada de tres mesos al Laboratori de Protein

Misfolding,dirigitperlaDra.Ramírez‐Alvarado,M.,delaClínicaMayo(Rochester,US).A

partir dels experiments realitzats prèviament per Sikking, L.A., i Randles, E.G., s’ha

continuat l’estudi el domini VL amiloidogènic AL‐12. Mitjançant tècniques

espectroscòpiques, com ara CD i fluorescència, s’ha fet una comparació termodinàmica

entreeldominiVLAL‐12ielsquatremutantsrestauratiusH32Y,R65S,H70DiQ96Y.Per

FTIR, s’ha seguit la via d’agregació del domini AL‐12 i les seves variants, per tal de

extraure’n els principals canvis conformacionals que pateix la proteïna nativa. Aquests

resultatsinicialshandeservirperadeterminarlacontribuciód’unaúnicamutaciósobre

l’estabilitat del domini VL, i clarificar si existeix una correlació directe entre unamenor

estabilitatiunamajortendènciaal’agregacióamiloide.

Interacció perduda Tipus i Localització

T5‐Q24 Pont d’hidrogen. Cadenes‐β A‐B

V19‐I75 Pont d’hidrogen. Cadenes‐β B‐E

I21‐T72 Pont d’hidrogen. Cadenes‐β B‐E

Q24‐D70H Electrostàtica. Cadenes‐β B‐E


185


3.1. MutagènesiDirigida.

Elsmutantsrestauratiusdel’AL‐12(H32Y,R65S,H70DiQ96Y)hanestatgenerats

emprant el kit de mutagènesi dirigida Quikchange® Multi Site‐Directed Mutagenesi Kit

(Agilent). El gen de la proteïna AL‐12, de 324 pb, ha estat prèviament clonat dins del

vectorpET‐12a (Sikkink,Ramirez‐Alvarado2008).Adiferenciad’altresmètodes, aquest

kitutilitzatansolsunúnicencebadorquecontéelcanvinucleotídic,elqualestraduiràen

elcanvid’aminoàciddesitjat,iquehibridasobreunDNAplasmídicdecadenasenzilla(ss‐

DNA).

Elsencebadorsdissenyatiempratperacadaundelsmutantssónsegüents:

‐ MutantH32Y:

‐ Parental5’GGACATTACCAACCATTTAAACTGGTATCAGCAAAAACC3’

‐ H32Y‐d 5’GGACATTACCAACTATTTAAACTGGTATCAGCAAAAACC3’

‐ MutantR65S:

‐ Parental 5’GGTTCAGTGGGCGTGGATCTGGGACACATTTCAC3’

‐ R65S‐d 5’GGTTCAGTGGGAGTGGATCTGGGACACATTTCAC3’

‐ MutantH70D:

‐ Parental 5’GGATCTGGGACACATTTCACTTTCACCATCAGCAGC3’

‐ H70D‐d 5’GGATCTGGGACAGATTTCACTTTCACCATCAGCAGC3’

‐ MutantQ96Y:

‐ Parental 5’GGACATTACCAACCATTTAAACTGGTATCAGCAAAAACC3’

‐ Q96Y‐d 5’GGACATTACCAACTATTTAAACTGGTATCAGCAAAAACC3’

Tal icomesdetallaa l’apartat2.1deMaterials iMètodesGenerals, lareaccióiel

cicle de PCR, la digestió amb l’endonucleasa DpnI, i la transformació a les cèl·lules

competentsXL‐Gold, s’harealitzat tal i com indicaelprotocoldelkitdemutagènesi.Les

seqüènciesdeDNAmutanthanestatcomprovadespelServeideSeqüenciaciódeDNAde

laClínicaMayo(USA).


186

3.2. Expressióheteròlogadel’AL‐12imutantsrestauratius.

Lasocad’E.coliempradaperal’expressióintracel·lulardeldominivariableAL‐12i

els seus mutants restauratius H32Y, R65S, H70D i Q96Y, ha estat la BL21sol(DE3),

mitjançantelvectord’expressiópET‐12aveureapartats3.1 i3.4deMaterialsiMètodes

Generals).

Per a l’expressió del domini variable AL‐12 i els seusmutants restauratius s’ha

seguitelsegüentprotocol:

1. Transformaciódelescèl·lulescompetentssoluBL21(DE3)ambDNAvectorpET‐12a::AL12,

seguintelprotocolexplicatal’apartat2.2.deMaterialsiMètodes.

2. Picarunacolòniaen80mLdemedi2xYTlíquidsuplementatambl’antibiòticAmp(selecció

delvector).


4. Inocular, en un volum final d’ 0.5 L, 30mL de cultiu saturat enmedi 2xYT amb Amp, i

incubar a les mateixes condicions anteriors fins arribar a una DO600 de 0.6‐0.8. (Per a

obtenirsuficientquantitatdeproteïna,normalments’hanexpressat2erlenmeyersde2L

amb0.5LdeLBpererlenmeyer).

5. Disminuirlatemperaturadelincubadora30°Ciinduirl’expressióamb0.8mMd’IPTGper

Ldecultiu.Eltempsd’induccióésdemàxim15ha30°C,enagitacióconstantde200rpm.

3.3. Purificacióproteïnaperiplasmàticasoluble.

Del’expressió,s’hapurificatlaproteïnaAL‐12ielsmutantsR65S,H70DiQ96Y

(12.6 kDa) de la fracció periplasmàtica soluble mitjançant cromatografies de bescanvi

iònicid’exclusiómolecular.

Un cop s’ha recuperat l’extracte cel·lular (veure apartat 3.5.2 de Materials i

MètodesGenerals), s’haprosseguit ambel protocol de rentat i recuperacióde la fracció

periplasmàtica,elqualnorequereixllisarlescèl·lulesjaquelesproteïnesdelperiplasma

s’alliberenperxocosmòtic,mantenintlamembranacel·lularpràcticamentintacte.

1. Resuspendreelpelletdecèl·lulesamb200mLdeTampódeResuspensió(Tris/HCl10mM,

pH8.7,prèviamentrefredata4°C)perLdecultiuexpressat,finsasertotalmenthomogeni.

2. Centrifugar a 43700 g durant 40 min a 4 °C, per a separar la fracció cel·lular de la

periplasmàticasoluble.

3. Recuperarelsobrenedantperdecantacióidescartarelpelletdecèl·lules.

4. Concentrarlamostrafinsauns150mL.

5. DialitzarlamostraaTampód’UniódeAEX.(Tris/HCl10mM,pH8.7).


187

3.3.1. Cromatografiadebescanvianiònic.

PeralprimerpasdepurificaciódeldominivariableAL12ielsseusmutants,s’ha

empratunacolumnadebescanvianiònic(AEX)ResourceQ‐6mL(GEHealthcare)(veure

apartat 3.6.2 de Materials i Mètodes Generals) Els tampons utilitzats per a la

cromatografiasónelssegüents:

‐ Tampód’UnióideRentat(A):Tris/HCl10mM,pH8.7.

‐ Tampód’Elució(B):Tris/HCl10mM,NaCl1M,pH8.7.

El pI de la proteïna és de 6.7, al utilitzar un tampó a pH 8.7, la mostra estarà

carregadanegativamenti interaccionaràamblareïnapositiva.Peral’eluciódeproteïna,

s’hautilitatungradientlinealambunincrementdelaforçaiònicadeΔ35%B/12VC(o

be,Δ0.5%B/mL).Lacapacitatd’uniódelacolumnaésde480mg(Lisozim,14.5kDa),per

tant,elvolumdemostrainjectatdependràdelaquantitatdeproteïnaenella.

Elprotocolseguitperarealitzarl’AEXéselsegüent:


conservacióa4°C.

2. Equilibrarlacolumnaamb5VCdetampóA.

3. Filtrar la mostra un filtre PVDF de 0.45 μm i injectar‐la, via loop de 50 mL, a un flux

constantde2mL/min.

4. Rentar lacolumnaamb5VCdetampóA,peratald’eliminarcompletament lafraccióde

proteïnanounidaacolumna.

5. Aplicarungradientd’eluciódeΔ35%B/12VC,aunfluxconstantde1mL/min,finsarribar

al100%d’aquesttampó.Recol·lectarfraccionsd’1mL.

6. Rentarlacolumnaa100%detampóBdurantun1VC,aunfluxconstantde2mL/min,per

acabard’eluirtotalafracciódeproteïnaunida.

7. Reequilibrarlacolumnapassantdel0%al100%detampóAamb2VC,aunfluxconstant

de2mL/min.

8. DialitzarlamostraatampódeSEC(tampóPBS,pH7.4).

3.3.2. Cromatografiad’exclusiómolecular.

Enl’últimpasdepurificaciódel’AL‐12ielsseusmutants,s’haempratlacolumna

d’alta resolució HiLoad 26/60 Superdex 75 (GE Healthcare), amb un rang de

fraccionamentde3·103‐7·104Da(veureapartat3.6.3.1deMaterialsiMètodesGenerals).

Per a la SEC, cal que totes les proteïnes parteixin delmateix punt inicial, per evitar un

desfasament de la mostra al iniciar la cromatografia, la capacitat màxima de mostra a


188

carregar és de 10mL, volum relatiu al diàmetre de la columna. El tampó usat per a la

cromatografiahaestateltampóPBS,pH7.4.

ElprotocolusatperlaSEC,expressatenvolumsdecolumna(1VC=360mL),ésel

següent:

1. Rentarlacolumnaambmínim1VCd’aiguaMilli‐Qpertald’eliminarl’etanolempratpera

lasevaconservacióa4°C.

2. Equilibrarlacolumnaambmínim1VCdetampóPBS,pH7.4.

3. Filtrar la mostra un filtre PVDF de 0.45 μm i injectar‐la, via loop de 10 mL, a un flux

constantde2mL/min.

4. Eluir lamostraambmínim1VCdetampóPBS,pH7.4, i recol·lectar‐laen fraccionsde2

mL.

5. Rentarlacolumnaambmínim1VCd’aiguaMilli‐Qiconservarlacolumnaa4°Cenetanol

al25%.

6. Dialitzarlamostraatampófinal(Tris/HCl10mM,pH7.4).

7. Concentrar la mostra fins a un mínim de 0.24 mg/mL, necessària per als experiment

posteriors.

8. Aliquotareneppendorfsd’1mL,congelarambN2‐líquidiguardara‐20°C.

3.4. Purificacióproteïnacitoplasmàticainsoluble.

Adiferenciadelesaltresproteïnes,lamajorpartdelaproteïnamutantH32Yes

troba a la fracció citosòlica insoluble, la qual s’ha purificat emprant les mateixes

cromatografiesdescritesanteriorment,desprésd’haverestatsolubilitzada.

3.4.1. LLisiCel·lular.

Per tal de recuperar la fracció citosòlica, s’ha segut el següent protocol de lisis

cel·lular:

1. Resuspendre el pellet de cèl·lules ambTampódeLlisi (Tris/HCl10mM, pH8.7,

prèviament refredata4 °C),aunarelacióde6mLde tampópergramdepellet,

finsasertotalmenthomogeni.

2. Sotmetrelescèl·lulesa3ciclesdecongelacióambN2‐líquididescongelacióa37°C.

3. Sonicarlasoluciómitjançant6ciclesde45seg,apotència9iunafreqüènciadel50

%,mantenintlamostrasempreengelireposant3minentrecicles.

4. Centrifugara43700gdurant40mina4°C,perasepararlafracciótotalsolublede

lainsoluble.

5. Descartarelsobrenedantperdecantacióimantenirelpelletengel.


189

3.4.2. Solubilitzaciódelafraccióproteicainsoluble

Totiquepartdelaproteïnaexpressadaestrobaenlafracciócitosòlicasoluble,el

rendiment obtingut de purificar aquesta fracció és baix. Per tant, s’ha optat per a

recuperar tan sols la fracció insoluble.Pera fer‐ho, es resuspènelpellet amb10mLde

TampódeSolubilització(Urea6MenTris/HCl10mM,pH8.7,prèviamentrefredata4°C)

per L de cultiu expressat, fins a ser pràcticament homogeni. El pellet s’acaba de

resuspendreper agitació orbital a 4 °Cdurantmínim2h.A continuació es centrifuga a

43700 g durant 40min a 4 °C, per a separar la fracció solubilitzada de la insoluble, es

recuperaelsobrenedantperdecantació.

3.4.3. Replegamentperdiàlisidelafraccióproteicainsoluble.

A diferència del replegament gota a gota fet en altres purificacions (com per

exemple de l’scFv‐h3D6), en aquest cas el replegament de la proteïna és realitzat

directamentperdiàlisicapaltampóTris/HCl10mM,pH8.7,a4°C.Uncopreplegada,la

proteïna és purificada seguint el mateix protocol descrit anteriorment, mitjançant la

cromatografiaAEXideSEC.

3.5. Determinaciódel’estructurasecundàriaiterciàriadel’AL‐12imutants.

Pelque faals fonamentsde les tècniquesdescritesacontinuació(espectroscòpia

de CD, de fluorescència i de infraroig), es troben detallats a l’apartat 4 de Materials i

MètodesGenerals.

3.5.1. EspectreCDalUV‐llunyà.

Peraobtenirl’espectredeCDd’estructurasecundàriadel’AL12ielseusmutants

s’ha utilitzat l’espectrofotopolarímetre Jasco J‐715, tal i com es va fer per l’scFv‐h3D6

(veure Capítol 1). La concentració experimental de proteïna ha estat de 20 μM (0.24

mg/mL),disposadaenunacubetadequarsde0.2cm.Peramesurarl’espectrede260a

190nm,s’hanenregistrat20acumulacionsaunavelocitatde50nm/min,unarespostade

2seg,unaampladadebandad’1nm,iunaresolucióde0.1nm.L’espectredelplegament

natiudel’scFvhaestatdeterminata25°C;mentrequeperl’AL12imutants,haestata4

°C. A més, s’ha registrat l’espectre de l’estat desplegat (a 90 °C) i de retorn a la

temperaturainicial,pertaldedeterminarsiladesnaturalitzaciótèrmicadelaproteïnaés

reversibleono.


190

3.5.2. Espectredefluorescènciadelresidudetriptòfan.

Peraobtenirl’espectredefluorescènciadel’AL12ielseusmutantss’hautilitzatel

fluorímetre Varian Cary Eclypse, tal i com es va fer per l’scFv‐h3D6 (Capítol 1). La

concentracióexperimentaldeproteïnahaestatde20μM(0.24mg/mL),disposadaenuna

cubeta de quars d’1mL. La longitud d’ona d’excitació ha estat de 290 nm, enregistrant

l’espectre d’emissió de 310 a 410 nm, prenent 5 acumulacions a una velocitat de 600

nm/min, amb una obertura d’emissió i d’excitació de 5 nm, i una resolució de 1 nm. A

diferènciade l’espectredelplegamentnatiude l’scFv‐heD6,queva seradquirit a25 °C;

perl’AL12imutantsl’adquisicióhaestata4°C.Tambés’haregistratl’espectredel’estat

desplegat (a 90 °C) i, tornant a la temperatura inicial, s’ha determinat si la

desnaturalitzaciótèrmicadelaproteïnaésreversibleono.Elmàximdefluorescènciade

l’estatnatius’hautilitzatposteriormentperlesdesnaturalitzacionstèrmiquesiquímiques.

3.5.3. DesnaturalitzaciótèrmicaperfluorescènciaiCD.

La desnaturalització tèrmica s’ha seguit per espectroscòpia de CD al UV‐llunyà i

per fluorescència dels residus de triptòfan (fluorímetre Varian Cary Eclypse), a una

concentraciód’AL‐12de20μM,disposadaenunacubetadequarsd’1mL.Elsexperiments

s’hanregistratdesde4°Ca90°C,aunavelocitatde1°C/min,seguintlael·lipticitata218

nm, i la fluorescènciadel triptòfana338nm(longitudd’onad’excitacióa290nm, iuna

oberturadelesfinestresd’excitacióid’emissióde5nm).Durantladesnaturalització,per

CD i fluorescència,esvanenregistrarelsespectresa25°C,90°C i, tornantarefredar la

mostraa25°C.

3.5.4. Desnaturalitzacióquímicaperfluorescència.

Per a la desnaturalització química d’AL12 i els seus mutants, s’han preparat

concentracionscreixentsd’ureaentampóTris/HCl10mM,pH7.4(de0a6M,cada0.15

M). A cada un dels punts s’hi ha afegit 100 μl de proteïna a 22 μM, obtenint una

concentració final de 2 μM en un volum de 1.1 mL. Un cop les mescles han estat

equilibradesa4°Cdurantunes15h,s’haenregistratl’espectred’emissiódefluorescència,

de 310 a 410 nm, de cada una de lesmostres. Els paràmetres de lectura han estat els

mateixosqueelsdescritsal’apartat3.6,augmentantlaresolucióa0.3nm.

3.5.4.1. Obtenciódelsparàmetrestermodinàmics.

Peradeterminarelmàximd’emissióacadaconcentraciód’urea,s’hafetunajust

polinòmicdetresparàmetresutilitzantelprogramaOriginLab.Elsmàximsobtingutss’han


191

representatenfunciódelaconcentraciód’ureaacadamostra;laconcentraciófinald’urea

ha estat verificada mitjançant un refractòmetre manual. Els paràmetres d’equilibri de

desnaturalització s’han calculat, per a cada concentraciód’urea, segons l’equaciódedos

estatssegüent:

/ 1

on, ; ; ∆ / ;∆

ionladependènciadelafluorescènciaintrínsecaal’estatnatiu(Fn)ialdesplegat

(Fu),sobrel’augmentdelaconcentraciódedesnaturalitzant(x),éstingudaencompteen

termesdeb·xid·x,respectivament(aproximaciólineal).D’aquestamanera,s’hanobtingut

elsvalorsde[D]50%(concentraciódedesnaturalitzantenlaqualel50%delaproteïnaes

trobadesplegada),de∆GN‐U(energialliuredeplegament),ielvalordemN‐U(diferenciaen

l’accessibilitatalsolvententrel’estatnatiuieldesplegat).

3.6. Estudid’agregaciódel’AL12imutantsperFTIR.

Peral’estudid’agregaciódedominiAL12ielsseusmutants,lesmostreshanestat

dialitzades enfront Tris/HCl 10 mM‐D2O, pD 7.4, a una concentració de 200 μM (2.4

mg/mL). S’han obtingut els espectres d’infraroig a 4, 40, 50, 55 i 60 °C, temperatures

extretesapartirdelescorbesdedesnaturalitzaciótèrmica.Peral’obtenciódelsespectres

s’ha emprat l’espectròmetreVarianResolutionsPro, registrant l’espectrede4000a400

cm‐1, a una velocitat de 95 cm−1/min, una resolucióde2 cm‐1, i fent lamitjanade1000

acumulacions.L’espectrevasercorregitcontraelsorolldefons(obackground),irestant

elsenyaldeltampóidelvapor.

Eltractamentdedadesiladeconvoluciódelabandad’amidaI’s’harealitzatusant

elsoftwareGRAMS(Thermoscientific).Ladeconvolució,sobreunacorbaLorentziana,s’ha

obtingutusantunaampladadebandade17iunfactorKde2.2,enapoditzaciódetipus

Bessel.Elsajustosdelesbandessobrel’espectredeconvolucionats’hanrealitzatsobreuna

corbaGaussiana.Lesdadesfinals,s’hanexpressatentantpercentd’estructurasecundària.


193

4. RESULTATS.

4.1. Estructurasecundàriadel’AL‐12.

L’espectredeCDalUV‐llunyàdeldominiAL‐12natiu,a4°C,mostraunmínima

216nmiunmàxima200nm,quecorresponal’estructurasecundàriaenfulla‐βtípicadel

plegament d’Igs (Figura 3. 2‐A). A més, conté un segon mínim, a 235 nm, degut a la

contribució a l’espectre dels residus aromàticsde laproteïna (Sreerama,Venyaminov&

Woody1999).A90°Cesperdelmínima235nm,mentrequeelsenyaldelmínima216

nm augmenta, adoptant l’espectre típic de fulla‐β canònica. Que a l’espectre també

apareguielmínima208nm,faentendrequepartdel’estructuraestrobaenrandom‐coil,

talicomhaestatdescritperaaltresdominisVL(McLaughlinetal.2006).Aquestresultat

indica que esmanté certa estructura secundària a l’estat desnaturalitzat. L’espectre de

renaturalització obtingut al retornar a 4 °C, indica que el desplegament parcial de

l’estructurasecundàriaper temperaturade l’AL‐12ésreversiblepràcticamental100%,

talcoms’hareportatprèviamentperalaproteïnagerminalкIO18/O8ialtresdominisVL

amiloidogènics(Badenetal.2008b).

Figura3.2.EstructurasecundàriaiexposiciódeLW35del’AL‐12adiferentstemperatures.A)Espectre

deCDalUV‐llunyà.L’espectrea4°C(vermell)mostradosmínimsd’el·lipticitat(216nmi237nm),iunmàxim

a200nm.Als90°C(blau)esperdelmínima237nmiapareixunmínima208nm,indicantpartd’estructura

en fulla‐β canònica i part en random‐coil.L’espectre de renaturalització (verd) indica que el desplegament

parcialdel’estructurasecundàriaésreversible.B)EspectredefluorescènciadelresiduW35.A4°C(vermell)

elmàximd’emissiódeltriptòfannatiueslocalitzaa340nm,mentrequea90°C(blau)esdesplaçacapa355

nm,indicantqueelW35estrobacompletamentexposatalsolventi,pertant,quel’estructuraterciàrianativa

s’haperdut.L’espectrederenaturalització(verd)indicaqueeldesplegamentdeldominiésirreversible.


194

Per fluorescència de l’únic residu de triptòfan de la seqüència de l’AL‐12 (βC‐

Trp35),s’hanregistratselscanvisanivelld’estructuraterciàriasotapertorbaciótèrmica.

Elfetquetansolshihagiuntriptòfan,permettenirencomptetantelscanvisd’intensitat

de fluorescència com el desplaçament del màxim d’emissió. El màxim d’emissió de

fluorescènciadel’estatnatiu(4°C)eslocalitza340nm(Figura3.2‐B)i,a90°C,aquestes

desplaçacapalvermell,finssituar‐sea355nm,indicantunacompletaexposicióalsolvent

del residu Trp35 (Vivian, Callis 2001). Pel que fa a la renaturalització del domini al

retornara4°C,elsenyalrecuperaelmàximd’emissióa340nmperòlaintensitatésmolt

més alta, més inclús que la de l’estat desnaturalitzat a 90 °C. Per tant, mentre que

l’estructura secundària sembla reversible, l’estructura terciària de l’AL‐12 no retorna a

l’estatnatiu.

4.1.1. Estructurasecundàriadelsmutantsrestauratius.

Delamateixamaneraquel’AL‐12,s’haanalitzatperCDifluorescència,l’estructura

secundàriaiterciàriadelsmutantsrestauratiusH32Y,R65S,H70DiQ96Y.

ElsmutantsH32Y,R65SiH70DmostrenunespectredeCDmoltsemblantal’AL‐

12, tant a 4 °C com a 90 °C. Concretament, el mutant R65S guanya en estructura

secundària(mínima216nm),mentrequeelmutantH70Dmanté lamateixasenyalque

l’AL‐12 (Figura3.3‐A,B).Pelque faalmutantH32Y, semblaqueperd senyalde fulla‐β

nativa(mínima216nm),peròencaramantéelplegamentd’Igs(Figura3.3‐D).Encanvi,

elmutantQ96Yperdelmínima237nmindicantquealaconformaciónativaelTrp35està

col·locatdemaneradiferentalarestademutants,amésdequeesdesplaçaelmínimde

216nm cap a 218nm (Figura 3. 3‐C). Pel que fa a la reversibilitat a nivell d’estructura

secundària, el mutant H70D recupera pràcticament el plegament natiu, mentre que el

Q96Y ho fa però amb menor intensitat de senyal, i els mutants R65S i H32Y són

irreversibles,mantenintl’espectredel’estatdesnaturalitzatambunsenyalinferior.


195

Figura3.3.Estructurasecundàriadelsmutantsrestauratiusd’AL‐12.Totsquatremutantsmantenen

l’estructurasecundària típicad’Igs.A)MutantR65S.B)MutantH70D.C)MutantQ96Y.D)MutantH32Y.

Vermell:estatnatiua4°C,blau:estatdesnaturalitzata90°C,verd:estatrenaturalitzatalretornara4°C.

L’emissió de fluorescència dels mutants H32Y, H70D i R65S es comporta de la

mateixa manera que a l’AL‐12 (dades no mostrades), amb el desplaçament del màxim

d’emissióde340a355nm,degutal’exposicióalsolventdelresidutriptòfan,il’augment

dela intensitat.Tal icoms’haobservatperCD, l’estatnatiudelmutantQ96Ydescriuun

espectre de fluorescència diferent al WT i la resta de variants. A 4 °C ja presenta una

elevada intensitat de senyal, major inclús que l’espectre renaturalitzat, i el màxim

d’emissióéstrobadesplaçatcapalvermell,dadaexplicalaposicióalteradaimésexposada

delresiduTrp35delmutantQ96Yrespectealdel’AL‐12ilarestademutants(Figura3.4).

Capdelsmutantstampocrecuperal’estructuraterciàrianativaalreplegara4°C.


196

Figura 3. 4.Espectrede fluorescència del residuTrp35 delmutantQ96Y. A 4 °C (vermell) el màxim

d’emissiódeltriptòfanestrobadesplaçatcapalvermellrespecteelmàximtípicdelestatnatiu,a340nm,ila

intensitatdefluorescènciaésmajorquel’AL‐12ilarestademutants,indicantqueelresiduTrp35inicialment

ja téuncertgraud’exposició.A90°C(blau)elmàxims’acabadedesplaçar finsels355nm, indicantqueel

Trp35 es troba completament exposat al solvent i, per tant, que l’estructura terciària nativa s’ha perdut.

L’espectrederenaturalització(verd)indicaqueeldesplegamentdeldominiésirreversible,ipersevalamenor

intensitat,diferental’estatnatiu.

4.2. Desnaturalitzaciótèrmicadel’AL‐12.

Per tal d’aprofundir en la transició conformacional induïda per temperatura de

l’AL‐12,s’hamonitoritzatladesnaturalitzaciótèrmicaperCDifluorescència.L’el·lipticitat

enelmínima216nmcomençaadecréixer apartirdels40 °C, onelplegament guanya

contingutenfulla‐β(figura3.5‐A), ielsenyals’estabilitzaenarribarals55°C.Tal icom

s’ha comentat més amunt, l’estat desnaturalitzat és reversible. La transició tèrmica

obtingudaindicaunprocésd’agregacióenfulla‐βdelaproteïnaAL‐12,dadaqueconcorda

amb la corba de desnaturalització seguida per fluorescència (Figura 3. 5‐B). El màxim

d’emissió a 340nm, augmenta el seu senyal a partir dels 40 °C, lamateixa queper CD,

arribantalmàximd’emissióals55°C, ipartird’aquíelsenyaldecreix,sensearribara la

mateixaquel’estatnatiu.

L’increment de la fluorescència per temperatura, indica una transició

conformacionalanivelld’estructuraterciària,onsemblaqueelplegamentglobulardela

molèculaperdpartdelseuempaquetamentnatiuperassolirunestatintermediari,a55°C,

queseràprecursordel’agregacióenfulla‐βordenadaoamiloide.


197

Figura3.5.DesnaturalitzaciótèrmicaAL‐12.A)PerCDs’haseguitelcanvid’el·lipticitatdelmínima216

nm (vermell), el qual, a partirde40 °C començauna transició conformacional guanyant en estructura‐β, el

senyal s’estabilitza als 60 °C. La senyal de renaturalització (blau) mostra la reversibilitat de l’estructura

secundària.B)PerfluorescènciadelresiduTrp35,s’haseguitl’evoluciódelmàxima340nm(vermell),elqual

passaperunatransicióconformacionalals55°C.L’estructuraterciàrianorecuperaelsenyaldelestatnatiual

renaturalitzar(blau).

4.2.1. Desnaturalitzaciótèrmicadelsmutantsrestauratius.

Alcompararelcomportamentdel’AL‐12ambelsseusmutantsrestauratius,veiem

quetotsellsguanyensenyald’el·lipticitata216nmalaugmentarlatemperatura,seguint

elmateixpatród’agregació,enllocdedesplegament,quel’AL‐12(Figura3.6‐A).

ElsmutantsR65SiQ96Y,inicienlatransicióconformacionalméstardquel’AL‐12,

als 45 i 47 °C, respectivament. Pel que fa als mutants H70D i H32Y, inicien la

reestructuració de la fulla‐β nativa a partir dels 38 i 25 °C, indicant que ambdues

mutacionshandesestabilitzatelplegamentnatiu,sobretotpelquefaa l’H32Y,quevaria

fins a15 °C respecte elWT, i que el seu espectredeCD a 4 °C ja donavamenys senyal

inicial(Figura3.3‐D).

