TESI DOCTORAL
Estudi de la via d’agregació de tres proteïnes
implicades en diferents malalties
conformacionals humanes:
scFv‐h3D6 com agent terapèutic per a la malaltia d’Alzheimer,
AL‐12 com a causa d’Amiloïdosi de cadena lleugera, i PDZ3 com
a organitzador del proteoma.
Marta Marin Argany
Setembre 2013
DEPARTAMENT DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR
Estudi de la via d’agregació de tres proteïnes
implicades en diferents malalties
conformacionals humanes:
scFv‐h3D6 com agent terapèutic per a la malaltia d’Alzheimer,
AL‐12 com a causa d’Amiloïdosi de cadena lleugera, i PDZ3 com
a organitzador del proteoma.
Tesi presentada per Marta Marin Argany per optar al grau de Doctora en Bioquímica i Biologia Molecular sota la direcció de la Dra. Sandra Villegas
Hernández.
Unitat de Biociències del Departament de Bioquímica i Biologia Molecular. Universitat Autònoma de Barcelona.
Marta Marin Argany Dra. Sandra Villegas Hernández
Bellaterra, Setembre 2013
Alamevamareialmeupare
AGRAÏMENTS.
Perfielsagraïments!!Fatempsqueimaginoelqueescriuriaalsagraïments,iem
sortienunesfrasesfantàstiquesperatoteslespersonesquehanpassatperlamevavida
durantaquestsanysdetesi.Iara...iaranoséquèposar!!Jaja!!Nomésse’mpassapelcap
“s’haacabat!!ueeeee!!”.Peròbé,som‐hi!Que,alfinal,elsagraïmentséslapartmésllegida
detoteslestesis,aixíquevulldonarlesgràcies,quesiguininfinites,atotalagentquem’ha
ajudatiquehacregutenmiperpodercomençar,seguir,iacabaraquestaèpocadoctoral:
Laprimerapersona,laSandra.Agrair‐tetotimés.Maioblidaréeldiaqueemvaig
passarpelteudespatxenbuscad’algunarecomanacióperferpràctiquesalestrangerien
vaig sortir, al cap de quasi tres hores, amb una beca de doctorat entre les mans i mig
tremolant. Encara no acabo d’entendre què et va fer escollir‐me, jo que no aspirava a
massacosa!Peròvascreureenmidesdelprimermoment,iaixíencarahofas.Gràciesper
lagranpaciènciaquehastingutambmi,perensenyar‐metotdesdezero,per“deixar‐me”
arribar a les tantes al laboratori, per fer‐me científica. Gràcies per ser tan positiva i els
bons consells en les meves èpoques de crisi existencial científica. I mil gràcies per les
varies copesde cava, les conversesentrepitis, iperhaverescollit elmillor companyde
laboratoridemón,elGyo!
Gyo!camarada!Queyacasisomosdoctores!Jajaja!!Surrealista,verdad?Ycuando
decíamos “por qué no escogimos ser biólogos de campo, así ahora estaríamos filmando
documentalesporÁfrica,envezdepasarnoseldíapurificandoproteínasqueniseven!Y
siempre terminábamos “será que, en el fondo, nos encanta esto de las columnitas y las
diálisis,sinonoseentiende...”.Gyo,quegrandeconocerteytrabajarjuntos.Sintiestátesis
nosería lamisma,ymisañosenel labotampoco.Muchasgraciasporestarsiempreallí,
cerquita, pendiente y ayudando, sin necesidad demuchas palabras.Muchas gracias por
crearelcaosdentrodemiorden.Esosí,lapróximavezquenosencontremosnotevoya
limpiarniunaprobeta,quelosepas!Ahorasi…Vencimos!
I que no falti el Bernat! Bernaaaaat!! que vas arribar i ben formar el trio PFs
(Perro‐Flautasdeienalguns!).Quinabonaèpocaquevampassarelstres,iquèbéqueens
vas ajudar amb els p**** scrambleds!! Llàstima que haguessis de marxar, però sempre
quedaunmoltbonamicperanaraferbirresicompartirgransconverses!
IlaanovageneraciódePFs,queheuhagutd’aprendretotelquesabíemamarxes
forçadesisempreapuntperdonar‐nosuncopdemà.Moltbonafeina!Aquestbest‐seller
tambévapervosaltres,Laia,GiselaiJofre,iusdesitjounbondoctoratatotstres.
Apartdelgrup,agrairatotalagentdeldepartament,enespecialalskinàsics,per
deixar‐nostotelquefeiafaltaquanencaranoteníemellabomuntat.AlMohammed,pels
bons consells de savi, sempre a punt per ajudar en tot moment. L’Helena! Per tota la
feinadaquefa!iperrecordar‐nosquehemdefercomandesdetantentant!Icomono...al
Salva,persercomés, tanrondinairecombonapersona, ideixar‐meentraralxiringuito
sempreaúltimahoraiamblespresses.Iatotalarestadecompanysicompanyes,quede
ben segur quem’heu ajudat amb algun experiment, algun reactiu, algunmaterial, algun
conselloalgunaconversadistretaentrepassadissosicentrífugues...moltesgràcies!
GràciesalaMarinaiatotalagentdelaClínicaMayo,perdonar‐melaoportunitat
de treballar amb ells. I al Jose i al seu grup de Granada, per les bones i agraïdes
col·laboracions que hem fet. Així com al Baldo i al seu grup de Bioinformàtica per
ensenyar‐meunamicadelseumóncomputacional.
Però què seria de tot plegat sense la famíliamigdia‐tincgana‐baixem‐solete‐bar‐
birres‐taper‐cafè?Noresseria!Quantscafèshauremfet?Iquinsfartsderiure?Heuestat
la millor teràpia per sobreviure en el món del laboratori. Aquesta tesi va dedicada a
vosaltres David, Pol, Font, Albert Serra, el Bigotis...i tots els que heu anat passant pels
dinarsiconversesdetaper.Enespecialperòalesmevesduesnenes:laPaulailaRitu.Ole
vosaltres!
IaraarribaeltorndeLaGranFamíliadeCanCargoliCanColoratta:lamevavida
paral·lela a la ciència. Sortde tenir‐vos cadadia al arribar a casa i perdistreure’mamb
plans irresistibles. Gràcies per voler entendre què hi faig tantes hores al labo, tot i que
semprehaestatmoltmésdivertitintentarcanviarelmón,oiquesi?Sougenials!
IquenofaltitotelgrupdeBioNenes:laDesi,laLaia,laJové,laPaula,laPadro,la
MireilaNeus.Nenes,aquestavapervosaltresitotselsanysqueportemjuntes!
A la Moni i a la Batet, i tota la penya de l’espardenya d’Horta República
Independent!
Ytambiénati,Roo,imposiblenoponerteentreestaslíneas,formaspartedeellasy
demi.
A laBola,porquesin tinuncahubierahechoundoctorado,aunquedigasqueno,
mehicistecrecericreerenmi,yesoniconunatesisseagradece.
I per tu, Kons.Mil gràcies per la paciència que has tingut durant l’últim any de
doctorat.Pelsànimsilaforçaquem’hasdonatperacabarambtotaixò.Perentendre’mi
aguantar‐me.Perser‐hisempreiseguiravançant!
Iperacabar,vulldedicarplenamentaquestatesialamevamare,almeupare,ials
meusgermans,elDavidielFerran.TambéalaNúriaialaLaia,iquenofaltinelspetits,el
JanilaLluna.ComtambéalrecorddelaPadrina.Pertotelvostrerecolzamentinfinitiper
quèusestimomolt!
ix
ÍNDEX.
AGRAÏMENTS.....................................................................................................................................................vii
ÍNDEX.....................................................................................................................................................................ix
ÍNDEXDEFIGURESITAULES.....................................................................................................................xvii
ABREVIATURES................................................................................................................................................xxi
Taulad’abreviaturesdelsaminoàcidsproteïnogènics...............................................................................xxv
Taulad’abreviaturesdelsnucleòtidsdeDNA/RNA.....................................................................................xxv
I. RESUM...........................................................................................................................................................1
II. INTRODUCCIÓ.............................................................................................................................................5
1. ESTRUCTURAIPLEGAMENTDEPROTEÏNES....................................................................................7
1.1. Antecedentshistòrics.....................................................................................................................................8
1.2. Energèticadeplegament..............................................................................................................................9
1.3. Embutsdeplegament.................................................................................................................................11
1.3.1. Intermediarisdeplegament................................................................................................12
2. Agregacióamiloide................................................................................................................................15
2.1. Mecanismedeformaciódefibresamiloides....................................................................................16
2.1.1. Determinantsamiloidogènics.............................................................................................19
2.2. Estructuradelesfibresamiloides.........................................................................................................19
2.3. Tipusdeviesamiloidogèniques.............................................................................................................20
2.3.1. Viadefibril·lacióamiloide...................................................................................................21
2.3.2. Viadefibril·lacióworm‐like................................................................................................22
2.4. Oligòmerssolubles.......................................................................................................................................23
2.4.1. Toxicitatdelsoligòmerssolubles.......................................................................................24
3. Amiloïdosiomalaltiesamiloidogèniques......................................................................................27
3.1. Malaltiad’Alzheimer....................................................................................................................................29
3.1.1. Proteïnaprecursoraamiloide,APP..................................................................................30
3.1.2. Hipòtesidelacascadaamiloide.........................................................................................32
3.1.3. Immunoteràpiacontral’Aβ.................................................................................................33
3.1.3.1. Fragmentsrecombinantsderivatsd’anticossos,scFv...................35
3.2. AmiloïdosisdeCadenaLleugera............................................................................................................37
3.2.1. VariabilitatdeseqüènciadelesLCiamiloidogènesi...............................................38
3.2.2. EstabilitatiagregaciódelescadenesLC.......................................................................39
3.2.3. DeterminantsestructuralsdelesproteïnesLCsamiloidogèniques...................39
3.2.3.1. InterfíciedelsdímersVL‐VLiamiloidogènesi...................................41
3.2.4. Futuresestratègiesterapèutiques....................................................................................43
4. Interactomaimalaltieshumanes......................................................................................................45
4.1. Proteïneshubidominismodulars........................................................................................................45
4.2. DominisPDZ....................................................................................................................................................47
x
4.2.1. CaracteritzacióestructuraldelsdominisPDZ.............................................................48
4.3. LaproteïnaPSD‐95......................................................................................................................................49
4.3.1. DominiPDZ3delaproteïnaPSD‐95................................................................................50
4.3.1.1. Hèlix‐α3addicionaldeldominiPDZ3...................................................51
4.3.1.2. Loopβ2‐β3deldominiPDZ3....................................................................52
4.4. MalaltiesrelacionadesambelsdominisPDZ...................................................................................53
III. OBJECTIUS.................................................................................................................................................57
IV. MATERIALSIMÈTODESGENERALS..................................................................................................61
1. AparellsGenerals...................................................................................................................................65
2. TècniquesdeDNARecombinant.......................................................................................................67
2.1. Reaccióencadenadelapolimerasa,PCR..........................................................................................67
2.1.1. Dissenyd’encebadorsdePCR..............................................................................................67
2.1.2. MutagènesiDirigida................................................................................................................68
2.1.2.1. Reacciódemutagènesi................................................................................68
2.1.2.2. DigestióambDpnI..........................................................................................69
2.1.2.3. TransformacióproductesdePCR...........................................................69
2.2. IntroducciódeDNAforaniacèl·lulesbacterianes.........................................................................70
2.1.3. Preparaciódecèl·lulescompetentsd’E.coli.................................................................70
2.1.4. Transformaciódecèl·lulescompetentsd’E.coli.........................................................70
2.2. ExtracciódeDNAplasmídicdecèl·lulesd’E.coli............................................................................71
2.3. SeqüenciaciódelDNA.................................................................................................................................71
2.4. DeterminacióespectrofotomètricadelaconcentraciódeDNA...............................................72
3. Sistemesd’expressióipurificació.....................................................................................................73
3.1. Soquesd’Escherichiacoli..........................................................................................................................73
3.1.1. Soquesd’E.coliperalclonatgeiextracciódeDNAplasmídic.............................73
3.1.2. Soquesd’E.coliperal’expressióheteròlogadeproteïnes.....................................73
3.2. Mantenimentsoquesbacterianes..........................................................................................................74
3.2.1. Glicerinats15%.........................................................................................................................74
3.3. Medisdecultiu...............................................................................................................................................75
3.3.1. Medilíquid...................................................................................................................................75
3.3.1.1. MediLB...............................................................................................................75
3.3.1.2. Medi2xYT..........................................................................................................75
3.3.2. Medisòlid.....................................................................................................................................75
3.3.3. Antibiòtics....................................................................................................................................76
3.4. Vectorsd’expressió......................................................................................................................................76
3.5. Expressióheteròlogadeproteïnes.......................................................................................................78
3.5.1. Inducciódel’expressió............................................................................................................78
3.5.2. Obtenciódelextractecel·lular............................................................................................79
xi
3.6. Tècniquesdecromatografialíquida.....................................................................................................79
3.6.1. Cromatografiad’afinitat.......................................................................................................79
3.6.1.1. Cromatografiad’afinitatambhistidines..............................................79
3.6.1.2. Cromatografiaatmosfèricad’afinitatperlipopolisacàrids..........80
3.6.2. Cromatografiadebescanviiònicd’altaresolució.....................................................80
3.6.3. Cromatografiad’exclusiómolecular................................................................................82
3.6.3.1. Cromatografiad’exclusiómoleculard’altaresolució.....................82
3.6.3.2. Cromatografiaatmosfèricad’exclusiómolecularperintercanvi
detampó.83
3.7. Mètodesd’intercanvidetampóoextracciódesals.......................................................................84
3.7.1. Diàlisi.............................................................................................................................................84
3.7.1.1. Pretractamentdelssacsdediàlisi..........................................................84
3.8. Concentraciódelvolumdelesmostresproteiques.......................................................................85
3.9. ElectroforesienSDS‐PAGE.......................................................................................................................85
3.9.1. Preparaciódelgeld’acrilamida.........................................................................................86
3.9.2. Tincióidestinciódelgeld’acrilamida............................................................................87
4. tècniquesespectroscòpiques.............................................................................................................89
4.1. Determinaciódelaconcentraciódeproteïna..................................................................................89
4.2. DicroismeCircular........................................................................................................................................89
4.3. Fluorescènciadelsresidusdetriptòfan..............................................................................................90
4.3.1. Desnaturalitzacióquímicaiobtenciódeparàmetrestermodinàmics.............91
4.4. FluorescènciadelsfluoròforsTioflavinaTiANS............................................................................92
4.5. Espectroscòpiad’infraroigambtransformadadeFourier(FTIR)..........................................93
4.6. Microscòpiaelectrònicadetransmissió(TEM)...............................................................................94
4.6.1. TinciónegativadelesmostresdeTEM...........................................................................94
5. CultiusCel·lulars.....................................................................................................................................97
5.1. Líniacel·lulardeneuroblastomahumàSH‐SY5Y...........................................................................97
5.2. Subcultiucel·lular.........................................................................................................................................97
5.3. Reservoridelalíniacel·lular...................................................................................................................98
5.4. Comptatgedecèl·lules................................................................................................................................98
5.5. Experimentsdeviabilitatcel·lulardeSH‐SY5Y...............................................................................99
5.5.1. AssajosdeviabilitatperMTT..............................................................................................99
6. TècniquesbioinformàtiqUes............................................................................................................101
6.1. Modelatgetridimensionaldel’scFv‐h3D6......................................................................................101
6.2. ExPASy............................................................................................................................................................101
V. CAPÍTOLS................................................................................................................................................103
xii
CAPÍTOL 1: Un fragment variable de cadena senzilla (scFv‐h3D6) anti‐Aβ impedeix la
formació de fibres amiloides i la citotoxicitat del pèptid Aβ mitjançant la retirada
d’oligòmersdelaviaamiloide..................................................................................................................105
1. RESUM......................................................................................................................................................107
2. INTRODUCCIÓ........................................................................................................................................109
3. MATERIALSIMÈTODES......................................................................................................................113
3.1. Expressióipurificaciódel’scFv‐h3D6.............................................................................................113
3.1.1. Expressióheteròlogadel’scFv‐h3D6............................................................................113
3.1.2. LLisiCel·lular...........................................................................................................................113
3.1.3. Solubilitzaciódelafraccióproteicainsoluble..........................................................114
3.1.4. Replegamentgotaagotadelafraccióproteicasolubilitzada.........................114
3.1.5. DigestióambproteasaTEV..............................................................................................114
3.1.6. Cromatografiad’afinitatambhistidines....................................................................115
3.1.7. Cromatografiadebescanvicatiònic.............................................................................116
3.2. ExpressióipurificaciódelaproteasaTEV.....................................................................................117
3.2.1. ExpressióheteròlogadelaproteasaTEV...................................................................117
3.2.2. PurificaciócitoplasmàticadelaproteasaTEV........................................................118
3.2.3. Cromatografiad’afinitatambhistidinesd’altaresolució...................................118
3.3. Determinaciódel’estructurasecundàriadel’scFv‐h3D6........................................................118
3.3.1. EspectredeCDalUV‐llunyà.............................................................................................119
3.3.2. Espectred’infraroigambtransformadadeFourier..............................................119
3.3.3. Desnaturalitzaciótèrmica.................................................................................................119
3.4. PreparaciódelpèptidAβ1‐42..................................................................................................................120
3.5. AgregaciódelpèptidAβ1‐42il’scFv‐h3D6.......................................................................................120
3.6. Assajosdecitotoxicitat............................................................................................................................120
3.6.1. Preparaciómostresd’scFv‐h3D6peralsassajosdecitotoxicitat....................121
3.7. Microscòpiaelectrònicadetransmissió(TEM)............................................................................122
3.8. Assajosd’agregacióperfluorescència.ThTiANS.......................................................................123
4. RESULTATS.............................................................................................................................................127
4.1. Expressióipurificaciódel’scFv‐h3D6.............................................................................................127
4.1.1. Dimeritzacióiformesscrambleddel’scFv‐h3D6....................................................128
4.2. Identificaciódel’intermediarid’agregacióWLdel’scFv‐h3D6............................................130
4.3. Prevenciódelatoxicitatdel’Aβ1‐42perl’scFv‐h3D6..................................................................133
4.4. MisfoldingdelpèptidAβ1‐42...................................................................................................................135
4.5. Misfoldingdel’scFv‐h3D6......................................................................................................................137
4.6. MisfolgingdelcomplexAβ1‐42‐scFv‐h3D6.......................................................................................138
5. DISCUSSIÓ...............................................................................................................................................141
5.1. Expressiódel’scFv‐h3D6il’activitatdelaxaperonatrx..........................................................141
5.2. Perfildeplegamentdel’scFv‐h3D6sotapertorbaciótèrmica..............................................141
5.3. Efectedel’scFv‐h3D6sobrelafibril·lacióicitotoxicitatdelpèptidAβ1‐42.......................142
xiii
5.4. Efectedel’scFv‐h3D6invivo................................................................................................................143
CAPÍTOL2:Modelatgetridimensionald’unfragmentvariabledecadenasenzilla(scFv‐h3D6)
específiccontraelpèptidAβ1‐42iredissenyracionaldelamolècula...........................................145
1. RESUM......................................................................................................................................................147
2. INTRODUCCIÓ........................................................................................................................................149
3. MATERIALSIMÈTODES......................................................................................................................153
3.1. Recercadeproteïnamotlleperhomologiadeseqüència........................................................153
3.2. ModelatgetridimensionaldelscFv‐h3D6.......................................................................................153
3.3. Numeracióestàndarddel’scFv‐h3D6ilocalitzaciódelesregionsCDR...........................154
3.4. Caracteritzacióestructuraldelmodeld’scFv‐h3D6perDSSP...............................................154
3.5. Predicciódetendènciaal’agregacióperTANGO.........................................................................154
3.6. AlineamentMúltipleiResidusConservats.....................................................................................155
3.7. AminoàcidScanning‐Mutation.............................................................................................................155
4. RESULTATS.............................................................................................................................................157
4.1. Proteïnamotlle:l’scFvespecíficcontradelvirusSARS............................................................157
4.2. Possibilitatsdemodels3Dperal’scFv‐h3D6...............................................................................158
4.3. Determinaciódelmodeldemínimaenergia..................................................................................159
4.4. NumeracióKabatdel’scFv‐h3D6ilocalitzaciódelesregionsCDR....................................160
4.5. Caracteritzaciódelmodeltridimensionaldel’scFv‐h3D6.......................................................162
4.6. Exposiciódelsresidusalsolvent........................................................................................................163
4.7. Predicciódetendènciaal’agregació.................................................................................................164
4.8. AlineamentMúltiple.................................................................................................................................165
4.9. AminoàcidScanning‐Mutation.............................................................................................................167
4.10. Redissenydel’scFv‐h3D6apartirdelmodel3D.........................................................................168
4.10.1. Mutacionsenelnuclihidrofòbic..................................................................................168
4.10.1.1. Resultatsexperimentalsdelsmutantsdissenyats.....................170
4.10.2. Re‐dissenydelextremC‐terminaldel’scFv‐h3D6................................................171
5. DISCUSSIÓ...............................................................................................................................................173
5.1. Mutacionsalnuclihidrofòbicaugmentenlatendènciaal’agregaciódel’scFv‐h3D6.174
5.2. L’elongaciódel extremC‐terminal augmenta l’estabilitat termodinàmica idisminueix
latendènciaal’agregaciódell’scFv‐h3D6......................................................................................................175
CAPÍTOL 3: Estudi inicial, mitjançant tècniques espectroscòpiques, de les propietats
termodinàmiques d’un domini variable d’Ig implicat en l’Amiloïdosi de cadena lleugera.
Mutacionsrestaurativesiestabilitat......................................................................................................177
1. RESUM......................................................................................................................................................179
2. INTRODUCCIÓ........................................................................................................................................181
3. MATERIALSIMÈTODES......................................................................................................................185
3.1. MutagènesiDirigida..................................................................................................................................185
3.2. Expressióheteròlogadel’AL‐12imutantsrestauratius..........................................................186
xiv
3.3. Purificacióproteïnaperiplasmàticasoluble..................................................................................186
3.3.1. Cromatografiadebescanvianiònic..............................................................................187
3.3.2. Cromatografiad’exclusiómolecular.............................................................................187
3.4. Purificacióproteïnacitoplasmàticainsoluble...............................................................................188
3.4.1. LLisiCel·lular...........................................................................................................................188
3.4.2. Solubilitzaciódelafraccióproteicainsoluble..........................................................189
3.4.3. Replegamentperdiàlisidelafraccióproteicainsoluble.....................................189
3.5. Determinaciódel’estructurasecundàriaiterciàriadel’AL‐12imutants.......................189
3.5.1. EspectreCDalUV‐llunyà...................................................................................................189
3.5.2. Espectredefluorescènciadelresidudetriptòfan...................................................190
3.5.3. DesnaturalitzaciótèrmicaperfluorescènciaiCD..................................................190
3.5.4. Desnaturalitzacióquímicaperfluorescència...........................................................190
3.5.4.1. Obtenciódelsparàmetrestermodinàmics.......................................190
3.6. Estudid’agregaciódel’AL12imutantsperFTIR........................................................................191
4. RESULTATS.............................................................................................................................................193
4.1. Estructurasecundàriadel’AL‐12.......................................................................................................193
4.1.1. Estructurasecundàriadelsmutantsrestauratius..................................................194
4.2. Desnaturalitzaciótèrmicadel’AL‐12................................................................................................196
4.2.1. Desnaturalitzaciótèrmicadelsmutantsrestauratius..........................................197
4.3. Estabilitattermodinàmicadel’AL‐12...............................................................................................199
4.3.1. Estabilitattermodinàmicadelsmutantsrestauratius.........................................201
4.4. Estudidel’agregaciódel’AL‐12perFTIR.......................................................................................201
4.4.1. Estudidel’agregaciódelsmutantsrestauratius.....................................................205
5. DISCUSSIÓ...............................................................................................................................................207
5.1. Estructurasecundària,desplegamentiestabilitatdeldominiAL‐12................................207
5.2. Viad’agregaciódeldominiAL‐12induïdapertemperatura..................................................208
5.3. Efectedelesmutacionsrestaurativessobrel’agregacióiestabilitatdeldominiAL‐12.
209
5.4. Expectativesdefuturenelestudidel’agregaciódel’AL‐12..................................................210
CAPÍTOL4:EstudiperFTIRde laviad’agregaciódeldominiPSD95‐PDZ3:Reorganització
estructural en fibres‐β de tipus worm‐like i citotoxicitat, i implicació de l’hèlix‐α3 en
l’estabilitatiagregaciódeldominiPDZ3...............................................................................................213
1. RESUM......................................................................................................................................................215
2. INTRODUCCIÓ........................................................................................................................................217
3. MATERIALSIMÈTODES......................................................................................................................221
3.1. ExpressióipurificaciódeldominiPDZ3imutants.....................................................................221
3.2. AgregaciódeldominiPDZ3imutants..............................................................................................221
3.3. Espectroscòpiad’infraroigambtransformadadeFourier......................................................221
3.4. Microscòpiaelectrònicadetransmissió(TEM)............................................................................222
xv
3.5. AssajosdecitotoxicitatdeldominiPDZ3........................................................................................222
3.6. ExperimentsdeDSC,DLSiCDdelesdiferentsvariantsdeldominiPDZ3......................223
3.7. Espectroscòpiad’RMN.............................................................................................................................223
4. RESULTATS.............................................................................................................................................225
4.1. EspectredeFTIRdeldominiPDZ3natiu........................................................................................225
4.1.1. EspectredeFTIRdel’agregaciódeldominiPDZ3..................................................227
4.1.2. Influenciadelaforçaiònicasobrel’agregaciódeldominiPDZ3....................228
4.1.3. CitotoxicitatdelsagregatsdePDZ3..............................................................................230
4.1.4. MicroscòpiaelectrònicadelsagregatscitotòxicsdePDZ3.................................231
4.1.5. AnàlisisperRMN‐HSQCdelsaspectesmolecularsdel’agregaciódelPDZ3.
232
4.2. Efectedeladeleciódel’hèlix‐α3sobreelplegamentdeldominiPDZ3............................234
4.2.1. Efectedeladeleciódel’hèlix‐α3sobrel’agregaciódeldominiPDZ3............237
4.2.1.1. EspectredeFTIRdeldomini∆10ct‐PDZ3natiu............................238
4.2.1.2. EspectredeFTIRdelintermediarid’agregaciódel’∆10ct‐PDZ3.
240
4.3. Interaccióhèlix‐α3iloopβ2‐β3ielseuefectesobrel’agregaciódeldominiPDZ3.....241
4.3.1. EstructurasecundàriadelestatnatiudelsmutantsdePDZ3...........................241
4.3.2. Estructurasecundàriadelintermediarid’agregaciódelsmutantsdePDZ3.
244
4.4. Anàlisiscalorimètric(DSC)delmutantsdeldominiPDZ3......................................................246
5. DISCUSSIÓ...............................................................................................................................................249
5.1. Lafulla‐βflexibledónallocal’agregaciódelPDZ3.....................................................................249
5.2. Importànciadelacadena‐β3enlareorganitzaciódelafulla‐βflexible............................250
5.3. Roldel’hèlix‐α3enelplegamentil’agregaciódeldominiPDZ3..........................................252
5.4. Residusimplicatsenlesinteraccionsentrel’hèlix‐α3ieldominiPDZ3...........................253
VI. CONCLUSIONSGENERALS...................................................................................................................255
VII. BIBLIOGRAFIA.......................................................................................................................................265
APÈNDIXD’ARTICLES...................................................................................................................................287
xvii
ÍNDEXDEFIGURESITAULES.
FiguraI.1.Representaciódel’estructuradeproteïnes.............................................................................................7
FiguraI.2Modelsdeviesdeplegamentdeproteïnes...............................................................................................9
FiguraI.3.Diagramaenergèticdelplegamentproteic...........................................................................................10
FiguraI.4.Representaciód’unembutdeplegamentdeproteïnes...................................................................11
FiguraI.5.Representacióesquemàticadel’embutdeplegamentid’agregació.........................................17
FiguraI.6.Representacióesquemàticadelspossiblesestatsconformacionalsquepotadoptaruna
cadenapolipeptídicailesprincipalsinterconversionsentreells.....................................................18
FiguraI.7.Modeldel’organitzacióestructuraldelesfibresamiloides..........................................................20
FiguraI.8.Modeld’agregacióamiloidedependentdenucleació.......................................................................21
FiguraI.9.Modeldecompetènciaentreviad’agregacióamiloideiviaWL..................................................22
FiguraI.10.Estructuracristal·linadel’oligòmerK11V‐TRiformacióamiloide........................................23
FiguraI.11.Reducciód’activitatcerebralidepòsitsfibril·larsenl’AD...........................................................30
FiguraI.12.TallproteolíticdelaproteïnaAPPiformaciódelpèptidAβ......................................................31
FiguraI.13.Esquemadelahipòtesisdelacascadaamiloideacobladaalciclededeposicióamiloide..
........................................................................................................................................................................................33
FiguraI.14.Esquemadelsdominisd’Igivariantsrecombinants......................................................................35
FiguraI.15.Cinèticad’agregaciódelpèptidAβ1‐42...................................................................................................36
FiguraI.16.Amiloïdosidecadenalleugera(AL).......................................................................................................37
FiguraI.17.AlineamentmúltiplededominisVLamiloidogènicsilasevalíniagerminalκIO18/O8.