LaparticularitatdelplegamentnatiudelmutantQ96Yfadifícillasevacomparació

directe amb el WT, ja que inicialment presenta una estructura secundària i terciària

alterada (Figura3.3‐C i3.4).De lamateixamanera, ladesnaturalització tèrmica també

mostraaquestaalteració,onlaintensitatdelmàxima340nmésmoltmajorquealaresta

deproteïnes,fetquecorroborauncertdesempaquetamentinicialdel’estructuraglobular;

comtambélamajorexposicióalsolventdelW35enelespectrenatiua4°C(Figura3.4).A

més,latransicióquedescriuperdesnaturalitzaciótèrmicamostraunpuntd’inflexióals60

°C, i que ve seguit per una pèrdua de senyal de la nova estructura‐β adquirida, que


198

s’estabilitzaapartirdels70°C.Aixòpodriaexplicar‐secomqueelmutantQ96Yparteix

d’unestatdeplegamentdiferentalaresta,quedirectamentcomençaaagregarsensepatir

una obertura de la molècula, però a continuació també reorganitza per donar lloc a

l’agregatfinal,passantperunestatintermediarials60°C.

Figura3.6.Desnaturalització tèrmicadelsmutants restauratiusd’AL‐12.A)Desnaturalització tèrmica

seguidaperCD,seguintelscanvisd’el·lipticitatdelmínima216nm.B)Desnaturalitzaciótèrmicaseguidaper

elcanvideintensitatdefluorescènciaa340nm.

Pel que fa a la transició seguida per fluorescència, tots els mutants despleguen

abansd’agregar,excepteelcasespecialdelmutantQ96Y(Figura3.6‐B),passantperun

estat intermediari precursor de l’agregació. En consonància amb el CD, elmutant R65S

assoleixl’estatintermediariméstardqueelWT(58°Cpelmutanti55°Cperl’AL‐12),per

tant tindria menys tendència a l’agregació; mentre que l’H70D i el H32Y formen

l’intermediarimésaviat,a50i40°C,respectivament,corroborantladesestabilitzaciódel

seuplegament.L’H32Y,apartd’agregarmoltmésràpidque larestademutants,mostra

una transició molt poc cooperativa, tal com indica l’amplada del senyal de la transició

conformacionalperfluorescència.


199

4.3. Estabilitattermodinàmicadel’AL‐12.

Així com la desnaturalització tèrmica dels diferents dominis variables de l’AL12

mostra un procés d’agregació passant per un estat intermediari, la desnaturalització

química,mitjançanturea,dónallocaunacorbadedesplegamentdelestatnatiuseguintun

procésdedosestats,sensepoblarcapintermediarialaviadeplegament(Figura3.7‐A),i

queésreversibleperatotselsmutants(dadanomostrada).A3Md’ureal’AL‐12assoleix

un estat deplateau als 355 nm,associat al desplegament de la proteïna on el Trp35 es

troba totalmentexposatalsolvent, iqueindicaquelaestructuraterciàriadeldominiés

perd completament en aquesta concentració d’urea. La desnaturalització química, ha

permèsdeterminarelsparàmetres termodinàmicsdelprocésdeplegamentde l’AL‐12a

partirdelacorbadedesplaçamentdelmàximd’emissióadiferentsconcentracionsd’urea.

L’ajustdelacorbad’ureasobrel’equaciódedosestatsestrobarepresentatalataula3.3.

L’energialliuredeplegamentenaigua(∆GN‐U)deldominiAL‐12ésde‐18.50±0.84KJ·mol‐

1.ElvalordemN‐U,elqualreflexaladiferenciad’accessibilitatalsolvententrel’estatnatiui

eldesplegat,ésde7.95±0.33KJ·mol‐1·M‐1.Laconcentraciód’ureaenlaqualel50%del

dominiestrobadesplegat,[D]50%,ésde2.33M.

Ha estat descrit prèviament, que la proteïna germinal кI O18/O8, menys

amiloidogènicaquelaAL‐12,téunvalorde∆GN‐Ude‐25.60±0.23KJ·mol‐1,iuna[D]50%de

3.98M(elvalordemN‐Unohaestatdetallat)(Badenetal.2008b).Pertant,l’AL‐12mostra

unadesestabilitzaciósignificativadelseuestatnatiu,possiblementdegutales7mutacions

no‐conservatives que conté la seqüència germinal, i que algunes d’elles podrien estar

relacionadesamblamajorcapacitatamiloidogènicadelaproteïna,totiquenoalterenla

interfíciedimèricadeldímerVL.

Taula 3. 3. Ajust, sobre un model d’equilibri de dos estats, de la corba de desnaturalització química de

l’AL‐12 i els seus mutants restauratius. N = estat natiu, U = estat desplegat. *Dades prèviament

reportades per Baden, E.M. (2008).

Proteïna ∆GN‐U

(KJ∙mol‐1) mN‐U

(KJ∙mol‐1∙M‐1) [D]50% (M)

AL‐12 ‐18.50 ± 0.84 7.95 ± 0.33 2.33

R65S ‐17.99 ± 0.91 7.37 ± 0.35 2.44

H70D ‐12.37 ± 0.70 7.83 ± 0.34 1.58

Q96Y ‐11.69 ± 0.85 5.33 ± 0.33 2.19

H32Y ‐7.86 ± 0.36 6.19 ± 0.16 1.27

кI O18/O8* ‐25.60 ± 0.23 ‐ 3.98 ± 0.07


200

Figura3.7.Desnaturalitzacióquímicaperureadel’AL‐12ielsseusmutantsrestauratius.Elmàximde

fluorescènciadelresiduTrp35(340nm)ésrepresentatenfunciódelaconcentraciód’urea,itenintencompte

lafracciódeproteïnaplegada.L’ajustsobreunmodeldedosestatsestrobarepresentatperunalíniaacada

gràfica.A)AL‐12,B)R65S,C)H70D,D)Q96Y,E)H32Y,F)ComparaciódelsdiferentsajustosobtingutsperAL‐

12(negre),R65S(vermell),H70D(verd),Q96Y(groc)iH32Y(blau).


201

4.3.1. Estabilitattermodinàmicadelsmutantsrestauratius.

Pelquefaal’estabilitatdeldiferentsmutantsrestauratius,elresultatmésnotable

éslarestauraciódelresiduargininacapaserinaR65S(Figura3.7‐B,F/Taula3.3).Amb

aquestamutaciósimple,l’AL‐12augmentaunamicaelvalorde[D]50%(O.11M);totiqueel

valorde∆GN‐Uéspocmésbaixquel’AL‐12(0.5KJ·mol‐1).

Talicomjas’havistperdesnaturalitzaciótèrmica(Figura3.6),elsdosmutantsde

residu histidina (βC‐H32 i βD‐H70) desestabilitzen la molècula. L’H32Y (Figura 3. 7‐E,

F/Taula3.3)desestabilitzatotalment lamolècula(∆GN‐U=‐7.86±0.36KJ·mol‐1), fetque

indica que aquest residu juga un paper important en el plegament i compactació del

domini.Comtambéafectaalasolubilitatdelamolècula,jaqueésl’únicmutantques’ha

purificatdelafracciócitosòlicainsoluble.L’H70D(Figura3.7‐C,F/Taula3.3),enmenor

mesura, també disminueix el valor de ∆GN‐U (‐12.37 ± 0.70 KJ·mol‐1). En consonància,

ambdósmutants són els quepresentenuns valors de [D]50%més baixos (1.58 i 1.27M,

respectivament).

Pel que fa almutant Q96Y (Figura 3. 7‐D, F/Taula 3. 3), i el seu comportament

particular,obtéunvalorde∆GN‐Ude‐11.69±0.85KJ·mol‐1;queelseuvalordemN‐Usigui

el més baix de tots els mutants, 5.33 ± 0.33 KJ·mol‐1·M‐1, indica que ja l’estat natiu no

adoptaunplegamentcompacte,deixantexposadesalsolventcertesregionsquehaurien

detrobar‐seenterrades.Aquest fetexplica lacorbadedesnaturalitzaciótèrmicaseguida

per fluorescència, on directament comença a agregar sense necessitat de desplegar la

molècula.

4.4. Estudidel’agregaciódel’AL‐12perFTIR.

LatècnicadeFTIRéslamésadequadaperestudiarelscanvisconformacionalsque

pateix l’estructura secundària en fulla‐β durant el procés d’agregació, ja que la

deconvolució del espectre de la banda d’amida I’ diferencia entre diferents tipus

d’estructura‐β,jasiguinativa,amiloide,odeltipusWL(Zandomeneghietal.2004).

PeraldominiAL‐12,s’haenregistratl’espectredeFTIRadiferentstemperatures.,

Ladeconvolucióde l’espectredeFTIRa la regióde l’amida I’ es trobarepresentadaa la

figura3.8‐A‐C,idetalladaalataula3.4.Ladeconvoluciódel’amidaI’a4°C,generaquatre

bandesprincipals,centradesa1684,1668,1652,i1634cm‐1(Figura3.8‐A/Taula3.4).


202

Figura3.8.Deconvoluciódel’espectredeFTIRdelaregióamidaI’del’AL‐12adiferentstemperatures.

A)4°C,B)40°C,C)55°C,iD)60°C.Labandaverdaindicalacomponenta1634cm‐1,quecorresponalafulla‐

βnativaantiparal·leladebaixafreqüència.Envermell,labandaproperaals1620cm‐1,associadaalsagregats‐

β(WL/Amiloide).

Lesduescomponentsenfulla‐βantiparal·lelanativa,lad’altaibaixafreqüència,es

corresponenamblesbandesa1684i1634cm‐1respectivament,sent lasegona lamajor

bandadelespectrenatiu(48%),enconsonànciaambelplegamentbarril‐βdelsdominis

d’Igs i amb les dades obtingudes prèviament per cristal·lografia de raigs‐X (codi PDB

3DVF)(Randlesetal.2009).Lacomponentenloops/girs‐βeslocalitzaalabandade1668

cm‐1 (Byler,Susi1986,Waltheretal.2010). Inesperadament, labandacorresponenta la


203

fraccióenhèlix‐α,situadaa1652cm.1, representael21%delespectredeFTIR,quanel

dominiAL‐12tansolscontéun2%d’hèlix‐αsegonslesdadesdelcristall.

Al escalfar la mostra durant 3 min a 40 °C (Figura 3. 8‐B/Taula 3. 4), la

temperaturaons’inicialatransicióconformacional,disminueixlafracciódefulla‐βnativa

(1634cm‐1)afavordel’incrementdelesbandesa1684,1668i1652cm‐1,corresponentsa

fulla‐βnativa antiparal·lela, loop/girs‐β, i hèlix‐α. I apareix la bandad’agregats‐β (8%),

queesfadifícildediferenciarentreamiloideiWLjaquelesbandesestrobenallímitde

tots dos components (1619‐1620 cm‐1). Als 55 °C, on es pobla l’intermediari tèrmic,

segueixdisminuintlabandadefulla‐βnativa,de1634cm‐1,finsal15%,icreixlabanda

d’agregats‐βfinsal27%deltotaldelespectre,iquecorresponalsagregats‐βdetipusWL

(1627cm‐1).Labandad’hèlix‐αpassaaserun25%delespectreiésmanté(Figura3.8‐

C/Taula3.4).Als60°C,labandaWLs’estabilitzasentel21%deltotaldelespectre,ies

recuperapartdelafracciódefulla‐βquepujafinsel19%(Figura3.8‐D/Taula3.4).


204

Taula 3. 4. Deconvolució de l’espectre de FTIR de la regió amida I’ de l’AL‐12 i mutants restauratius a

diferents temperatures.

4 °C AL‐12 R65S H70D Q96Y H32Y

Estructura secundària Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Fulla‐β antiparal∙lela d’alta freqüència

1684 12 1684 12 1684 20 1685 19 1684 18

Loops/girs‐β 1668 15 1668 18 1669 19 1669 18 1669 19

Hèlix‐α 1652 21 1652 18 1652 23 1652 25 1652 24

Fulla‐β antiparal∙lela de baixa freqüència

1634 48 1635 43 1635 28 1636 24 1636 28

WL ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 1621 12

Amiloide 1614 4 1614 10 1619 9 1619 14 ‐ ‐

40 °C AL‐12 R65S H70D Q96Y H32Y


Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)


1684 19 1684 16 1684 21 1684 19 1684 14

Loops/girs‐β 1669 19 1669 18 1670 20 1669 19 1669 20

Hèlix‐α 1652 24 1652 23 1652 25 1652 27 1652 27


1635 30 1635 31 1635 25 1636 26 1636 20

WL ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 1623 19

Amiloide 1619 8 1618 12 1619 9 1619 9 ‐ ‐

55 °C AL‐12 R65S H70D Q96Y H32Y


Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)


1683 14 1684 17 1684 21 1684 21 1684 22

Loops/girs‐β 1669 19 1669 20 1669 20 1670 20 1670 20

Hèlix‐α 1652 25 1652 26 1652 27 1652 26 1652 26


1637 15 1636 18 1636 19 1636 21 1636 16

WL 1627 27 1623 19 1621 13 1621 12 1620 14

60 °C AL‐12 R65S H70D Q96Y H32Y


Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)


1683 15 1684 19 1684 20 1684 20 1684 23

Loops/girs‐β 1669 20 1669 20 1669 21 1669 20 1670 20

Hèlix‐α 1652 26 1652 26 1652 27 1652 27 1652 26


1636 19 1636 18 1636 19 1636 18 1636 16

WL 1625 21 1622 16 1621 13 1622 15 1620 14


205

4.4.1. Estudidel’agregaciódelsmutantsrestauratius.

Pelquefaalsmutantsdel’AL‐12,ladeconvoluciódel’espectredeFTIRalaregió

de l’amida I’, dóna lloc a lesmateixesquatrebandesprincipalsqueper l’AL‐12, a1684,

1668, 1652, i 1634 cm‐1 (Figura 3. 9‐A‐D/Taula 3. 4). Sent la fracció de fulla‐β nativa

antiparal·leladebaixafreqüèncialamajoritàriaentotselscasos.

Figura3.9.Evolució,enfunciódelatemperatura,delsprincipalscomponentsdelespectredeFTIRala

regiódel’amidaI’del’AL‐12imutantsrestauratius.A)4°C,B)40°C,C)55°C,iD)60°C.


206

Tal i com s’ha vist en el espectre de CD (Figura 3. 3), a 4 °C, elsmutantsH70D,

H32Y i Q96Y tenen menys % de fulla‐β inicial que l’AL‐12, amb un 28 % per als dos

primers,iun24%peralQ96Y(Figura3.9‐A/Taula3.4).Mentrequel’R65Smantéquasi

lamateixaproporcióqueelWT(43%respecteel48%delWT).Ladisminuciódelabanda

enaquestmutantesveucompensadaperunincrementdelabandad’agregats‐βa1619‐

1620 cm‐1. Un cop s’inicia l’increment de temperatura, el mutant R65S és el que es

comportademaneraméssimilaralWT.Als40°C(Figura3.9‐B/Taula3.4),disminueixla

componentdefulla‐βnativa,a1634cm‐1,aexpensesdel’incrementdelesbandesa1684,

1668 i 1652 cm‐1, corresponents a fulla‐β nativa antiparal·lela, loop/girs‐β, i hèlix‐α. La

bandad’agregats‐βapareixenmajorpercentatge(un5%més)queenelWT.A40°C,els

mutantsH70D i Q96Y no varienmassa respecte els 4 °C, indicant que inicialment ja es

trobaven parcialment agregats. Pel que fa a l’H32Y, a 40 °C ja ha assolit la transició

conformacionalqueportaal’agregació,talicoms’havistperladesnaturalitzaciótèrmica

seguidaper fluorescència (Figura3. 6), i a aquesta temperatura la bandadeWL final, a

1627cm‐1, jaestrobabendefinida,aexpensesdeladisminuciódefulla‐βnativa(1687i

1634cm‐1),mentrequeelWTnohofafinsels55°C(Figura3.9‐C/Taula3.4).Encanvi,

elsmutantsR65S,H70DiQ96Y,augmentenprogressivament lafracciód’agregats‐βamb

latemperatura,finsqueals55°CjaqueesdefineixcomagregatsdeltipusWL.Finalment,

als60°C,totselsmutantspresentenunalleugeradisminuciódelabandadeWL,afavorde

lade1687cm‐1,lafulla‐βd’altafreqüència(Figura3.9‐D/Taula3.4).


207

5. DISCUSSIÓ.

L’AL pertany a la gran família d’amiloïdosis humanes sistèmiques. La seva

complexitatmolecularvedonadaperl’elevadavariabilitatdeseqüènciaquepresentenles

cadenesLCsd’Igs.Encondicionspatogèniques, lescèl·lulesplasmàtiquesdelmolldel’os

secreten grans quantitats de LCs lliures en el plasma, esdevenint les precursores de la

deposicióamiloideendiferentsteixitsorgànics.EstudiscomparatiusdeseqüènciadeLCs

depacientsd’ALhanaportatquelesmutacionssomàtiquesnoconservadessónlesquees

trobenmésrepresentadesenseqüènciesamiloidogèniques,isovintestrobenlocalitzades

eneldominivariable(VL)de lacadena.El85%delspacientsd’ALpresentendímersde

LCs en el corrent sanguini, on els dominis VL de cada cadena LC s’associen entre ells

adoptant la interfície canònica dels dímers d’VL‐VH d’Ig funcionals. A més, les fibres

amiloides es troben formades principalment per dominis VL (Blancas‐Mejia, Ramirez‐

Alvarado2013).L’alteraciódelainterfíciedimèricaendominisVLamiloidogènics,sembla

tenirunafortacorrelacióambladeposicióamiloideielgraudeseveritatdelamalaltia,tal

icoms’hademostratperaldominiVLAL‐09,undelsmésamiloidogènicsdescritsfinsara,

onlasevainterfíciedimèricaestrobarotada90°CrespectelagerminalкIO18/O8(Baden

etal.2008a).

A diferència de l’AL‐09, la proteïna AL‐12, que conté set mutacions somàtiques

respecte la germinal,manté la interfície canònica d’Igs, tot i això té unmajor potencial

amiloidogènicisegueixunacinèticadeformaciódefibresamiloidesmésràpida(Randles

et al. 2009, Sikkink,Ramirez‐Alvarado2008). Per tant, lesmutacions somàtiquespoden

tenirefectesestructuralsimportantsobéméssubtilsperò,d’algunamaneraoaltre,tenen

unefectealacapacitatamiloidogènicadelaproteïna.

5.1. Estructurasecundària,desplegamentiestabilitatdeldominiAL‐12.

LaproteïnaamiloidogènicaAL‐12presentaunplegamentnatiutípicd’Igs,ambel

mínimd’el·lipticitata216nmielmàxima200nm.Amés,presentaunsegonmínima235

nmques’atribueixalacontribucióalespectredeCDdelsresidusaromàticsdelaproteïna,

especialmentdelresiduconservatTrp35.Pelquefaal’espectredeFTIRdel’estatnatiude

l’AL‐12, la component en fulla‐β antiparal·lela nativa de baixa freqüència (1634 cm‐1)

representa lamajorbandadel espectrenatiu (48%), en consonància ambelplegament

barril‐βdelsdominisd’Igs iamb lesdadesobtingudesprèviamentpercristal·lografiade

raigs‐X (codi PDB 3DVF) (Randles et al. 2009). S’esperava que la segona banda més

representativadelespectredeFTIRfoslacomponentenloopigirs‐β,degutalplegament

tot‐βdeldomini.Enaquestsentit,lacomponentenloops/girs‐β,localitzadaalabandade


208

1668 cm‐1, representa el 15 % del total del espectre. Inesperadament, la banda

corresponentalafraccióenhèlix‐α,situadaa1652cm.1,representael21%delespectre

deFTIR,quaneldominiAL‐12tansolscontéun2%d’hèlix‐αsegonslesdadesdelcristall.

Amés,larenaturalitzaciótèrmica,seguidaperCDifluorescènciadelresiduTrp35,indica

que el domini és reversible a nivell d’estructura secundàriamentre que la terciària no

recuperal’estatnatiu.

La desnaturalització química, mitjançant urea, del domini AL‐12 dóna lloc al

desplegament total del domini seguint un procés de dos estats, sense poblar cap

intermediaridereacció.Elsparàmetrestermodinàmicsdelaproteïnamitjançantunmodel

dedosestats,plegatidesplegat,indiquenquel’estabilitatdeldominiAL‐12amiloidogènic,

amb un valor de ∆GN‐U de ‐18.50 ± 0.84 KJ·mol‐1, és inferior a la de la seva proteïna

germinalкIO18/O8(‐25.60±0.23KJ·mol‐1).Anivelldeseveritatdelamalaltia,l’AL‐12té

un potencial patològic entremig de la germinal кI O18/O8 i el domini AL‐09, el més

amiloidogènicreportat finsara, iquetéunvalorde∆GN‐Ude‐14.6KJ·mol‐1(Badenetal.

2008b).

5.2. Viad’agregaciódeldominiAL‐12induïdapertemperatura.

En llocdel desplegamentde lamolècula, la desnaturalització tèrmicadel domini

AL‐12, a 90 °C, dóna lloc a l’agregació de la proteïna, tal i com s’ha vist per CD i

fluorescència del triptòfan. El guany inicial en estructura secundària implica una

reorganització directa de la fulla‐β nativa, i la corba de desnaturalització seguida per

fluorescènciaindicaqueelW35s’exposaalsolventperadesprésenterrar‐sedenou.Això

concorda amb la transició conformacional a partir dels 40 °C, i l’aparició d’un estat

intermediarials55°C,queseràelprecursordel’agregaciódetipus‐β.

L’espectre de FTIR indica que a partir dels 40 °C s’inicia la reorganització

conformacional,deformaquel’estatintermediarijapresentaunaconformaciósimilarala

de l’estat agregat final, el qual ha perdut gran part de la component en fulla‐β

antiparal·lelanativa(19%respecteel48%inicial),a1634cm‐1,afavordel’augmentdela

bandaassociadaalsagregats‐βdetipusWL(21%respecteel0%inicial,a1625cm‐1).

A diferència de l’AL‐12, la desnaturalització tèrmica d’altres dominis VL

amiloidogènicsdescritsprèviament,comaral’AL‐09,haestatdescritacomaunacorbade

desplegament en la qual s’assoleix l’estat totalmentdesplegat, seguintunprocésdedos

estats plegat‐desplegat i completament reversible. Segons aquests resultats, és possible

extraure els valors de Tm (temperatura en la qual el 50 % de la població es troba

desplegada)iΔHN‐Uapartirdel’equaciódeVan’tHoff,comalternativaalsexperimentsde

calorimetria(John,Weeks2000).Degutaque lescorbesdedesnaturalitzaciótèrmicade


209

l’AL‐12no corresponen a unprocés de desplegament de dos estats, sinód’agregació en

fulla‐β ordenada, i que no acabade ser reversible al 100%, no s’hanpogut extraure els

valorsdeTmiΔHN‐Udel’AL‐12.

5.3. Efecte de les mutacions restauratives sobre l’agregació i estabilitat del

dominiAL‐12.

Les quatre mutacions restauratives de l’AL‐12 caracteritzades en aquest treball

(H32Y,R65S,H70D, iQ96Y) formenpart de cadenes‐βde l’estructura globular. La seva

caracterització, a nivell d’estructura secundària, mostra que totes elles tendeixen al

plegamentnatiutípicd’Igs,peròperdengranpartdelareversibilitatobservadaenl’AL‐12,

possiblement per estabilització del intermediari d’agregació, i desviament de la via de

plegamentcapalaviadeformaciód’agregats‐βmésestables.Lesduesmutacionssituades

a la interfície dimèrica (βC‐H32Y i βG‐Q96Y) adopten una estructura secundària nativa

relativament alterada. Concretament, la mutació H32Y perd senyal de fulla‐β nativa

(mínim a 216 nm) respecte l’AL‐12, mentre que la mutació Q96Y perd el senyal

corresponent als residus aromàtics (mínim a 237 nm). Per tant, la restauració, en totes

dues posicions, cap al residu altament conservat Tyr35 afecta el plegament natiu de la

proteïnaAL‐12.

Pelquefaalsparàmetrestermodinàmicsobtingutsapartirdeladesnaturalització

química, aquests indiquen que cap de les mutacions puntuals recuperen l’estabilitat

termodinàmicadelaproteïnagerminalкIO18/O8.Sinoalcontrari,toteselleshanestat

desestabilitzadoresrespectel’AL‐12.

Pelquefaal’agregació,elsdosmutantsrestauratiusderesidusd’histidina(H32Yi

H70D)inicienlatransicióconformacionalcapl’agregat‐βabansquel’AL‐12.Encanvi,en

elsmutantR65SiQ96Yl’estatintermediariapareixcapals55°C,pràcticamentigualquea

l’AL‐12.AlanalitzaraquestestransicionsperFTIR,totselsmutantspresenteninicialment

menyscomponentenfulla‐βnativa,aexpensesdelapresènciainiciald’agregatsdetipus‐

β,peraquestaraó,latransicióconformacionals’observapitjorqueenelcasdel’AL‐12.En

totselscasosperò,a60°C,labandade1620cm‐1,ésinferioraladel’AL‐12,afavord’un

augment de la banda de 1683 cm‐1, que es correspon a la fulla‐β antiparal·lela d’alta

freqüència.

Per tant,semblaaserqueenelcasde l’AL‐12, ladesestabilitzaciódeldominiva

relacionada amb unamajor tendència a l’agregació, tal i com s’observa a les corbes de

desnaturalització tèrmica, seguides per CD i fluorescència de triptòfan. Actualment al

laboratori, s’està treballant amb cinètiques de formació de fibres amiloides, assajades

mitjançant l’emissió de fluorescència del fluoròfor ThT i en funció del pH, per tal de


210

corroborarodescartaraquestapossiblerelació,aixícomperestudiarl’efectedelpHenel

procésdefibril·lació.Peraltrabanda,tambés’estàrealitzantlapreparaciódemostresper

microscòpia. Mitjançant TEM, s’espera completar els resultats del procés d’agregació

obtingutsperFTIRgràciesa l’obtenciód’imatgesdelsagregatsadiferentstemperatures.

TambéperTEM,esvolestudiarl’efectedelpHsobrelaviad’agregacióilamorfologiadels

agregats‐βdel’AL12idelsseusmutantsrestauratius.

5.4. Expectativesdefuturenelestudidel’agregaciódel’AL‐12.

Recopilantlesdadesobtingudes,podemafirmarquelarestauracióderesiduscap

alalíniagerminal,noimplica,excepteenalguncasexcepcional,coméselmutantH87Yde

la AL‐09 (Baden et al. 2008b), el retorn de les propietats conformacionals i

termodinàmiques germinals al domini amiloidogènic. Per tant, és improbable que una

únicamutaciósiguilacausadequeundominiVLesdevinguiamiloidogènicicausimalaltia.

Calmésinformacióexperimentalperapoderdescriuremésdetalladamentl’efecte

delesmutacionssomàtiquesdel’AL‐12enelcontextdelseupotencialamiloidogènic.Per

aquestaraó,actualments’estàtreballantenlescinètiquesdeformaciódefibresamiloides,

mitjançantfluorescènciadeThTienfunciódelpH,aixícoml’obtenciód’imatgesdeTEM,

del’AL‐12idelsseusmutantsrestauratius.Aquestspropersresultatshandeservirpera

tancarl’estudiinicialdeldominivariableAL‐12,implicatenl’AL.

Peraltrabanda, resulta indispensable,decaraaun futur,obtenir lesestructures

cristal·logràfiques dels diferents mutants restauratius, per entendre millor quin efecte

tenenaquestscanvisal’estructurai,també,alainterfíciedimèricaqueformenentreells,i

entendred’aquestamaneraelroldelsdímersVLenl’AL.

Qin et al. afirmen que els dímers VL‐VL de la proteïna amiloidogènica SMA,

estabilitzenl’estatnatiu,disminuintlaquantitatd’intermediaridesplegati,pertant,tenen

unefecteprotectorinhibintlaformaciódefibresamiloides(Qinetal.2007).Enelcasdela

proteïna amiloidogènica TTR, implicada en la malaltia d’amiloïdosi familiar, mutacions

puntualsenlasevaseqüènciapodencausarladissociaciódeltetràmernatiudonantlloca

unmonòmermolt inestable i precursor amiloide (Shnyrov et al. 2000). Aquest cas ens

porta a relacionar la pèrdua de l’estructura tetramèrica d’Ig, degut a un excés de LCs

lliuressecretadesenpacientsd’AL,ambladesestabilitzaciódeldominiilasevadeposició

amiloide.Pertant,totapuntacapunacombinaciódefactorsdesestabilitzants,iniciantper

lapèrduadeltetràmernaturald’Igilesmutacionssomàtiquesnoconservades,quepoden

implicardesdepetitscanvisd’interaccióintraiinterdomini,finsaprovocargranscanvis

conformacionals. Depenent del grau de desestabilització, la proteïna adquirirà un


211

potencial amiloide diferent, possiblement correlacionat amb una major cinètica de

fibril·lació.