........................................................................................................................................................................................40
FiguraI.18.Estructurad’immunoglobulinesidominisVL...................................................................................41
FiguraI.19.Diferenciesenlainterfíciedimèricaentreeldímerd’AL‐09ideκIO18/O8.....................42
FiguraI.20.PromiscuïtatdelainterfíciedimèricadelsdominisVLamiloidogènics................................43
FiguraI.21.Representaciódel’organitzaciódelfluxd’informaciócel·lular................................................46
FiguraI.22.ExempledeproteïnesmultidominiquecontenendominisPDZ..............................................47
FiguraI.23.RepresentaciódelplegamentcanònicdelsdominisPDZ.............................................................48
TaulaI.2.ClassificaciódedominisPDZenfunciódelasevaespecificitatd’unió.......................................49
FiguraI.24.Localitzaciópost‐sinàpticaiinteraccionsmolecularsdelaproteïnaPSD‐95....................50
FiguraI.25.Estructuracristal·linadeldominiPDZ3..............................................................................................51
FiguraI.26.Representaciódelsresidusdelloopβ2‐β3deldominiPDZ3implicatsenlainteracció
ambpèptidsil’hèlix‐α3addicional................................................................................................................53
FiguraM.1.Mapadelsvectorsd’expressiópET‐trx1aipET‐12a......................................................................77
FiguraM.2.Cromatografiadebescanviiònic.............................................................................................................81
FiguraM.3.Cromatografiad’exclusiómolecular......................................................................................................82
FiguraM.4.EspectredeCDdediferentsestructuressecundàriesdeproteïnes........................................90
Figura1.1.Representaciódelesdiferentsformesscrambleddel’scFv‐h3D6.........................................128
Figura1.2.Identificaciódel’scFv‐h3D6natiuilesformesscrambled.........................................................129
xviii
Figura1.3EspectredeCDalUV‐llunyàdel’scFv‐h3D6adiferentstemperatures................................130
Figura 1. 4.Deconvolució de l’espectre de FTIRde la regió d’amida I’ de l’scFv‐h3D6 a diferents
temperatures.........................................................................................................................................................131
Figura1.5.Desnaturalitzaciótèrmicadel’scFv‐h3D6.........................................................................................132
Figura1.6.AssaigdeviabilitatperMTTdelalíniacel·lulardeneuroblastomahumàSH‐SY5Y.....133
Figura1. 7. Formacióde fibresamiloides iWLperpartde l’Aβ1‐42, l’scFv‐h3D6 i el complexAβ1‐
42:scFv‐h3D6,enfunciódelatemperaturailapresenciadeDMSO..............................................136
Figura1.8.Assaigd’agregacióperfluorescènciadeTioflavinaTiANS......................................................137
Figura1.9.Assajosd’agregació induïdaper temperaturaper fluorescènciadeTioflavinaT iANS.
.....................................................................................................................................................................................138
Figura 1. 10. Diagrama energètic de la via d’agregació del pèptid Aβ1‐42, de l’scFv‐h3D6, i del
complexAβ1‐42:scFv‐h3D6...............................................................................................................................143
Figura2.1.EvoluciódelesestructuresproteiquesdipositadesenelPDB................................................149
Figura2.2AlineamentdelaseqüènciascFv‐h3D6amblaseqüènciamotlle2GHTrp:B.....................157
Figura2.3.Modelsteòricsdel’estructura3Ddel’scFv‐h3D6.........................................................................158
Figura2.4.Perfilsenergèticsdecadaundels5models.....................................................................................160
Figura2.5.Esquemadelaseqüènciadel’scFv‐h3D6inumeracióKabat..................................................161
Figura2.6.Modeltridimensionaldel’estructuradel’scFv‐h3D6..................................................................162
Figura2.7.Superfícied’exposicióalsolvent............................................................................................................164
Figura2.8.Predicciódelatendènciaal’agregaciódel’scFv‐h3D6...............................................................165
Figura2.9.Alineamentmúltipledel’scFv‐h3D6....................................................................................................166
Taula2.1.AminoàcidScanning‐Mutation..................................................................................................................167
Figura2.10.Desnaturalitzaciótèrmicaiquímicadel’scFv‐h3D6ilessevesvariants..........................170
Figura2.11.Detalldel’extremC‐terminaldelscFv‐h3D6.................................................................................172
Figura3.1.Estructuracristal·linade laproteïnaAL‐12 isolapamentamb laproteïnagerminalкI
O18/O8....................................................................................................................................................................183
Taula3.2.Detall i localitzaciódelesinteraccionsalteradesoperdudesdegutalesmutacionsque
contélaproteïnaAL‐12....................................................................................................................................184
Figura3.2.EstructurasecundàriaiexposiciódeLW35del’AL‐12adiferentstemperatures..........193
Figura3.3.Estructurasecundàriadelsmutantsrestauratiusd’AL‐12........................................................195
Figura3.4.EspectredefluorescènciadelresiduTrp35delmutantQ96Y.................................................196
Figura3.5.DesnaturalitzaciótèrmicaAL‐12...........................................................................................................197
Figura3.6.Desnaturalitzaciótèrmicadelsmutantsrestauratiusd’AL‐12................................................198
Figura3.7.Desnaturalitzacióquímicaperureadel’AL‐12ielsseusmutantsrestauratius..............200
Figura 3. 8. Deconvolució de l’espectre de FTIR de la regió amida I’ de l’AL‐12 a diferents
temperatures.........................................................................................................................................................202
Figura3.9.Evolució,enfunciódelatemperatura,delsprincipalscomponentsdelespectredeFTIR
alaregiódel’amidaI’del’AL‐12imutantsrestauratius..................................................................205
Figura 4. 1. Descomposició en bandes de l’espectre deconvolucionat de FTIR del domini PDZ3
adquiritentampóKH2PO450mM,pH7.5...............................................................................................225
xix
Figura4.2.EspectredeCDdeldominiPDZ3entampóKH2PO450mM,pH7.5......................................226
Taula 4. 1. Descomposició en bandes de l’espectre deconvolucionat de FTIR del domini PDZ3
adquiritentampóKH2PO450mM,pH7.5...............................................................................................227
Figura4.3.EvoluciódelesprincipalscomponentsdelespectredeFTIR,sotadiferentscondicions,
durantlaincubacióa60°C.............................................................................................................................229
Taula 4. 2. Descomposició en bandes de l’espectre deconvolucionat de FTIR del domini PDZ3
adquiritentampóPBS,pH7.4.......................................................................................................................229
Taula 4. 3. Descomposició en bandes de l’espectre deconvolucionat de FTIR del domini PDZ3
adquiritentampóKH2PO450mM,pH7.5,més150mMd’NaCl....................................................230
Figura4.4.AssaigdeviabilitatperMTTdelalíniacel·lulardeneuroblastomahumàSH‐SY5Y.....231
Figura4.5.ImatgesdeTEMdeldominiPDZ3incubata60°C,entampóPBS,pH7.4..........................232
Figura4.6.Espectredecorrelació1H‐15NHSQC‐RMNdeldominiPDZ3entampóKH2PO450mM,pH
7.5,desde25a60°C.........................................................................................................................................233
Figura4.7.CorbesdeldesplegamenttèrmicdeldominiPDZi∆10ct‐PDZ3obtingudesperDSC...235
Figura4.8.Distribuciódepoblacionsdelsdiferentsestats eneldesplegament tèrmicdeldomini
PDZ3ideldomini∆10ct‐PDZ3......................................................................................................................237
Figura4.10.Comparaciódelsprincipalscomponentsdel’espectrenatiudeFTIRdelsmutantsdel
dominiPDZ3,adquiritsentampóKH2PO450mM,pH7.5ia25°C..............................................241
Taula4.5.Descomposicióenbandesdel’espectredeconvolucionatdeFTIRdelsmutantsdeldomini
PDZ3adquirit en tampóKH2PO450mM,pH7.5, i comparacióambelsvalorsdeldomini
PDZ3..........................................................................................................................................................................243
Figura 4. 11 Evolució, en funció del temps d’incubació a 60ºC, dels principals components de
l’espectrenatiudeFTIRdelmutantPDZ3‐E401R,adquiritsentampóKH2PO450mM,pH
7.5...............................................................................................................................................................................244
Figura 4. 14. Comparació de les corbes del desplegament tèrmic del domini PDZ3 i les seves
variantsobtingudesperDSC..........................................................................................................................247
Taula 4. 6. Paràmetres termodinàmics del desplegament tèrmic del domini PDZ3 i les seves
variants....................................................................................................................................................................247
Figura4.15.AnàlisisperTANGOdelesregionspropensesal’agregaciódeldominiPDZ3...............251
Figura4.16.Evolució,enfunciódeltempsd’incubacióa60°C,delabandade1620cm.1deFTIR,
corresponentalsagregats‐β,deldominiPDZ3ilessevesvariants..............................................254
xxi
ABREVIATURES.
Abs AbsorbànciaAD Malaltiad’AlzheimerAEX Cromatografiad’intercanvianiònic(AnionExchangeChromatography)AFM MicroscòpiadeforçaatòmicaAICD APPIntracellularC‐terminalDomainAL AmiloïdosidecadenalleugeraAMPA àcidα‐amino‐3‐hidroxi‐5‐metil‐4‐isoxazolpropiònicANS Àcid8‐anilin‐naftalè‐sulfònicAPOE ApolipoproteïnaEAPOJ ApolipoproteïnaJAPP Proteïnaprecursoraamiloide(AmyloidPrecursorProtein)Aβ1‐42 Pèptidβ‐amiloide(residus1‐42del’APP)Aβ39‐42 Pèptidβ‐amiloide(residus39‐42del’APP)BLAST BasicLocalAlignmentSearchToolCAA Angiopatiaamiloidecerebral(CerebralAmyloidAngiopathy)CD Dicroismecircular(CircularDichroism)CDR Regiócomplementariad’antigen(ComplementaryDeterminingRegion)CEX Cromatografiad’intercanvianiònic(CationExchangeChromatography)CRIPT Cysteine‐RichInteractorProteincal CaloriesC‐terminal Carboxi‐terminalCβ Carboni‐βdelenllaçpeptídicCα Carboni‐αdelenllaçpeptídicD EstatDesplegatDa Daltonsdeg Graud’el·lipticitatDNA Àciddesoxiribonucleic(Desoxyribonucleicacid)DLS DynamicLightScatteringDMEM/F‐12 Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium/NutrientMixtureF‐12HamDMSO DimetilsulfòxiddNTP DesoxiribonucleòtidtrifosfatDO600 Densitatòpticaa600nmDSC DifferentialScanningCalorimetrydsDNA DNAdedoblecadena(double‐strandDNA)DSSP DefinitionofSecondaryStructureofProteinsD2O AiguadeuteradaE.coli EscherichiacoliEDTA ÀcidetilèdiaminotetraacèticELISA Enzyme‐LinkedImmunoSorbentAssayetal. Icol·laboradors(delllatíetalter)ExPASy ExpertProteinAnalysisSystemFab Fragmentd’unióal’antigen(Fragmentantigen‐binding)FBS Sèrumfetalboví(FetalBovineSerum)Fc Regióconstant(Fragmentcrystallizableregion)
xxii
Fn Fluorescènciaintrínsecaal’estatnatiuFu Fluorescènciaintrínsecaal’estatdesplegatFPLC FastProteinLiquidChromatographyFTIR Espectroscòpiad’infraroigambtransformadadeFourierFXS SíndromeXfràgil(FragileXSyndrome)g Gramsg RCF(RelativeCentrifugalForce)GK DominiGuanilatKinasaGndCl ClorurdeGuanidiniGSH GlutatióreduïtGSSG Glutatióoxidath HoraHSQC‐NMR HeteronuclearSingleQuantumCoherence‐NuclearMargneticResonanceHC Cadenapesada(HeavyChain)HCl ÀcidclorhídricHFIP 1,1,1,3,3,3‐hexafluoro‐2‐isopropanolI Intermediarisdeplegamentmeta‐estableIg ImmunoglobulinaIDP Proteïnaintrínsecamentdesordenada(IntrinsicallyDisorderedProtein)IMAC ImmobilizedMetalionAffinityChromatographyIPTG Isopropilβ‐D‐1‐tiogalactopiranòsidI‡ EstatdetransicióJ JouleKd Constantd’equilibridedissociaciódelcomplexproteïna‐lligandL LitresLB MediLuria‐BertaniLC Cadenalleugera(LightChain)LPS LipopolisacàridM Molarm metresmAb AnticòsmonoclonalMAGUK MembraneAssociatedGuanylateKinaseMAPK Mitogen‐ActivatedProteinKinaseMCS MultipleCloningSiteMEF‐2 FactordetranscripcióMyocyteEnhancerFactor‐2min MinutsMRE MeanResidueEllipticityMPB MaltoseBindingProteinMTT 3‐(4,5‐dimetiltiazol‐2‐il)‐2,5‐difeniltetrazolmN‐U Diferènciaenl’accessibilitatalsolvententrel’estatnatiuieldesplegatN EstatNatiuoPlegatNAA Non‐essentialAminoacidsNMDA N‐metil‐D‐aspartatnNOS Sintasaneuronald’ÒxidNítricN‐terminal Amino‐terminalORI Origendereplicació
xxiii
PA Persulfatamònicpb ParelldebasesPCR Reaccióencadenadelapolimerasa(PolymeraseChainReaction)PDB ProteinDataBankPDVF PolyvinylidenedifluoridepI PuntIsoelèctricPiB‐PET PittsburghcompoundB‐Tomografiad’emissiód’electronsPSD‐95 PostSynapticDensityprotein‐95PSEN Presenilina(oγ‐secretasa)RL Fibresrod‐likeRMN RessonànciamagnèticanuclearRNA ÀcidRibonucleic(RibonucleicAcid)ROS Espèciesreactivesd’oxigen(ReactiveOxygenSpecies)rpm RevolucionsperminutSARS SevereAcuteRespiratoriSyndromesAPPα Fragmentd’APPextracellularsolublegeneratperl’α‐secretasasAPPβ Fragmentd’APPextracellularsolublegeneratperlaβ‐secretasascFv Fragmentvariabledecadenasenzilla(single‐chainvariableFragment)SDS DodecilsulfatsòdicSDS‐PAGE ElectroforesiengeldepoliacrilamidaenpresènciadeSDSSEC Cromatografiad’exclusiómolecular(SizeExclusionChromatography)seg SegonsSEM StandardErroroftheMeanSH3 SRCHomology3DomainSNC SistemanervióscentralssDNA DNAdecadenasenzilla(single‐strandDNA)ssNMR RessonànciamagnèticanuclearenfasesòlidaT TemperaturaTA TemperaturaambientTa Temperaturad’hibridaciódefragmentsdeDNA(annealing)TEM MicroscòpiaelectrònicadetransmissióTEMED N,N,N’,N’‐tetrametilè‐diamíTEV TobacoEtchProteinThT TioflavinaT(ThioflavineT)Tm Temperaturaenlaqualel50%delapoblacióestrobadesplegadaTm TemperaturadefusiódefragmentsdeDNA(melting)trx ProteïnadefusiótioredoxinaTTR ProteïnaTranstiretina(TransthyretinProtein)U EstatDesplegatUE Unitatsd’endotoxinaUPR UnfoldedProteinResponseUV Ultravioladav/v Relacióvolum/volumv/p Relacióvolum/pesVC VolumdecolumnaVH Dominivariabledecadenapesada
xxiv
VL DominivariabledecadenalleugeraWL Fibresworm‐likeWT Wild‐Type
ZO ProteïnaZònulaoccludensΔ IncrementG EnergialliuredeGibbsH EntalpiaS Entropia
[D]50%Concentraciódedesnaturalitzantenlaqualel50%delaproteïnaestrobadesplegada
1H IsòtopradioactiuHidrogen13D Tridimensional15N IsòtopradioactiuNitrogen15Å Armstrongsε Coeficientd’extinciómolarλ Longitudd’onak‐ Quilo‐m‐ Mil·li‐n‐ Nano‐ɵ El·lipticitatμ‐ Micro‐°C GrausCentígrads% Tantpercent
xxv
Taulad’abreviaturesdelsaminoàcidsproteïnogènics.