QueelsdominisVLformindímerspotentendre’scomunefecteprotectorevitantla

lliure acumulació del intermediari amiloidogènic. Tanmateix, certes mutacions

localitzadesenresidusdelainterfíciedonenllocadímersnocanònics,ambunaestructura

globulardiferentdepenentdel canvi d’interaccions global queprovoquena lamolècula.

Per tant, a nivell de potencial amiloidogènic tan es pot considerar un fort precursor

fibril·larelmonòmerinestablesolublecomlasevaformadimeritzadaalterada;imésque

ladesestabilitzaciódelestatnatiu,serial’augmentdelatendènciaal’agregacióo,ditd’una

altra manera, l’increment d’estabilitat de les espècies intermediàries precursores de

l’agregacióeldetonantdel’amiloïdosi.

CAPÍTOL 4: Estudi per FTIR de la via d’agregació del

domini PSD95‐PDZ3: Reorganització estructural en

fibres‐βde tipusworm‐like icitotoxicitat, i implicacióde

l’hèlix‐α3enl’estabilitatiagregaciódeldominiPDZ3.


Theinterconversionbetweenaflexibleβ‐sheetandafibrilβ‐arrangementconstitutesthemainconformationaleventduringmisfoldingofPSD95‐PDZ3

domain

Marín‐Argany,M.*,Candel,MA.*,Murciano‐Calles,J.,Martinez,JC.&Villegas,S.

BiophysicalJournal103,738‐47(doi:10.1016/j.bpj.2012.07.029)2012

*Firstco‐author

AthermodynamicstudyofthethirdPDZdomainofMAGUKneuronalproteinPSD‐95revealsacomplexthree‐statefoldingbehavior

Murciano‐Calles,J.,Martinez,JC.,Marín‐Argany,M.,Villegas,S.&Cobos,ES.

BiophysicalChemistry,SubmittedonSeptember,2013

Theimpactofextra‐domainstructuresandpost‐translationalmodificationsinthefolding/misfoldingbehaviourofthethirdPDZdomainofMAGUKneuronalprotein

PSD‐95

Marín‐Argany,M.*,Murciano‐Calles,J.*,Cobos,ES.,Villegas,S.&Martinez,JC.

*Firstco‐author

Articleenredacció

V‐Capítol4 Resum

215

1. RESUM.

Laviademisfolding,induïdapertemperatura,deldominiPDZ3,eltercerdominide

laproteïnaneuronalPSD95, éspobladaperun intermediari trimèric ric enestructura‐β

que dóna lloc a la formació reversible d’estructures fibril·lars altament ordenades.

Mitjançant la tècnica de FTIR, s’ha determinat que la via demisfolding és deguda a la

interconversió d’una fulla‐β flexible del domini cap a un intermediari que porta a la

formaciódefibresworm‐like(WL),sensepassarperunafasedenucleació.L’apariciódela

bandadeFTIR corresponent a les fibresWLva acompanyada, amésde la pèrduade la

fulla‐βflexible,d’unalleudisminuciódelacomponentdeloopsdel’estatnatiu,mentreque

la resta d’elements d’estructura secundària de la molècula es mantenen pràcticament

inalterats. Per microscòpia electrònica de transmissió, s’ha confirmat la presència de

fibres WL a partir dels 60 °C, temperatura on la població del intermediari trimèric és

màxima.Assajos de toxicitat emprant la línia cel·lular deneuroblastomahumà SH‐SY5Y

mostrenque aquesta citotoxicitat augmenta amesuraque el procésd’agregació avança.

L’anàlisi d’RMNper desplaçament químic en funció de la temperatura ha revelat que la

reorganitzaciódelafulla‐βalvoltantdelacadena‐β3promouelcanviconformacionalque

dónallocal’agregaciódeldominiPDZ3.

Amb l’objectiu de definir els determinants conformacionals implicats en la

regulacióde la funciódeldominiPDZ3, s’ha realitzatunacaracterització termodinàmica

delprocésdeplegamentid’agregaciódeldominiPDZ3,aixícomdelavariantmancadade

la tercera hèlix‐α, l’∆10ct‐PDZ3, i d’una sèrie de mutants específics de la interacció

d’aquesta hèlix‐α amb el domini PDZ3, els mutants E401R, D332G/P i E334L/Q. Els

experiments de FTIR i DSC, demostren la forta implicació de l’hèlix‐α3 en el plegament

globaldeldomini,lasevaestabilitatitendènciaal’agregació.


217

2. INTRODUCCIÓ.

Tal i com s’ha descrit a la introducció general, els dominis PDZ són un dels

principalsmòdulsdelesproteïnesmultidominihub,constituintl’elementestructuralmés

abundant enmamífers. Reconeixen els extrems C‐terminal de diferents pèptids lligands

amb una elevada especificitat, de forma que actuen com a suport estructural demoltes

proteïnes funcionals (Ivarsson 2012). La proteïna PSD‐95 és un exemple de sistema

multimodularhub i formapartde la famíliadeproteïnesMAGUK(MembraneAssociated

GuanylateKinase).Estrobalocalitzadaalaregiódedensitatpost‐sinàptica, iorganitzala

transducció de senyals i coordina el tràfic molecular de la sinapsis neuronal. Aquesta

proteïnaestàorganitzadaentresdominisPDZ,undominiSH3,iundominiGK,elsquals

estan connectats per loops flexibles que juguen un rolmolt important en la plasticitat i

funcionalitatdelaproteïnaglobal(Zhangetal.2013).

Enaquestcapítols’exposal’estudisobreeldominiPDZ3delaproteïnaPSD‐95,un

treballrealitzatdurantlatesidoctoral,iques’hadutatermeencol·laboracióambelgrup

derecercadelDr.JoséC.Martínez,delDepartamentdeQuímicaFísicadelaUniversitatde

Granada.Elsresultatsaquípresentatsparteixend’estudisprèviamentrealitzatsperaquest

grupiquepodenserconsultatsextensamentalaTesiDoctoraldelDr.Murciano‐Calles,J.

Aquesta, així com les publicacions del grup, seran citades al llarg del capítol per tal de

posarencontextelresultatsaexposar.

EldominiPDZ3delaPSD‐95repespecialimportànciadegutaquecontéunahèlix‐

αaddicionalalextremC‐terminal,queconnectaambelsegüentdominiSH3delaPSD‐95,i

quenoéspresent a la restadedominisPDZ.Anivell funcional, aquesta extensió regula

al·lostèricament l’afinitat del domini per unir‐se als lligands (Petit et al. 2009, Camara‐

Artigasetal.2010,Zhangetal.2011,Mostarda,Gfeller&Rao2012).

Desdelpuntdevista termodinàmic,elsprimersestudisd’equilibrideplegament

que es van realitzar sobre els dominis PDZ mitjançant tècniques espectroscòpiques,

mostravenunaúnicatransicióconformacionaldedosestats,plegatidesplegat.Unmodel

quenoacabavad’encaixarambl’elevadaplasticitatifuncionalitatd’aquestsdominis.Més

recentment, els estudisde calorimetriaduts a termeper elDr.Murciano‐Calles, J., i que

precedeixenelsresultatsseguidamentexposats,posenenevidènciaaquestmodelsimplei

proposenunnouplegamentdetresestatsdeldominiPDZ3,enelqualespoblaunestat

intermediari trimèric ric en estructura‐β, que es troba fora de la via de plegament del

domini(off‐pathway)idónallocalaformaciódefibresreversibles.Unmodelqueestroba

en consonància amb l’elevada plasticitat dels dominis PDZ (Murciano‐Calles et al. 2010,

Murciano‐Callesetal.2011).ResultamoltinteressantelfetdequeeldominiPDZ3ésun

dels pocs casos descrits on es segueix una via de plegament no natiu (d’ara endavant


218

anomenada de misfolding) que dóna lloc a agregats reversibles. A més, l’anàlisi de

l’equilibrid’altresdominisPDZdonaràpistessobresiaquestcomportamentdetresestats

ésgeneraldinslafamíliadedominisPDZ.

LatècnicadeDSC(DifferentialScanningCalorimetry)ésconegudaperserl’òptima

per a detectar qualsevol conformació en el equilibri que es pugui poblar durant el

desplegament. Segons la corba de desplegament tèrmic del domini PDZ3, a pH neutre i

sota incubació a 60‐70 °C, apareixen dues transicions endotèrmiques que indiquen

l’existènciade3estatsconformacionalsdiferents:l’estatnatiu,N;l’estatdesnaturalitzat,D,

iunestatintermediari,I.Amés,lesduesendotermesesdistancienentresiamesuraque

augmenta la concentració de proteïna, suggerint un cert grau d’associació

(oligomerització) del estat intermediari. D’aquesta manera es va establir que el

desplegamentdeldominiPDZ3‐PSD95segueixl’esquemasegüent:

Per DLS (Dynamic Light Scattering), es va caracteritzar l’equilibri d’associació‐

dissociaciódelestat intermediari. Inicialment,a20ºC, l’estatmonomèric(de11kDaiun

radide1.8nm)representael100%delapoblaciód’espèciesconformacionals.Mentreque

després d’incubar a 60ºC, desapareix l’estat monomèric a favor d’estructures

oligomèriquesde33kDai2.6nm.Aquestadadaapuntaqueelsmonòmerss’associenamb

unaestequiometriaden=3,formantunestatintermediaritrimèric,elqualaugmentade

grandària amesuraque s’allargael tempsd’incubació (fins a12nm, corresponenauns

100monòmers).

Energèticament,elprocésdeformaciódefibresapartirdelintermediaritrimèric

delPDZ3ésunexempleinusualperlesraonsdescritesseguidament:

‐ L’associació dels oligòmers no implica cap altre canvi conformacional de l’estat

intermediari,perquèlasegonatransiciódelacorbadeDSCjaésladedissociació

delintermediari.

‐ La fibril·lació,visualitzadaperTEMiseguidaper fluorescènciade l’ANS i laThT,

segueixuncomportamentnocooperatiu,nodepenentdenucleació.

‐ L’energialliuredeGibbsdel’estatnatiua25ºC(∆GN‐D=‐40kJ/mol)ésmajorque

lad’associaciódel’estatintermediaria60ºC(∆GD‐In=‐25kJ//mol).Raóperlaqual

lesfibresamiloidesformadessónreversibles.

nN⇄In⇄nD


219

‐ I per últim, la poca variació del valor d’entalpia entre l’intermediari i l’estat

desnaturalitzat (entalpia de dissociació) (∆HD‐In = ‐130 kJ/mol) indiquen que la

formaciódefibressegueixunmecanismebàsicamententròpic.

A condicions àcides, el domini PDZ desplega seguint un procés de dos estats.

Aquestcomportaments’atribueixalaprotonaciódelsresidusglutàmiciaspàrtic(pKa3‐4)

situatsal’hèlix‐α3(Glu401)ialloopβ2iβ3(Glu334iAsp332).ApHneutre,existeixuna

repulsió electrostàtica entre aquests residus carregats negativament, i que suposa

l’aperturadelahèlix-α3delarestadeldomini,l’exposicióalsolventderegionsambmés

tendènciaa l’agregació i,així, la formaciód’oligòmers trimèrics.Encanvi,apHsàcids, la

protonació evita aquesta repulsió i l’intermediari restaria com amonòmer inestable en

solució,fentqueelprocésd’agregaciósiguiméslent,depenentdenucleació,idonantlloca

fibresmésestablesiirreversibles(Murciano‐Callesetal.2011).

Elconjuntde lescaracterístiquesd’equilibriconformacionaldeldominiPDZ3fan

d’ell unmodel d’estudi de la formació d’oligòmers i fibres amiloides, i la seva possible

relacióambdeterminadespatologieshumanes.Anivelldefuncionalitatfisiològica,espot

concloure que l’entorn intracel·lular modula l’electrostàtica del domini PDZ3 i, com a

conseqüència, controla la seva afinitat espai‐temporal per a unir lligands, a través de

canvisconformacionalsenlahèlix-α3.

Amb l’objectiu d’aprofundir en els detalls moleculars de la via d’agregació del

dominiPDZ3,enaquestcapítols’exposenelsresultatsobtingutsmitjançantlestècniques

deFTIR,TEM,experimentsdecitotoxicitat,id’RMN.S’hadeterminatqueunadelesdues

fulles‐βdeldomini,concretamentlamésflexible,éslaprecursoradelareestructuracióde

l’estatnatiucapalaformaciódel’intermediariqueportaalaformaciódefibres‐βdeltipus

worm‐like (WL), mentre que la resta d’estructures secundàries resten pràcticament

inalterades. Gràcies a l’anàlisi d’RMN, en funció de la temperatura, realitzat per la Dra.

Candel, A.M., s’ha reportat tal interconversió a nivell de residu. En particular, s’ha

identificatlacadena‐β3comlaprincipalresponsabledelcanviconformacionalquepateix

laproteïnaiquel’arrossegacapalaviad’agregació.L’adquisiciód’aquesttipusdefibres

WL i el seu caràcter citotòxic ha estat confirmat per TEM i assajos de citotoxicitat,

respectivament.

Degut a l’absència d’informació sobre l’energètica i l’origen estructural d’aquest

canviconformacional,hemanalitzatperDSC,FTIR,ialtrestècniquesespectroscòpiques,el

comportamentdeplegament/agregaciódeldominiPDZ3enabsènciadelatercerahèlix‐α

addicional (residus 302‐492 de la PSD‐95), anomenat a partir d’ara ∆10ct‐PDZ3, on els


220

deuresidusdelextremC‐terminalqueformenl’hèlix‐α3hanestatdelecionats.Apriori,la

variant∆10ct‐PDZ3,adoptaeltípicplegamentdelsdominisPDZ,peròrealmentésmenys

estable que el PDZ3 original. I, mentre que el PDZ3 sencer segueix un procés de

desplegamentdetresestats,haestatnecessaridefinirunnoumodeldequatreestatspera

descriurecorrectamentlaviadedesplegamentdel’∆10ct‐PDZ3.

A part de la variant ∆10ct‐PDZ3, s’ha realitzat un anàlisis mutacional sobre els

residusimplicatsenlesinteraccionsentreeldominiil’hèlix‐α3.S’havistquelainteracció

entrelaLys355ielGlu401resultadeterminantenelscanvisobservatsdurantl’agregació

deldomini,mésquelainteraccióGlu334iArg399descritaanteriorment(Camara‐Artigas

etal.2010).Aquestaúltimaéscrucialpelquefaalaregulaciódel’afinitatperalspèptids,

perònotansiparlemanivelldereestructuracióconformacional.Finalment,s’haanalitzat

larellevànciadelacircularització,enformad’anelldesuccinimidina,delresiduAsp332a

través de les mutacions D332G i D332P, aquest últim emularia l’efecte de l’aspàrtic

circularitzat.


221


3.1. ExpressióipurificaciódeldominiPDZ3imutants.

Les mostres de PDZ3 i les seves variants (∆10ct‐PDZ3, E401R, D332G, D332P,

E334L i E334Q) han estat purificades per el Dr. Murciano‐Calles, J., seguint el protocol

descrit a (Camara‐Artigas et al. 2010, Murciano‐Calles et al. 2010). Resumidament, les

seqüències del domini PDZ3 i els seusmutants (residus 302‐402de la PSD‐95), i la del

∆10ct‐PDZ3 (residus 302‐492) van ser subclonades dins el vector pBAT4 (EMBL Core

PurificationFacility, Heidelberg, Germany) i expressades en la soca d’E. coliBL21(DE3)

(Novagen,Madison,WI).Lescèl·lulesvanserllisadesiultracentrifugadespertald’obtenir

lafracciósoluble.Després,laproteïnavaserpurificadaperprecipitacióensulfatd’amoni

al 75 %, seguit d’una cromatografia d’exclusió molecular Superdex‐75 (GE‐Healthcare,

Fairfield,CT)entampóTris/HCl50mM,KCl400mM,pH7.5.Elrendimentdepurificació

obtingutvaser,d’aproximadament,15mgdeproteïnaPDZ3ielsseusmutantssimples,i

de8mgdeproteïna∆10ct‐PDZ3,perLdecultiud’LBexpressat.

LesmostresexperimentalsvanserdialitzadescontraeltampóKH2PO450mM,pH

7.5ieltampóPBS,pH7.4,a4°C.

Elcoeficientd’extinciómolar(ε278)empratperalaquantificaciódelesmostresva

serde2985u.Abs.·cm‐1·M‐1,peraldominiPDZ3imutants,ide1425u.Abs.cm‐1·M‐1,pera

la variant ∆10ct‐PDZ3. La massa molecular, confirmada per MALDI‐TOF (Centro de

InstrumentaciónCientífica(CIC)delaUniversidaddeGranada),vaserde11004Dai9898

Da,respectivament.

3.2. AgregaciódeldominiPDZ3imutants.

Abans d’induir la fibril·lació del domini PSD95‐PDZ3 per incubació a 60 °C, les

mostres,aunaconcentracióde8mg/mLientampóKH2PO450mM,pH7.5,tampóPBS,

pH 7.4, o en tampó KH2PO4 50 mM, 150 mM d’NaCl, pH 7.5, van ser liofilitzades i

resuspesesen200μldeD2O,icentrifugadesa10.000gdurant5min.

Els diferentsmutants van ser tractats de lamateixamanera però tan sols es va

prepararlamostraentampóKH2PO450mM,pH7.5.

Peralafibril·lació,lesmostresvanserincubadesa60°C,durant0,4,8i16dies.

3.3. Espectroscòpiad’infraroigambtransformadadeFourier.

Pelquefaalsfonamentsdelatècnicad’infraroigdescritaacontinuació,estroben

detallatsal’apartat4.5deMaterialsiMètodesGenerals.


222

Mitjançant l’espectròmetre Varian Resolutions Pro, es van obtenir els espectres

d’infraroig de les diferents mostres prèviament fibril·lades. Primer, la mostra inicial

(temps 0 dies), a 25 i 60°C, i posteriorment les de diferents temps d’incubació a 60 °C,

sempre deixant temperar la mostra 5 min abans de la lectura. Els espectres es van

registrarde4000a400cm‐1,aunavelocitatde95cm−1/min,unaresolucióde2cm‐1,ifent

la mitjana de 1000 acumulacions. L’espectre va ser corregit contra el soroll de fons

(background),irestantlasenyaldeltampóidelvapor.

Eltractamentdedadesiladeconvoluciódelabandad’amidaI’s’harealitzatusant

elsoftwareGRAMS(Thermoscientific).Ladeconvolució,sobreunacorbaLorentziana,s’ha

obtingutusantunaampladadebandade17iunfactorKde2.2,enapoditzaciódetipus

Bessel.Elsajustosdelesbandessobrel’espectredeconvolucionats’hanrealitzatsobreuna

corbaGaussiana.Lesdadesfinals,s’hanexpressatentantpercentd’estructurasecundària.


Les mateixes mostres del domini PDZ3 induïdes a fibril·lació i analitzades per

FTIR,vanservisualitzadesperelmicroscopielectrònicdetransmissióHitachiH‐7000,del

serveidemicroscòpiadelaUAB,ianalitzadesambelsoftwareDigitalMicrograph(Gatan).

Per a fer‐ho, lesmostres van ser absorbides en reixetes de coure recobertes de

carboni, i tenyides negativament amb acetat d’uranil al 1 % (veure apartat 4.6.1 de

MaterialsiMètodesGenerals).

3.5. AssajosdecitotoxicitatdeldominiPDZ3.

ElsassajosdecitotoxicitatdelsagregatsdePDZ3esvanrealitzarmitjançantlalínia

cel·lular de neuroblastoma humà SH‐SY5Y (veure apartat 5.5 de Materials i Mètodes

Generals).

Prèviament,esvainduirlafibril·laciódeldomini,talicoms’haexplicatal’apartat

3.2, però aquest cop a una concentració de 44 mg/mL en tampó PBS, pH 7.4. Un cop

agregades,esvaafegir10μldemostraperpoudecultius,obtenintunaconcentraciófinal

de4.4mg/mLperpoude100μl,iesvadeixarincubantdurant24ha37°C.

Seguidament es va mesurar el % de viabilitat del cultiu cel·lular mitjançant el

mètode d’MTT (veure apartat 5.5.1 de Materials i Mètodes Generals). Cada condició

consistiaen6rèpliquesperexperiment,i2experimentsindependentsvanseranalitzats

estadísticament per nivell de significança (test de rangs signats de Wilcoxon, SPSS),

desprésdenormalitzar lesdadesusant la concentracióde la condició tampóPBScoma

referència.Elsresultatsrepresentenl’errorSEM(StandardErroroftheMean).


223

3.6. ExperimentsdeDSC,DLSiCDdelesdiferentsvariantsdeldominiPDZ3.

Els experiments de calorimetria (DSC, Differential Scanning Calorimetry), DLS

(DinamycLightScattering)iCD(CircularDichroism)hanestatrealitzatspelDr.Murciano‐

Calles,J.delaUniversitatdeGranada.

Resumidament,lesmostresaestatanalitzadesentampóKH2PO450mM,pH7.5ia

4 °C. Els experiments de DSC han estat registrats a una velocitat de 1.5 K/min, i a

concentracionsde0.4a7.2mg/mL,mitjançantelcalorímetreVP‐DSC(MicrocalINC.),tali

com s’ha descrit prèviament (Viguera et al. 1994). Els experiments de DLS i CD també

s’hanrealitzatsegonss’hadescritanteriorment(Cobosetal.2004,Cobosetal.2009).El

pesmolecular de les espècies ha estat calculat a partir del respectiu radi hidrodinàmic,

emprant el model de “proteïna globular” inclòs en el software de l’instrument de DLS

(DynaPro,DYNAMICSV6,WyattTechnologyCorporation).

3.7. Espectroscòpiad’RMN.

Els experiments d’espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (RMN) han

estatrealitzatsperlaDra.Candel,A.M.,delaUniversitatdeGranada.

Resumidament,laproteïnamarcadaamb15Nvaserpurificadad’uncultiucel·lular

crescut en medi mínimM9 amb 15NH4Cl com a única font de nitrogen, d’acord amb el

mètodedescritanteriorment(Marley,Lu&Bracken2001).

Lesmostresperalsexperimentsd’RMNvanserpreparadesa8mg/mLen90%

H2O/10%D2OientampóKH2PO450mM,pH7.5.

L’espectredecorrelació1H‐15Nvaserregistratdesde25a60°C,aintervalsde2.5

°C,mitjançant l’espectròmetreVarianNMRDirect‐DriveSystem600MHz(freqüènciade

l’1Hde600.25MHz)equipatambcryoprobe.Lesdadesd’RMNvanserprocessadesusant

NMRpipe i analitzades usant SPARKY. L’assignació del domini PDZ3 va ser obtingut

emprant els mètodes estàndards. Les intensitats dels pics a l’espectre 2D van ser

determinadesusantlarutinadepeak‐pikingenSPARKY.


225

4. RESULTATS.

4.1. EspectredeFTIRdeldominiPDZ3natiu.

Ladeconvoluciódel’espectredelabandad’amidaI’deldominiPDZ3a25°C,en

tampóKH2PO450mM,pH7.5,generasisbandesprincipalscentradesa1680,1669,1659,

1650,1640, i1631cm‐1, i tresbandesminoritàries centradesa1692,1620, i1606cm‐1

(Figura4.1‐A/Taula4.1).

Figura4.1.Descomposicióenbandesdel’espectredeconvolucionatdeFTIRdeldominiPDZ3adquirit

entampóKH2PO450mM,pH7.5.A)25°C,B)desprésde5mina60°C,C)desprésde4diesa60°C, iD)

després de 8 dies a 60 °C. La banda de 1640 cm‐1 és representada en verd, i la banda de 1620 cm‐1 és

representadaenvermell.Larestadebandessónrepresentadesengris.


226

Labandamésrepresentativa,ambun28%del’àreatotaldelespectre,éslocalitza

a1640cm‐1,ideprimerespodriaserassignadacomacomponentenrandom‐coil(Byler,

Susi1986).Totiaixò,aquestvalorestrobaallímitentreelrangatribuïtalacontribució

enrandom‐coil(1645‐1640cm‐1)il’atribuïtalacomponentenfulla‐βantiparal·lelanativa

de baixa freqüència (1630‐1640 cm‐1) (Byler, Susi 1986, Zandomeneghi et al. 2004).

L’espectre de CD del domini PDZ3, obtingut prèviament (Murciano‐Calles et al. 2010),

mostraunperfilcanònicdefulla‐β,ambelmínima218nm(Figura4.2),pertant,quela

majorbandadel’espectredeFTIRsiguiunacomponentenfulla‐βantiparal·lelanativade

baixafreqüènciaprenméssentit.

Figura4.2.EspectredeCDdeldominiPDZ3en tampóKH2PO450mM,pH7.5. Enverdes representa

l’espectre de la proteïna nativa a 2 °C y en vermell l’espectre a 98 °C. Per a comprovar la reversibilitat, la

mostraesvareplegardenoubaixantlatemperaturafinsa2°Ciesvaregistrarl’espectredesprésde5min

d’incubació.FiguraadaptadadeMurciano‐Calles,J.(tesisdoctoral,2011).

Apart,esgeneraunaaltrabanda,a1631cm‐1,queestrobaenelrangassignatper

a la component en fulla‐β antiparal·lela nativa de baixa freqüència, però tan sols

contribueixenun14%delespectre(Taula4.1),encontradel34%obtingutapartirde

l’estructuracristal·logràficadelPDZ3,resoltaprèviament(Camara‐Artigasetal.2010).Per

tant, lanostrahipòtesi inicialvaserque labandaa1640cm‐1corresponiaauna fracció

moltflexibledelafulla‐β,iquefàcilmentesdesorganitzaensolució;fetqueconcordaamb

la flexibilitat conformacional que requereix el domini PDZ3 per tal d’assolir l’elevada

capacitat d’unió que té cap als pèptids lligands (Saro et al. 2007). Per altra banda, la

componentenfulla‐βantiparal·lelanativad’altafreqüència,eslocalitzaa1681cm‐1,itan

solscontribueixenun8%del’àreadel’espectre.


227

Lacomponentengirs‐βestrobaa1669i1659cm‐1(Byler,Susi1986),enaquesta

últimabandatambéhicontribueixenelsloops(Heredia,DeLasRivas2003),irepresenta

el16%del’àreatotal.Lacomponentenhèlix‐α,centradaa1650cm‐1,contribueixnomés

enun16%de l’espectre,menysdel24%donatper lesdadescristal·logràfiques(veure

apartat5.2deDiscussió)(Taula4.1)(Camara‐Artigasetal.2010).

Taula4.1.Descomposicióenbandesdel’espectredeconvolucionatdeFTIRdeldominiPDZ3adquirit

entampóKH2PO450mM,pH7.5.

25 °C

60 °C, 0 dies

60 °C, 4 dies

60 °C, 8 dies

60 °C, 16 dies


Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Girs‐ 1694 1 1695 1 1692 2 1692 2 1694 1


1680 8 1684 2 1679 12 1679 12 1680 10

‐ 1676 9 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Girs‐ 1669 9 1669 7 1668 8 1668 8 1668 11

Loops / Girs‐ 1659 16 1659 15 1658 13 1658 13 1659 12

Hèlix‐α 1650 16 1649 16 1648 13 1648 13 1649 16

Fulla‐β flexible / Random coil

1640 28 1640 19 1640 13 1640 13 1640 11


1631 14 1631 16 1631 13 1631 13 1630 18

WL /Amiloide 1620 4 1620 12 1620 22 1620 22 1621 19

Cadenes laterals 1606 4 1606 3 1606 4 1606 4 1607 3

Pelquefaalesbandesminoritàries,labandaa1620cm‐1corresponalsagregats‐β

(Zandomeneghietal.2004),ilade1606cm‐1alescadeneslaterals(Arrondoetal.1993);

la banda a 1692 cm‐1 és pot considerar negligible (Taula 4. 1). A l’estat natiu, la banda

assignada als agregats‐β, a 1620 cm‐1, tan sols representa el 4% del espectre, però ja

reflexa la tendència del domini PDZ3 a l’agregació, tot i ser trobar‐se a temperatura

ambient.Aquestabandaestrobaentrelesduescomponentsd’agregatsfibril·larsordenats,

lesfibresWL(de1630a1620cm‐1)ilesfibresamiloides(de1620a1615cm‐1).

4.1.1. EspectredeFTIRdel’agregaciódeldominiPDZ3.

L’espectrea60°Cs’haadquiritdesprésd’incubarlesmostresdesdeminutsfinsa

varisdies, jaques’haviavistqueaaquestatemperaturaes formal’intermediaritrimèric

precursor de fibres amiloides reversibles (Murciano‐Calles et al. 2010). Un cop dins la

cel·la de FTIR, lesmostres van ser equilibrades durant 5min a 60 °C abans d’adquirir

l’espectre.