Nom Coditreslletres Codiunalletra
Alanina Ala A
Arginina Arg R
Asparagina Asn N
ÀcidAspàrtic Asp D
Cisteïna Cys C
ÀcidGlutàmic Glu E
Glutamina Gln Q
Glicina Gly G
Histidina His H
Isoleucina Ile I
Leucina Leu L
Lisina Lys K
Metionina Met M
Fenilalanina Phe F
Prolina Pro P
Serina Ser S
Treonina Thr T
Triptòfan Trp W
Tirosina Tyr Y
Valina Val V
Taulad’abreviaturesdelsnucleòtidsdeDNA/RNA.
NomdelaBase
Nitrogenada
Codiuna
lletra
Adenina A
Citosina C
Guanina G
Timina T
Uracil U
I. RESUM.
I‐Resum
3
Aquesta Tesi Doctoral es centra en l’estudi molecular de tres proteïnes
relacionadesambmalaltiesconformacionalshumanes,oAmiloïdosis.Mitjançanttècniques
espectroscòpiques,s’handescritelsmecanismesdeplegamentnatiuid’agregacióenfulla‐
βordenada,duesviesqueestrobenencompetènciaatravésdelapresènciadediferents
estatsintermediarisal’espaiconformacional.Elsintermediarisd’agregació,precursorsde
lesfibresamiloides,sónconsideratselsprincipalscausantsdelacitotoxicitatcel·lularen
moltesdelesmalaltiesamiloidogèniques,pertant,elseuestudiéscrucialperaprofundir
enl’etiologiad’aquestespatologieshumanes,moltesd’ellessensetractamentcuratiu.
Perunabanda,s’haobtingutunfragmentd’anticòsrecombinantespecíficperaβ‐
oligòmersdelpèptidAβ1‐42 causantde l’Alzheimer, l’scFv‐h3D6.El seuestudihaestatel
primerendescriureelmecanismepelqualunscFvretiraelpèptidAβ1‐42delaviaamiloide
ievitalasevatoxicitatneuronal,talicoms’hademostratenassajosdeviabilitatencultius
cel·lulars.Amés, l’obtenciód’unmodel tridimensionalde l’scFv‐h3D6,perhomologiade
seqüències,hapermès ferunredissenyracionalde lamolèculaper taldemillorar‐ne la
sevaestabilitat,augmentarlasevaproducció,idisminuirladosiefectivajademostradaen
ratolinsmodeld’Alzheimer.
Per altra banda, s’ha treballat amb un domini variable (VL) d’immunoglobulina,
extret d’una pacient amb Amiloïdosi de cadena lleugera, l’AL‐12. Aquest domini
amiloidogènicpresenta7mutacionsrespectelasevalíniagerminalκIO18/O8.L’obtenció
delespropietatstermodinàmiquesdel’AL‐12,aixícomdequatremutantsrestauratius,ha
servitperestudiarl’efectedelesmutacionssomàtiquessobrel’estabilitatdelsdominisVL.
Així, larestauracióderesiduspuntualsdel’AL‐12capalaseqüènciagerminal,implicala
desestabilització del domini i un augment de la tendència a l’agregació i, per tant, s’ha
demostratqueunaúnicamutaciósomàticanoseria lacausadelpotencialamiloidogènic
de l’AL‐12, sinóque seria la combinaciódevaris factorsdesestabilitzantsdelplegament
natiu, donant lloc a canvis conformacionals susceptibles a l’agregació amiloide, i la seva
deposicióendiferentsòrgansiteixitscel·lulars.
I per últim, s’ha estudiat el domini PSD95‐PDZ3, unamolècula reguladora de la
sinapsis neuronal, i relacionada amb malalties com l’Alzheimer o l’Autisme. El domini
PDZ3 segueix una via d’agregació amiloide reversible, una particularitat rellevant de la
qualsen’handeterminatelscanvisconformacionalsquelapromouen.Amés,eldissenyde
6 variants del PDZ3 han servit per determinar les regions implicades en l’estabilitat i
plegamentglobaldeldomini,aixícomelseupaperenlaregulacióal·lostèricadel’activitat
deldomini.
Aquest treball demostra la importància dels estats intermediaris a l’espai
conformacional de les proteïnes, la seva relació amb les malalties conformacionals, i
l’aplicabilitat del seu coneixement en el desenvolupament de teràpies efectives.
II. INTRODUCCIÓ.
II‐Introducció EstructuraiPlegamentdeProteïnes
7
1. ESTRUCTURAIPLEGAMENTDEPROTEÏNES.
Elplegamentdeproteïneséselprocéspelqualunacadenapolipeptídica,amesura
que és sintetitzada pels ribosomes, adopta la seva conformació tridimensional nativa i
funcional.Elplegamentnatiuestrobaestabilitzatgràciesa interaccions intramoleculars,
tant locals (estructura secundària) com distants (estructura terciària). Principalment
s’estableixen interaccions no covalents (electrostàtiques, hidrofòbiques i ponts
d’hidrogen) entre les cadenes laterals dels aminoàcids de la seqüència primària, encara
quetambéendonenentrelescadeneslateralsilacadenaprincipal.Lesinteraccionslocals
donenllocaestructuressecundàriesregulars(hèlix‐αicadenes‐β)oirregulars(hèlix‐310,
loops i girs‐β), i parlem de motius estructurals quan es considera una combinació
d’estructures secundàries. L’estructura terciària s’assoleix per aproximació en el espai i
interacció de residus distants dins la seqüència, de forma que la proteïna s’empaqueta
sobre si mateixa, enterrant el nucli hidrofòbic i adquirint una conformació globular,
compactaiestable,denominadadomini(FiguraI.1).
FiguraI.1.Representaciódel’estructuradeproteïnes.Detalldel’estructurasecundàriaenhèlix‐αifulla‐β,
estabilitzadesperpontsd’hidrogen locals.El seuempaquetamenta l’espaidóna lloca l’estructura terciària,
estabilitzadaperinteraccionsentrediferentsmotiusestructurals(groc)distantsdinslamolècula.
II‐Introducció EstructuraiPlegamentdeProteïnes
8
En el cas de proteïnes multidomini, aquests s’uneixen mitjançant estructures
secundàries irregulars, i l’estructura terciària global s’estabilitza per interaccions
interdomini que expulsen l’aigua de l’interior de la molècula. S’anomena estructura
quaternàriaalacombinaciódediversescadenespolipeptídiques.
El plegament natiu és dinàmic, és a dir, presenta diversitat d’espècies
conformacionalsquefluctuenentreelles,adquirintlaflexibilitatnecessàriaperadaptar‐se
al entorn i interaccionar amb d’altres molècules, complint d’aquesta manera les seves
funcions.Aquestaestabilitatcompromesadelestatnatiuhaesdevingutuntemaclauenels
darrersanys,degutaqueésundelsdesencadenantsdemoltesmalaltiesconformacionals.
1.1. Antecedentshistòrics.
Alsanys60,ChristianAnfinsenvaaconseguirinvitroelreplegamentdelaproteïna
RibonucleasaA,unexperiment clauquevademostrarque tota la informaciónecessària
peraquèunaproteïnaadquireixi la sevaestructura tridimensionalnativa, es trobaa la
seqüència aminoacídica (Anfinsen et al. 1961). Amb aquest experiment, Anfinsen va
postularque,encondicionsfisiològiques, l’estatnatiud’unaproteïnarepresentaelnivell
mínimd’energiaglobaldelsistema,iquelatermodinàmicaéseldeterminantprincipalen
elprocésdeplegament.Méstard,CyrusLevinthalvademostrarqueelplegamentproteic
nopotseraleatoripereltempsinfinitqueestardariaenassolirl’estatnatiu,argumentant
que lacontribució termodinàmicanopotser laúnicadurantelprocés(Levinthal1968).
Cap als anys80, es va a formular la teoriade les viesdeplegament, segons laqual una
proteïnadesplegadasegueixunesviesdeplegamentespecífiques,regidaperunnombre
limitat de conformacions cinèticament possibles i termodinàmicament favorables
(Bryngelsonetal.1995).Llavors,l’objectiuvaserentendrecomlaproteïnasegueixlavia
“correcta”ievitalaresta.
Inicialmentesvandesenvolupardosmodelsdeviesdeplegamentque tenienen
comptelapresènciad’intermediarisdeplegamentiquelimitarienlareorganitzaciócapa
l’estat natiu (Baldwin 1989) (Figura I. 2, panell superior). El model seqüencial (o
framework),segonselqualprimeresformenelselementslocalsd’estructurasecundàriai
seguidament, per acoblament d’aquestes estructures al espai, s’adquireix l’estructura
terciàriafinal(Kim,Baldwin1982,Kim,Baldwin1990).Ielmodeldelcol·lapsehidrofòbic,
quedefensalaideadequelaproteïnacol·lapsaràpidamentsobreelsresidushidrofòbics
donantllocaunintermediariparcialmentcompacte(molten‐globule).Encontraposicióes
va proposar elmodel del trencaclosques (o jigsaw), que nega la necessitat d'una via de
plegamentúnicaipostulaquecadamolèculadeproteïnapotseguirunarutadiferentper
arribaral’estatnatiu(HarrisonandDurbin,1985)(FiguraI.2,panellinferior,esquerra).
II‐Introducció EstructuraiPlegamentdeProteïnes
9
Tanmateixlanecessitatd’intermediarisalesviesdeplegamentvaserqüestionada
alsanys90,quanesdemostràqueproteïnespetitessegueixenviesdedosestats(Jackson,
Fersht1991,Villegasetal.1995).Elmodeldenucleació‐condensació,unificaelsmodels
seqüencial i de col·lapse hidrofòbic postulant que les interaccions a llarga distància i
d’altresinteraccionshidrofòbiquespresentsal’estatnatiuesformenal’estatdetransició
de la vía de plegament, estabilitzant d’aquesta manera les altrament poc estables
estructuressecundàries(FiguraI.2,panellinferior,dreta)(Itzhaki,Otzen&Fersht1995,
Fersht1997,Villegasetal.1998).Aquestmodelvaprendreforçaquanvarisestudisvan
revelarque,jaal’estatdesplegat,existeixencertesinteraccionsnativesquemarquenlavia
de plegament i guien a la proteïna cap al estat natiu (Mok et al. 1999, Daggett, Fersht
2003).
Figura I. 2Models de vies de plegament de proteïnes. A partir dels experiments d’Anfinsen, que van
demostrar que les proteïnes pleguen espontània i reversiblement, es van descriure diferents models
mitjançantelqualunaproteïnaadoptaelseuplegamentnatiu.FiguraadaptadadeRadford,S.E.(2000).
1.2. Energèticadeplegament.
Energèticament,elprocésdeplegamentdeproteïnessegueixunareaccióons’ha
de traspassarunabarreraenergèticademajor energiaque l’estatdesplegat (U) i plegat
(N) (Figura I. 3). Aquesta alta barrera energètica correspon als anomenats estats de
transició(I‡),ambunaestructuraitermodinàmicacaracterística,peròquelasevaelevada
inestabilitatelsfadifícild’estudiar.L’estatdetransicióésdefineixcoml’etapalimitantdel
II‐Introducció EstructuraiPlegamentdeProteïnes
10
procés de plegament, i determina la cinètica o velocitat del procés, i la formació
d’intermediarisdeplegamentmeta‐estables(I)(Radford2000).
FiguraI.3.Diagramaenergèticdelplegamentproteic.U:estatdesplegat,I‐I’:intermediarisdeplegament,
I‡:estatintermediari,N:estatnatiu,∆G:energialliuredeGibbs,∆GU‡:energialliuredelpasdelestatdesplegat
alestatdetransició,∆GN‡:energialliuredelpasdelestatdetransicióalestatnatiuFiguraadaptadadeFersht,
A.R.(1993).
L’estabilitat termodinàmicad’unaproteïnaesdefineixper ladiferènciad’energia
lliure,odeGibbs,entrel’estatplegatieldesplegat ∆ i,generalment,estrobaentre
elsvalorsde5‐15kcal·mol‐1 (21‐63kJ·mol‐1) (Creighton1992,Dobson,Evans&Radford
1994, Fersht 1993, Chan, Bromberg & Dill 1995). Assolir l’estat natiu implica una
disminucióde l’energia lliuredelsistema(∆GN‐U<0).Entenentque∆ ∆ ∆ ,
llavorsl’entalpiai l’entropiadelareacciócontribueixenal’energiaglobal.Lacontribució
entròpica (∆S) durant el plegament acostuma a ser desfavorable, ja que implica un
augment de l’ordre en el sistema. Tot i això, existeix el que s’anomena penalització
entròpica,sovintatribuïdaaproteïnesintrínsecamentdesordenadesoqueperdenpartde
l’estructuranativaperaserfuncionals.Tambés’hapostulatquealgunesproteïnespoden
seguirunplegamentdown‐hill, sensebarreresenergètiques,quanelsvalorsd’entropia i
d’entalpiaessincronitzen(Eaton1999,Sadqi,Fushman&Munoz2006).Apartd’aquests
casos, el plegament de proteïnes es regeix, principalment, per un canvi favorable
d’entalpia (∆H), associat a l’establiment d’interaccions natives que estabilitzen l’estat
natiu.
II‐Introducció EstructuraiPlegamentdeProteïnes
11
1.3. Embutsdeplegament.
Gràciesalacombinaciód’unagranvarietatdetècniquesexperimentalsimètodes
teòrics (com per exemple, l’stopped‐flow, l’RMN, l’intercanvi protó‐deuteri, i
aproximacions computacionals), s’hapogut estudiar, anivell de residu i a una escalade
tempsdemilisegons,elprocésdeplegamentdeproteïnesdediferentcomplexitat.Aquest
avanç tecnològic ha permès la caracterització i l’obtenció de valors d’equilibri cinètic i
termodinàmic dels diferents estats que poblen una reacció de plegament, inclòs l’estat
intermediari(Serrano,Matouschek&Fersht1992,Brockwell,Smith&Radford2000).
Actualment s’entén que no existeix una via de plegament lineal, sinó que la
proteïna desplegada es troba dins un mapa energètic multidimensional, o embut de
plegament (Figura I. 4), en el que la proteïna pot seguir múltiples trajectòries de
plegament, podent passar per diferents estats intermediaris, fins a convergir en l’estat
natiu demínima energia (Bryngelson et al. 1995,Wolynes,Onuchic&Thirumalai 1995,
Dill,Chan1997,Radford2000).
FiguraI.4.Representaciód’unembutdeplegamentdeproteïnes.U:estatdesplegat,I: intermediaris,N:
estatnatiu,M:proteinamalplegadaomisfolded,Q:nombredecontactesnatius.FiguraadaptadadeSchultz,C.P.
(2000).
A l’estat desplegat, s’estableixen contactes entre residus clau de la seqüència,
formantunnuclideplegamentquemarcalatopologiailaviaaseguirdelaproteïna,fent
queelprocésresultiràpidieficient(Daggett,Fersht2003,Koehl,Levitt2002).
II‐Introducció EstructuraiPlegamentdeProteïnes
12
S’ha de tenir en compte que, en una proteïna desnaturalitzada, encara poden
persistir certes interaccions natives, o no natives, tot i haver perdut la seva estructura
terciària. Per tant, cal diferenciar entre un estat totalment desplegat (o estructura en
random‐coil)idesnaturalitzat(Blanco,Serrano&Forman‐Kay1998,Klein‐Seetharamanet
al.2002).
Elperfildel’embutdeplegamentésúnicperacadaproteïna,variabledepenentde
lescondicionsdelentorn,iésdeterminatperlespropietatscinètiquesitermodinàmiques
de la seqüènciapolipeptídica.Enelprocésdeplegament, elnivelldemínimaenergiaés
ocupat per l’estat natiu, però poden existir espècies intermediàries transitòries que
marquenmínimsenergèticslocals(Jahn,Radford2005).
1.3.1. Intermediarisdeplegament.
Elsdominisproteicsiproteïnesglobularspetites(demenysde100residusisense
pontsdisulfur)solenplegarcooperativament,seguintunatransiciódedosestats,plegat‐
desplegat, ambuna cinètica ràpida i sensenecessitat de passar per cap intermediari de
reacció (Villegas et al. 1995). El primer, demolts exemples descrits, va ser la proteïna
inhibidoradelaquimotripsina2(CI2),de64residus(Jackson,Fersht1991).Encanvi,les
proteïnes de grandàriamajor de 100 residus, acostumen a seguir una transició de tres
estats,implicantunintermediaricinèticestable.Laraóseriaquelesproteïnesgranstenen
tendènciaacol·lapsarenelsolvent,donant llocaestatscompactesambcertaestructura
nativa,lareorganitzaciócapaalplegamentnatiupassariapertravessarunaaltabarrera
energètica,donantllocaestatsintermediarisparcialmentplegats(Jahn,Radford2005).
Elplegamentdeproteïnesésunprocéscooperatiu,deformaqueelplegamentd’un
dominipotdesencadenariestabilitzarelplegamentd’unaltredemenysestable,enaquest
cas,passantperunestat intermediari.Encanvi, sielsdominisque formenunaproteïna
tenenunaestabilitat similarentreells, llavorsplegaransimultàniamentsensenecessitat
depoblarintermediaris(Tsytlonok,Itzhaki2013).
Segons la seva naturalesa, els estats intermediaris poden dividir‐se en a)
intermediaris termodinàmics o metastables, que es troben en equilibri, i per tant
s’acumuleniespodenaïllar;ib)intermediariscinètics,queapareixendegutauncanvide
velocitatdurantlatransicióentrel’estatplegatieldesplegat,iqueespodendetectarperò
noaïllar,jaquenos’acumulen.
El paper dels estats intermediaris encara provoca certa controvèrsia. Per una
banda, representen una etapa important de la via de plegament (on‐pathway), establint
contactes natius crucials per arribar a l’estat plegat; aquests intermediaris es poden
considerartransitorisomínimsenergèticslocals.Peròencertesocasions,l’estatdesplegat
II‐Introducció EstructuraiPlegamentdeProteïnes
13
estableix interaccions no natives, s’acumula en una trampa cinètica en forma
d’intermediariparcialmentplegatquedifícilmentrevertiràcapalaviadeplegamentnatiu.
Aquests intermediaris es consideren fora de la via de plegament (off‐pathway) i, en els
darrersanys,hanestatidentificatscomaprincipalsprecursorsdel’agregacióproteica.A
partdelsagregatsamorfs, rebenespecial importànciaelsagregatsβ‐amiloides jaquees
troben altament relacionats amb moltes malalties humanes. (Jahn, Radford 2008,
Tsytlonok,Itzhaki2013).
II‐Introducció AgregacióAmiloide
15
2. AGREGACIÓAMILOIDE.
L’agregacióamiloideéselprocéspelqualunpèptidoproteïnasolubleifuncional,
pateixunareestructuracióconformacionaldonantllocalasevaauto‐associacióiformació
d’agregats fibril·lars insolubles altament ordenats en estructura‐β creuada. Aquests
agregats es troben implicats en un gran nombre de patologies humanes, anomenades
malalties amiloidogèniques, conformacionals, o amiloïdosi. Entendre el mecanisme
d’agregaciódeproteïnesésclauperapoderarribaradesenvoluparteràpiesefectivesper
aquestespatologies.
Engeneral,lesproteïnesglobularstenenpocatendènciaal’agregacióperò,certes
mutacions o canvis en l’entorn proteic poden desestabilitzar l’estat natiu i desplaçar
l’equilibricapaintermediarissusceptiblesal’agregació.Amés,lesproteïnesgrans,iamb
unplegamentpoccooperatiu,tenenmésriscd’agregar(Chiti,Dobson2009).
Avuiendiaéssabutquel’estabilitzaciód’espèciesintermediàriesnonativesésel
desencadenantsdel’agregacióamiloide.Aquestesespèciesexposenregionshidrofòbiques,
queestrobarienenterradesenelplegamentnatiu,fent‐lesaccessiblesalsolventipertant
propiciant l’establiment de interaccions intermoleculars i l’auto‐associació. En el cas de
l’enzim lisozimode laproteïna transtiretina (TTR),mutacionspuntualsen la seqüència
desestabilitzen l’estat natiu i la seva cooperativitat de plegament. La β2‐microglobulina
resulta amiloidogènica degut a canvis locals en l’entorn proteic. La sobreproducció de
proteïna amiloidogènica és la causa de determinades amiloïdosis, com la de cadena
lleugera(AL).Enelcasdel’Alzheimer(AD),unadesregulacióenelprocésproteolíticdela
proteïnaprecursoraamiloide(APP)desencadenal’acumulacióamiloidedelpèptidAβ1‐42.
D’altra banda, l’al·lel APOE4 incrementa el risc de patir AD esporàdic plausiblement
perquè s’uneix al pèptid Aβ1‐4 amb unes 20 vegades menys afinitat que l’al·lel més
freqüentenhumans,l’APOE3,i,pertant,noelretiraambl’eficàcianecessària(LaDuetal.
1994). No obstant això, encara s’ha d’aprofundir molt en el mecanisme específic de
formacióamiloide(Blancas‐Mejia,Ramirez‐Alvarado2013).
Malgrat la directa relació entre amiloidogènesi i patologia, existeixen un gran
nombred’organismesqueconverteixen,durantelseuciclefisiològic,unaomésproteïnes
endògenes en fibres amiloides funcionals, anomenades proteïnes amiloid‐like, per
diferenciar‐lesde lespatogèniques.Unexemplen’és laproteïnaCurlin, de labactèriaE.
coli, que té com a funció colonitzar superfícies inertes i mitjançar la unió a proteïnes
hostes. O bé, la proteïna Chaplins, de la bactèria S. coelicolor, que disminueix la tensió
superficialde l’aigua ipermeteldesenvolupamentde leshifesaèries.Algunesproteïnes
podenexistir,dinsdesistemesbiològicsfuncionals,tantenformasolublecomd’agregats
amiloides,actuantcomelementsgenèticsextracromosomals,capaçosd’autopropagar‐sei
II‐Introducció AgregacióAmiloide
16
transmetre’s,iquesónanomenatsprionsnopatogènics,comaralaproteïnaSup35p,del
llevatS.cerevisiae,ilaHET‐s,delfongP.anserina(Chiti,Dobson2006).
Aquestfetfapensarquelaformaciódefibresamiloidesésunapropietatinherenti
genèrica de les cadenes polipeptídiques, i que es poden formar sota unes condicions
específiques altament controlades. A més, gràcies a tècniques computacionals, com ara
l’algoritme TANGO, s’han identificat les regions de la seqüència polipeptídica amb
tendènciaa l’agregació(Fernandez‐Escamillaetal.2004).L’evolució,però,haafavoritel
plegament natiu per davant de l’agregació, mitjançant la presència d’altes barres
cinètiques de desplegament, xaperones moleculars que ajuden a assolir l’estat natiu, i
mecanismesdeidentificacióidegradaciód’agregatsproteics(Stefani2012).
2.1. Mecanismedeformaciódefibresamiloides.
In vitro, les fibres amiloides es poden formar en presencia d’agents
desnaturalitzants (com la urea o el GdnHCl), a pHs àcids, a elevada temperatura, o sota
canvisd’aminoàcids,deformaques’incrementalapoblaciódeconformacionsparcialment
desplegadessusceptiblesal’auto‐associació.
Toticonèixerelsdesencadenants invitro,encaraestàperclarificarquinssónels
mecanismesinvivoqueprovoquenqueunaproteïnaesdesviïdelasevaviadeplegament
nativaientrialaviad’agregació.Semblaserqueelsprocessosdeplegamentiagregacióes
trobenencompetència,deformaqueessolapaundobleembutdeplegament(FiguraI.5),
onlesespèciesprecursoressóncapacesdesuperarlabarreraenergèticaquedónapasal
plegamentamiloide,unaviaambunaestabilitatglobalmajorquelanativa,ionlesfibres
representen l’estat de mínima energia de tot el sistema (Bucciantini et al. 2002, Jahn,
Radford2008,Fandrich2012,Stefani2012).
De forma general, el procés de fibril·lació segueix un patró jeràrquic on
determinadesmodificacionsdel’entorniestructuralscausenlacombinaciódemonòmers
parcialment desplegats cap a oligòmers més o menys compactes, i la subseqüent
reorganització d’aquests donant lloc a estructures fibril·lars complexes i ordenades en
fulla‐βcreuada(Fitzpatricketal.2013).
PerFTIRespotdiferenciarlafulla‐βnativadel’amiloide,queésgeneradadesprès
d‘aquestareorganització(Zandomeneghietal.2004).
Teòricament, la desestabilització i pèrdua del estat natiu, o bé l’augment de la
tendència a l’agregació d’espècies parcialment desplegades, és la justificació més
apropiada per almecanisme d’agregació amiloide, però s’han descrit casos d’associació
entreespèciesencaranatives,isónelsoligòmersambestructuranativaelsquepateixenla
reorganització conformacional cap a l’estructura rica en fulla‐β ordenada, com per
II‐Introducció AgregacióAmiloide
17
exempleelprocésd’agregacióamiloidedelainsulina,odel’ataxina3associadaal’atàxia
espinocerebel·lar(Chiti,Dobson2006).
Figura I.5.Representacióesquemàticade l’embutdeplegament id’agregació.La superfíciemostra la
varietatdeconformacionsquecondueixencapal’estatnatiu,atravésdecontactesintramoleculars;obécapa
laformaciódefibresamiloides,atravésdecontactesintermoleculars.Cadaunadelesvieséspobladaapartir
dediferentsintermediarisdeplegament.Elpasd’unaviaal’altreencaraestàperdefinir.Figuraadaptadade
Jhan,T.R.&Radford,S.E.(2005).
El mecanisme d’agregació esdevé tan complex com la multitud d’estats
conformacionalsquepotadoptarunacadenapolipeptídicadesplegada,queestrobenen
equilibri ique,pertant,sóninterconvertiblesentreells.Talicomindical’esquemadela
figura I.6,dinsd’aquesta complexadinàmicamolecularnoésd’estranyarquequalsevol
errordelsistemaderegulació(xaperonesmoleculars,sistemesdedegradacióidecontrol
de qualitat), canvis en l’entorn cel·lular, o en condicions patològiques, desencadenin
l’acumulacióilareestructuracióenagregats‐βd’algunad’aquestesespècies,jasiguil’estat
plegat,eldesplegattotaloparcial,elsagregatsamorfs,oelsoligòmersfuncionals.Malgrat
tot, clarament, les espècies total o parcialment desplegades són més susceptibles a
l’agregacióquenopasl’estatnatiu(Chiti,Dobson2006).
II‐Introducció AgregacióAmiloide
18
Figura I. 6. Representació esquemàtica dels possibles estats conformacionals que pot adoptar una
cadena polipeptídica i les principals interconversions entre ells. Totes aquestes interconversions es
trobenreguladesperl’entorncel·lular,xaperonesmoleculars,sistemesdedegradacióiprocessosdecontrolde
qualitat. Molts dels estats conformacionals poden ser biològicament funcionals, incloses les proteïnes
desplegades i les fibres. Però, determinats errors en el sistema de regulació propiciarien l’acumulació
d’espèciesiagregatsnofuncionals,desencadenantsdemalaltiesconformacionals.FiguraadaptadadeChiti,F.
&Dobson,C.M.(2006).
II‐Introducció AgregacióAmiloide
19
2.1.1. Determinantsamiloidogènics.
A part de l’estabilitat del plegament proteic i l’acumulació d’intermediaris no
natius, les propietats de la seqüència polipeptídica influeixen notablement sobre la
capacitat intrínseca d’una proteïna per formar agregats. A continuació és detallen tres
propietatsqueesdevenendeterminantsperal’auto‐associació:
‐ El grau d’hidrofobicitat de les cadenes laterals. La presència d’illots hidrofòbics
facilita l’agregació d’espècies total o parcialment desplegades. Evolutivament, les
seqüènciesproteiquesevitengrupsdetresomésresidushidrofòbicsconsecutius.
‐ La càrrega neta de la seqüència. De forma general, una elevada càrrega neta, ja
sigui global o local, dificulta l’agregació degut a la repulsió electrostàtica entre
residus.
‐ Iperúltim,latendènciaaformarestructuresenfulla‐β.L’elevadaconservacióde
residus prolina i glicina, dos residus que trenquen les cadenes‐β, i la menor
freqüènciadeplegamentsnatiusenconformaciótot‐β,podrienserunmecanisme
evolutiuperadisminuirlatendènciaal’agregació.
2.2. Estructuradelesfibresamiloides.
Leprimeresdescripcionsdefibresamiloidesvanrealitzar‐semitjançanttècniques
comTEM,AFMidifraccióderaigs‐X.Enselsdarrersanys,lacaracteritzaciódelesfibres
ha fet un gran salt gràcies a la tècnica de ressonànciamagnètica nuclear en fase sòlida
(ssNMR), i l’obtenció de nano i micro‐cristalls de fragments de pèptids amb
característiquesamiloides.
Lesfibresamiloidesrepresentenunestatd’organitzaciódiferental’estatnatiu.Tot
iquelesforcesd’interacció(pontsd’hidrogeniinteraccionshidrofòbiques,principalment)
sónlesmateixesentotesduesvies,enelmecanismed’agregacióesperdenelscontactes
natiusis’estableixencontactesintermoleculars,dependentsdeconcentració.
Les fibresamiloidessónagregats insolubles imoltestables.Malgratqueelsseus
precursors són, seqüencial i estructuralment, molt diversos, totes elles adopten una
estructura altament ordenada en fulla‐β creuada, on les cadenes‐β es disposen
perpendicularsaleixdelafibra,deixantenterratelnuclialtamenthidrofòbic(FiguraI.7).
Presenten un diàmetre d’entre 7 i 13 nm, i estan formades per un conjunt de 2 a 6
protofilaments,de2‐5nmdediàmetre,associatslateralmentiformantunahèlixsobresi
mateixos (Serpell et al. 2000).Aquestpatró canònic, fa pensarque lespropietats físico‐
químiquesdelacadenapolipeptídicasónundelsprincipalsdeterminantsdel’estructura
II‐Introducció AgregacióAmiloide
20
fibril·lar. Una altra característica comuna de les fibres amiloides, és que uneixen
específicamentelsfluoròforsCongoRediTioflavinaT(ThT),totiques’havistqueelsseus
precursors oligomèrics també són capaços d’establir aquesta interacció (Maezawa et al.
2008).
Figura I. 7. Model de l’organització estructural de les fibres amiloides. La imatge obtinguda per
microscòpiaconsisteixenuna fibra formadaper4protofilaments,associats lateralment i formantunahèlix
sobre si mateixos. Cada protofilament creix formant un nucli hidrofòbic en fulla‐β disposada
perpendicularmentaleixdelafibra.FiguraadaptadadeStefani,M.(2004).