228

Elprincipalcanvienl’espectredesprésdelaprimeraincubacióa5min(Figura4.

1‐B/Taula4.1),ésunaapreciabledisminuciódelabandaa1640cm‐1,corresponentala

fulla‐β flexible, a favor de l’increment de banda a 1620 cm‐1, la dels agregats WL o

amiloide. Aquesta reorganització conformacional entre fulles‐β fa que augmenti el grau

d’empaquetament entre cadenes‐β, i per tant el nombre d’ona baixa, tal i com ha estat

descrit en altres processos de fibril·lació (Zandomeneghi et al. 2004, Cerda‐Costa et al.

2009).Pelquefaalabandaatribuïdaalafulla‐βantiparal·lelanativadebaixafreqüència,

a 1631 cm‐1, i la de l’hèlix‐α, a 1650 cm‐1, resten quasi inalterades. Degut a les seva

complexitat i les discrepàncies d’assignació entre autors, resulta difícil d’interpretar els

canvisa laregióde1700‐1660cm‐1,aixícomladivisióendosdelabandade1680cm‐1

(Olingeretal.1986,Arrondoetal.1993).

Quan lamostra és incubada durant 4 dies a 60 °C (Figura 4. 1‐C/Taula 4. 1), la

reorganització conformacional entre fulles‐β continua, decreixent la fracció flexible de

fulla‐βnativafinsal13%(desdel28%a25°C),iaugmentantlabandaWL/amiloidefins

al22%(desdel4%a25°C).Amés,semblaque labandadegirs‐β/loops,a1650cm‐1,

tambétendeixadisminuir.

Finalment, després d’incubar lamostra durant 8 i 16 dies a 60 °C (Figura 4. 1‐

D/Taula4.1), l’espectredeFTIResmantépràcticament igualqueals4diesd’incubació.

Aixòimplicaquelareorganitzacióquegeneral’estatintermediaritrimèrics’assoleixals4

diesd’incubació.

4.1.2. Influenciadelaforçaiònicasobrel’agregaciódeldominiPDZ3.

Pertaldecomprovarl’efectedelaforçaiònicasobrelaviad’agregaciódeldomini

PDZ,s’hacomparatelsresultatsdeFTIRobtingutsentampóKH2PO450mM,pH7.5,amb

elsespectresentampóPBS,pH7.4.Talicoms’observaalafigura4.3‐A,B,l’agregaciódel

domini es comporta de manera similar en totes dues condicions, però el canvi

conformacionalcapafibresWL/amiloidesentampóPBS,s’assoleixals5primersminuts

d’incubacióa60°C,indicantquelaforçaiònicaacceleraelprocésdereorganitzaciódeles

fulles‐β,perònocanviaeltipusdeviad’agregació.


229

Figura 4. 3. Evolució de les principals components del espectre de FTIR, sota diferents condicions,

durant la incubacióa60 °C.A)En tampóKH2PO450mM,pH7.5.B)En tampóPBS,pH7.4. C)En tampó

KH2PO450mM,pH7.5,més150mMd’NaCl.Lacomponentde1659‐1658cm‐1haestatdesignadacoma1660

cm‐1 per tal de facilitar la gràfica (resolució del espectre inicial 2 cm‐1). La mostra 0 dies a 60 °C va ser

temperadadurant5minabansderegistrarl’espectredeFTIR.


entampóPBS,pH7.4.

25 °C

60 °C, 0 dies

60 °C, 4 dies

60 °C, 8 dies

60 °C, 16 dies


Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Girs‐ 1694 1 1694 1 1695 2 1695 2 1695 2


1683 2 1684 4 1684 5 1684 8 1685 4

1679 6 1676 2 1676 7 1677 4 1677 9

Girs‐ 1669 9 1670 17 1668 9 1668 13 1667 9

Loops / Girs‐ 1659 16 1658 11 1659 13 1658 9 1658 10

Hèlix‐α 1649 18 1648 16 1649 13 1648 14 1648 14


1640 24 1640 13 1640 15 1640 12 1640 11


1630 16 1631 15 1631 12 1631 13 1631 12

WL /Amiloide 1621 4 1620 17 1619 22 1619 22 1620 25


Peraconfirmarl’efectedelaforçaiònicasobrelaformaciódefibres‐β,tambéesva

dissenyar l’agregació en tampó KH2PO4 50 mM, pH 7.5. més 150 mM d’NaCl (una

concentraciódesalsimilaraladeltampóPBS).Lafigura4.3‐Cconfirmaquelatransició

conformacionalésassolidaals5mina60°Cdegutalapresènciadeforçaiònica,talicom

jahaestatreportatenaltresproteïnesambtendènciaaformarfibres,comaraelsdominis

VLd’immunoglobulines(Sikkink,Ramirez‐Alvarado2008).


230


entampóKH2PO450mM,pH7.5,més150mMd’NaCl.

25 °C

60 °C, 0 dies

60 °C, 4 dies

60 °C, 8 dies

60 °C, 16 dies


Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Girs‐ 1694 2 1694 2 1694 1 1693 3 1694 1


1680 7 1683 6 1683 6 1684 7 1685 5

1676 2 1677 5 1676 5 1677 6

Girs‐ 1669 8 1669 14 1669 11 1670 12 1669 12

Loops / Girs‐ 1659 15 1658 10 1658 11 1658 9 1658 9

Hèlix‐α 1650 18 1648 15 1649 15 1649 14 1649 15


1640 27 1640 12 1640 14 1640 12 1640 11


1630 16 1631 14 1631 13 1631 13 1631 12

WL /Amiloide 1620 5 1620 22 1620 21 1620 23 1620 24


Lestaules4.2i4.3mostrenelscanvisquepateixeldominiPDZ3incubata60°C

en presència de sal. Resumidament, la component en de fulla‐β flexible decreix

dràsticament,acostad’incrementarlabandadeWL/amiloideidisminuir,també,lafracció

degirs‐β/loops.Lapartmésestructuradade lamolècula, la fulla‐βantiparal·lelanativa i

l’hèlix‐α,tambédisminueixlleugerament,totiqueesconsiderapocrepresentatiu.

4.1.3. CitotoxicitatdelsagregatsdePDZ3.

Per als assajos de citotoxicitat, mostres del domini PDZ3, a 44 mg/mL, van ser

incubadesa60°Cdurantdiferentsperíodesde temps(0,4,8 i16dies),per tald’induir

l’agregació(veureapartat3.5deMaterials iMètodesdelcapítol).Laconcentració finala

cultius,de4.4mg/mL,éslameitatdel’empradaperalsespectresdeFTIR,jaqueamajors

concentracions la mostra es troba massa agregada per a realitzar assajos de viabilitat

obtenint resultats reals i reproduïbles. S’ha de tenir en compte, a més, que la via

d’agregaciódeldominiespotveurerevertidapelcanvidetemperaturaacultius,passant

de60a37°C,onesmantédurant24hores.Pertant,apartdecomprovarperTEMaquesta

possible reversibilitat dels agregats, no és pot fer una comparació directe entre els

resultatsdeFTIRicitotoxicitat,degutaladiferenciadeconcentracióidetemperaturadels

experiments.


231

Figura 4. 4.Assaig de viabilitat perMTT de la línia cel·lular de neuroblastoma humà SH‐SY5Y. Les

cèl·lulesvansertractadesdurant24hambtampóPBS,pH7.4, iambPDZ3incubata60°Cdurantdiferents

dies (0,4,8 i16).Laconcentracióde lamostradurant la incubació ienelcultiucel·lularvaserde44 i4.4

mg/mL,respectivament.

Els assajos de toxicitat en la línia cel·lular de neuroblastoma humà SH‐SY5Y,

mostren que la citotoxicitat augmenta a mesura que la via d’agregació es troba més

avançada(Figura4.4).Aquestresultats indiquenque l’agregacióhauriadeser, tansols,

parcialmentreversibleiqueaquestareversibilitatdecreixamesuraquelareaccióéstroba

mésdesplaçadacapalaformaciód’agregatsmadurs.

4.1.4. MicroscòpiaelectrònicadelsagregatscitotòxicsdePDZ3.

Pertaldedeterminareltipusdeviad’agregació(WL/amiloide)quesegueixenels

agregats citotòxics del domini PDZ3, assignada a la banda de FTIR 1620 cm‐1, s’han

obtingut imatges de TEM de les mostres emprades per als espectres de FTIR, a

concentració8mg/mL,ientampóPBS,pH7.4(veureapartat3.4deMaterialsiMètodes

del capítol).Améss’hacomprovatelgraudereversibilitatdelsagregatsen funcióde la

temperatura, iverificaraixí,sialdisminuir la temperaturaa37°Cdurant24h,condició

necessàriaperalsassajosdecitotoxicitat,elsagregatsesmanteneni,pertant,sisónels

responsablesdeladisminuciódelaviabilitatcel·lular.

Tal icoms’observaa la figura4.5‐A,alsestadis inicialsde l’agregacióhi trobem

petitesestructuresglobulars,sensepresènciad’agregatsfibril·lars.Segonselsresultatsde

citotoxicitat, aquestaconformacióno seria tòxicaencultius.Desprésde la incubacióper

varisdiesa60°C,apareixenfibresdeltipusWL,queescaracteritzenpersercorbades,no

massallarguesiambundiàmetrede8‐9nm.AquestesfibresWLésmantenendurantels


232

4,8i16diesd’incubació.SegonsFTIR,aquestesfibresesformenràpidamentals5mina

60°C,iesmantenendurantlarestadediesd’incubació.

Pelquefaalareversibilitat,lesimatgesdelafigura4.5‐B,mostrenqueelcanvide

temperatura a 37 °C, no afecta al grau d’agregació, i per tant, la citotoxicitat en cultius

cel·lularsespotatribuir,talicoms’esperava,alsagregatsdeltipusWLdeldominiPDZ3.A

més,podemcorroborarquel’agregaciódeldominiPDZ3ésparcialmentreversible.

Figura4.5.ImatgesdeTEMdeldominiPDZ3incubata60°C,entampóPBS,pH7.4.A)Incubacióa60°C

durant0,4i8dies.B)Incubacióa60°Cdurant0,4i8dies,més24ha37°C,quemostraquelescondicionsde

cultiu cel·lular no reverteixen els agregatsWL del domini PDZ3. En totes dues condicions, a temps 0 dies

s’observenestructuresglobulars.Als4diesd’incubació,apareixenfibresdeltipusWL,queesfanmésevidents

als8diesd’incubació(lesimatgesadquiridesals16diesd’incubaciósónmoltsimilarsals8diesa60°C).

4.1.5. Anàlisis per RMN‐HSQC dels aspectes moleculars de l’agregació del

PDZ3.

Per tal d’aprofundir en el mecanisme molecular d’agregació del domini PDZ3, i

corroborarelpasperun intermediari trimèricquedonaria lloca laviaWL, tal icomha

estat descrit anteriorment pel Dr. Murciano‐Calles (Murciano‐Calles et al. 2010), s’ha

analitzat, per espectroscòpia d’RMN, les regions responsables del canvi conformacional

observatperFTIR.Aquestsexperimentsil’anàlisideresultatshanestatdesenvolupatsper

laDra.Candel,A.M.,delaUniversitatdeGranada.


233

L’espectre de correlació 1H‐15N HSQC‐NMR (Heteronuclear Single Quantum

Coherence‐Nuclear Margnetic Resonance) correlaciona els desplaçaments químics (o

chemical shifts) dinsdels grupsNHde la cadenapolipeptídica. L’espectrebidimensional

del domini PDZ3 en tampó KH2PO4 50mM, pH 7.5, va ser registrat des de 25 a 60 °C

(Figura4.6‐A).

Figura4.6.Espectredecorrelació1H‐15NHSQC‐RMNdeldominiPDZ3entampóKH2PO450mM,pH7.5,

desde25a60°C.A)Efectede la temperaturasobre les intensitatsdelspicsobtingutpercomparaciódels

espectres de correlació 1H‐15N adquirits a intervals de temperatura de 2.5 °C. Per simplificar‐ho, la figura

mostra espectres adquirits cada 5 °C. Tots els pics esmouen cap a freqüènciesmajors (o cap a l’esquerra,

downfield)enl’espectredeprotóamesuraqueaugmentalatemperatura.B)Representaciódel’estructuradel

domini PDZ3 (codi PDB3K82). En colors, esmostra el graudepertorbaciódeHSQC.Magenta: residusque

mantenenelsseuspicsenposició i intensitatsimilar.Cian:residusque, tot i canviar les intensitats/volums,

mantenenlasevaposicióals60°C.Blau:residusquemodifiquenlasevaposicióinicialjaqueelpicdesapareix

ocanviadelocalitzacióals60°C.C)EstructurasecundàriaipertorbaciódeHSQCanivellderesidu,usantel

mateixcodidecolorquealafiguraB.Lesregionsambtendènciaal’agregació(perTANGO)sónmarcadesen

negreta.

L’anàlisid’aquestespectreaportainformaciódelesintensitats/volumsdelspicsde

cada residu en funció de la temperatura, i ha permès classificar‐los en funció de si

mantenenonoladisposicióconformacionaldel’estatnatiudesprésd’incubara60°C.


234

D’aquestamaneras’hanidentificattrestipusderesidusdinsl’estructuraglobular

deldominiPDZ3(Figura4.6‐B,C):elsquemantenenlaconformaciódel’estatnatiujaque

lesintensitats/volumsdelsseuspicsnodecreixensignificativament;elsresidusque,toti

atenuar les intensitats/volums, mantenen la seva posició nativa; i els residus que

modifiquenlasevaposicióinicial,jasiguiperquèelpicdesapareixocanviadelocalització

als60°C.

Aquesta classificació dins l’estructura globular del domini (Figura 4. 6‐B, C),

mostra que els residus localitzats a les cadenes β1 i β5, les quals s’organitzen en un β‐

hairpin antiparal·lel, són aquells que mantenen la seva disposició. En contra, la fulla‐β

formada per les cadenes β2, β3 i β4, sembla pateix un cert grau de desorganització o

readaptació, juntamentambelsresidusde l’hèlix‐α1, laqual tambéestrobaparcialment

inclosa com a regió amb tendència a l’agregació, tal i com s’ha predit per l’algoritme

TANGO.

Lapermanènciadelasenyaldecorrelaciódelaβ1ilaβ5concordaperfectament

ambelsresultatsdeFTIR,onpartdelacomponentenfulla‐βnativaésmantéals60°C.Per

altrabanda,lafeblesaodesapariciódelasenyaldelaβ2,β3iβ4estariarelacionatambla

fracciódefulla‐βnativaiflexible,responsabledel’apariciódelabandad’agregatsWL.

4.2. Efectedeladeleciódel’hèlix‐α3sobreelplegamentdeldominiPDZ3.

Laimportànciadel’hèlix‐α3haestatcorroboradaambelpaperreguladorsobreles

propietats d’unió del domini PDZ3 (Petit et al. 2009). Aquest domini presenta una

regulacióal·lostèricaatravésdel’hèlixaddicional,quenointeraccionadirectamentambel

lligand.Alestudiarlespropietatsd’uniódeldominisensel’α3,esvaobservarquel’afinitat

varianotablement,depenentdelpèptidlligand,finsa20vegadesmenys.Aquestavariació

de l’afinitat no sembla que estigui acompanyada d’un canvi conformacional, sinó a

fenòmensdinàmicsdecaràcterentròpic.

Vista l’evident importància d’aquesta hèlix‐α3, es va decidir estudiar les

conseqüències de la seva eliminació en el procés de plegament. Per això es va clonar i

purificar la construcció del tercer domini PDZ de la proteïna PSD‐95, amb deleció dels

últims 10 residus del extrem C‐terminal, la variant ∆10ct‐PDZ3. Els experiments de

clonatge, expressió, i l’estudi del plegament del domini ∆10ct‐PDZ3, han estat realitzats

perelDr.Murciano‐Calles, J.,de laUniversitatdeGranada, iestrobendetallatsa laseva

Tesi Doctoral, i al article en col·laboració en espera d’acceptació i publicació(Murciano‐

Calles2011,Murciano‐Callesetal.2013).


235

Uncopcomprovatquel’afinitatdeldominiPDZ3peral lligandKKETAVésmajor

(Kd = 1 μM) que la del domini ∆10ct‐PDZ3 (Kd = 3.6 μM) (Murciano‐Calles 2011), es va

estudiar,mitjançantDSC,l’efectedel’eliminaciódel’hèlix‐α3enelplegamentdeldomini.

La figura 4. 7 mostra les traces calorimètriques obtingudes prèviament amb el

dominiPDZ3(Murciano‐Callesetal.2010) i lesdel l’∆10ct‐PDZ3(Murciano‐Calles2011,

Murciano‐Callesetal.2013).Lesduestransicionsendotèrmiquesindiquenlapresènciade

tresestatsmacroscòpicsenequilibri,reversibles,iindependentsalavelocitatdecanvide

temperatura (dada no mostrada). Al augmentar la concentració de proteïna, les dues

endotermes es separen, indicant un fenomen d’associació del estat intermediari. La

primeraendoterma(quecorresponalequilibriN⇄In)reflexaelprocésd’associaciódel

estat intermediari durant el desplegament, i és resultat de dos processos oposats: a) la

contribuciópositivadelprocésdedesplegamentdel’estatnatiu, ib)elprocésexotèrmic

de l’associaciódel intermediari. La segonaendoterma (corresponent al equilibri In⇄D)

indica, únicament, la pèrdua de l’estat d’associació (o dissociació) donant lloc al estat

desplegat. Qualitativament, les dues construccions difereixen en que les transicions de

l’∆10ct‐PDZ3sónmésagudes.Però,ladiferenciamésimportantéselgraudereversibilitat

del’∆10ct‐PDZ3(un10%),forçainferioraldeldominiPDZ3sencer(un60%).

Figura 4. 7. Corbes del desplegament tèrmic del domini PDZ i ∆10ct‐PDZ3 obtingudes per DSC. A

diferentconcentraciódeproteïna,ientampóKH2PO450mM,pH7.5,s’hanobtingutelsvalorsexperimentals

(cerclesgrisos).L’anàlisiglobals’harealitzatapartirdelmodeldetresestats(PDZ)odequatreestats(∆10ct‐

PDZ3)iésrepresentatambunalínianegra.ImatgesextretesdeMurciano‐Calles2011.


236

MalgratqueelperfildeDSCversuslaconcentracióésmoltsemblantentretotsdos

constructes,elmodel3tresestats(nN⇄In⇄nD)empratperal’anàlisideDSCdeldomini

PDZ3nos’ajustaalatraçacalorimètricadel’∆10ct‐PDZ3,pertanthacalgutdefinirunnou

modeldequatreestatsperadescriureladesnaturalitzaciótèrmicadel’∆10ct‐PDZ3,ique

éselsegüent:

Pertant,eldesplegamentdeldomini∆10ct‐PDZ3contétresprocessosenequilibri,

1)elpasdelestatnatiualintermediari(N⇄I),alquesegueix,2)eldesplegamentcomplet

del domini (I ⇄ D), i per altra banda, i off‐pathway, 3) l’equilibri d’associació del

intermediari(I⇄(1/3)I3).Així,seguintaquestmodel,existeixunintermediarimonomèric

en equilibri previ al procés d’associació, el qual s’associarà donant lloc a un oligòmer

trimèric,lamateixaestequiometriafinalqueperaldominiPDZ3sencer.

Apartirdelsparàmetrestermodinàmicsobtingutsdelmodeldequatreestats,s’ha

fetunanàlisidepoblacionsdelsdiferentsestatsenequilibri(Murciano‐Calles2011).Ala

figura4.8espotobservarquel’intermediaritrimèricespoblapràcticamental100%enel

intervaldetemperaturad’entre50i85°C,iqueaconcentracionsbaixestambéesforma

de manera majoritària (fins a un 90 %). Això reflexa una diferencia important amb el

dominiPDZ3sencer,queabaixaconcentraciól’intermediaritansolsarribaaserel50%,i

dinsd’unrangdetemperaturamenor,de65a85°C.Pelquefal’estatmonomèric,totiser

indispensable, no supera el 10% de població a cap temperatura, concloent que l’estat

oligomèricésmésestablequeelmonomèric.

nN⇄In⇄nD

⇅

(1/n)In


237

Figura4.8.DistribuciódepoblacionsdelsdiferentsestatseneldesplegamenttèrmicdeldominiPDZ3i

deldomini∆10ct‐PDZ3.Peracadadominiesmostraladistribuciódepoblacions,obtingudesapartirdeles

traces de DSC, a concentració de 85 μM (línia continua) i 480 μM (línia discontinua). Imatges extretes de

Murciano‐Calles2011.

Per tant, gràcies a l’excel·lent ajust a un model de quatre estats de les dades

calorimètriques, realitzat per el Dr. Murciano‐Calles, i els espectres de FTIR

deconvolucionats que es presenten a continuació, es pot concloure que al delecionar la

tercera hèlix‐α del domini PDZ3, s’estabilitza l’intermediari, ja que apareix a

concentracionsmenorsiespoblaenmajorproporciórespectel’estatnatiuidesplegat.

4.2.1. Efectedeladeleciódel’hèlix‐α3sobrel’agregaciódeldominiPDZ3.

Un cop caracteritzat el mecanisme de plegament del domini ∆10ct‐PDZ3, s’ha

determinat l’efecte de la deleció de l’hèlix‐α3 addicional sobre la via d’agregació del

domini PDZ3. Per a fer‐ho, s’han adquirit els espectres de FTIR del domini ∆10ct‐PDZ3

natiuiadiferentstempsd’incubacióa60°C.


238

4.2.1.1. EspectredeFTIRdeldomini∆10ct‐PDZ3natiu.

L’espectre de FTIR natiu (25 °C), de l’∆10ct‐PDZ3, genera sis bandes principals

centradesalvoltantdels1680,1670,1660,1650,1640,i1630cm‐1;aixícomtresbandes

minoritàriesals1690,1620,i1605cm‐1(Figura4.9‐A).Aquestesbandessónlesmateixes

quelesobtingudeseneldominiPDZ3,pertant,podemconfirmarquel’∆10ct‐PDZ3manté

eltípicplegamentdelsdominisPDZ.

Totiaixò,existeixencertscanvisrespecteelPDZ3.Sorprenentment,ladeleciódel

l’hèlix‐α3 tan sols implica una disminució del 2 % de la banda d’hèlix‐α, a 1650 cm‐1,

constituintun14%de l’àreatotalde l’espectre(Figura4.9‐A/Taula4.4).Apartqueel

FTIRésunatècnicadebaixaresolució,unapossibleexplicacióseriaqueaquestahèlixes

troba empaquetada contra la fulla‐β flexible (cadenes β2, β3 i β4), que a al seu torn es

troba empaquetada contra l’hèlix‐α1. La deleció de l’α3 resultaria en una millor

acomodacióde la fulla‐β flexible i l’estabilitzacióde l’hèlix‐α1, compensant lapèrduade

component‐α.

Figura 4. 9. Descomposició en bandes de l’espectre deconvolucionat de FTIR del domini ∆10ct‐PDZ3

adquirit en tampó KH2PO4 50 mM, pH 7.5. A) 25 °C, B) després de 5 min a 60 °C. La banda de 1640 cm‐1

és representada en verd, i la banda de 1620 cm‐1 és representada en vermell. La resta de bandes són

representades en gris.

Per altra banda, tot i haver estat descrit que la deleció de l’α3 incrementa la

flexibilitat del loop β1‐β3 (Mostarda, Gfeller & Rao 2012), per FTIR no es pot detectar

aquesta diferencia. De fet, la component en fulla‐β flexible, centrada a 1640 cm‐1,

disminueixenl’∆10ct‐PDZ3respecteelPDZ3sencer(del28al21%).


239

Taula 4. 4. Descomposició en bandes de l’espectre deconvolucionat de FTIR del domini ∆10ct‐PDZ3

adquirit en tampó KH2PO4 50 mM, pH 7.5, i comparació amb els valors del domini PDZ3.

PDZ3 25 °C

60 °C, 0 dies

60 °C, 4 dies

60 °C, 8 dies

60 °C, 16 dies


Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Girs‐ 1694 1 1694 1 1695 2 1695 2 1695 2


1683 2 1684 4 1684 5 1684 8 1685 4

1679 6 1676 2 1676 7 1677 4 1677 9

Girs‐ 1669 9 1670 17 1668 9 1668 13 1667 9

Loops / Girs‐ 1659 16 1658 11 1659 13 1658 9 1658 10

Hèlix‐α 1649 18 1648 16 1649 13 1648 14 1648 14


1640 24 1640 13 1640 15 1640 12 1640 11


1630 16 1631 15 1631 12 1631 13 1631 12

WL /Amiloide 1621 4 1620 17 1619 22 1619 22 1620 25


∆10ct‐PDZ3 25 °C

60 °C, 0 dies

60 °C, 4 dies

60 °C, 8 dies

60 °C, 16 dies


Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Centre (cm‐1)

Àrea (%)

Girs‐ 1692 2 1691 4 1694 2 1695 3 1694 4


1677 9 1683 12 1684 13 1684 16

1669 7 1679 10 1670 17 1676 7 1670 24

Girs‐ 1659 15 1668 8 1659 10 1667 15 1659 8

Loops / Girs‐ 1649 14 1659 13 1650 10 1659 7 1650 11

Hèlix‐α 1641 21 1649 10 1640 14 1651 13 1641 11


1631 22 1641 13 1631 8 1641 11 1631 8


1621 6 1631 11 1618 25 1631 12 1621 17

WL /Amiloide 1607 4 1619 29 1606 3 1618 16 1605 2


Alcontraripassaamblafulla‐βestable(atribuïdaalescadenesβ1iβ5),localitzada

a labandade1630 cm‐1, que incrementa clarament en la variant∆10ct‐PDZ3 (22%per

l’10ct‐PDZ3versusel14%enelPDZ3)(Figura4.9‐A/Taula4.4).Pertant,l’incrementde

labandade1630cm‐1ésdegudaal’estabilització,ipertant,disminuciódelacomponent

enfulla‐βflexible,a1640cm‐1.Aquestaestabilitzaciógeneraldelesfulles‐βpodriaserla

raó de que, malgrat la baixada de reversibilitat del desplegament de l’∆10ct‐PDZ3

(aproximadament del 10 %), l’estabilitat del domini 10ct‐PDZ3 no decreixi

dramàticamentrespecteelPDZ3sencer(ΔGN‐DPDZ3=‐39±6kJ·mol‐1,ΔGN‐D10ct‐PDZ3

=‐28±10kJ·mol‐1).

En el cas de l’∆10ct‐PDZ3, l’estat natiu conté un tant per cent de fulla‐β

WL/Amiloide, atribuïda a la banda de 1620 cm‐1, lleugerament superior que el domini


240

PDZ3 (Taula 4. 4), una característica que podria indicar unamajor tendència inicial del

domini∆10ct‐PDZ3perentraralaviaamiloide.Siguicomsigui,aquestvalornoésmassa

acurat, i la informació sobre el procés d’agregació a 60 °C hauria de clarificar aquesta

consideracióinicial.

4.2.1.2. EspectredeFTIRdelintermediarid’agregaciódel’∆10ct‐PDZ3.

Elscanvisconformacionalsdelavariant∆10ct‐PDZ3uncopincubadaa60°C,han

estatestudiatsdesprésdeserequilibradadurant5min,idesprésdeserincubadadurant

4,8,i16dies.

Després de 5 min a 60 °C, l’∆10ct‐PDZ3 mostra un increment de la regió que

correspon als loops/girs‐β, i aquest increment és progressivament major durant la

incubació(Figura4.9‐B/Taula4.4);perexemple,a25°Caquestabandarepresentael33

%de l’àrea total del espectre,mentreque als 16dies el valor ja arribar a serdel 52%

(Taula4.4).Pelquefaalacomponentenhèlix‐α,disminueixun4%desprésdelaprimera

incubacióperò s’incrementadesprésdels8dies sense recuperar el14% inicial.Aquest

patró de canvi conformacional de les hèlix‐α també es dóna en el domini PDZ3 però a

partirdels4diesd’incubació,irecuperanttotalmenteltantpercentals16dies(Taula4.

4).

Pelquefaalpercentatgedecomponent‐β,desprésd’incubardurant5min,canvia

deformadràstica.Totesduesfulles‐βnatives,laflexibleil’estable,esperdenafavordela

component en agregats‐β, la bandade1620 cm‐1, que creixdel 6 al 29%.En el domini

PDZ3sencer, la fulla‐βestableesmantémésomenysconstantal llargde totsels temps

d’incubació, i la component‐β flexible també decreix, però, de nou, ho fa a partir dels

quatredies.

Totil’importantaugmentdelabandaa1620cm‐1als5mind’incubació,assolintel

29%del’àreatotal,apartird’aquídisminueixprogressivamentafavordel’incrementen

loops i girs‐β, tal i com s’hamencionat anteriorment.Després de 16dies d’incubació, la

bandad’agregats‐βrepresentael17%del’espectre.