Lescadenes lateralsde laseqüènciapolipeptídicaexerceixenunagran influència
sobrel’empaquetamentamiloide,provocantcertesdiferènciesestructuralsentrediferents
fibres, com ara, la llargada de les fulles‐β, la disposició paral·lela o antiparal·lela de les
cadenes‐β,ilasevadistanciad’empaquetament,aixícomelnombredeprotofilamentsque
les formen També trobem diferències en la llargada i conformació de les estructures
irregularsqueestrobenforadelnuclihidrofòbicdelafibra.Amés,lapresènciadeponts
disulfur,oderegionsdepoliglutamina,tambépodenpertorbarl’estructuracanònicadela
fibra(Chiti,Dobson2006).
2.3. Tipusdeviesamiloidogèniques.
L’estudi d’agregació de la proteïna β2‐microglobulina va ser el primer en
identificar i classificar diferents tipus d’agregats‐β (Kad et al. 2003, Gosal et al. 2005).
Inicialment, la intenció era classificar les fibres amiloides en funció de les seves
II‐Introducció AgregacióAmiloide
21
característiques conformacionals, però certes propietats cinètiques van revelar la
existènciadeduesviesamiloidogèniquesdiferents,laviaamiloideilaviaworm‐like(WL).
2.3.1. Viadefibril·lacióamiloide.
Aquestaviaamiloidogènicarepresentarial’estructuraclàssicadelsagregatstipus‐
β.Sónfibresrígides,senseramificacions,iformenungirsobresimateixes.Enfunciódel
número de protofilaments que les componen i de la distància de gir, aquestes fibres es
subdivideixenendiferentstipus(Kadetal.2003,Gosaletal.2005).
Figura I.8.Modeld’agregacióamiloidedependentdenucleació.Elprocés consisteix endues fases que
donenllocauncreixementsigmoïdal(corbaverda):a)lafasedenucleació,termodinàmicamentdesfavorablei
lenta,enlaqualelsmonòmerspateixenuncanviconformacionalsis’associenformantunnuclioligomèric,ib)
la fased’elongació,onelnuclicreixràpida i favorablementperaddiciódemonòmersa la fibra.L’addicióde
fibres pre‐formades escurça el temps de nucleació i indueix la formació d’agregats ràpidament (corba
vermella).Asota, imatgesdeTEMdeA)espèciesoligomèriques,B)protofilaments, iC) fibresamiloides.La
barracorrespon20nm.Figuraadaptadade(Kumar,Walter2011).
II‐Introducció AgregacióAmiloide
22
Cinèticament, la formaciódefibresamiloidessegueixunmecanismedepenentde
nucleació(FiguraI.8),enelqueelsmonòmerssolublesformenunnuclienergèticament
desfavorable (fase lag). A partir d’aquí la fibra creix ràpidament per associació de
monòmers i oligòmers al nucli pre‐format, sent un creixement exponencial i altament
favorable. In vitro, l’addició de formes prefibril·lars prèviament formades (o seeding),
redueix la barrera de nucleació de la fase lagde forma que s’accelera la seva formació
(Serio et al. 2000). Per TEM i AFM, s’han identificat espècies oligomèriques i
protofilamentspoblatsdurantlaformaciódelesfibres(FiguraI.8,A‐C).
2.3.2. Viadefibril·lacióworm‐like.
Les fibres WL són més curtes, de menys de 600 nm, flexibles, de 2.5 nm de
diàmetre, i exhibeixenunamorfologianodularambunadistanciade repeticióal voltant
dels30nm,sovintconfosesambprotofilaments.
LacaracterísticamésimportantdelesfibresWLésquesegueixenunacinèticade
fibril·lacióindependentdenucleació,pelquelasevaelongacióésràpidailineal,enlaqual
hihaunadirecteassociaciódelsmonòmersperaformarlafibra(FiguraI.9).
Figura I. 9.Model de competència entre via d’agregació amiloide i viaWL. Les fibresWL es formen
seguintunprocés independentdenucleació, favorablecinèticament, ipassantperunestat inicial identificat
com a fibres Rod‐like (RL). En competència per els mateixos monòmers, es troben les fibres amiloides,
dependentsdenucleació,ifavorablestermodinàmicament.Lesimatgespresesmitjançantmicroscòpiad’AFM,
mostra les característiques diferencials entre tots dos tipus d’agregats‐β. Figura adaptada de Jhan, T.R. &
Radford,S.E.(2008).
Unaaltraparticularitatde les fibresWLésque,sovint, tenencaràcterreversible,
fetquepotanar lligat laconservaciódegranpartde la fulla‐βnativa,adiferènciadeles
fibres amiloides, les quals pateixen una important reorganització de l’estructura
II‐Introducció AgregacióAmiloide
23
secundària,caientenmínimsenergèticsirreversibles.Lamancadenucleaciódelesfibres
WLresultaambunafibril·laciómoltmésràpidaquel’amiloide.Invitro,laviaWLinhibeix
laformacióamiloide,jaquecompeteixenpercaptarestatsmonomèrics.Totplegatindica
que les fibresWLsónespècies estabilitzades cinèticament,mentreque les amiloidesho
sóntermodinàmicament(Kadetal.2003,Gosaletal.2005).
2.4. Oligòmerssolubles.
A diferència de les fibres amiloides, poc és sabut sobre les característiques
estructurals dels oligòmers, degut a que són espècies meta‐estables, poblades
transitòriament durant la via de fibril·lació, i que adopten diverses morfologies.
Recentments’haaconseguitlesprimerescristal·litzacionsd’espèciesoligomèriques,iper
DinàmicaMoleculars’hasimulatlareorganitzacióestructuralquepateixenelsoligòmers,
ajudantaentendreelpasdelaviadeplegamentnatiualad’agregacióamiloide(FiguraI.
10).(Ahmedetal.2010,Laganowskyetal.2012,Neudeckeretal.2012).
Figura I.10.Estructuracristal·linade l’oligòmerK11V‐TR i formacióamiloide. L’estructuracristal·lina
del oligòmer cilindrinaK11V‐TR és formada per tres fulles‐β (blau, verd, vermell), estabilitzades per ponts
d’hidrogen, que adopten una conformació en barril‐β cilíndric. La simulació, per DinàmicaMolecular, de la
transició estructural cap a la formació amiloidemostra un trencament inicial de la interfície (punts 2 i 3),
seguidament el cilindre es desplega per la completa dissociació dels ponts d’hidrogen febles (punts 4 i 5),
mentrequelesinteraccionsfortesesmantenen(punt6).Finalment,lesformesestesesenfulla‐βantiparal·lela
II‐Introducció AgregacióAmiloide
24
(punt7)s’associenicauenenunmínimenergèticmésbaixquel’estatinicial.FiguraadaptadadeLaganowsky,
A.(2012).
Ésnecessariuncertgraudedesplegamenti flexibilitatdelsprecursorsamiloides
per a reorganitzar‐se en estructures fibril·lars en fulla‐β creuada, així com una elevada
hidrofobicitatiuncàrreganetapetita(Uversky,Fink2004,Fandrich2012,Stefani2012).
Igualquelesfibres,elsoligòmerssolublestambéuneixenelsfluoròforsCongoRediThT
(Maezawaetal.2008).
Degutalpolimorfismedelesespèciesoligomèriques,resultadifícildescriure’lsde
formagenèrica.Depenentdel tipusdecadenapolipeptídica,o finshi totdelprotocolde
oligomerització utilitzat in vitro, s’han detectat diferents tipus d’oligòmers. A nivell
d’estructura secundària, existeixen oligòmers rics en estructura‐β i d’altres d’estructura
secundàriairregular.Semblaaserqueelpolimorfismedelsoligòmerséstrobarelacionat
amb el seu potencial citotòxic, així com amb la tendència a formar fibres amiloides
(Fandrich 2012). Seguint les evidències de que existeixenmúltiples vies d’agregació en
competència entre elles, els oligòmers es poden considerar intermediaris on‐pathway o
off‐pathwaydelaviaamiloide,donantlloc,perexempleafibresWL,talicoms’haexplicat
anteriorment(Gosaletal.2005,Jahn,Radford2008,Wuetal.2010).
2.4.1. Toxicitatdelsoligòmerssolubles.
Aproximadament20anysenrere,s’enteniaquelesfibresamiloideserenelfactor
citotòxic principal en les malalties amiloidogèniques. Avui en dia, és acceptat que les
espèciesoligomèriquessónpotencialmentméstòxiquesquelesfibresmadures,sobretot
pelquefaamalaltiesneurodegeneratives.Finsitot, lesfibrespodrientenirunafinalitat
protectoradinslescèl·lules,atrapantoligòmerstòxics,totiquecertsautorslesdescriuen
com a font d’espècies citotòxiques mitjançant la seva fragmentació (Bucciantini et al.
2002).Encertesamiloïdosissistèmiques,però,l’acumulaciódefibressegueixsentunfort
desencadenantdedisfuncióorgànica(Fandrich2012).
Elsintermediarisoligomèricsexerceixenefectesimportantssobrelaviabilitatiel
metabolismecel·lular.Elsoligòmersinteraccionenambregionsd’elevadacàrreganegativa
de lamembrana lipídica i la desestabilitzen, de forma que esmodifica la permeabilitat
cel·lular,perjudicantlesproteïnesdemembranaiviesdesenyalització(Houetal.2005).
Lacomposicióirigidesadelamembranalipídicajugaunpaperimportantenlainteracciói
internalitzacióde les formesoligomèriques,concretamentquesiguinpobresoriquesen
colesterollesfamésomenysvulnerables,respectivament(Stefani2012).Lahipòtesidels
canals de membrana proposa que els agregats tòxics formen porus inespecífics a la
membranacel·lular,alterantcondicionscel·lularsfonamentals,comaraelsnivellsdeCa2+
II‐Introducció AgregacióAmiloide
25
o l’equilibri redox i, finalment, provocant apoptosi mitjançada per caspases, estrès
oxidatiu, i disfunció mitocondrial (Fandrich 2012, Stefani 2012). A nivell
neurodegeneratiu, la interacciódelsoligòmerssobre lesmembranesplasmàtiquesafecta
directamentalesxarxesneuronalsialasevaplasticitat,jaques’alterencanalsireceptors
de membrana importants per a l’homeòstasi de ions, el flux d’informació i respostes
neuronals.
Endefinitiva, lavarietatmorfològicadelesfibresamiloidei l’existènciadevaries
vies amiloidogèniquesdemostra la complexitatdelprocésd’agregació en fulla‐β.Encara
està per clarificar com les característiques moleculars del precursor monomèric i les
diferentsrutescinètiquesinfluenciensobrelareacciód’assemblatgeinvivoilamorfologia
final de la fibra, així com la possibilitat d’interconversió entre diferents vies
amiloidogèniques.Amés,s’hadetenirencompteelpotencialtòxicdecadaunad’aquestes
varietats amiloides, com es troben representades a les diferents patologies
amiloidogèniques,il’efectequetenenencadaunad’elles.
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
27
3. AMILOÏDOSIOMALALTIESAMILOIDOGÈNIQUES.
En humans, les amiloïdosis, o malalties amiloidogèniques, són el conjunt de
patologiesconformacionalsrelacionadesambunincorrecteplegamentproteic,toteselles
associades a l’acumulació de fibres amiloides insolubles a diferents òrgans o teixits
cel·lulars,causantlamortcel·lulariladisfuncióorgànica.Lesmalaltiesamiloidogèniques
sónungrupmoltheterogeniquederivendefinsa27proteïnesdiferents(Taula1).Toti
que l’estructura i funció de la forma nativa de cada una d’elles és diferent, totes
comparteixen el mateix patró amiloide en fulla‐β creuada (Blancas‐Mejia, Ramirez‐
Alvarado2013).
Clínicament,lesamiloïdosispodendividir‐seendosgransgrupsenfunciódesila
proteïna precursora és expressada i secretada al mateix o a diferent lloc de la seva
deposicióamiloide:lesamiloïdosislocalsilesamiloïdosissistèmiques.
Les amiloïdosis sistèmiques afecten a diferents òrgans (cor, ronyó, fetge, nervis
perifèrics, tracte intestinal, etc.) i són causades per una gran varietat de proteïnes
precursores. Totes elles coincideixen en que la proteïna precursora és expressada i
secretada en una regió diferent del lloc de deposició, s’acumulen extracel·lularment i, a
partdelsefectesrelacionatsacadaundelsòrgansafectats,comparteixenmoltssímptomes
inespecífics,comarafatiga,debilitat,lapèrduadepesidelagana.
Lesamiloïdosislocalssónlesanomenadesmalaltiesneurodegenerativesjaquees
localitzenalcervellicausendesordresdegeneratiusprogressius,comperexemplel’AD,el
Parkinson o la malaltia de Huntington. A diferència de les sistèmiques, la proteïna
patogènicaéssintetitzada idipositadaa lamateixaregió, ielsagregatsamiloidespoden
serintra‐oextracel·lulars.
Un aspecte important que diferencia l’amiloïdosi sistèmica de la local és que la
proteïna amiloidogènica sempre és sintetitzada per cèl·lules especialitzades en síntesi i
secreciódegransquantitatsdeproteïnaalplasmasanguini,comperexemplelescèl·lules
plasmàtiquesenelcasdel’Amiloïdosidecadenalleugera(AL),oelshepatòcitsenelcasde
laPolineuropatiaamiloidefamiliar(FAP).Cadatipusdecèl·lulasecretoratéelseupropi
mecanisme per actuar sobre proteïnesmal plegades, l’UPR (UnfoldedProteinResponse),
produeixenxaperonesielementsdelproteosoma.Amés,elreticleendoplasmàticjugaun
papercrucialenelcorrecteplegamentdelesproteïnessintetitzadesperaquestescèl·lules
(vanAnken,Braakman2005).Lasobreexpressiódeproteïnapotarribarasaturaraquests
sistemesdereparació,acumulantprecursorsamiloidogènics.Enlesamiloïdosislocals,en
canvi, les neurones produeixen proteïnes depenent de les seves necessitats funcionals,
pèptidsoproteïnesdecurtadurada, iquenorequereixendemecanismesdecontrolde
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
28
plegament.Podriaentendre’squel’agregacióintracel·lularésunmecanismecompensatori
delesneuronesperaïllarelspèptidsmalplegatsinoeliminats.
Taula I. 1. Exemples demalalties humanes amiloidogèniques o amiloïdosi.Malgrat que esdevenen a
partir de proteïnes precursores, amb característiques físico‐químiques i un plegament natiu diferent, totes
ellesdonenllocalaformaciódedipòsitsamiloidesextraointracel·lulars.Depenentdelllocdesíntesiiellloc
dedeposicióamiloidedelaproteïnaprecursora,esdiferencienenamiloïdosissistèmiquesolocals,aquestes
últimessónrelacionadesambprocessosneurodegeneratius.TaulaadaptadadeChiti,F.&Dobson,C.M.(2006).