Aquestaràpidareorganitzaciófapensarque,l’estatintermediarimonomèricjaes

troba en conformació de fulla‐β compacta (banda a 1620 cm‐1), fent possible les

interaccionsintermolecularsquedonenllocalasevaassociacióioligomerització.


241

4.3. Interaccióhèlix‐α3i loopβ2‐β3ielseuefectesobre l’agregaciódeldomini

PDZ3.

A part de la variant ∆10ct‐PDZ3, s’ha realitzat un anàlisis mutacional sobre els

residus implicats en les interaccions entre el domini i l’hèlix‐α3, concretament les

interaccionsentre laLys355(β4) ielGlu401(α3),mutacióE401R, i l’establertaentreel

Glu334 (loop β2‐β3) i l’Arg399 (α3), mutació E334L/Q. També s’ha indagat sobre la

rellevància de la circularització, en forma d’anell de succinimida, del residu Asp332 a

travésdelesmutacionsD332G/P,aquestúltimemularial’efectedel’aspàrticcircularitzat.

4.3.1. EstructurasecundàriadelestatnatiudelsmutantsdePDZ3.

A25°Clesestructuressecundàriesirregulars,loopsigirs‐β,queessituenlaregió

de 1690‐1660 cm‐1, creixen clarament en els mutants localitzats al loop β2‐β3 (D332 i

E334), però no per aquells on s’hanmutat residus de l’hèlix‐α3 (E401R i10ct‐PDZ3)

(Figura 4. 10/Taula 4. 5). Això implica un cert grau de descompactació de l’estat natiu

degutal’alteraciódelaregiódelloopβ1‐β2.Pelquefaalabandadefulla‐βflexible(1640

cm‐1), disminueix en tots els mutants, mentre que la estable (1630 cm‐1), incrementa

lleugerament,totinoseruncanvitanobvicomenelcasdel’10ct‐PDZ3.Peraltrabanda,

lacomponentenagregats‐βdelsdiferentsmutantsésmoltsimilaraladelPDZ3(un3‐4%

del’àreaentotselscasos).

Figura 4. 10. Comparació dels principals components de l’espectre natiu de FTIR delsmutants del

dominiPDZ3,adquiritsentampóKH2PO450mM,pH7.5ia25°C.


242

‐ MutacióE401R(hèlix‐α3).

ElresiduGlu401éslocalitzaal’extremC‐terminaldel’hèlix‐α3;elfetdemutar‐lo

per un residu d’arginina implica la introducció de càrrega positiva, que permet la

interacció d’aquest amb l’últim grup carboxil de l’hèlix, disminuint el dipol elèctric del

motiu estructural i, com a conseqüència, aquest és estabilitzat. Per altra banda, aquesta

mutació trenca la interaccióentreelGlu334(de l’α3) i laLys355(de lacadena‐β4),que

desestabilitzaria lahèlix‐α.Elsdosefectesoposats resultenenunanul·la alteracióde la

componentenhèlix‐α,centradaa1650cm‐1(Figura4.10/Taula4.5).Encanvi,respectea

lafraccióenfulla‐β,lamutaciócausalasevaestabilització,incrementantlabandade1630

cm‐1aexpensesdelade1640cm‐1,deformasimilaralcasdel’10ct‐PDZ3.

‐ MutacióE334L/Q(loopβ2‐β3).

Les mutacions en el residu Glu334 causen un major contingut en estructures

secundàriesirregulars(1690‐1660cm‐1;39%i40%perE334LiE334Q,respectivament,

respecteel34%perPDZ3),aexpensesdelafraccióenfulla‐βflexible,quedisminueixmés

d’un20%(Figura4.10/Taula4.5).Aquestaugments’explicaperquèelGlu334estableix

unió amb l’Arg399 (hèlix‐α3), imutar‐lo implica lapèrduade la interacció i conseqüent

desestabilització del loop β2‐β3 (Camara‐Artigas et al. 2010). Les fraccions d’hèlix‐α i

d’agregats‐βesmantenenpràcticamentinalteradesrespecteelPDZ3.

‐ MutacióD332G/P(loopβ2‐β3).

LesmutacionsalresiduAsp332,situadaalloopβ2‐β3,causenelmajorincrement

enestructurasecundàriairregulard’entretotselsconstructesdePDZ3,sentun45%i42

%perD332GiD332P,respectivament,respecteel34%delPDZ3(Figura4.10/Taula4.

5).Especialment,augmenta la flexibilitatdel loopquans’introdueixunresidudeglicina.

L’anelldesuccinimida formatperaquestresiduenelPDZ3,quesemblaquedisminueixi

aquesta flexibilitat (Camara‐Artigas et al. 2010), no pot formar‐se espontàniament en

aquestsdosmutants,peròl’efecteésmimetitzatpelresidudeprolina.

Mutar l’Asp332 implica una lleugera reducció de la fracció en hèlix‐α (13 %

respecteel16%perPDZ3),perunapossibledesestabilitzaciódel’α3.

Labandadefulla‐βflexibledecreixperatotsdosmutants,un20%iun23%per

D332G i D332P, respectivament, respecte el 28% per PDZ3. Tot i això, la β‐estable es

mantéinalterada,sentl’estructurairregular(1690‐1660cm‐1)laqueesveuincrementada

(Figura4.10/Taula4.5).


243

Taula4.5.Descomposicióenbandesde l’espectredeconvolucionatdeFTIRdelsmutantsdeldomini

PDZ3adquiritentampóKH2PO450mM,pH7.5,icomparacióambelsvalorsdeldominiPDZ3.

PDZ3 E401R D332G D332P E334L E334Q

25 °C, 0 dies Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Girs‐β 1694 1 1692 3 1691 9 1691 7 1691 5 1691 6Fulla‐β anti. d’alta freqüència

1680 8 1680 8 1679 10 1679 10 1679 9 1679 9

Girs‐β 1669 9 1669 8 1668 9 1668 9 1668 9 1668 9Loops/Girs‐β 1659 16 1659 16 1659 16 1659 17 1659 17 1659 17Hèlix‐α 1650 16 1649 17 1649 13 1649 13 1649 15 1649 15Fulla‐β flexible/ Random coil

1640 28 1640 24 1641 20 1641 23 1641 24 1640 22

Fulla‐β anti. de baixa freqüència

1630 14 1631 16 1630 14 1630 14 1630 15 1630 15

WL/Amiloide 1620 4 1621 3 1621 4 1621 3 1621 3 1621 3Cadenes laterals 1606 4 1605 5 1605 5 1605 4 1605 4 1605 4

60 °C, 5 min Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)


1684 2

1676 9 1679 10 1678 11 1678 11 1679 10 1678 10Girs‐β 1669 7 1669 8 1668 9 1668 9 1668 9 1668 9Loops/Girs‐β 1659 15 1659 13 1659 14 1659 14 1659 13 1659 14Hèlix‐α 1649 16 1649 10 1648 10 1648 10 1649 10 1649 11Fulla‐β flexible/ Random coil

1640 19 1641 14 1641 14 1641 14 1641 14 1641 15


1631 16 1631 11 1630 11 1630 12 1630 11 1630 12



‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)


1679 12 1681 11 1683 6 1683 7 1682 11 1683 5


1640 13 1640 12 1640 10 1640 10 1640 13 1640 6


1631 13 1631 10 1631 11 1631 11 1630 11 1632 15



‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)


1683 12 1683 10 1683 11 1682 13 1683 10

1679 12 Girs‐β 1668 8 1670 19 1669 19 1670 20 1670 9 1669 16Loops/Girs‐β 1658 13 1659 10 1659 9 1659 9 1659 15 1659 10Hèlix‐α 1648 13 1650 8 1650 9 1650 8 1649 8 1650 10Fulla‐β flexible/ Random coil

1640 13 1641 15 1641 14 1641 15 1641 15 1641 14


1631 13 1631 7 1631 8 1631 7 1631 9 1631 9



244

PDZ3 E401R D332G D332P E334L E334Q


‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)

Centre (cm

‐1)

Àrea (%)


1680 10 1683 14 1683 13 1683 11 1682 10 1681 10


1640 11 1640 14 1641 15 1640 15 1640 10 1640 8


1630 18 1630 7 1631 6 1631 7 1631 14 1631 16


4.3.2. Estructura secundària del intermediari d’agregació delsmutants de

PDZ3.

Els canvis conformacionals dels diferents mutants del domini PDZ3, un cop

incubatsa60°C,hanestatestudiatsdesprésdeserequilibratsdurant5min,idesprésde

serincubatsdurant4,8,i16dies.

‐ MutacióE401R(hèlix‐α3).

A la mutació E401R, la regió corresponent a loops/girs‐β (1690‐1660 cm‐1) es

manté invariable fins als 8 dies d’incubació, quan es dóna un clar increment de la

component,iqueésmajorals16dies(Figura4.11/Taula4.5).

Figura4.11Evolució,enfunciódeltempsd’incubacióa60ºC,delsprincipalscomponentsdel’espectre

natiudeFTIRdelmutantPDZ3‐E401R,adquiritsentampóKH2PO450mM,pH7.5.

Labandade leshèlix‐α(1650cm‐1) ide fulles‐β(tan flexiblecomestable,1640 i

1630 cm‐1), disminueixen progressivament durant la incubació, a favor de la banda


245

d’agregats‐β.Aquestabanda,però,disminueixlleugeramentaperíodesd’incubacióllargs

(8i16dies),queésquanaugmentenlesestructuresirregularsjacomentades.

En aquest mutant, que a priori estabilitza la hèlix‐α3, sorprenentment la

disminueixdesprésdels5mina60°C(Figura4.11/Taula4.5).S’hadetenirencompte

quelamutacióevitalainteraccióentreelGlu401ilaLys355(alaβ4),pelqueesdedueix

que l’energia d’aquesta interacció ésmajor que l’energia que es guanya en disminuir el

dipolelèctricdel’hèlix‐α.Siguicomsigui,segueixelmateixcomportamentquelavariant

Δ10ct‐PDZ3,talicoms’haexplicatenapartatsanteriors.

‐ MutacióE334L/Q(loopβ2‐β3).

Els dos mutants de la posició Glu334, els E334L/Q (Figura 4. 12/Taula 4. 5),

segueixenuncomportamentsimilar.Laregióde loops/girs‐βdecreixenprogressivament

durantlaincubació,mentrequelabandad’hèlix‐αfluctuaalvoltantdelvalorobtinguta25

°C. Les bandes de fulla‐β flexible i estable, a 1640 i 1630 cm‐1, respectivament,

disminueixen durant la incubació, en concordança amb l’increment de la banda de

agregats‐β, a 1620 cm‐1. Tot i això, als 16 d’incubació, la fulla‐β estable tendeix a

recuperar‐secapalsvalorsinicials,especialmentenelcasdelmutantE334Q.

Figura 4. 12. Evolució, en funció del temps d’incubació a 60ºC, dels principals components de

l’espectre natiu de FTIR dels mutant PDZ3‐E334L/Q, adquirits en tampó KH2PO4 50 mM, pH 7.5.

‐ MutacióD332G/P(loopβ2‐β3).


246

Pel que fa al mutant D332G, és comporta de manera semblant als del residu

Glu334. La regió dels loops/girs‐β decreix progressivament durant la incubació,mentre

quelabandad’hèlix‐αfluctuaalvoltantdelvalorobtinguta25°C.Lesbandesdefulla‐β

flexible i estable, a 1640 i 1630 cm‐1, respectivament, disminueixen progressivament

durant la incubació.Labandadelsagregats‐β,a1620cm‐1, incrementasignificativament

als5mina60°C.ElmutantD332Ptambésegueixaquestatendència,malgratquelaregió

de loops/girs‐β tan sols varia als quatre dies d’incubació; que es mantinguin les

estructures irregulars pot ser degut a les restriccions conformacionals del residu de

prolina.Capdelsdosmutants,adiferènciadelsdelGlu334,recuperenpartdel’estructura

enfulla‐β,nilaestablenilaflexible(Figura4.13/Taula4.5).

Figura 4. 13. Evolució, en funció del temps d’incubació a 60 °C, dels principals components de

l’espectre natiu de FTIR dels mutants PDZ3‐D334G/P, adquirits en tampó KH2PO4 50 mM, pH 7.5.

4.4. Anàlisiscalorimètric(DSC)delmutantsdeldominiPDZ3.

Talicoms’hafetambeldominiPDZ3senceriel10ct‐PDZ3,peracadaundels

mutants s’han realitzat experiments deDSC.Aquests experiments i l’anàlisi de resultats

han estat desenvolupats pel Dr. Murciano‐Calles, J., de la Universitat de Granada

(Murciano‐Calles 2011).

ComparantelperfildeDSCdelsdiferentsmutants(Figura4.14),totsellsmostren

una major similitud amb el perfil del domini PDZ3 ja publicat (Murciano‐Calles et al.

2010), que no amb la variant 10ct‐PDZ3. Conseqüentment, les traces calorimètriques

delsmutantshanestatajustatsalmodeldetresestats(nN⇄In⇄nD)empratperalPDZ3

sencer, enlloc del model de quatre estats de l’10ct‐PDZ3. Amb excepció del mutant

E401R, l’ajust ha estat assolit amb una bona convergència, obtenint així els paràmetres


247

termodinàmics de l’equilibri d’associació, de l’estat natiu, i del desplegat, de lamateixa

maneraquepeldominiPDZ3(Murciano‐Callesetal.2010).

Figura4.14.Comparacióde lescorbesdeldesplegamenttèrmicdeldominiPDZ3ilessevesvariants

obtingudesperDSC.ImatgesextretesdeMurciano‐Calles2011.

EnelcasdelmutantE401R,noesvaobtenircapconvergènciaraonablemitjançant

elmodeldetresestats,pertant,esvaoptarperajustar‐losobreelnoumodeldequatre

estatsdescritperalavariant10ct‐PDZ3.

El conjunt de paràmetres termodinàmics obtinguts de les diferents variants del

dominiPDZ3,apartirdelesdadesdeDSCienfunciódesisegueixenunmodeldetreso

quatreestats,estrobenrecollitsalataulasegüent:

Taula4.6.ParàmetrestermodinàmicsdeldesplegamenttèrmicdeldominiPDZ3ilessevesvariants.

Lesdadeshanestatobtingudesapartirdel’anàlisideDSCambelmodeldetresoquatreestats,depenentdela

variant.DadesobtingudesperMurciano‐Calles,J..

Model de tres estats TU‐N

(ºC) ΔHU‐N(TU‐N) kJ∙mol‐1

ΔGU‐N(298) kJ∙mol‐1

TIn‐U (ºC)

ΔHIn‐U(TIn‐U) kJ∙mol‐1

ΔGIn‐U(343) kJ∙mol‐1

PDZ3 70.4 ± 0.5 335 ± 20 39 ± 6 79.2 ± 1.2 ‐130 ± 20 ‐25 ±5 D332G 70.1 ± 1.5 360 ± 40 33 ± 8 88.6 ± 2.0 ‐145 ± 40 ‐24 ± 7 D332P 71.6 ± 2.0 360 ± 25 33 ± 7 89.9 ± 2.0 ‐160 ± 30 ‐25 ± 5 E334L 67.4 ± 1.3 300 ± 10 (1‐3) 25 ± 4 96.0 ± 1.5 ‐145 ± 20 ‐24 ± 3 E334Q 70.1 ± 1.5 370 ± 25 32 ± 6 89.0 ± 1.5 ‐145 ± 20 ‐41 ± 10


248

Model de quatre estats

TI‐N (ºC)

ΔHI‐N

(TI‐N) kJ∙mol

‐1

ΔGI‐N

(298) kJ∙mol

‐1

TU‐I (ºC)

ΔHU‐I

(TU‐I) kJ∙mol

‐1

ΔGU‐I

(298) kJ∙mol

‐1

TIn‐I (ºC)

ΔHIn‐I

(TIn‐I) kJ∙mol

‐1

ΔGIn‐I

(343) kJ∙mol

‐1

ΔGU‐N

(298) kJ∙mol

‐1

Δ10ct‐PDZ3 51.6 ± 3 250 ± 20 28 ± 8 78.5 ± 3 215 ± 10 17 ± 6 124.6 ± 4 ‐135 ± 15 ‐27 ± 5 28 ± 10E401R 64.4 ± 3.5 315 ± 30 57 ± 10 87.5 ± 7 300 ± 25 35 ± 12 127.7 ± 4 ‐115 ± 20 ‐24 ± 6 81 ± 20

Al comparar els valorsdeΔG, sembla serque elsmutants a lesposicionsE332 i

D334 presenten estabilitats similars al domini PDZ3 però tenen unamajor tendència a

l’agregació, tal i com s’ha observat per FTIR. Pel que fa a lamutació E401R, clarament

presenta una estabilitatmolt superior al PDZ3 i resta de variants, però no sembla que

tinguiunamajortendènciaal’agregació,segonss’extraudelanàlisiperFTIR.


249

5. DISCUSSIÓ.

5.1. Lafulla‐βflexibledónallocal’agregaciódelPDZ3.

Labandad’amidaI’del’espectredeFTIR,eslocalitzaentreels1700i1600cm‐1i,

bàsicament,sorgeixdelavibraciódelenllaçC=Odel’esqueletpeptídic.L’assignaciódeles

diferents estructures secundàries dins la regió d’amida I’ resulta complicada degut a

l’elevada sensibilitat de la radiació infraroja davant de factors estructurals i ambientals

(Arrondoetal.2003).L’assignacióméscompromesaésladelsgirs‐β,ondiferentsbandes

es localitzendins laregiód’entre1700 i1660cm‐1.Elspicscentratsa1670 i1660cm‐1

són, generalment, assignats a elements d’estructura secundària irregulars, com ara els

girs‐β (Byler, Susi 1986), tot i que els loops estables també contribueixen a la bandade

1660cm‐1(Heredia,DeLasRivas2003).Permésdificultat,labandaproperaals1680cm‐1

és assignada a la component en fulla‐β antiparal·lela d’alta freqüència, la qual no és

detecta en estructures en fulla‐β paral·lela ((Chirgadze, Nevskaya 1976, Goormaghtigh,

Cabiaux&Ruysschaert1994,Zandomeneghietal.2004).Amés,tambédinsaquestaregió

de1700‐1660cm‐1,labandade1690cm‐1,quasinegligible,haestatatribuïdaalafulla‐β

paral·lela(Chirgadze,Nevskaya1976),totiquealgunsautorslaidentifiquencomagirs‐β

(Olingeretal.1986).

Pelquefaalaregióde1655‐1630cm‐1,elpicalvoltantde1650cm‐1ésindicatiu

de contingut en hèlix‐α, mentre que els pics a 1645‐1640 cm‐1 i 1640‐1630 cm‐1,

corresponentarandomcoilifulla‐β,respectivament(Arrondo,Goni1999).

Com a regla general, un increment en interaccions d’hidrogen resulta en un

desplaçament cap números d’onamés baixos, el qual explicaria perquè els agregats de

tipusWLcontenenpicsde fulla‐βcentradesa1630‐1620cm.1, ielsagregatsamiloidesa

1620‐1615cm‐1(Zandomeneghietal.2004).L’espectredel’estatintermediarideldomini

PDZ3,a60°C,mostraunaugmentdel18%delabandade1620cm‐1,allímitentrelaregió

WL i l’amiloide (Figura 4. 1/Taula 4. 1). Aquests dos tipus d’agregats‐β segueixen vies

d’agregació diferents, les fibres amiloides segueixen una cinètica depenent de nucleació

(sigmoïdal,cooperativa),mentrequelesfibresWLnoensóndependents,sinóquecreixen

exponencialmentideformanocooperativa(Gosaletal.2005).Prèviament,s’hareportat

queeldominiPDZ3uneixelfluoròforsThTiANSdurantlacinèticad’agregació,iquehofa

de manera exponencial (Murciano‐Calles et al. 2010). Conseqüentment, el procés no

requereixd’unnucliprèviamentformat,estable i jaorganitzatenestructura‐βordenada.

PeracabardediscernirsilacomponentdeFTIRenfulla‐βa1620cm‐1corresponafibres

WL o amiloides, s’han obtingut imatges per TEM (Figura 4. 4). La presència de fibres


250

corbadesirelativamentcurtesdefinitivamentconfirmaqueelsagregatsdeldominiPDZ3

sónfibresWL.

Desafortunadament,laconcentraciódeproteïnailatemperaturaempradaperals

assajosdecitotoxicitathandeserdiferentsdelsusatsperal’estudid’agregacióperFTIR.

Tenint en compte que el procés d’agregació del domini PDZ3 ha estat descrit com a

reversible (Murciano‐Calles et al. 2010), és important anar en compte a l’hora

d’interpretarelsresultatsdecultiuscel·lulars(Figura4.5).Alescondicionsassajades,la

via d’agregació pot haver‐se desplaçat cap a estadis inicials de l’agregació, com per

exemplel’oligòmertrimèric,quaneldominiagregata60°Césdiluït10vegadesalscultius

i incubat durant 24 h a 37 °C. Tot i això, és important determinar si els precursors de

l’agregacióWLdeldominiPDZ3sóncitotòxicsono,pelfetdequealtresestatsoligomèrics

hanestatdescritscomaespèciescitotòxiquesendeterminadesproteïnesambtendènciaa

l’agregació(Chiti,Dobson2006),comtambénotòxiquesperaaltres(Marin‐Arganyetal.

2011).Amés,lacitotoxicitatdelsagregatsdePDZ3incrementaamesuraqueaugmentael

temps d’incubació a 60 °C previ als cultius. Per tant, sembla que la via d’agregació del

dominiés, tansols,parcialment reversible, iqueaquesta reversibilitatdecreixamesura

queavançaelprocésd’agregaciócapaestadis finals.De fet, s’hademostratprèviament,

queelsagregatsformatsdurantmésde16dies,esmantenenensoluciótotidisminuirla

temperaturaals25°C(Murciano‐Callesetal.2010).

5.2. Importànciadelacadena‐β3enlareorganitzaciódelafulla‐βflexible.

ElsexperimentsdeFTIRa25°C(Figura4.1/Taula4.1)revelenuncontinguten

hèlix‐α inferior a aquell determinat a partir de les dades cristal·logràfiques (codi PDB

3K82)(Camara‐Artigasetal.2010).L’explicaciómésplausibleaaquestadiferenciaseria

que l’hèlix‐α1, empaquetada contra la fulla‐β flexible, pateix una desorganització en

solució. Així, la disminució de la fracció d’hèlix‐α després de la incubació a 60 °C seria

degudaalapèrduadel’hèlix‐α1,mentrequel’α2il’α3esmantindrienintactesenl’estat

intermediari. Aquest fet també s’explica amb l’espectre de correlació de 1H‐15N, el qual

mostra que part dels residus que es mantenen intactes en funció de la temperatura,

estableixencontactesdirectesambl’hèlix‐α2(Figura4.6).

Talicoms’hadescritmésamunt,labandad’infraroigde1660cm‐1corresponala

fracciódegirs‐βiloops,idecreixalincubara60°C(Figura4.1).EldominiPDZ3conté4

regionsloopmajorsde4residus,elloopβ1‐β2,elβ2‐β3,l’α1‐β4,ielloopβ4‐α2.Elsloops

β2‐β3iα1‐β4podrienserelsresponsablesdeladisminucióde labandadeFTIRa1660

cm‐1, ja que es troben localitzats dins la regió de la molècula que és flexible i que es

desorganitzadurantl’agregació,d’acordambelsexperimentsdeHSQC‐RMN(Figura4.6).


251

El loopβ1‐β2estrobapropera la fulla‐β formadaper lescadenesestablesβ1 iβ5,però

comquelacadena‐β2pateixcertgraudedesorganització,esfadifícildiscernirsiaquest

looptambéparticipaadisminuirlabandade1660cm‐1ono.Apart,elloopβ4‐α2estroba

empaquetat contra l’α2, i conté aquells residusqueesmantenenconformacionalment, a

part dels de les cadenes β1 i β5, i que interaccionen amb l’α2, per tant, és evident que

aquestloopmantélasevaconformaciónativa.

Pelquefaal’algoritmeTANGO,empratperadeterminarlesregionsambtendència

a l’agregació (Fernandez‐Escamilla et al. 2004), el domini PDZ3 mostra una tendència

pràcticamentnul·laentoteldominiambexcepciódelsresidus335‐344(queformenpart

delmotiusestructuralsβ3‐α1),idelsresidus384‐392(localitzatsalacadenaβ5)(Figura

4.14‐A).

Figura4.15.AnàlisisperTANGOdelesregionspropensesal’agregaciódeldominiPDZ3.A)Estructura

secundària i regions amb tendència a l’agregació. La regió dels residus 335‐344 (β3‐α1) és marcada en

vermell,mentreque la regiódels residus384‐392 (β5) ésmarcada en taronja. B)Representaciódelmodel

tridimensional de l’estructura del domini PDZ3 (codi PDB 3K82), on es mostren les dues interfícies amb

tendència a l’agregació. Adopten una estructura en fulla‐β i es localitzen en cares oposades de l’estructura

globular.Esrepresententrespuntsdevistadiferentsdelamolècula,rotats90°C.

Ladisposiciótridimensionald’aquestsresidusdinsl’estructuraresoltaapartirde

la difracció de raigs‐X (Camara‐Artigas et al. 2010),mostren dues superfícies principals

localitzadesencaresoposadesal’estructuraglobular(Figura4.14‐B),facilitantquecada

monòmerinteractuïambaltresdosaddicionals,formanteltrímeroligomèricprecursorde

l’agregació(Murciano‐Callesetal.2010).Justament,laregióβ3iα1,queéslaquepresenta


252

més tendència a agregar, forma part de la fulla‐β flexible que es reorganitza durant la

fibril·lació, tal i com s’ha resolt anteriorment. Però pel que fa a la regió de la cadena

superficialβ5,totiserpreditaperTANGO,mantélaconformaciónativadurantl’agregació.

Aquesta contradicció s’explicapel fetdeque agregacióno implicadirectament formació

amiloide (Rousseau, Schymkowitz & Serrano 2006), i TANGO reconeix patrons amb

tendència a l’agregació amorfa, no amiloide ni fibril·lar. En canvi, l’algoritme PASTA

(Trovato et al. 2006), que prediu estructures involucrades en la formació d’agregats

ordenatsenfulla‐βcreuada,tansolsreconeixlaregiódefulla‐βflexiblecomaprecursora

del’agregació,d’acordambelsnostresresultatsobtinguts.

Un altre dada que corrobora que la fulla‐β flexible es la que pateix una

reorganització estructural que dóna lloc al intermediari ric en estructura‐β, és que la

presènciadel pèptid lligandKKETAV, el demajor afinitat pel dominiPDZ3 (Kd=1μM),

afectal’estabilitatdelestatnatiu,perònoladelintermediarid’agregació(Murciano‐Calles

et al. 2010). Fet que s’explica perquè la butxaca d’unió a lligands, que es localitza a la

cavitatentrelacadena‐β2il’hèlix‐α2,esveupertorbadadurantlaviad’agregació.Amés,

el loop β2‐β3 juga un paper important en la unió de pèptids (Mostarda, Gfeller & Rao

2012),itambéesveualteratdegutaladesorganitzaciódelescadenesβ2iβ3.

5.3. Roldel’hèlix‐α3enelplegamentil’agregaciódeldominiPDZ3.

Una comprensiva interpretació dels resultats obtinguts d’estudiar la via de

plegament i d’agregació de la variant10ct‐PDZ3, emprant com a referència el domini

PDZ3 sencer, on s’inclou l’hèlix‐α3 al extrem C‐terminal, ens permet confirmar que

aquestahèlixésunelementreguladordelplegamentdeldominiPDZ3.

Ladeleciódel’hèlix‐α3noevita lareorganitzacióquegenera l’estat intermediari,

prèviament detectat en el PDZ3 (Murciano‐Calles et al. 2010). Però, tot i que l’anàlisi

calorimètric (DSC) mostra una estequiometria trimèrica en els estadis inicials de

l’associació,talicomhofaelPDZ3,enelcasdel’10ct‐PDZ3aquestaassociaciótrimèrica

no s’ha pogut detectar ni per cromatografia d’exclusió molecular, ni per DLS, on es

detectenpartículesdegrandàriasuperior(Murciano‐Calles2011).Aquestacaracterística

podriaserconseqüènciadelanoreversibilitatdelsagregatsdel’10ct‐PDZ3,mentreque

la presencia de l’α3 genera un cert grau de reversibilitat dels estats oligomèrics

(Murciano‐Callesetal.2010).Així,laràpidainter‐associaciódelespartículestrimèriques

del10ct‐PDZ3podriaserlaraódelasevairreversibilitat.

En tot cas, totes les evidències que indiquen que la supressió de l’hèlix‐α3

estabilitza l’intermediari a l’equilibri, han estat confirmades per la major tendència a


253

formaragregats fibril·larsperpartde l’10ct‐PDZ3, en comparació ambelPDZ3 sencer

(Taula4.4).Lahèlix‐α3 interactuaambresidusde la regióβ2‐β3 (Camara‐Artigaset al.

2010),laqualhaestatpreditaperTANGOiPastacomapropensaal’agregacióenfulla‐β

ordenada (Figura 4. 15). Per tant, l’absència de l’α3 incrementa l’exposició al solvent

d’aquesta regió, el qual facilita el desplegament i l’auto‐associació dels dominis.

L’estabilitatdelesespèciesintermediàries,però,esveudisminuïdaavalorsdepHpersota

de 3.0, fet que dóna importància a les regions involucrades en la formació d’oligòmers

(Murciano‐Callesetal.2011).Enaquestsentit,laprotonaciódelsresidusGlu/Aspsemblen

serelsresponsablesd’aquestadesestabilització.

ElsespectresdeFTIRestrobenenplenaconsonànciaamblaràpidaagregaciódel

domini10ct‐PDZ3,itambémostrenqueésdegutalescomponentsenfulla‐βnativadel

domini, tant la flexible com l’estable, les quals es perden a favor de la component en

agregats‐β (Taula 4. 4). Fet que es confirma amb els resultats de l’algoritme TANGO, el

qualrevelaqueelsresidus335‐344(regió3)i384‐392(regió5)sónelsméspropensos

aagregar.EnelcasdelPDZ3sencer,lahèlix‐α3protegeix,encertamanera,latendènciaa

l’agregaciódeldomini,mantenintlaintegritatdelafulla‐βnativaformadaperlescadenes

β1 i β5. En el cas de 10ct‐PDZ3, la cadena β5 passa a ser l’extrem C‐terminal de la

molècula, empitjorant l’empaquetament global del domini, i llavors, les cadenes β1 i β5

tambéesdevenenprecursoresdel’agregació.

5.4. Residusimplicatsenlesinteraccionsentrel’hèlix‐α3ieldominiPDZ3.

Apartdelpaperreguladorde l’hèlix‐αaddicionalsobreelplegamentdeldomini,

també és un element regulador al·lostèric d’unió a pèptids lligands, tal i com ha estat

descritprèviament (Camara‐Artigas et al. 2010,Mostarda,Gfeller&Rao2012).Aquesta

regulacióadistànciaéspossiblegràciesalfortempaquetamentdel’hèlix‐α3amblaregió

β2‐β3,moltproperaalabutxacad’unióapèptidsiqueinteraccionaambellsdirectament.

Lesinteraccionsentrel’Arg399(α3)ielGlu334(loop2‐3),ielGlu401(α3)ilaLys355

(β4), empaqueten l’hèlix‐α3 contra el domini, i és la primera interacció la que està

directamentimplicadaenlaregulaciódel’afinitat.Amés,l’anelldesuccinimidaformatpel

residuAsp332(loopβ2‐β3), jugaunpaper importantsobre la flexibilitatd’aquest loop, i

indirectamentsobrel’empaquetamentdelesduesregions.

LamutaciódelresiduGlu334(E334L/Q)trencalainteraccióambl’Arg399,i,tali

coms’havistperFTIR,esveuenincrementadeslescomponentsenestructurasecundària

irregular(1690‐1660cm‐1)aexpensesde ladesestabilitzacióde la fulla‐β flexible(1640

cm‐1)(Figura4.10/Taula4.5).DelamateixamanerapassaamblesmutacionsD332G/P,


254

queevitenlaformaciódel’anelldesuccinimida.Peraltrabanda,almutarelresiduGlu401

(E401R) les fulles‐βnoesveuenalterades.Això remarca la importànciade la interacció

entrel’hèlix‐α3ilescadenesβ2iβ3,tantanivelld’afinitatcomd’estabilitzacióglobaldela

molècula, disminuint la tendència a l’agregació. Per tant, trencar les interaccions entre

aquestesduesregionsdeldominidonariallocaunadesestabilitzaciódelaregiódelPDZ3

ambtendènciaal’agregació,lescadenesβ2,β3iβ4.

Pelque faa la formacióde l’estat intermediariapartirdemonòmersmutants,el

canviprincipalentotselsmutantsrespecteelPDZ3,éselpromiscuisignificantincrement

de la banda a 1620 cm‐1 just després dels 5 min a 60 °C (Figura 4. 16/Taula 4. 5),

corresponentalsagregats‐βordenats,principalmentenelcasdel’E401R,quasisemblant

al’10ct‐PDZ3(un26%i29%,respectivament,versusel12%delPDZ3).

Figura 4. 16.Evolució, en funció del temps d’incubació a 60 °C,de la banda de 1620 cm.1 de FTIR,

corresponentalsagregats‐β,deldominiPDZ3ilessevesvariants.

En concordança, aquest increment es troba relacionat amb la reorganització

conformacional que pateix la fulla‐β nativa del domini durant la via d’agregació. En

general,elsmutantslocalitzatsal’hèlix‐α3(l’10ct‐PDZ3ielE401R)sónméspropensosa

l’agregació,totiqueals16diesd’incubacióeltantpercentdelabandaa1620cm‐1ésla

mateixaquealdominiPDZ3,un18%(Taula4.5).Elsmutants,D332G/PiE334L/Q,tots

quatre situats dins la regió del domini amb tendència a l’agregació,mostren unamajor

tendènciaqueelPDZ3justdesprésdelaincubacióinicial,ilamantenenalllargdetemps

representantel25%del’àrea,aproximadament.Endefinitiva,delsresultatsdeFTIRse’n

extreuquetotselsmutantsdonenllocaproteïnesambméstendènciaal’agregacióqueel

dominiPDZ3.

VI. CONCLUSIONSGENERALS.

VI‐ConclusionsGenerals Capítol1

257

Aquest treball demostra la importància dels estats intermediaris a l’espai

conformacionaldelesproteïnes,lasevarelacióamblesmalaltiesconformacionalsi

l’aplicabilitatdelseuconeixementeneldesenvolupamentdeteràpiesefectives.

‐ Capítol1:

S’ha optimitzat l’obtenció d’un fragment d’anticòs recombinant específic contra

oligòmers d’Aβ1‐42, l’scFv‐h3D6, a partir del replegament de la fracció insoluble

obtinguda dins del sistema d’expressió d’E. coliOrigami2(DE3) i la proteïna de

fusiótrx,posteriormenteliminadaperlaproteasaespecíficaTEV.

L’scFv‐h3D6conté4residuscisteïna,dosperdomini,elsqualspodenformarfinsa

8 combinacions de ponts disulfur diferents, a banda de la nativa. Les formes

scrambledmodifiqueninteraccionsintra‐domini,alterendràsticamentl’estabilitat

globaldelamolècula,iaugmentenlatendènciaal’agregaciódel’scFv‐h3D6.

Percromatografiadebescanvicatiònic,s’hapogutseparar la formanativade les

scrambled.

Les estructures secundària i terciària de l’scFv‐h3D6, estudiades per CD,

fluorescènciadetriptòfaniFTIR,segonselcas,mostraeltípicplegamenttot‐βd’Ig,

i on els residus triptòfan conservats dels nuclis hidrofòbics contribueixen en ell

donantllocalsespectresparticularsdelsscFv.

Sota pertorbació tèrmica, l’scFv‐h3D6 entra a la via d’agregació en fulla‐β

ordenada,independentdeconcentracióiirreversible,laqualestàpobladaperun

intermediariricenestructura‐β.

Per FTIR i TEM, s’ha comprovat que l’agregació per temperatura de l’scFv‐h3D6

esdevé en la formació de fibres WL, mentre que el pèptid Aβ1‐42 causant de

l’Alzheimerdónallocafibresamiloides.

Els assajos per MTT, mostren que els oligòmers del pèptid Aβ1‐42, induïts per

temperatura,redueixenlaviabilitatdelcultiucel·lulardeneuroblastomahumàSH‐

SY5Yfinsaun60%.

Lacoincubaciódel’scFv‐h3D6ambelpèptidAβ1‐42anul·laelseuefectetòxicsobre

lescèl·lulesSH‐SY5Yd’unamaneradepenentdeconcentració.

En condicions natives, l’scFv‐h3D6 inhibeix la formació de fibres amiloides i la

citotoxicitat del pèptidAβ1‐42mitjançant la retiradadels oligòmers d’Aβ1‐42 de la

viaamiloidecapalaviaWL.


258

Les fibres WL formades pel complex Aβ1‐42:scFv‐h3D6 són cinètica i

termodinàmicamentmés favorablesque lesdel l’scFv‐h3D6sol, jaqueapareixen

sensenecessitatdetractamentambtemperatura,ienpresènciadeDMSO.

La descripció del mecanisme pel qual l’scFv‐h3D6 actua contra la toxicitat del

pèptid Aβ1‐42 obre una nova via per a millorar, en un futur, el seu potencial

terapèutic.


259

‐ Capítol2:

S’haobtingutunmodeltridimensionaldelfragmentd’anticòsscFv‐h3D6específic

contra el pèptid Aβ1‐42. El pdb motlle utilitzat, l’scFv 2GHW, té un grau global

d’homologiaalvoltantdel94%amblanostraseqüència,característicaquefaque

elmodelsiguimoltfiable.

El 6% de les mutacions no conservatives es troben en els CDR, les regions de

reconeixementdelantigen.

La manca de resolució estructural del connector, degut a la seva elevada

flexibilitat, ha fet necessari refinar la seva estructura 3D. Aquest fet implica una

reestructuraciódelarestadelamolècula,principalmentdeldominiVH,elmenys

estableenlamajoriadelesseqüènciesdel’alineament,perònoenl’scFv‐h3D6.

Pel que fa a la classificació dels CDRs, tan sols el VH‐CDR1 s’allunyadel consens

general,perlasevallargàriailocalitzacióeneldomini,iguanyaimportànciaenla

funciód’interaccióambl’antigen.

Elmodelfinalcontéun51%defulla‐β,un29%degirs‐β,iun20%deloops.Cada

domini adopta un plegament de tipus barril‐β amb un pont disulfur, en

concordançaambelplegamentdetipusimmunoglobulina.

ElsCDRsd’ambdósdominiseslocalitzenalamateixacaradel’estructuraglobular,

oposats al connector, i exposats al solvent; una disposició òptima per a unir

l’antigeniassolirlamàximaestabilitatdelamolècula.

L’obtenciódelsvalorsdel’exposiciódelresidusalsolvent,laprediccióderegions

amb tendència a l’agregació, i l’alineament múltiple de seqüències, ha permès

extreurelainformaciónecessàriaperaunredissenyracionaldelamolècula,iaixí

millorar‐nel’estabilitatidisminuirlatendènciaal’agregació.

S’hanidentificat4regionsdel’scFv‐h3D6ambfortatendènciaal’agregació,totes

elles molt enterrades al nucli hidrofòbic de la molècula, de les quals s’han

dissenyat6mutantspuntualsperadisminuir latendènciaa l’agregaciódelscFv‐

h3D6.

Lesmutacionsalnuclihidrofòbicaugmenten la tendènciaa l’agregacióde l’scFv‐

h3D6,confirmantladificultatdemutarresidusenterratsdinslamolècula.

L’extremC‐terminaldelamolècula,elresiduVL‐K107,segueixformantpartdela

cadena‐β G i estableix interaccions que desestabilitzen la cadena, de forma que

s’han dissenyat 3 mutants per tal d’elongar aquest extrem i augmentar‐ne

l’estabilitat.


260

L’elongació de l’extrem C‐terminal, mutants VL‐el‐R108G VL‐el‐R108 i VL‐el‐

R108T109, augmenta l’estabilitat termodinàmica i disminueix la tendència a

l’agregaciódel’scFv‐h3D6.

L’obtenció d’un model tridimensional de l’scFv‐h3D6, per homologia de

seqüències,hapermèsferunredissenyracionaldelamolèculapertaldemillorar‐

ne la seva estabilitat, disminuir la tendència a l’agregació, augmentar la seva

producció, i disminuir la dosi efectiva ja demostrada en ratolins model

d’Alzheimer.


261

‐ Capítol3:

L’AL‐12, un domini variable d’Ig procedent d’una pacient amb Amiloïdosi de

cadenalleugera,aixícom4mutantsrestauratius,hanestatobtingutsipurificatsde

lafraccióperiplasmàticad’E.coli,excepteelmutantH32Yquehaestatpurificatde

lafraccióinsoluble,degutalasevamajortendènciaal’agregació.

EldominiAL‐12adoptaunplegamentenbarril‐β típicd’immunoglobulina,onel

residuTrp35altamentconservatcontribueixenelespectredeCDambunmínim

d’el·lipticitataddicional.

Elplegamentnatiudel’AL‐12ésreversibleanivelld’estructurasecundàriamentre

quelaterciàrianorecuperal’estatnatiu.

Ladesnaturalitzaciótèrmica,seguidaperCDifluorescènciadelresiduTrp35,dóna

llocal’agregaciódelaproteïna,laqualpateixunatransicióconformacionalones

formaunestatintermediariprecursordel’agregaciódetipus‐β.PerFTIRs’observa

queaquestintermediarijapresentaunaconformaciósimilaraladel’estatagregat

final.

Ladesnaturalitzacióquímica,mitjançanturea,dónallocaldesplegamenttotaldel

dominiseguintunprocésdedosestats,sensepoblarcapintermediaridereacció.

Les mutacions restauratives, cap a la línia germinal i menys amiloidogènica кI

O18/O8, perden gran part de la reversibilitat observada en l’AL‐12, estabilitzen

l’intermediarid’agregació, idesvien laviadeplegament capa laviade formació

d’agregats‐βmésestables.

Capdelesmutacionspuntualsrecuperal’estabilitattermodinàmicadelaproteïna

germinal кI O18/O8, si no al contrari, totes elles han estat desestabilitzadores

respectel’AL‐12.

LadesestabilitzaciódeldominiAL‐12varelacionadaambunamajor tendènciaa

l’agregació,talicoms’observaalescorbesdedesnaturalitzaciótèrmica,seguides

perCDifluorescènciadetriptòfan.

Larestauracióderesiduspuntualsdel’AL‐12capalalíniagerminalкIO18/O8,no

implicaelretornde lespropietatsconformacionals i termodinàmiquesgerminals

aldominiamiloidogènic i,pertant,és improbablequeunaúnicamutaciósigui la

causadequeundominiVLesdevinguiamiloidogènicicausantdelamalaltia.


263

‐ Capítol4:

LacorbadedesnaturalitzaciótèrmicadeldominiPSD95‐PDZ3segueixunareacció

dedosestatsonespoblaunestatintermediaritrimèricricenestructura‐β,quees

trobaforadelaviadeplegamentdeldominiiquedónallocalaformaciódefibres

reversiblesinodependentsdeconcentració.

PerTEMiFTIR,s’hademostratqueelsagregats‐βdeldominiPDZ3sónde tipus

WL; i lesmicrografiesmostrenque lasevareversibilitatdecreixamesuraque la

reaccióéstrobamésdesplaçadacapalaformaciód’agregatsmadurs.

Lainfluènciadelaforçaiònicasobreelprocésd’agregaciódeldominiPDZaccelera

lareorganitzaciódelesfulles‐β,perònocanviaeltipusdeviad’agregació.

Els assajos de toxicitat en la línia cel·lular de neuroblastoma humà SH‐SY5Y,

mostren que els agregats WL del domini PDZ3 són citotòxics, i que aquesta

augmentaamesuraquelaviad’agregacióestrobamésavançada.

Lesduesregionsamb tendènciaa l’agregació, les cadenesβ3 iβ5,es trobena la

superfície i en cares oposades de l’estructura globular, facilitant la formació de

l’oligòmertrimèricprecursordel’agregació.

PerFTIR,s’hadeterminatqueunadelesduesfulles‐βdeldomini,concretamentla

mésflexible,éslaprecursoradelareestructuraciódel’estatnatiucapalaformació

de l’intermediari que porta a la formació de fibres‐β ordenades, mentre que la

restad’estructuressecundàriesrestenpràcticamentinalterades.

Per RMN, s’ha identificat la cadena β3 com la principal responsable del canvi

conformacional que pateix la proteïna i que l’arrossega cap a la via d’agregació.

D’aquestamanera, la fullaβ formadaper lescadenesβ2,β3 iβ4ésmolt flexible,

mentrequelaformadaperlescadenesβ1iβ5ésmésestable.

Elfetquelabutxacad’unióalligands,queeslocalitzaalacavitatentrelacadena‐

β2i l’hèlix‐α2,esvegipertorbadadurant laviad’agregacióexplicaperquè l’estat

intermediarinoésfuncional.

La deleció de l’hèlix‐α3, reguladora al·lostèrica de l’afinitat del domini, afecta el

procés de plegament del domini PDZ3, de forma que apareix un intermediari

monomèric a l’equilibri previ a la seva associació, seguint un procés de quatre

estats.

L’absència de l’hèlix‐α3 estabilitza l’estat l’intermediari a l’equilibri i incrementa

l’exposicióalsolventdelesduesregionsambtendènciaal’agregació.Aixòfacilita

eldesplegamentil’auto‐associaciódelsdominis,i,pertant,augmentalatendència

aformaragregatsfibril·larsperpartdeldomini.


264

Lapèrduad’interaccióentrel’hèlix‐α3ielloopβ2iβ3,importantperalaregulació

de l’afinitat i l’empaquetamentdeldomini,dóna llocaunadesestabilitzacióde la

regió del PDZ3 amb tendència a l’agregació. Per tant, els mutants d’aquesta

interacciógenerenproteïnesambméstendènciaal’agregacióqueeldominiPDZ3.

ElmutantE401R, situata lahèlix‐α3, segueixunprocésdeplegamentdequatre

estats,igualquelavariantΔ10ct‐PDZ3,sensel’hèlix‐α3.Encanvi,elsmutantsdela

regiódelloopβ2‐β3mantenenelmecanismedetresestatsdeldominiPDZ3.

L’eliminaciódelahèlix‐α3.obédelsseuscontactesamblarestadeldomini,regula

negativamentlacapacitatd’uniódelesproteïneslligand.

L’anàlisi de l’equilibri i l’agregació del domini PDZ3 aportarà pistes sobre si el

plegament de tres estats i l’agregació de tipusWL parcialment reversible és un

comportamentgeneraldinslagranfamíliadedominisPDZ.

VII. BIBLIOGRAFIA.

VII‐Bibliografia

267

Abraham,R.S.,Geyer,S.M.,Price‐Troska,T.L.,Allmer,C.,Kyle,R.A.,Gertz,M.A.&Fonseca,R.2003, "Immunoglobulin light chain variable (V) region genes influence clinicalpresentationandoutcomeinlightchain‐associatedamyloidosis(AL)",Blood,vol.101,no.10,pp.3801‐3808.

Ahmed,M.,Davis,J.,Aucoin,D.,Sato,T.,Ahuja,S.,Aimoto,S.,Elliott,J.I.,VanNostrand,W.E.& Smith, S.O. 2010, "Structural conversion of neurotoxic amyloid‐beta(1‐42)oligomerstofibrils",Naturestructural&molecularbiology,vol.17,no.5,pp.561‐567.

Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman,D.J.1990,"Basiclocalalignmentsearchtool",JournalofMolecularBiology,vol.215,no.3,pp.403‐410.

Anfinsen, C.B., Harber, E., Sela, M. & White, F.H.,Jr 1961, "The kinetics of formation ofnativeribonucleaseduringoxidationofthereducedpolypeptidechain",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.47,pp.1309‐1314.

Arbel, M. & Solomon, B. 2007, "Immunotherapy for Alzheimer's disease: attackingamyloid‐betafromtheinside",Trendsinimmunology,vol.28,no.12,pp.511‐513.

Arndt,K.M.,Muller,K.M.&Pluckthun,A.1998,"Factorsinfluencingthedimertomonomertransitionofanantibodysingle‐chainFvfragment",Biochemistry,vol.37,no.37,pp.12918‐12926.

Arrondo, J.L., Echabe, I., Iloro, I., Hernando, M.A., de la Cruz, F. & Goni, F.M. 2003, "Abacterial TrwC relaxase domain contains a thermally stable alpha‐helical core",JournalofBacteriology,vol.185,no.14,pp.4226‐4232.

Arrondo,J.L.&Goni,F.M.1999,"Structureanddynamicsofmembraneproteinsasstudiedbyinfraredspectroscopy",Progressinbiophysicsandmolecularbiology,vol.72,no.4,pp.367‐405.

Arrondo, J.L., Muga, A., Castresana, J. & Goni, F.M. 1993, "Quantitative studies of thestructure of proteins in solution by Fourier‐transform infrared spectroscopy",Progressinbiophysicsandmolecularbiology,vol.59,no.1,pp.23‐56.

Bacskai,B.J.,Kajdasz,S.T.,McLellan,M.E.,Games,D.,Seubert,P.,Schenk,D.&Hyman,B.T.2002, "Non‐Fc‐mediated mechanisms are involved in clearance of amyloid‐beta invivo by immunotherapy", The Journal of neuroscience : the official journal of theSocietyforNeuroscience,vol.22,no.18,pp.7873‐7878.

Baden,E.M.,Owen,B.A.,Peterson,F.C.,Volkman,B.F.,Ramirez‐Alvarado,M.&Thompson,J.R.2008a,"Altereddimerinterfacedecreasesstabilityinanamyloidogenicprotein",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.283,no.23,pp.15853‐15860.

Baden,E.M.,Randles,E.G.,Aboagye,A.K.,Thompson, J.R.&Ramirez‐Alvarado,M. 2008b,"Structural insights into the role of mutations in amyloidogenesis", The Journal ofbiologicalchemistry,vol.283,no.45,pp.30950‐30956.

Baldwin,R.L.1989,"Howdoesproteinfoldinggetstarted?",Trendsinbiochemicalsciences,vol.14,no.7,pp.291‐294.

VII‐Bibliografia

268

Bard,F.,Cannon,C.,Barbour,R.,Burke,R.L.,Games,D.,Grajeda,H.,Guido,T.,Hu,K.,Huang,J., Johnson‐Wood, K., Khan, K., Kholodenko, D., Lee, M., Lieberburg, I., Motter, R.,Nguyen, M., Soriano, F., Vasquez, N., Weiss, K.,Welch, B., Seubert, P., Schenk, D. &Yednock, T. 2000, "Peripherally administered antibodies against amyloid beta‐peptideenterthecentralnervoussystemandreducepathologyinamousemodelofAlzheimerdisease",Naturemedicine,vol.6,no.8,pp.916‐919.

Beel, A.J., Mobley, C.K., Kim, H.J., Tian, F., Hadziselimovic, A., Jap, B., Prestegard, J.H. &Sanders, C.R. 2008, "Structural studies of the transmembraneC‐terminal domainofthe amyloid precursor protein (APP): does APP function as a cholesterol sensor?",Biochemistry,vol.47,no.36,pp.9428‐9446.

Bennion, B.J. & Daggett, V. 2003, "Themolecular basis for the chemical denaturation ofproteinsbyurea",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.100,no.9,pp.5142‐5147.

Berman,H.,Henrick,K.,Nakamura,H.&Markley,J.L.2007,"TheworldwideProteinDataBank (wwPDB): ensuring a single, uniform archive of PDB data", Nucleic acidsresearch,vol.35,no.Databaseissue,pp.D301‐3.

Birnboim, H.C. & Doly, J. 1979, "A rapid alkaline extraction procedure for screeningrecombinantplasmidDNA",Nucleicacidsresearch,vol.7,no.6,pp.1513‐1523.

Blancas‐Mejia,L.M.&Ramirez‐Alvarado,M.2013,"SystemicAmyloidoses",AnnualReviewofBiochemistry,.

Blancas‐Mejia, L.M., Tellez, L.A., del Pozo‐Yauner, L., Becerril, B., Sanchez‐Ruiz, J.M. &Fernandez‐Velasco, D.A. 2009, "Thermodynamic and kinetic characterization of agerm line human lambda6 light‐chain protein: the relation between unfolding andfibrillogenesis",JournalofMolecularBiology,vol.386,no.4,pp.1153‐1166.

Blanco, F.J., Serrano, L. & Forman‐Kay, J.D. 1998, "High populations of non‐nativestructures in the denatured state are compatible with the formation of the nativefoldedstate",JournalofMolecularBiology,vol.284,no.4,pp.1153‐1164.

Blasco‐Moreno, B. 2011, Estabilització de l'extrem C‐terminal d'un fragment variable decadena senzilla (scFv) específic per al pèptid Aβ, Treball de Màster, UniversitatAutònomadeBarcelona.

Blommel, P.G. & Fox, B.G. 2007, "A combined approach to improving large‐scaleproduction of tobacco etch virus protease",Protein expressionandpurification, vol.55,no.1,pp.53‐68.

Bramucci, E., Paiardini, A., Bossa, F. & Pascarella, S. 2012, "PyMod: sequence similaritysearches, multiple sequence‐structure alignments, and homology modeling withinPyMOL",BMCbioinformatics,vol.13Suppl4,pp.S2‐2105‐13‐S4‐S2.

Brenner,D.A., Jain,M.,Pimentel,D.R.,Wang,B.,Connors,L.H.,Skinner,M.,Apstein,C.S.&Liao, R. 2004, "Human amyloidogenic light chains directly impair cardiomyocytefunctionthroughanincreaseincellularoxidantstress",Circulationresearch,vol.94,no.8,pp.1008‐1010.

VII‐Bibliografia

269

Brockwell, D.J., Smith, D.A. & Radford, S.E. 2000, "Protein folding mechanisms: newmethodsandemergingideas",Currentopinioninstructuralbiology,vol.10,no.1,pp.16‐25.

Bryngelson, J.D.,Onuchic, J.N., Socci,N.D.&Wolynes,P.G.1995, "Funnels,pathways, andtheenergylandscapeofproteinfolding:asynthesis",Proteins,vol.21,no.3,pp.167‐195.

Bucciantini,M.,Giannoni,E.,Chiti,F.,Baroni,F.,Formigli,L.,Zurdo,J.,Taddei,N.,Ramponi,G.,Dobson,C.M.&Stefani,M.2002,"Inherenttoxicityofaggregatesimpliesacommonmechanismforproteinmisfoldingdiseases",Nature,vol.416,no.6880,pp.507‐511.

Byler, D.M. & Susi, H. 1986, "Examination of the secondary structure of proteins bydeconvolvedFTIRspectra",Biopolymers,vol.25,no.3,pp.469‐487.

Camara‐Artigas,A.,Murciano‐Calles,J.,Gavira,J.A.,Cobos,E.S.&Martinez,J.C.2010,"Novelconformational aspects of the third PDZ domain of the neuronal post‐synapticdensity‐95 protein revealed from two 1.4A X‐ray structures", Journal of structuralbiology,vol.170,no.3,pp.565‐569.

Cascella,R.,Conti, S.,Tatini, F., Evangelisti, E., Scartabelli,T., Casamenti, F.,Wilson,M.R.,Chiti, F. & Cecchi, C. 2013, "Extracellular chaperones prevent Abeta42‐inducedtoxicityinratbrains",Biochimicaetbiophysicaacta,vol.1832,no.8,pp.1217‐1226.

Cerda‐Costa,N.,DelaArada,I.,Aviles,F.X.,Arrondo,J.L.&Villegas,S.2009,"InfluenceofaggregationpropensityandstabilityonamyloidfibrilformationasstudiedbyFouriertransform infrared spectroscopy and two‐dimensional COS analysis", Biochemistry,vol.48,no.44,pp.10582‐10590.

Cerda‐Costa, N., Esteras‐Chopo, A., Aviles, F.X., Serrano, L. & Villegas, V. 2007, "Earlykinetics of amyloid fibril formation reveals conformational reorganisation of initialaggregates",JournalofMolecularBiology,vol.366,no.4,pp.1351‐1363.

Chan, H.S., Bromberg, S. & Dill, K.A. 1995, "Models of cooperativity in protein folding",Philosophical transactionsof theRoyalSocietyofLondon.SeriesB,Biologicalsciences,vol.348,no.1323,pp.61‐70.

Cheng, I.H.,Scearce‐Levie,K.,Legleiter, J.,Palop, J.J.,Gerstein,H.,Bien‐Ly,N.,Puolivali, J.,Lesne, S., Ashe, K.H.,Muchowski, P.J. &Mucke, L. 2007, "Accelerating amyloid‐betafibrillization reduces oligomer levels and functional deficits in Alzheimer diseasemousemodels",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.282,no.33,pp.23818‐23828.

Chirgadze, Y.N. & Nevskaya, N.A. 1976, "Infrared spectra and resonance interaction ofamide‐Ivibrationoftheantiparallel‐chainpleatedsheet",Biopolymers,vol.15,no.4,pp.607‐625.

Chiti, F. & Dobson, C.M. 2009, "Amyloid formation by globular proteins under nativeconditions",Naturechemicalbiology,vol.5,no.1,pp.15‐22.

Chiti,F.&Dobson,C.M.2006,"Proteinmisfolding,functionalamyloid,andhumandisease",AnnualReviewofBiochemistry,vol.75,pp.333‐366.