Amiloïdosi Proteïna precursora
Causa Òrgans afectats
Amiloïdosis Sistèmiques
Amiloïdosi de cadena lleugera (AL) Cadena lleugera
d’Ig Mutació o
sobreproducció Cor, ronyó, fetge
Amiloïdosi de cadena lleugera (AH) Cadena pesada d’Ig Associada a Mieloma Ronyó, fetge
Amiloïdosi senil sistèmica (SSA) Transtiretina (TTR) Acumulació Cor, vasos
sanguinis, teixits tous
Polineuropatia amiloidòtica familiar (FAP)
Transtiretina (TTR) Mutació hereditària
Cor, ronyó, SNC
Amiloïdosi secundària (ΑA) Proteïna amiloide A
del sèrum Sobreproducció
Ronyó, fetge, melsa
Amiloïdosi relacionada amb diàlisi (Aβ2M)
Microglobulina‐β2 Diàlisi crònica Articulacions, cor, intestí, pulmó
Amiloïdosi del lisozim (ALys) Lisozim Mutació Hereditària Ronyó, fetge,
melsa
Apo AI amiloïdosi (AApo AI) Fragment d’Apo AI Mutació Hereditària Ronyó, cor,
fetge Apo AII amiloïdosi (AApo AII) Fragment d’Apo AII Mutació Hereditària Fetge
Apo AIV amiloïdosi (AApo AIV) Fragment d’Apo
AIV Mutació Hereditària Fetge
Amiloïdosi del fibrinogen Cadena‐α del fibrinogen
Mutació Hereditària Fetge
Amiloïdosi de la cistatina Cistatina‐ C Mutació Hereditària Capil∙lars sanguinis
Cataractes γ‐Cristal∙lina
Amiloïdosis Locals o Neurodegeneratives
Malaltia d’AD Pèptid Aβ (1‐40, 1‐
42) Errors en processos
proteolítics SNC
Malaltia del Parkinson α‐Sinucleïna SNC Malaltia de Huntington Huntingtina Mutació Genètica SNC Amiloïdosi familiar Transtiretina (TTR) Mutació Hereditària SNC Atàxia espinocerebel∙lar Ataxina‐3 Mutació Genètica SNC
Síndrome de Creutzfeldt‐Jacob Proteïna priònica
(PrP)
Propagació de canvis conformacionals no
natius SNC
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
29
Lesamiloïdosissóncomplicadesd’estudiaridiagnosticarjaquesovintinvolucren
diferentsòrgans,enelcasdelessistèmiques,ialgunssímptomespodenpassarfàcilment
desapercebuts o no diagnòstics fins ja avançada la patologia. En els darrers anys, s’ha
avançatmoltenl’estudidelsmecanismesmolecularspatogènics,deformaques’hapogut
millorartanteldiagnòsticprecoç,comelstractamentsterapèutics,obtenintunpronòstic
mésfavorableperalspacientsdemoltesamiloïdosis.Totiaixò,malgratlesnovesteràpies
emergents i esperançadores, sobretot en el camp de la immunoteràpia, encara cal
aprofundirenmoltsaspectesd’aquestesmalalties.Caldriabuscarunavisiómésglobalque
destapi nous mecanismes interconnectats tan a nivell local i molecular, com fisiològic,
ambientalment,finsitotemocionaldelpacient,pertald’assolirelnivelldecomplexitatde
l’organismehumàidel’amiloïdosi,iaixíaspirar,enunfutur,aunstractamentscuratiusi
ambunsefectessecundaris, sien tenen,queno limitin l’esperançani laqualitatdevida
delspacientstractats.
3.1. Malaltiad’Alzheimer.
Lamalaltiad’Alzheimer(AD)vaserdescritaperprimercopl’any1906pelmetge
alemany Alois Alzheimer i, actualment és la malaltia neurodegenerativa més comuna
mundialment,afectantamésde35milionsdepersonesatotelmón,irepresentantel70
%delcasosdedemència.Segonsl’InformeMundialsobrel’AD,s’esperaqueenelspropers
40 anys augmentin els casos dràsticament, sobretot en els països en desenvolupament,
arribant als 115milions el 2050 (Wimo, Prince 2010). Amb la excepció dels pocs casos
d’AD familiar detectats en individus menors de 60 anys, la prevalença de la malaltia
augmentaambl’edat,afectantal40%delapoblaciómajorde85anys.Peraquestesraons,
actualmentl’estudidelADesdevéunanecessitatprimordial,juntamentambelcàncer.
L’ADconsisteixenundesordreneurodegeneratiuiprogressiuqueescaracteritza
per la pèrdua de memòria i capacitats cognitives (Figura I. 11‐A). A nivell anatòmic,
s’observaunaimportantatròfiacerebral i, fisiològicament,esrelacionaamblapresència
d’agregats insolubles extracel·lulars (les fibres amiloides) i intracel·lulars (els cabdells
neurofibril·lars), formats majoritàriament pel pèptid Aβ1‐42 i la proteïna Tau
hiperfosforil·lada,respectivament(FiguraI.11‐B)(Solomon2006).Lapatologiadel’ADés
complexa i segueixunmecanismequeencara,avuiendia,estàperdefinir.Tot i això, la
granquantitatd’estudisrealitzatsfinsarafanevidentquel’agregaciódelpèptid‐Aβésel
procés desencadenant de deposició amiloide i la progressiva neurodegeneració (Arbel,
Solomon2007).
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
30
Figura I. 11. Reducció d’activitat cerebral i depòsits fibril·lars en l’AD. A) Imatges adquirides per
tomografiad’emissiód’electrons(PiB‐PET).Laimatgedel’esquerracorresponauncervellsa,mentrequeel
deladretaauncervellafectatd’AD.Lesàreesblavesinegresalaimatgedeladretaindiquenunareduccióde
l’activitatcerebraldegutalamalaltia.B)Imatgesobtingudespermicroscòpiaelectrònicadeplaquesamiloides
icabdellesneurofibril·larspresentsalcervelldepacientsd’AD.Imatgesextretesdecoloradodementia.org.
3.1.1. Proteïnaprecursoraamiloide,APP.
ElpèptidAβ resultadelprocessamentproteolíticde laproteïnaAPP, laproteïna
precursora amiloide. L’APP és una glicoproteïna de membrana, de 695‐770 residus,
depenent del procés de modificació post‐transcripcional que pateix abans de la seva
síntesi,iactuacomareceptortantencèl·lulesneuronalscomnoneuronals.Elseuextrem
C‐terminal es troba en el citoplasma, mentre que l’extrem N‐terminal es localitza cap
l’exteriorcel·lular.Lasevafuncióbiològicasegueixdesconeguda,totiqueescreuquepot
estar relacionada amb l’adhesió cel·lular, la plasticitat neuronal, així com també la de
sensordeconcentraciódecolesterolalescèl·lulesneuronals(Beeletal.2008).
L’APPesprocessadaespecíficamentpelsenzimsanomenatssecretases.Tal icom
mostralafiguraI.12,depenentdel’acciódelstrestipusdesecretases(α,βiγ),existeixen
duesviesdeprocessament(Haass,Selkoe2007):
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
31
‐ Via no amiloidogènica. En condicions normals, i la més freqüent, l’α‐secretasa
alliberael fragmentextracel·lularsolublesAPPα.Posteriorment, laγ‐secretasa(o
PSEN)processalapartencaraintegradaalamembrana,alliberantelpèptidP3iel
dominiAICD(APPIntracellularC‐terminalDomain)capalcitosol.
‐ Viaamiloidogènica.Encondicionspatològiques,enllocdel’α‐secretasa,actualaβ‐
secretasa, generant el fragment extracel·lular sAPPβ. Llavors, el tall de la γ‐
secretasageneraelpèptidAβieldominiAICD.
El llocdetallde laγ‐secretasaésvariable, ipotdonar‐sedesprésdelaminoàcids
38,40i42,generantpèptidsdediferentgrandàriaihidrofobicitat.Aquestpuntdetallés
especialmentrellevantperalasubseqüenttendènciaal’agregaciódelpèptidAβ,sentl’1‐
42elmésamiloidogènic.
FiguraI.12.TallproteolíticdelaproteïnaAPPiformaciódelpèptidAβ.L’APPéslaproteïnaprecursora
del pèptid amiloide.Depenent de l’acció de proteases específiques, la seva proteòlisis donarà lloc a la via
amiloidogènica.L’accióde l’α‐secretasaevita la formaciódelpèptidamiloide,alliberantelpèptidP3 iAICD,
mentre que quan l’APP és tallada per la β‐secretasa, i posteriorment per la γ‐secretasa, s’allibera a l’espai
extracel·lularelpèptidAβ.FiguraadaptadadeSaraceno,C.(2013).
Mutacions hereditàries en els gens APP i PSEN, són les responsables de l’AD
familiar. És interessant citar que el gen APP es troba al cromosoma 21, fet que explica
perquèelsindividusambSíndromedeDownmanifestenADdemaneraprecoç.
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
32
Deformanatural,enellíquidcerebroespinalhumàienelplasmad’individussans,
hisónpresentsanticossoscontraelpèptidAβ39‐42,elsnivellsdelsquals,però,esredueixen
significativament en pacients d’AD, suggerint que la patologia pot tenir una base
immunodeficient(Solomon2009).
3.1.2. Hipòtesidelacascadaamiloide.
Lahipòtesimésacceptadaactualmentéslacascadaamiloide(FiguraI.13),laqual
s’inicia amb una sobreexpressió del pèptid Aβ, sobretot la forma Aβ1‐42, on la seva
incapacitat d’eliminar‐lo, donaria lloc a l’auto‐associació progressiva en espècies
oligomèriques,provocantl’incrementdelarespostainflamatòriaidelefectedegeneratiu
sobre les cèl·lules neuronals, i la deposició final en formade fibres amiloides i cabdells
neurofibril·larscaracterísticsdelademència(Solomon2006,Haass,Selkoe2007).
Recentment,s’hadefinitunanovavisiódelaetiopatologiadel’AD,laqualintegra
lacascadaamiloidedinsdelques’enténperciclededeposicióamiloide(FiguraI.13), ja
queperelquepodríemdirretroalimentació,l’agregaciódelpèptid‐Aβestimulalaresposta
inflamatòria, i aquesta estimula l’agregació del pèptid‐Aβ. Aquesta nova visió vincula
fortament l’agregació amiloide amb les forces que desencadenen la demència (Herrup
2010,Stefani2012).
Igual que per la gran majoria de malalties amiloidogèniques, anys enrere
s’assumienelsagregats insolublesd’Aβcomelscausantsdelapèrduadesinapsis imort
cel·lular,jaquecreavenunabarrerafísicaalvoltantdelescèl·lules,bloquejantl’intercanvi
denutrients,iatraientelsmacròfags(Lorenzo,Yankner1994).Undelprimersindicisque
posava en qüestió la toxicitat de les fibres amiloides va ser la localització, al còrtex
cerebral, d’espècies monomèriques, dimèriques i trímers d’Aβ, tan solubles com
insolubles,ilafortacorrelacióentrelesformessolublesiladensitatdeplaquesamiloidesi
de cabells neurofibril·lars (McLean et al. 1999). Més tard, es van separar les diferents
espèciesdepèptid,monòmerioligòmer(dímeritrímer),iesvaninjectararatolinsmodel
d’AD (Lorenzo, Yankner 1994,McLean et al. 1999,Dodart et al. 2002). Es vademostrar
queelsdèficitscognitiusestrobendirectamentrelacionatsamblaconcentraciód’espècies
oligomèriquessolublesdelpèptidAβ,noamblesmonomèriquesniamblesfibril·lars,tali
coms’haviapensatfinselmoment(Dodartetal.2002).
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
33
Figura I.13.Esquemade lahipòtesisde lacascadaamiloideacobladaalciclededeposicióamiloide.
Tan la l’AD familiar com l’esporàdic donen lloc a la sobreproducció del pèptid Aβ, un cop aquesta espècie
tòxicacomençaaagregar,esdesencadenalacascadadeprocessosqueprodueixenelssímptomesbiològicsi
neurològics del AD. L’activació de la resposta inflamatòria forma part del cicle de deposició amiloide, i
connecta tots dos processos. Tot i que són processos independents, el l’AD es troben connectats i
retroalimentatspositivament.FiguraadaptadadeHerrup,K.(2010).
3.1.3. Immunoteràpiacontral’Aβ.
Finsavuiendiaiencarasegueix,s’haninvestigatmoltesestratègiesdetractament
contra l’AD, com ara, la inhibició dels enzims β i γ‐secretases, la reducció d’agregat
amiloide, l’ús de pèptids trencadors de l’estructura en fulla‐β (β‐breakers), l’alliberació
d’Aβdelcervelloladisminuciódelainflamacióassociadaalsdepòsitsd’Aβ(Schenk2002).
Peròsemblaa serque la immunoteràpiaés l’estratègiamésesperançadora i laqueestà
guanyantmésforçaenelsdarrersanys,detalmanera,quevariesvacunesambanticossos
monoclonalshanarribatfinsafasesclíniquesavançades.
Laprimerademostracióinvivodequelaimmunoteràpiaanti‐Aeraefectivaesva
realitzarenratolinstransgènicsPDAPP,el1999.Laimmunitzacióactiva,administrantel
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
34
pèptid A, reduïa dràsticament la deposició en còrtex i hipocamp, les dues regions
principalsd’acumulaciódelpèptid(Schenketal.1999).
Pel que fa a la immunització passiva, l’administració d’anticossos monoclonals
(mAb) específics contra l’Aβ, en absència d’activació de la resposta cel·lular, també
reverteix la pèrdua dememòria en ratolins PDAPP. En aquest cas però, l’anticòs uneix
específicamentelpèptidAβsoluble,enllocdel’agregatinsoluble.Amés,nonomésuneix
Aβcerebral, sinóque tambéreconeixAβsolubleenplasma i, anivellsmésbaixos,enel
líquidcerebroespinald’animalsimmunitzats(Mohajerietal.2002).
Després dels resultats obtinguts en ratolinsmodel, es va prosseguir a iniciar les
fasesclíniquesenhumans.Totilesbonesexpectatives,laprovad’immunitzacióactivaAN‐
1792 (Ellan Phamaceuticals) va ser parada l’any 2002 en fase clínica IIa degut als
símptomes de meningoencefalitis asèptica en el 6 % dels casos (Nicoll et al. 2003).
L’anàlisipost‐mortem, però, va demostrar la reducció de fibres amiloides al cervell dels
pacients (Schenk 2002,Hock et al. 2003). A part de lameningoencefalitis, un altre dels
efectes secundaris d’administrar l’mAb sencer, és que agreuja la angiopatia amiloide
cerebral (CAA), un trastorn dels vasos sanguinis del SNC caracteritzada pel depòsit de
materialβ‐amiloidesobrelesparetsdelsvasos(Pfeiferetal.2002).Apartdequelaregió
constant (Fc) de l’anticòs podria ser la responsable d’activar la resposta complement
donantllocalaneuroinflamacióimicrohemorràgia,elcoadjuvantutilitzatalassaignoera
elmésadient.
Desprésdenombrososestudisperaprevenirels efectes secundarisnodesitjats,
lesprovesclíniquesqueméshanavançatsónlesdelavacunaACC‐001,queconsisteixen
underivatdelpèptidAβ,ilesdelanticòsAAB‐001,oBapineuzumab,unanticòsmAbmurí
dirigitcontraelsresidus1‐5del’extremN‐terminaldelpèptidAβ(mAb‐h3D6),elqualés
específicdelsoligòmersd’Aβ (Jacobsen2006,Wisniewski,Konietzko2008,Nitsch,Hock
2008). Malgrat les grans expectatives, aquest últim tractament ha estat aturat en fase
clínica III, degut a resultats inesperats (Thomas 2012). En fase clínica II, els efectes
adversosdelBapineuzumabhanestatlleusitransitoris,peròhancausatedemavasogènic
(Rinneetal.2010).Aquestefectes’harelacionatambladosidefàrmac, i lamajoriadels
casoscorresponienaportadorsdell’al·lelAPOE4.Desafortunadament,lesrestriccionsde
dosi i el reclutamentde pacients amb l’al·lelAPOE3 nohan estat suficientsper a seguir
amblafaseIII(Thomas2012).Calmencionarqueaquestesproveshanestatrealitzadesen
pacients amb un diagnòstic de lamalaltiamassa avançat, tal i com reivindica la revista
WorldADReport2011(Prince,Bryce&Ferri2011).