VII‐Bibliografia

270

Chothia, C. & Lesk, A.M. 1986, "The relation between the divergence of sequence andstructureinproteins",TheEMBOjournal,vol.5,no.4,pp.823‐826.

Cobos, E.S., Iglesias‐Bexiga,M., Ruiz‐Sanz, J.,Mateo, P.L., Luque, I. &Martinez, J.C. 2009,"Thermodynamic characterization of the folding equilibrium of the human Nedd4‐WW4domain:atthefrontiersofcooperativefolding",Biochemistry,vol.48,no.36,pp.8712‐8720.

Cobos,E.S.,Pisabarro,M.T.,Vega,M.C.,Lacroix,E.,Serrano,L.,Ruiz‐Sanz,J.&Martinez,J.C.2004, "A miniprotein scaffold used to assemble the polyproline II binding epitoperecognized by SH3 domains", JournalofMolecularBiology,vol. 342, no. 1, pp. 355‐365.

Comenzo, R.L., Zhang, Y., Martinez, C., Osman, K. & Herrera, G.A. 2001, "The tropism oforgan involvement in primary systemic amyloidosis: contributions of Ig V(L) germlinegeneuseandclonalplasmacellburden",Blood,vol.98,no.3,pp.714‐720.

Creighton,T.E.1992,ProteinFolding,W.H.Freeman&Co.,NewYork.

Daggett, V. & Fersht, A.R. 2003, "Is there a unifying mechanism for protein folding?",Trendsinbiochemicalsciences,vol.28,no.1,pp.18‐25.

Dahlgren, K.N., Manelli, A.M., Stine, W.B.,Jr, Baker, L.K., Krafft, G.A. & LaDu, M.J. 2002,"Oligomeric and fibrillar species of amyloid‐beta peptides differentially affectneuronal viability",The Journal ofbiological chemistry, vol. 277, no. 35, pp. 32046‐32053.

Das, A. & Mukhopadhyay, C. 2009, "Urea‐mediated protein denaturation: a consensusview",Thejournalofphysicalchemistry.B,vol.113,no.38,pp.12816‐12824.

del Pozo Yauner, L., Ortiz, E., Sanchez, R., Sanchez‐Lopez, R., Guereca, L., Murphy, C.L.,Allen,A.,Wall,J.S.,Fernandez‐Velasco,D.A.,Solomon,A.&Becerril,B.2008,"Influenceof the germline sequence on the thermodynamic stability and fibrillogenicity ofhumanlambda6lightchains",Proteins,vol.72,no.2,pp.684‐692.

DeLano,W.L.2002,ThePyMOLMolecularGraphicsSystem,DeLanoScientific,SanCarlos,CA.

Deshpande,A.,Mina,E.,Glabe,C.&Busciglio,J.2006,"Differentconformationsofamyloidbeta induce neurotoxicity by distinctmechanisms in human cortical neurons",TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience,vol.26,no.22,pp.6011‐6018.

Dill, K.A. & Chan,H.S. 1997, "From Levinthal to pathways to funnels",Nature structuralbiology,vol.4,no.1,pp.10‐19.

Dineley, K.T., Xia, X., Bui, D., Sweatt, J.D. & Zheng, H. 2002, "Accelerated plaqueaccumulation, associative learning deficits, and up‐regulation of alpha 7 nicotinicreceptor protein in transgenic mice co‐expressingmutant human presenilin 1 andamyloidprecursorproteins",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.277,no.25,pp.22768‐22780.

VII‐Bibliografia

271

Dobson, C.M., Evans, P.A. & Radford, S.E. 1994, "Understanding how proteins fold: thelysozymestorysofar",Trendsinbiochemicalsciences,vol.19,no.1,pp.31‐37.

Dodart, J.C.,Bales,K.R.,Gannon,K.S.,Greene,S.J.,DeMattos,R.B.,Mathis,C.,DeLong,C.A.,Wu, S.,Wu, X., Holtzman, D.M. & Paul, S.M. 2002, "Immunization reversesmemorydeficitswithoutreducingbrainAbetaburden inAlzheimer'sdiseasemodel",Natureneuroscience,vol.5,no.5,pp.452‐457.

Doyle,D.A.,Lee,A.,Lewis,J.,Kim,E.,Sheng,M.&MacKinnon,R.1996,"Crystalstructuresofacomplexedandpeptide‐freemembraneprotein‐bindingdomain:molecularbasisofpeptiderecognitionbyPDZ",Cell,vol.85,no.7,pp.1067‐1076.

Dunker, A.K., Silman, I., Uversky, V.N. & Sussman, J.L. 2008, "Function and structure ofinherentlydisorderedproteins",Currentopinion in structuralbiology,vol. 18,no.6,pp.756‐764.

Eaton,W.A.1999, "Searching for "downhill scenarios" inprotein folding",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesof theUnitedStatesofAmerica,vol.96,no.11,pp.5897‐5899.

Elias, G.M. & Nicoll, R.A. 2007, "Synaptic trafficking of glutamate receptors by MAGUKscaffoldingproteins",Trendsincellbiology,vol.17,no.7,pp.343‐352.

Esquerda‐Canals,G.2013,Neuronalvulnerability inthe3xTg‐ADmouseand itsprotectionby the anti‐amyloid β antibody fragment scFv‐h3D6, Treball de Màster, UniversitatAutònomadeBarcelona.

Esquerda‐Canals,G.,Marti, J.,Rivera‐Hernandez,G.,Gimenez‐Llort,L.&Villegas,S.2013,"Loss of deep cerebellar nuclei neurons in the 3xTg‐ADmice and protection by ananti‐amyloidbetaantibodyfragment",mAbs,vol.5,no.5,pp.660‐664.

Facciuto, F., Cavatorta, A.L., Valdano, M.B., Marziali, F. & Gardiol, D. 2012, "DifferentialexpressionofPDZdomain‐containingproteinsinhumandiseases‐challengingtopicsandnovelissues",TheFEBSjournal,vol.279,no.19,pp.3538‐3548.

Fandrich, M. 2012, "Oligomeric intermediates in amyloid formation: structuredeterminationandmechanismsoftoxicity",JournalofMolecularBiology,vol.421,no.4‐5,pp.427‐440.

Fenyö,D.2010,ComputationalBiology,SpringerProtocols,US.

Fernandez‐Escamilla,A.M.,Rousseau,F.,Schymkowitz,J.&Serrano,L.2004,"Predictionofsequence‐dependent and mutational effects on the aggregation of peptides andproteins",Naturebiotechnology,vol.22,no.10,pp.1302‐1306.

Fersht, A.R. 1997, "Nucleation mechanisms in protein folding", Current opinion instructuralbiology,vol.7,no.1,pp.3‐9.

Fersht,A.R.1993, "ThesixthDattaLecture.Protein foldingandstability: thepathwayoffoldingofbarnase",FEBSletters,vol.325,no.1‐2,pp.5‐16.

Fitzpatrick, A.W., Debelouchina, G.T., Bayro, M.J., Clare, D.K., Caporini, M.A., Bajaj, V.S.,Jaroniec, C.P., Wang, L., Ladizhansky, V., Muller, S.A., MacPhee, C.E., Waudby, C.A.,

VII‐Bibliografia

272

Mott, H.R., De Simone, A., Knowles, T.P., Saibil, H.R., Vendruscolo, M., Orlova, E.V.,Griffin, R.G.&Dobson, C.M. 2013, "Atomic structure andhierarchical assembly of across‐beta amyloid fibril", Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnitedStatesofAmerica,vol.110,no.14,pp.5468‐5473.

Focant, M.C. & Hermans, E. 2013, "Protein interacting with C kinase and neurologicaldisorders",Synapse(NewYork,N.Y.),.

Fukuchi,K.,Accavitti‐Loper,M.A.,Kim,H.D.,Tahara,K.,Cao,Y.,Lewis,T.L.,Caughey,R.C.,Kim,H.&Lalonde,R.2006,"Ameliorationofamyloidloadbyanti‐Abetasingle‐chainantibody in Alzheimer mouse model", Biochemical and biophysical researchcommunications,vol.344,no.1,pp.79‐86.

Gimenez‐Llort,L.,Blazquez,G.,Canete,T.,Johansson,B.,Oddo,S.,Tobena,A.,LaFerla,F.M.& Fernandez‐Teruel, A. 2007, "Modeling behavioral and neuronal symptoms ofAlzheimer's disease in mice: a role for intraneuronal amyloid", Neuroscience andbiobehavioralreviews,vol.31,no.1,pp.125‐147.

Gimenez‐Llort, L., Rivera‐Hernandez, G., Marin‐Argany, M., Sanchez‐Quesada, J.L. &Villegas, S. 2013, "Early intervention in the 3xTg‐AD mice with an amyloid beta‐antibodyfragmentamelioratesfirsthallmarksofAlzheimerdisease",mAbs,vol.5,no.5,pp.665‐677.

Goh,K.I.&Choi,I.G.2012,"Exploringthehumandiseasome:thehumandiseasenetwork",Briefingsinfunctionalgenomics,vol.11,no.6,pp.533‐542.

Gomez, S.B. & Di Mauro, P.P. 2012, Polymeric nanoparticles for drug delivery<br />,WO/2012/153286edn,PCT/IB2012/052320,ES.

Good,M.C.,Zalatan,J.G.&Lim,W.A.2011,"Scaffoldproteins:hubsforcontrollingtheflowofcellularinformation",Science(NewYork,N.Y.),vol.332,no.6030,pp.680‐686.

Goormaghtigh, E., Cabiaux, V. & Ruysschaert, J.M. 1994, "Determination of soluble andmembrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy. I.Assignmentsandmodelcompounds",Sub‐cellularbiochemistry,vol.23,pp.329‐362.

Gosal, W.S., Morten, I.J., Hewitt, E.W., Smith, D.A., Thomson, N.H. & Radford, S.E. 2005,"Competing pathways determine fibril morphology in the self‐assembly of beta2‐microglobulinintoamyloid",JournalofMolecularBiology,vol.351,no.4,pp.850‐864.

Haass, C. & Selkoe, D.J. 2007, "Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessonsfrom the Alzheimer's amyloid beta‐peptide", Nature reviews.Molecular cell biology,vol.8,no.2,pp.101‐112.

Hanahan,D.1983,"StudiesontransformationofEscherichiacoliwithplasmids",JournalofMolecularBiology,vol.166,no.4,pp.557‐580.

Heredia, P. & De Las Rivas, J. 2003, "Calcium‐dependent conformational change andthermal stability of the isolated PsbO protein detected by FTIR spectroscopy",Biochemistry,vol.42,no.40,pp.11831‐11838.

VII‐Bibliografia

273

Herrup,K.2010,"ReimaginingAlzheimer'sdisease‐‐anage‐basedhypothesis",TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience,vol.30,no.50,pp.16755‐16762.

Hock,C.,Konietzko,U.,Streffer,J.R.,Tracy,J.,Signorell,A.,Muller‐Tillmanns,B.,Lemke,U.,Henke, K., Moritz, E., Garcia, E., Wollmer, M.A., Umbricht, D., de Quervain, D.J.,Hofmann,M.,Maddalena,A., Papassotiropoulos,A.&Nitsch,R.M.2003, "Antibodiesagainstbeta‐amyloidslowcognitivedeclineinAlzheimer'sdisease",Neuron,vol.38,no.4,pp.547‐554.

Hou, X., Richardson, S.J., Aguilar, M.I. & Small, D.H. 2005, "Binding of amyloidogenictransthyretin to the plasma membrane alters membrane fluidity and inducesneurotoxicity",Biochemistry,vol.44,no.34,pp.11618‐11627.

Humphreys,D.T.,Carver,J.A.,Easterbrook‐Smith,S.B.&Wilson,M.R.1999,"Clusterinhaschaperone‐like activity similar to that of small heat shock proteins",The Journalofbiologicalchemistry,vol.274,no.11,pp.6875‐6881.

Hurle,M.R.,Helms,L.R.,Li,L.,Chan,W.&Wetzel,R.1994,"Arolefordestabilizingaminoacidreplacementsinlight‐chainamyloidosis",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.91,no.12,pp.5446‐5450.

Huse,M.&Kuriyan, J. 2002, "The conformationalplasticityofproteinkinases",Cell,vol.109,no.3,pp.275‐282.

Hust,M.,Jostock,T.,Menzel,C.,Voedisch,B.,Mohr,A.,Brenneis,M.,Kirsch,M.I.,Meier,D.&Dubel,S.2007,"SinglechainFab(scFab)fragment",BMCbiotechnology,vol.7,pp.14.

Itzhaki, L.S., Otzen, D.E. & Fersht, A.R. 1995, "The structure of the transition state forfolding of chymotrypsin inhibitor 2 analysed by protein engineering methods:evidence for a nucleation‐condensation mechanism for protein folding", Journal ofMolecularBiology,vol.254,no.2,pp.260‐288.

Ivarsson, Y. 2012, "Plasticity of PDZ domains in ligand recognition and signaling",FEBSletters,vol.586,no.17,pp.2638‐2647.

Jackson,S.E.&Fersht,A.R.1991, "Foldingof chymotrypsin inhibitor2.1.Evidence foratwo‐statetransition",Biochemistry,vol.30,no.43,pp.10428‐10435.

Jacobsen, J.S. 2006, Antibodies specific for epitopes within amyloid β (Aβ), for use inimprovingcognition.,WO/2006/066171edn,PCT/US2005/045860,US.

Jahn,T.R.&Radford,S.E.2008,"Foldingversusaggregation:polypeptideconformationsoncompetingpathways",ArchivesofBiochemistryandBiophysics,vol.469,no.1,pp.100‐117.

Jahn,T.R.&Radford,S.E.2005, "TheYinandYangofprotein folding",TheFEBS journal,vol.272,no.23,pp.5962‐5970.

Jahn, T.R., Tennent, G.A. & Radford, S.E. 2008, "A common beta‐sheet architectureunderlies in vitro and in vivo beta2‐microglobulin amyloid fibrils", The Journal ofbiologicalchemistry,vol.283,no.25,pp.17279‐17286.

VII‐Bibliografia

274

Jemth,P.&Gianni,S.2007,"PDZdomains:foldingandbinding",Biochemistry,vol.46,no.30,pp.8701‐8708.

John,D.M.&Weeks,K.M.2000,"van'tHoffenthalpieswithoutbaselines",Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety,vol.9,no.7,pp.1416‐1419.

Johnson, G. & Wu, T.T. 2001, "Kabat Database and its applications: future directions",Nucleicacidsresearch,vol.29,no.1,pp.205‐206.

Johnson, W.C.,Jr 1988, "Secondary structure of proteins through circular dichroismspectroscopy", Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry, vol. 17, pp.145‐166.

Jones,T.A.&Thirup,S.1986,"Usingknownsubstructuresinproteinmodelbuildingandcrystallography",TheEMBOjournal,vol.5,no.4,pp.819‐822.

Jurado,P.,deLorenzo,V.&Fernandez,L.A.2006,"Thioredoxinfusionsincreasefoldingofsingle chain Fv antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli: evidence thatchaperone activity is the prime effect of thioredoxin", JournalofMolecularBiology,vol.357,no.1,pp.49‐61.

Kabat,E.A.1983,Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,U.S.

Kabsch, W. & Sander, C. 1983, "Dictionary of protein secondary structure: patternrecognitionofhydrogen‐bondedandgeometrical features",Biopolymers,vol.22,no.12,pp.2577‐2637.

Kad, N.M., Myers, S.L., Smith, D.P., Smith, D.A., Radford, S.E. & Thomson, N.H. 2003,"Hierarchical assembly of beta2‐microglobulin amyloid in vitro revealed by atomicforcemicroscopy",JournalofMolecularBiology,vol.330,no.4,pp.785‐797.

Khurana,R.,Gillespie, J.R.,Talapatra,A.,Minert,L.J., Ionescu‐Zanetti,C.,Millett, I.&Fink,A.L.2001,"Partiallyfoldedintermediatesascriticalprecursorsoflightchainamyloidfibrilsandamorphousaggregates",Biochemistry,vol.40,no.12,pp.3525‐3535.

Kim, J., Jiang, H., Park, S., Eltorai, A.E., Stewart, F.R., Yoon, H., Basak, J.M., Finn, M.B. &Holtzman,D.M.2011,"HaploinsufficiencyofhumanAPOEreducesamyloiddepositionin a mouse model of amyloid‐beta amyloidosis", The Journal of neuroscience : theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience,vol.31,no.49,pp.18007‐18012.

Kim,P.S.&Baldwin,R.L.1990,"Intermediatesinthefoldingreactionsofsmallproteins",AnnualReviewofBiochemistry,vol.59,pp.631‐660.

Kim, P.S. & Baldwin, R.L. 1982, "Specific intermediates in the folding reactions of smallproteinsand themechanismofprotein folding",AnnualReviewofBiochemistry,vol.51,pp.459‐489.

Klein‐Seetharaman,J.,Oikawa,M.,Grimshaw,S.B.,Wirmer,J.,Duchardt,E.,Ueda,T.,Imoto,T., Smith, L.J., Dobson, C.M.& Schwalbe,H. 2002, "Long‐range interactionswithin anonnativeprotein",Science(NewYork,N.Y.),vol.295,no.5560,pp.1719‐1722.

VII‐Bibliografia

275

Koehl, P. & Levitt, M. 2002, "Protein topology and stability define the space of allowedsequences",Proceedingsof theNationalAcademy of Sciencesof theUnited States ofAmerica,vol.99,no.3,pp.1280‐1285.

Kopp, J. & Schwede, T. 2004, "The SWISS‐MODEL Repository of annotated three‐dimensionalproteinstructurehomologymodels",Nucleicacidsresearch,vol.32,no.Databaseissue,pp.D230‐4.

Kumar,S.&Walter,J.2011,"Phosphorylationofamyloidbeta(Abeta)peptides‐atriggerforformationoftoxicaggregatesinAlzheimer'sdisease",Aging,vol.3,no.8,pp.803‐812.

LaDu,M.J.,Falduto,M.T.,Manelli,A.M.,Reardon,C.A.,Getz,G.S.&Frail,D.E.1994,"Isoform‐specific binding of apolipoprotein E to beta‐amyloid", The Journal of biologicalchemistry,vol.269,no.38,pp.23403‐23406.

Laganowsky, A., Liu, C., Sawaya, M.R., Whitelegge, J.P., Park, J., Zhao, M., Pensalfini, A.,Soriaga,A.B.,Landau,M.,Teng,P.K.,Cascio,D.,Glabe,C.&Eisenberg,D.2012,"Atomicviewofatoxicamyloidsmalloligomer",Science(NewYork,N.Y.),vol.335,no.6073,pp.1228‐1231.

Lansbury, P.T. & Lashuel, H.A. 2006, "A century‐old debate on protein aggregation andneurodegenerationenterstheclinic",Nature,vol.443,no.7113,pp.774‐779.

Leach,A.R.2001,Mollecularmodelling.Principlesandapplications.2ndEditionedn,.

Lee,H.J.&Zheng,J.J.2010,"PDZdomainsandtheirbindingpartners:structure,specificity,andmodification",Cellcommunicationandsignaling:CCS,vol.8,pp.8‐811X‐8‐8.

Levinthal,C.1968,"Aretherepathwaysforproteinfolding?", JournaldeChimiePhysique,vol.65,no.1,pp.44‐45.

Linding, R., Schymkowitz, J., Rousseau, F., Diella, F. & Serrano, L. 2004, "A comparativestudyoftherelationshipbetweenproteinstructureandbeta‐aggregationinglobularandintrinsicallydisorderedproteins",JournalofMolecularBiology,vol.342,no.1,pp.345‐353.

Lockless, S.W.&Ranganathan,R.1999, "Evolutionarily conservedpathwaysof energeticconnectivityinproteinfamilies",Science(NewYork,N.Y.),vol.286,no.5438,pp.295‐299.

Long, J.F., Tochio,H.,Wang, P., Fan, J.S., Sala, C.,Niethammer,M., Sheng,M.& Zhang,M.2003, "Supramodular structure and synergistic target binding of the N‐terminaltandemPDZdomainsofPSD‐95",JournalofMolecularBiology,vol.327,no.1,pp.203‐214.

Lorenzo, A. & Yankner, B.A. 1994, "Beta‐amyloid neurotoxicity requires fibril formationandisinhibitedbycongored",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.91,no.25,pp.12243‐12247.

Maezawa,I.,Hong,H.S.,Liu,R.,Wu,C.Y.,Cheng,R.H.,Kung,M.P.,Kung,H.F.,Lam,K.S.,Oddo,S., Laferla, F.M. & Jin, L.W. 2008, "Congo red and thioflavin‐T analogs detect Abetaoligomers",Journalofneurochemistry,vol.104,no.2,pp.457‐468.

VII‐Bibliografia

276

Manoutcharian,K.,Acero,G.,Munguia,M.E.,Becerril,B.,Massieu,L.,Govezensky,T.,Ortiz,E., Marks, J.D., Cao, C., Ugen, K. & Gevorkian, G. 2004, "Human single chain Fvantibodies and a complementarity determining region‐derived peptide binding toamyloid‐beta1‐42",Neurobiologyofdisease,vol.17,no.1,pp.114‐121.

Marin‐Argany,M.2009,Modelatgetridimensionald'unfragmentvariabledecadenasenzilla(scFv) específic contra el pèptidAbeta, Treball deMàster, Universitat Autònoma deBarcelona.

Marin‐Argany, M., Rivera‐Hernandez, G., Marti, J. & Villegas, S. 2011, "An anti‐Abeta(amyloidbeta)single‐chainvariablefragmentpreventsamyloidfibril formationandcytotoxicity by withdrawing Abeta oligomers from the amyloid pathway", TheBiochemicaljournal,vol.437,no.1,pp.25‐34.

Marley, J., Lu, M. & Bracken, C. 2001, "A method for efficient isotopic labeling ofrecombinantproteins",JournalofBiomolecularNMR,vol.20,no.1,pp.71‐75.

McGee,A.W.&Bredt,D.S.2003,"Assemblyandplasticityoftheglutamatergicpostsynapticspecialization",Currentopinioninneurobiology,vol.13,no.1,pp.111‐118.

McGee,A.W.,Dakoji,S.R.,Olsen,O.,Bredt,D.S.,Lim,W.A.&Prehoda,K.E.2001,"StructureoftheSH3‐guanylatekinasemodulefromPSD‐95suggestsamechanismforregulatedassemblyofMAGUKscaffoldingproteins",Molecularcell,vol.8,no.6,pp.1291‐1301.

McLaughlin,R.W.,DeStigter,J.K.,Sikkink,L.A.,Baden,E.M.&Ramirez‐Alvarado,M.2006,"Theeffectsofsodiumsulfate,glycosaminoglycans,andCongoredon thestructure,stability, and amyloid formation of an immunoglobulin light‐chain protein",Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety,vol.15,no.7,pp.1710‐1722.

McLean,C.A.,Cherny,R.A.,Fraser,F.W.,Fuller,S.J.,Smith,M.J.,Beyreuther,K.,Bush,A.I.&Masters, C.L. 1999, "Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity ofneurodegeneration in Alzheimer's disease",Annals ofNeurology, vol. 46, no. 6, pp.860‐866.

McParland,V.J.,Kad,N.M.,Kalverda,A.P.,Brown,A.,Kirwin‐Jones,P.,Hunter,M.G.,Sunde,M. & Radford, S.E. 2000, "Partially unfolded states of beta(2)‐microglobulin andamyloidformationinvitro",Biochemistry,vol.39,no.30,pp.8735‐8746.

Mohajeri,M.H.,Saini,K.,Schultz,J.G.,Wollmer,M.A.,Hock,C.&Nitsch,R.M.2002,"Passiveimmunization against beta‐amyloid peptide protects central nervous system (CNS)neuronsfromincreasedvulnerabilityassociatedwithanAlzheimer'sdisease‐causingmutation",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.277,no.36,pp.33012‐33017.

Mok,Y.K.,Kay,C.M.,Kay,L.E.&Forman‐Kay,J.1999,"NOEdatademonstratingacompactunfolded state for an SH3 domain under non‐denaturing conditions", Journal ofMolecularBiology,vol.289,no.3,pp.619‐638.

Montoliu‐Gaia, L. 2013, Anàlisi de les conseqüències termodinàmiques i conformacionalsd'eliminarelpontdisulfurdeldominiVLd'unfragmentd'anticòsanti‐Aβ(scFv‐h3D6),TreballdeMàster,UniversitatAutònomadeBarcelona.

VII‐Bibliografia

277

Mostarda,S.,Gfeller,D.&Rao,F.2012,"Beyondthebindingsite:theroleofthebeta(2)‐beta(3) loop and extra‐domain structures in PDZ domains", PLoS computationalbiology,vol.8,no.3,pp.e1002429.

Muller, B.M., Kistner, U., Veh, R.W., Cases‐Langhoff, C., Becker, B., Gundelfinger, E.D. &Garner, C.C. 1995, "Molecular characterization and spatial distribution of SAP97, anovel presynaptic protein homologous to SAP90 and the Drosophila discs‐largetumor suppressor protein", The Journal of neuroscience : the official journal of theSocietyforNeuroscience,vol.15,no.3Pt2,pp.2354‐2366.

Mullis, K.B. & Faloona, F.A. 1987, "Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase‐catalyzedchainreaction",Methodsinenzymology,vol.155,pp.335‐350.

Murciano‐Calles, J. 2011, Caracterización termodinámico‐estructural de la estabilidad dedominiosPDZyanálisisdesuespecificidaddeuniónmediantelibreríasdeexpresiónenfagos,TesisDoctoral,UniversidaddeGranada.

Murciano‐Calles, J., Cobos, E.S., Mateo, P.L., Camara‐Artigas, A. &Martinez, J.C. 2011, "AcomparativeanalysisofthefoldingandmisfoldingpathwaysofthethirdPDZdomainofPSD95investigatedunderdifferentpHconditions",Biophysicalchemistry,vol.158,no.2‐3,pp.104‐110.

Murciano‐Calles, J., Cobos,E.S.,Mateo,P.L.,Camara‐Artigas,A.&Martinez, J.C.2010, "Anoligomeric equilibrium intermediate as the precursory nucleus of globular andfibrillarsupramacromolecularassemblies inaPDZdomain",Biophysical journal,vol.99,no.1,pp.263‐272.

Murciano‐Calles, J., Martinez, J.C., Marin‐Argany, M., Villegas, S. & Cobos, E.S. 2013, "Athermodynamic studyof the thirdPDZdomainofMAGUKneuronalproteinPSD‐95revealsacomplexthree‐statefoldingbehavior",BiophysicalChemistry,Submitted.

Naiki, H., Higuchi, K., Hosokawa, M. & Takeda, T. 1989, "Fluorometric determination ofamyloid fibrils in vitro using the fluorescent dye, thioflavin T1", AnalyticalBiochemistry,vol.177,no.2,pp.244‐249.

Nallamsetty,S.,Kapust,R.B.,Tozser,J.,Cherry,S.,Tropea,J.E.,Copeland,T.D.&Waugh,D.S.2004, "Efficient site‐specific processing of fusion proteins by tobacco veinmottlingvirusproteaseinvivoandinvitro",Proteinexpressionandpurification,vol.38,no.1,pp.108‐115.

Neudecker,P.,Robustelli,P.,Cavalli,A.,Walsh,P.,Lundstrom,P.,Zarrine‐Afsar,A.,Sharpe,S., Vendruscolo,M.&Kay, L.E. 2012, "Structure of an intermediate state in proteinfoldingandaggregation",Science(NewYork,N.Y.),vol.336,no.6079,pp.362‐366.

Nicoll, J.A., Wilkinson, D., Holmes, C., Steart, P., Markham, H. & Weller, R.O. 2003,"NeuropathologyofhumanAlzheimerdiseaseafterimmunizationwithamyloid‐betapeptide:acasereport",Naturemedicine,vol.9,no.4,pp.448‐452.

Nitsch, R.M. & Hock, C. 2008, "Targeting beta‐amyloid pathology in Alzheimer's diseasewithAbetaimmunotherapy",Neurotherapeutics :the journaloftheAmericanSocietyforExperimentalNeuroTherapeutics,vol.5,no.3,pp.415‐420.

VII‐Bibliografia

278

Nix, S.L., Chishti, A.H., Anderson, J.M. &Walther, Z. 2000, "hCASK and hDlg associate inepithelia,andtheirsrchomology3andguanylatekinasedomainsparticipateinbothintramolecular and intermolecular interactions",The Journalofbiologicalchemistry,vol.275,no.52,pp.41192‐41200.

Novotny, J. & Haber, E. 1985, "Structural invariants of antigen binding: comparison ofimmunoglobulin VL‐VH and VL‐VL domain dimers", Proceedings of the NationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.82,no.14,pp.4592‐4596.

Olinger, J.M., Hill, D.M., Jakobsen, R.J. & Brody, R.S. 1986, "Fourier transform infraredstudies of ribonuclease inH2O and 2H2O solutions",Biochimica etbiophysicaacta,vol.869,no.1,pp.89‐98.

Oliva, B., Bates, P.A., Querol, E., Aviles, F.X. & Sternberg, M.J. 1998, "Automatedclassificationof antibody complementaritydetermining region3of theheavy chain(H3) loops intocanonical formsand itsapplicationtoproteinstructureprediction",JournalofMolecularBiology,vol.279,no.5,pp.1193‐1210.

O'Nuallain,B.,Allen,A.,Kennel,S.J.,Weiss,D.T.,Solomon,A.&Wall,J.S.2007,"Localizationofaconformationalepitopecommontonon‐nativeandfibrillarimmunoglobulinlightchains",Biochemistry,vol.46,no.5,pp.1240‐1247.

Passafaro,M.,Sala,C.,Niethammer,M.&Sheng,M.1999,"MicrotubulebindingbyCRIPTanditspotentialroleinthesynapticclusteringofPSD‐95",Natureneuroscience,vol.2,no.12,pp.1063‐1069.

Pawar, A.P., Dubay, K.F., Zurdo, J., Chiti, F., Vendruscolo, M. & Dobson, C.M. 2005,"Predictionof"aggregation‐prone"and"aggregation‐susceptible"regionsinproteinsassociatedwithneurodegenerative diseases", JournalofMolecularBiology,vol. 350,no.2,pp.379‐392.

Pearson,W.R.1990,"RapidandsensitivesequencecomparisonwithFASTPandFASTA",Methodsinenzymology,vol.183,pp.63‐98.

Pedroso,I.,Irun,M.P.,Machicado,C.&Sancho,J.2002,"Four‐stateequilibriumunfoldingofanscFvantibodyfragment",Biochemistry,vol.41,no.31,pp.9873‐9884.

Peterson, F.C., Baden, E.M., Owen, B.A., Volkman, B.F. & Ramirez‐Alvarado, M. 2010, "Asingle mutation promotes amyloidogenicity through a highly promiscuous dimerinterface",Structure(London,England:1993),vol.18,no.5,pp.563‐570.

Petit,C.M.,Zhang,J.,Sapienza,P.J.,Fuentes,E.J.&Lee,A.L.2009,"HiddendynamicallosteryinaPDZdomain",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.106,no.43,pp.18249‐18254.

Pfeifer, M., Boncristiano, S., Bondolfi, L., Stalder, A., Deller, T., Staufenbiel, M., Mathews,P.M. & Jucker, M. 2002, "Cerebral hemorrhage after passive anti‐Abetaimmunotherapy",Science(NewYork,N.Y.),vol.298,no.5597,pp.1379.

Phillips, S.E. & Schoenborn, B.P. 1981, "Neutron diffraction reveals oxygen‐histidinehydrogenbondinoxymyoglobin",Nature,vol.292,no.5818,pp.81‐82.

VII‐Bibliografia

279

Pim,D.,Bergant,M.,Boon,S.S.,Ganti,K.,Kranjec,C.,Massimi,P.,Subbaiah,V.K.,Thomas,M.,Tomaic,V.&Banks,L.2012,"HumanpapillomavirusesandthespecificityofPDZdomaintargeting",TheFEBSjournal,vol.279,no.19,pp.3530‐3537.

Pokkuluri, P.R., Huang, D.B., Raffen, R., Cai, X., Johnson, G., Stevens, P.W., Stevens, F.J. &Schiffer, M. 1998, "A domain flip as a result of a single amino‐acid substitution",Structure(London,England:1993),vol.6,no.8,pp.1067‐1073.

Poshusta,T.L., Sikkink, L.A., Leung,N., Clark,R.J.,Dispenzieri,A.&Ramirez‐Alvarado,M.2009, "Mutations in specific structural regions of immunoglobulin light chains areassociatedwithfreelightchainlevelsinpatientswithALamyloidosis",PloSone,vol.4,no.4,pp.e5169.

Preissmann, D., Leuba, G., Savary, C., Vernay, A., Kraftsik, R., Riederer, I.M., Schenk, F.,Riederer, B.M. & Savioz, A. 2012, "Increased postsynaptic density protein‐95expression in the frontal cortex of aged cognitively impaired rats", Experimentalbiologyandmedicine(Maywood,N.J.),vol.237,no.11,pp.1331‐1340.

Prince,M.,Bryce,R.&Ferri,C.2011,"Thebenefitsofearlydiagnosisandintervention.", ,ed.WorldAlzheimerReport,Alzheimer’sDiseaseInternational(ADI),.

Qin,Z.,Hu,D.,Zhu,M.&Fink,A.L.2007,"Structuralcharacterizationofthepartiallyfoldedintermediates of an immunoglobulin light chain leading to amyloid fibrillation andamorphousaggregation",Biochemistry,vol.46,no.11,pp.3521‐3531.

Radford, S.E. 2000, "Protein folding: progress made and promises ahead", Trends inbiochemicalsciences,vol.25,no.12,pp.611‐618.

Rain, J.C., Selig, L.,DeReuse,H., Battaglia, V.,Reverdy, C., Simon, S., Lenzen,G., Petel, F.,Wojcik, J., Schachter, V., Chemama, Y., Labigne,A.& Legrain, P. 2001, "Theprotein‐protein interactionmapofHelicobacterpylori",Nature,vol.409,no.6817,pp.211‐215.

Ramirez‐Alvarado,M.2012,"Amyloidformationinlightchainamyloidosis",Currenttopicsinmedicinalchemistry,vol.12,no.22,pp.2523‐2533.

Ramírez‐Alvarado,M.,Kelly,J.W.&Dobson,C.M.2010,Proteinmisfoldingdiseases:currentand emergingprinciplesand therapies.VladimirN. Uversky, Series Editor edn, JohnWiley&Sons,NewYork.

Randles, E.G., Thompson, J.R., Martin, D.J. & Ramirez‐Alvarado, M. 2009, "Structuralalterations within native amyloidogenic immunoglobulin light chains", Journal ofMolecularBiology,vol.389,no.1,pp.199‐210.

Ray, S.S., Singh, S.K.&Balaram, P. 2001, "An electrospray ionizationmass spectrometryinvestigationof1‐anilino‐8‐naphthalene‐sulfonate(ANS)bindingtoproteins",JournaloftheAmericanSocietyforMassSpectrometry,vol.12,no.4,pp.428‐438.

Rezaei‐Ghaleh, N., Blackledge, M. & Zweckstetter, M. 2012, "Intrinsically disorderedproteins: from sequence and conformational properties toward drug discovery",Chembiochem:aEuropeanjournalofchemicalbiology,vol.13,no.7,pp.930‐950.

VII‐Bibliografia

280

Rinne, J.O., Brooks, D.J., Rossor, M.N., Fox, N.C., Bullock, R., Klunk, W.E., Mathis, C.A.,Blennow,K.,Barakos, J.,Okello,A.A.,RodriguezMartinezdeLiano,S.,Liu,E.,Koller,M.,Gregg,K.M.,Schenk,D.,Black,R.&Grundman,M.2010,"11C‐PiBPETassessmentofchange in fibrillaramyloid‐beta load inpatientswithAlzheimer'sdisease treatedwith bapineuzumab: a phase 2, double‐blind, placebo‐controlled, ascending‐dosestudy",Lancetneurology,vol.9,no.4,pp.363‐372.

Rivera‐Hernandez,G.2013,TesiDoctoralenredacció,UniversitatAutònomadeBarcelona.

Rivera‐Hernandez,G.2009,Expresión recombinante,purificaciónycaracterización inicialdeun fragmentovariabledecandenasencilla (scFv)específicoparaelpéptidoAbeta,TreballdeMàster,UniversitatAutònomadeBarcelona.

Rivera‐Hernandez,G.,Marin‐Argany,M.,Blasco‐Moreno,B.,Bonet,J.,Oliva,B.&Villegas,S.2013, "Elongation of the C‐terminal domain of an anti‐amyloid beta single‐chainvariable fragment increases its thermodynamic stability and decreases itsaggregationtendency",mAbs,vol.5,no.5,pp.678‐689.

Robert,R.,Dolezal,O.,Waddington,L.,Hattarki,M.K.,Cappai,R.,Masters,C.L.,Hudson,P.J.& Wark, K.L. 2009, "Engineered antibody intervention strategies for Alzheimer'sdisease and related dementias by targeting amyloid and toxic oligomers", Proteinengineering,design&selection:PEDS,vol.22,no.3,pp.199‐208.

Rousseau, F., Schymkowitz, J.& Serrano, L. 2006, "Protein aggregation and amyloidosis:confusionofthekinds?",Currentopinioninstructuralbiology,vol.16,no.1,pp.118‐126.

Royer,C.A.1995,"Fluorescencespectroscopy",Methodsinmolecularbiology(Clifton,N.J.),vol.40,pp.65‐89.

Sadqi, M., Fushman, D. & Munoz, V. 2006, "Atom‐by‐atom analysis of global downhillproteinfolding",Nature,vol.442,no.7100,pp.317‐321.

Sali, A. & Blundell, T.L. 1993, "Comparative proteinmodelling by satisfaction of spatialrestraints",JournalofMolecularBiology,vol.234,no.3,pp.779‐815.

Sanchez, R., Pieper, U., Melo, F., Eswar, N., Marti‐Renom, M.A., Madhusudhan, M.S.,Mirkovic, N. & Sali, A. 2000, "Protein structure modeling for structural genomics",Naturestructuralbiology,vol.7Suppl,pp.986‐990.

Sanger, F.&Coulson,A.R. 1975, "A rapidmethod for determining sequences inDNAbyprimedsynthesiswithDNApolymerase", JournalofMolecularBiology,vol.94,no.3,pp.441‐448.

Saraceno, C., Musardo, S., Marcello, E., Pelucchi, S. & Luca, M.D. 2013, "ModelingAlzheimer'sdisease:frompasttofuture",Frontiersinpharmacology,vol.4,pp.77.

Saro, D., Li, T., Rupasinghe, C., Paredes, A., Caspers, N. & Spaller, M.R. 2007, "Athermodynamic ligand binding study of the third PDZ domain (PDZ3) from themammalianneuronalproteinPSD‐95",Biochemistry,vol.46,no.21,pp.6340‐6352.

Schenk, D. 2002, "Amyloid‐beta immunotherapy for Alzheimer's disease: the end of thebeginning",Naturereviews.Neuroscience,vol.3,no.10,pp.824‐828.

VII‐Bibliografia

281

Schenk, D., Barbour, R., Dunn, W., Gordon, G., Grajeda, H., Guido, T., Hu, K., Huang, J.,Johnson‐Wood,K.,Khan,K.,Kholodenko,D.,Lee,M.,Liao,Z.,Lieberburg,I.,Motter,R.,Mutter, L., Soriano, F., Shopp,G., Vasquez,N., Vandevert, C.,Walker, S.,Wogulis,M.,Yednock, T., Games, D. & Seubert, P. 1999, "Immunization with amyloid‐betaattenuatesAlzheimer‐disease‐likepathology in thePDAPPmouse",Nature,vol.400,no.6740,pp.173‐177.

Serio,T.R.,Cashikar,A.G.,Kowal,A.S.,Sawicki,G.J.,Moslehi,J.J.,Serpell,L.,Arnsdorf,M.F.&Lindquist, S.L. 2000, "Nucleated conformational conversion and the replication ofconformational information by a prion determinant", Science (New York,N.Y.), vol.289,no.5483,pp.1317‐1321.

Serpell,L.C.,Sunde,M.,Benson,M.D.,Tennent,G.A.,Pepys,M.B.&Fraser,P.E.2000,"Theprotofilamentsubstructureofamyloidfibrils",JournalofMolecularBiology,vol.300,no.5,pp.1033‐1039.

Serrano,L.,Matouschek,A.&Fersht,A.R.1992,"Thefoldingofanenzyme.III.Structureofthe transition state for unfolding of barnase analysed by a protein engineeringprocedure",JournalofMolecularBiology,vol.224,no.3,pp.805‐818.

Shapiro,A.L.,Vinuela,E.&Maizel,J.V.,Jr1967,"Molecularweightestimationofpolypeptidechains by electrophoresis in SDS‐polyacrylamide gels",Biochemical and biophysicalresearchcommunications,vol.28,no.5,pp.815‐820.

Sheng, M. & Sala, C. 2001, "PDZ domains and the organization of supramolecularcomplexes",AnnualReviewofNeuroscience,vol.24,pp.1‐29.

Shi,J.,Guan,J.,Jiang,B.,Brenner,D.A.,DelMonte,F.,Ward,J.E.,Connors,L.H.,Sawyer,D.B.,Semigran,M.J.,Macgillivray,T.E.,Seldin,D.C.,Falk,R.&Liao,R.2010,"Amyloidogeniclight chains induce cardiomyocyte contractile dysfunction and apoptosis via a non‐canonicalp38alphaMAPKpathway",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.107,no.9,pp.4188‐4193.

Shnyrov,V.L.,Villar,E.,Zhadan,G.G.,Sanchez‐Ruiz, J.M.,Quintas,A.,Saraiva,M.J.&Brito,R.M.2000,"Comparativecalorimetricstudyofnon‐amyloidogenicandamyloidogenicvariantsofthehomotetramericproteintransthyretin",Biophysicalchemistry,vol.88,no.1‐3,pp.61‐67.

Sierralta,J.&Mendoza,C.2004,"PDZ‐containingproteins:alternativesplicingasasourceof functional diversity", Brain research.Brain research reviews, vol. 47, no. 1‐3, pp.105‐115.

Sikkink, L.A. & Ramirez‐Alvarado, M. 2010, "Cytotoxicity of amyloidogenicimmunoglobulinlightchainsincellculture",Celldeath&disease,vol.1,pp.e98.

Sikkink, L.A. & Ramirez‐Alvarado, M. 2008, "Salts enhance both protein stability andamyloidformationofanimmunoglobulinlightchain",Biophysicalchemistry,vol.135,no.1‐3,pp.25‐31.

Solomon, A., Weiss, D.T. & Wall, J.S. 2003, "Immunotherapy in systemic primary (AL)amyloidosis using amyloid‐reactive monoclonal antibodies", Cancer biotherapy &radiopharmaceuticals,vol.18,no.6,pp.853‐860.

VII‐Bibliografia

282

Solomon, B. 2009, "Immunotherapeutic strategies for Alzheimer's disease treatment",TheScientificWorldJournal,vol.9,pp.909‐919.

Solomon, B. 2006, "Alzheimer's disease immunotherapy: from in vitro amyloidimmunomodulationtoinvivovaccination",JournalofAlzheimer'sdisease:JAD,vol.9,no.3Suppl,pp.433‐438.

Solomon, B., Koppel, R., Frankel, D. & Hanan‐Aharon, E. 1997, "Disaggregation ofAlzheimerbeta‐amyloidbysite‐directedmAb",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.94,no.8,pp.4109‐4112.

Songyang, Z., Fanning,A.S., Fu,C., Xu, J.,Marfatia, S.M., Chishti,A.H., Crompton,A., Chan,A.C., Anderson, J.M. & Cantley, L.C. 1997, "Recognition of unique carboxyl‐terminalmotifsbydistinctPDZdomains",Science(NewYork,N.Y.),vol.275,no.5296,pp.73‐77.

Sreerama, N., Manning, M.C., Powers, M.E., Zhang, J.X., Goldenberg, D.P. &Woody, R.W.1999,"Tyrosine,phenylalanine,anddisulfidecontributionstothecirculardichroismof proteins: circular dichroism spectra of wild‐type and mutant bovine pancreatictrypsininhibitor",Biochemistry,vol.38,no.33,pp.10814‐10822.

Sreerama,N.,Venyaminov,S.Y.&Woody,R.W.1999,"Estimationofthenumberofalpha‐helicalandbeta‐strandsegmentsinproteinsusingcirculardichroismspectroscopy",Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety,vol.8,no.2,pp.370‐380.

Stefani,M.2012,"Structural featuresandcytotoxicityofamyloidoligomers: implicationsin Alzheimer's disease and other diseases with amyloid deposits", Progress inneurobiology,vol.99,no.3,pp.226‐245.

Stevens, F.J. 2000, "Four structural risk factors identify most fibril‐forming kappa lightchains",Amyloid:theinternationaljournalofexperimentalandclinicalinvestigation:theofficialjournaloftheInternationalSocietyofAmyloidosis,vol.7,no.3,pp.200‐211.

Stevens,P.W.,Raffen,R.,Hanson,D.K.,Deng,Y.L., Berrios‐Hammond,M.,Westholm,F.A.,Murphy,C.,Eulitz,M.,Wetzel,R.&Solomon,A.1995,"Recombinantimmunoglobulinvariable domains generated from synthetic genes provide a system for in vitrocharacterizationoflight‐chainamyloidproteins",Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety,vol.4,no.3,pp.421‐432.

Thomas, K. 2012, Trials for Alzheimer’s drug halted after poor results., The New YorkTimes.,US.

Thompson,J.D.,Higgins,D.G.&Gibson,T.J.1994,"CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position‐specific gappenalties andweightmatrix choice",Nucleicacids research,vol. 22, no.22,pp.4673‐4680.

Trinkaus‐Randall,V.,Walsh,M.T.,Steeves,S.,Monis,G.,Connors,L.H.&Skinner,M.2005,"Cellularresponseofcardiacfibroblaststoamyloidogeniclightchains",TheAmericanjournalofpathology,vol.166,no.1,pp.197‐208.

VII‐Bibliografia

283

Trovato, A., Chiti, F.,Maritan, A. & Seno, F. 2006, "Insight into the structure of amyloidfibrilsfromtheanalysisofglobularproteins",PLoScomputationalbiology,vol.2,no.12,pp.e170.

Tsai,N.P.,Wilkerson,J.R.,Guo,W.,Maksimova,M.A.,DeMartino,G.N.,Cowan,C.W.&Huber,K.M. 2012, "Multiple autism‐linked genes mediate synapse elimination viaproteasomaldegradationofasynapticscaffoldPSD‐95",Cell,vol.151,no.7,pp.1581‐1594.

Tsytlonok,M.&Itzhaki,L.S.2013,"Thehow'sandwhy'sofproteinfoldingintermediates",ArchivesofBiochemistryandBiophysics,vol.531,no.1‐2,pp.14‐23.

Umeda,K.,Ikenouchi,J.,Katahira‐Tayama,S.,Furuse,K.,Sasaki,H.,Nakayama,M.,Matsui,T.,Tsukita,S.,Furuse,M.&Tsukita,S.2006,"ZO‐1andZO‐2independentlydeterminewhereclaudinsarepolymerizedintight‐junctionstrandformation",Cell,vol.126,no.4,pp.741‐754.

Uversky,V.N.2013,"Adecadeandahalfofprotein intrinsicdisorder:Biologystillwaitsforphysics",Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety,.

Uversky,V.N.&Fink,A.L.2004, "Conformational constraints foramyloid fibrillation: theimportanceofbeingunfolded",Biochimicaetbiophysicaacta,vol.1698,no.2,pp.131‐153.

Vallabhajosyula, R.R., Chakravarti, D., Lutfeali, S., Ray, A. & Raval, A. 2009, "Identifyinghubsinproteininteractionnetworks",PloSone,vol.4,no.4,pp.e5344.

vanAnken, E.&Braakman, I. 2005, "Endoplasmic reticulum stress and themaking of aprofessionalsecretorycell",Criticalreviewsinbiochemistryandmolecularbiology,vol.40,no.5,pp.269‐283.

vandenBerg,S.,Lofdahl,P.A.,Hard,T.&Berglund,H.2006,"ImprovedsolubilityofTEVproteasebydirectedevolution",JournalofBiotechnology,vol.121,no.3,pp.291‐298.

VanRossum,G.1991,Python(programminglanguage),PythonSoftwareFoundation.

Viguera, A.R., Martinez, J.C., Filimonov, V.V., Mateo, P.L. & Serrano, L. 1994,"Thermodynamic and kinetic analysis of the SH3 domain of spectrin shows a two‐statefoldingtransition",Biochemistry,vol.33,no.8,pp.2142‐2150.

Villegas,V.,Azuaga,A.,Catasus,L.,Reverter,D.,Mateo,P.L.,Aviles,F.X.&Serrano,L.1995,"Evidenceforatwo‐statetransitioninthefoldingprocessoftheactivationdomainofhumanprocarboxypeptidaseA2",Biochemistry,vol.34,no.46,pp.15105‐15110.

Villegas,V.,Martinez,J.C.,Aviles,F.X.&Serrano,L.1998,"StructureofthetransitionstateinthefoldingprocessofhumanprocarboxypeptidaseA2activationdomain",JournalofMolecularBiology,vol.283,no.5,pp.1027‐1036.

Vivian,J.T.&Callis,P.R.2001,"Mechanismsoftryptophanfluorescenceshiftsinproteins",Biophysicaljournal,vol.80,no.5,pp.2093‐2109.

VII‐Bibliografia

284

Wall,J.,Schell,M.,Murphy,C.,Hrncic,R.,Stevens,F.J.&Solomon,A.1999,"Thermodynamicinstability of human lambda 6 light chains: correlation with fibrillogenicity",Biochemistry,vol.38,no.42,pp.14101‐14108.

Wall, J.G. & Pluckthun, A. 1999, "The hierarchy of mutations influencing the folding ofantibodydomainsinEscherichiacoli",Proteinengineering,vol.12,no.7,pp.605‐611.

Walther,F.J.,Waring,A.J.,Hernandez‐Juviel,J.M.,Gordon,L.M.,Wang,Z.,Jung,C.L.,Ruchala,P., Clark, A.P., Smith,W.M., Sharma, S. & Notter, R.H. 2010, "Critical structural andfunctional roles for the N‐terminal insertion sequence in surfactant protein Banalogs",PloSone,vol.5,no.1,pp.e8672.

Weiss,G.A.,Watanabe,C.K.,Zhong,A.,Goddard,A.&Sidhu,S.S.2000,"Rapidmappingofprotein functional epitopes by combinatorial alanine scanning", Proceedings of theNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.97,no.16,pp.8950‐8954.

Wiederstein,M.&Sippl,M.J.2007,"ProSA‐web:interactivewebservicefortherecognitionoferrorsinthree‐dimensionalstructuresofproteins",Nucleicacidsresearch,vol.35,no.WebServerissue,pp.W407‐10.

Wimo,A.&Prince,M.2010,WorldAlzheimerReport2010,TheGlobalEconomicImpactofDementia,Alzheimer’sDiseaseInternational,London,2010.

Wisniewski, T. & Konietzko, U. 2008, "Amyloid‐beta immunisation for Alzheimer'sdisease",Lancetneurology,vol.7,no.9,pp.805‐811.

Wolynes,P.G.,Onuchic,J.N.&Thirumalai,D.1995,"Navigatingthefoldingroutes",Science(NewYork,N.Y.),vol.267,no.5204,pp.1619‐1620.

Worn, A. & Pluckthun, A. 2001, "Stability engineering of antibody single‐chain Fvfragments",JournalofMolecularBiology,vol.305,no.5,pp.989‐1010.

Worn,A.&Pluckthun,A.1999,"DifferentequilibriumstabilitybehaviorofScFvfragments:identification,classification,andimprovementbyproteinengineering",Biochemistry,vol.38,no.27,pp.8739‐8750.

Worn,A.&Pluckthun,A.1998,"MutualstabilizationofVLandVHinsingle‐chainantibodyfragments, investigatedwithmutantsengineeredforstability",Biochemistry,vol.37,no.38,pp.13120‐13127.

Wu,J.,Yang,Y.,Zhang,J.,Ji,P.,Du,W.,Jiang,P.,Xie,D.,Huang,H.,Wu,M.,Zhang,G.,Wu,J.&Shi,Y.2007,"Domain‐swappeddimerizationof thesecondPDZdomainofZO2mayprovideastructuralbasisforthepolymerizationofclaudins",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.282,no.49,pp.35988‐35999.

Wu,J.W.,Breydo,L.,Isas,J.M.,Lee,J.,Kuznetsov,Y.G.,Langen,R.&Glabe,C.2010,"Fibrillaroligomersnucleate theoligomerizationofmonomericamyloidbetabutdonotseedfibrilformation",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.285,no.9,pp.6071‐6079.

Wu,T.T.&Kabat,E.A.1970,"AnanalysisofthesequencesofthevariableregionsofBenceJones proteins and myeloma light chains and their implications for antibodycomplementarity",TheJournalofexperimentalmedicine,vol.132,no.2,pp.211‐250.

VII‐Bibliografia

285

Wuthrich,K.2001,"ThewaytoNMRstructuresofproteins",Naturestructuralbiology,vol.8,no.11,pp.923‐925.

Yankner, B.A., Dawes, L.R., Fisher, S., Villa‐Komaroff, L., Oster‐Granite,M.L. & Neve, R.L.1989, "Neurotoxicity of a fragment of the amyloid precursor associated withAlzheimer'sdisease",Science(NewYork,N.Y.),vol.245,no.4916,pp.417‐420.

Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S.V. & Sierks, M.R. 2008, "Anti‐oligomeric Abeta single‐chain variable domain antibody blocks Abeta‐inducedtoxicity against human neuroblastoma cells", JournalofMolecularBiology,vol. 384,no.4,pp.917‐928.

Zandomeneghi, G., Krebs, M.R., McCammon, M.G. & Fandrich, M. 2004, "FTIR revealsstructural differences between native beta‐sheet proteins and amyloid fibrils",Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety,vol.13,no.12,pp.3314‐3321.

Zhang,J.,Lewis,S.M.,Kuhlman,B.&Lee,A.L.2013,"SupertertiaryStructureoftheMAGUKCorefromPSD‐95",Structure(London,England:1993),vol.21,no.3,pp.402‐413.

Zhang, J., Petit, C.M., King, D.S. & Lee, A.L. 2011, "Phosphorylation of a PDZ domainextension modulates binding affinity and interdomain interactions in postsynapticdensity‐95 (PSD‐95) protein, a membrane‐associated guanylate kinase (MAGUK)",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.286,no.48,pp.41776‐41785.

Zhang,X.,Xu,J.&Xiao,W.X.2013,"Anewmethodforthediscoveryofessentialproteins",PloSone,vol.8,no.3,pp.e58763.

Zheng,L.,Baumann,U.&Reymond,J.L.2003,"ProductionofafunctionalcatalyticantibodyScFv‐NusA fusion protein in bacterial cytoplasm", Journal ofBiochemistry, vol. 133,no.5,pp.577‐581.

APÈNDIXD’ARTICLES.

An anti‐Aβ (amyloid β) single‐chain variable fragment prevents amyloid fibrilformationandcytotoxicitybywithdrawingAβoligomersfromtheamyloidpathwayMarin‐Argany,M.*,Rivera‐Hernández,G.*,Martí‐Clua,J.&Villegas,S.BiochemicalJournal437,25–34(doi:10.1042/BJ20101712)2011*Firstco‐authorEarly intervention in the 3xTg‐AD mice with an amyloid β‐antibody fragmentamelioratesfirsthallmarksofAlzheimerdisease.Giménez‐Llort,L.,Rivera‐Hernández,G.,Marin‐Argany,M.,Sánchez‐Quesada,JL.&Villegas,S.mAb5:5,665–677(doi:10.4161/mabs.25424)2013Elongation of the C‐terminal domain of an anti‐amyloid Aβ single‐chain variablefragment increases its thermodynamic stability and decreases its aggregationtendencyRivera‐Hernández,G.*,Marin‐Argany,M.*,Blasco‐Moreno,B.,BonetJ.,OlivaB.&Villegas,S.mAb5:5,678–689(doi:10.4161/mabs.25382)2013*Firstco‐authorThe interconversion between a flexible β‐sheet and a fibril β‐arrangementconstitutes the main conformational event during misfolding of PSD95‐PDZ3domainMarín‐Argany,M.*,Candel,MA.*,Murciano‐Calles,J.,Martinez,JC.&Villegas,S.BiophysicalJournal103,738‐47(doi:10.1016/j.bpj.2012.07.029)2012*Firstco‐authorAthermodynamicstudyofthethirdPDZdomainofMAGUKneuronalproteinPSD‐95revealsacomplexthree‐statefoldingbehaviorMurciano‐Calles,J.,Martinez,JC.,Marín‐Argany,M.,Villegas,S.&Cobos,ES.BiophysicalChemistry,SubmittedonSeptember,2013The impactofextra‐domainstructuresandpost‐translationalmodifications in thefolding/misfoldingbehaviourofthethirdPDZdomainofMAGUKneuronalproteinPSD‐95Marín‐Argany,M.*,Murciano‐Calles,J.*,Cobos,ES.,Villegas,S.&Martinez,JC.*Firstco‐authorArticleenredacció

proteïnes - UAB Barcelonade totes les tesis, així que vull donar les gràcies, que siguin...

Documents

Transcript of proteïnes - UAB Barcelonade totes les tesis, així que vull donar les gràcies, que siguin...