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
35
3.1.3.1. Fragmentsrecombinantsderivatsd’anticossos,scFv.
Actualment, la immunitzaciópassivaamb fragmentsvariablesde cadena senzilla
(single‐chainvariableFragment,scFv),ésadir,anticossosmancatsdelaregióFc(FiguraI.
14), resulta serunaestratègia terapèuticamolt esperançadoraper a lamalaltiad’AD, ja
quenoactivenlamicròglia,noprodueixenhemorràgiacerebral,niedemavasogènic,ihan
mostrat ser tanpotents i específicscomelsmAbdelsqualderiven (Fukuchiet al.2006,
Zameeretal.2008,Robertetal.2009).
Els fragmentd’unióa l’antigend’Ig(Fab,antigen‐bindingFragment), tambéestan
agafantforçacomapossibleimmunoteràpiacontral’AD(FiguraI.14).Encomparacióamb
elsscFv,tenenunamenoreficiènciad’expressióenE.colidegutaquetenendobledepes
moleculariquelesduescadenespolipeptídiquesestrobenunidesperunpontdisulfur,fet
quedificultaelseuplegamentcapal’estatnatiu.Amés,tenentendènciaaformarhomo‐
dímers entre les cadenes lleugeres (LC), coneguts coma proteïnes Bence‐Jones.Malgrat
això,elsFab,presentenunamajorestabilitatiafinitatqueelsscFv,quetendeixenaformar
agregatsisónrelativamentinestablesallargtermini(Hustetal.2007).
FiguraI.14.Esquemadelsdominisd’IgivariantsrecombinantsS’hirepresentaunanticòssencer(IgG),el
fragmentd’unióal’antigen(Fab)ielfragmentvariabledecadenasenzilla(scFv).CH,cadenaconstantipesada;
CL,cadenaconstantilleugera;VH,cadenavariableipesada;VL,cadenavariableilleugera.Imatgeextretade
www.aapsj.org.
L’estratègiadelsscFvhaagafatforçaaldemostrarquelapartFcdel’anticòsnoés
necessàriaquanladianaantigènicasónelsoligòmersd’Aβsolubles.Amés,mostrenmajor
afinitatperalsoligòmersd’Aβ1‐42,isóncapaçosd’inhibirtotalmentl’agregaciódel’Aβ1‐42
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
36
(Figura I. 15‐A). Amés, tenen capacitat de desfer, almenys fins lameitat, la càrrega de
fibres ja formades (Figura I. 15‐B), entenent que l’scFv també seria específic per als
agregatsinicialsencarasolubles(Bacskaietal.2002,Zameeretal.2008).
Figura I. 15. Cinètica d’agregació del pèptid Aβ1‐42. La cinètica ha estat mesurada per intensitat de
fluorescènciadelfluoròforThT(excitacióa450nmiemissióa482nm),enpresenciaoabsènciadel’scFv‐A4.
A)Co‐incubacióAβ1‐42+scFv‐A4.B)Efectedel’scFvenmostrapre‐agregada.AdaptadadeZameer,A.(2008).
Enresum, lesprincipalsavantatgesdels fragmentd’anticossosscFvcoma futura
estratègiaterapèuticacontral’ADsón,entred'altres:
‐ Lamancade la regióFc evita l’activacióde la resposta inflamatòriaque esdóna
ambelsanticossossencers.
‐ Mantenenunaafinitatperalantigenequiparablealsanticossossencers.
‐ Els gens dels scFv poden ser manipulats de forma racional per a millorar
l’especificitatiafinitatperalsoligòmerssolublesd’Aβ.
‐ Sónmoltmés petits que els anticossos convencionals i, a banda demostrar una
millorfarmacocinètica,podensermodificatsperafacilitarelseupasperlabarrera
hematoencefàlica,obé,serinternalitzatsennanopartículescapacesdesuperar‐la
(Gomez,DiMauro2012).
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
37
3.2. AmiloïdosisdeCadenaLleugera.
L’amiloïdosi de cadena lleugera (AL) és una de les amiloïdosis sistèmiques
humanes més complexes, on la proteïna precursora és la cadena lleugera (LC)
d’immunoglobulines(Ig).L’ALésl’amiloïdosisistèmicaméscomunaenelmónoccidental,
ambunaincidènciade10pacientspermilióperany.Lamajoriad’afectatssónmajorsde
45anysi lamitjaestrobaal’edatde67anys,ambunamitjanadesupervivènciad’entre
12‐40mesosdesprésdeserdiagnosticada(Blancas‐Mejia,Ramirez‐Alvarado2013).
Figura I. 16. Amiloïdosi de cadena lleugera (AL). Les cèl·lules plasmàtiques són les encarregades de
secretaralplasmatetràmersd’immunoglobulines(Igs)formatsperduescadenespesades(HC)iduescadenes
lleugeres(LC)idèntiquesunidesperpontsdisulfur.Encondicionspatològiques,esdónaunasecrecióaberrant
decadeneslleugeres(LC),perpartdecèl·lulesplasmàtiques,donantllocaladeposiciódedímersdeLCsen
òrgansvitals.FiguraadaptadadeBlancas‐Mejía,L.M.&Ramírez‐Alvarado,M.(2013).
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
38
L’ALés causadaperunaanormalproliferacióde cèl·lulesplasmàtiquesmonoclonalsdel
mollde l’os,quealliberenunagranquantitatdeLCs lliuresencirculació,sovint formant
dímers de LCs (proteïnes Bence‐Jones). A diferència de l’AH (amiloïdosi de cadena
pesada), no existeix una evident relació amb processos tumorals com ara el mieloma
múltiple. Aquestes cadenes agreguen formant fibres amiloides a l’espai extracel·lular de
diferents òrgans, sobretot ronyons, cor, fetge, tracte gastrointestinal i nervis perifèrics,
provocant la seva fallida (Figura I. 16). Els tractaments actuals específics contra
l’amiloïdosi ALno són curatius (Ramirez‐Alvarado2012). La presència de LCs lliures al
sèrumi/oorinaésfreqüentenindividusmajorsde50anys,peròtansolsunbaixnombre
desencadenaràl’AL.Ladeposicióamiloideésconseqüènciadelespropietatsestructuralsi
biofísiques de la proteïna amiloidogènica i de l’entorn fisiològic del teixit implicat
(Ramírez‐Alvarado,Kelly&Dobson2010)
3.2.1. VariabilitatdeseqüènciadelesLCiamiloidogènesi.
Lagranvariabilitatdeseqüènciade lesLCss’obtéper recombinacióaleatòriade
fragmentsdegensgerminalsd’Ig:elsgensIgV,IgJiIgC,iperhipermutacionssomàtiques,
conservades i no‐conservades, que milloren l’afinitat per l’antigen. En funció de la
recombinació d’aquests gens, existeixen dos tipus de LCs: кLCs i λLCs. Estudis
comparatius,revelenquelesseqüènciesgerminalsκI,λ1,λII,λIII, iλVI(especialmentles
línies κI O18/O8 i λVIa) es troben més representades en pacients d’amiloïdosi AL,
contenen més mutacions no conservatives i són intrínsecament més propenses a
l’agregacióquelesseqüènciesd’LCsnormals(Comenzoetal.2001,Abrahametal.2003).
Lacombinaciódegensimutacionsfanquecadapacientd’ALpresentiunaúnicaseqüència
proteicaambdiferent tendènciaa formar fibresamiloides,queesdipositaranenòrgans
diferents, variant el rang de severitat de lamalaltia, fet que complica el diagnòstic i el
posteriortractament.(Ramirez‐Alvarado2012).
S’hanrealitzatmoltsestudisambl’objectiudetrobarpatronsdemutaciócomuns
entre el gran nombre de seqüències d’AL, així com característiques estructurals que
impliquin més o menys tendència amiloidogènica (Stevens 2000). Tot i ser molt útil,
l’anàlisideseqüèncianoresultasuficient.UnexempleserialaproteïnaJto,depacientde
mielomamúltiple, que conté una seqüència quasi idèntica a la proteïnaWil, de pacient
d’AL. Totes dues deriven de la mateixa línia germinal λVI, però la primera no causa
disfuncióorgànicaniagregatsamiloides,talicomhofalaamiloidogènicaWil(Walletal.
1999).
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
39
Sembla a ser que, enlloc del nombre de mutacions, seria la seva localització
respecte la seqüència germinal i comafecten al plegament de laproteïna, el quepodria
ajudaraentendreelsdeterminantsamiloidogènicsiferpronòsticavançatdel’evolucióde
lamalaltia(Poshustaetal.2009).
3.2.2. EstabilitatiagregaciódelescadenesLC.
Per a les proteïnes en general, ha estat demostrat que no hi ha una correlació
directaentrelapèrduad’estabilitatiunamajortendènciaal’agregació(Cerda‐Costaetal.
2009). Tot i això, estudis inicials d’estabilitat termodinàmica de LC implicades en AL,
apuntencapaunacorrelacióentremutacionsnoconservades,desestabilitzaciódelestat
natiu iaugmentde lacapacitatamiloidogènica(Hurleetal.1994,Stevensetal.1995).A
més, totsells coincideixenenque lamajoriadeLCssegueixenuna transiciódeequilibri
plegat‐desplegatdedosestatsdepenentdenucleacióireversible,enlaques’acumulaun
intermediaricinèticparcialmentdesplegat,capaçdedesviarlaviadedesplegamentcapa
l’amiloide(Walletal.1999,Qinetal.2007,Blancas‐Mejiaetal.2009).
Aquestintermediaricinèticésconsideratelprecursordelaviaamiloide,jaqueés
capaç d’adoptar una estructura no nativa rica en fulla‐β, autoassociar‐se i, finalment,
formar fibres β‐amiloides. (Blancas‐Mejia, Ramirez‐Alvarado 2013). És interessant citar
queKhurana et al. van descriure la presència, depenent de les condicions, de dos tipus
d’intermediariscinèticsdiferents:l’intermediarinatiu(IN)queseriaprecursord’agregats
amorfs, i l’intermediari desplegat (IU) que promouria la via amiloide. Caldria però,
aprofundirmés en les cinètiquesde formació i d’equilibri conformacional d’aquestsdos
estats(Khuranaetal.2001).
És sabut que les fibres amiloides no es formen sota condicions que afavoreixen
l’estat natiu o el totalment desplegat. Això suggereix que, a condicions fisiològiques, és
necessariqueesdonin canvis conformacionalsde l’estatnatiuperpoderentrar a la via
amiloide(Blancas‐Mejiaetal.2009).Pertant,esdedueixquecertesmutacionssomàtiques
afectendirectamentalaconformaciónativadelaproteïna,iafavoreixenl’estabilitzaciódel
estatintermediari,fentquelaproteïnaadquireixiunaltpotencialamiloidogènic.
3.2.3. DeterminantsestructuralsdelesproteïnesLCsamiloidogèniques.
κI O18/O8 i λ6a són les dues línies germinalsmés abundants en pacients d’AL.
Totesduestendeixenintrínsecamentaformarfibresamiloidesipresentenunaestabilitat
termodinàmica semblant, tot i que la λ6a segueixuna cinèticade fibril·laciómés ràpida
quelaκIO18/O8(Blancas‐Mejia,Ramirez‐Alvarado2013).Encaracalenmésestudisper
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
40
explicar perquè aquestes dues línies germinals, i les proteïnesAL derivades d’elles, són
mésamiloidogèniquesqueleslíniesgerminalsd’Igdepacientssans.
Partintd’aquestatendèncianatural,aquestesduesproteïneshanestatcomparades
exhaustivament amb les seves corresponents proteïnes AL mutades, amb la finalitat
d’entendrelacontribuciód’unaúnicamutacióenl’estructurail’estabilitattermodinàmica
delaproteïnaielperquèaquestesestrobenmésdesestabilitzadesrespectelagerminal.
Les proteïnes amiloidogèniques AL‐09, AL‐12 i AL‐103 (amb 7, 8 i 4mutacions,
respectivament), comparteixenmésd’un90%d’identitatamb lasevaproteïnagerminal,
κI O18/O8, i totes adopten el plegament canònic de les Igs (Figura I. 17). Tot i això, la
proteïnagerminaléstermodinàmicamentmésestableisegueixunacinèticadefibril·lació
méslentaquelesamiloidogèniques(Badenetal.2008b,Sikkink,Ramirez‐Alvarado2008,
Randlesetal.2009).DelamateixamanerasucceeixamblalíniagerminalλVIailaproteïna
Wil,queenderivad’aquestaipresenta11mutacionssomàtiques(delPozoYauneretal.
2008).
Dinsdelheterotetràmerd’Igsambunplegamentcorrecte,eldominiVLieldomini
VH es trobenunitsno‐covalentment formantuna interfíciedimèrica ambuna estructura
terciària i quaternària molt conservada. En el cas d’AL, el 85% del pacients amb AL
secretendímersdeLCslliuresenelplasma(proteïnesBence‐Jones),onelsdominisVL‐VL
s’associenformant lamateixainterfíciequeelsdímersVL‐VHd’Ig(Novotny,Haber1985).
Pertant,l’estudid’aquestsdominisvariablesilasevaconformaciódimèricaésnecessària.
Figura I.17.AlineamentmúltiplededominisVL amiloidogènics i la seva línia germinal κIO18/O8.
L’alineamentmúltiplerespectelalíniagerminalκIO18/O8mostraladiversitatdemutacionssomàtiquesdins
delesseqüències.AL‐12conté8mutacions,delesquals7nosónconservatives,mentrequel’AL‐103conté4i
totesnoconservades,inclosalainserciódelaprolina95ProIns.L’AL‐09conté7mutacions,3delesqualsno
sónconservatives.GranpartdelesmutacionseslocalitzenalCDR1iCDR3,iregionsFR.Totesellessegueixen
lanomenclaturaKabat(Kabat1983).Sindicafulla‐β.
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
41
3.2.3.1. InterfíciedelsdímersVL‐VLiamiloidogènesi.
Els dominis VL d’Igs adopten un plegament de tipus barril‐β, format per nou
cadenes (A,B,C,C’,C’’,D,E,F, iG)empaquetadesendues fulles‐β iunidesperunpont
disulfur, deixant enterrat el nucli hidrofòbic. Les cadenes B‐C, C’‐C’’ i F‐G estan
connectadespels loops CRD,quees trobenexposatsa la superfíciedeldomini (Figura I.
18).
FiguraI.18.Estructurad’immunoglobulinesidominisVL.A)Estructuraderaigs‐Xdel’anticòsк‐IgG[codi
PDB1IGT].Duescadenespesades(verd)iduescadeneslleugeres(groc)s’associenformantl’heterotetràmer.
B)Estructuradelacadenalleugerasencera(LC),taneldominiCL(vermell)comeldominiVL(groc)presenten
el plegament característic d’Igs. C) Alineament estructural de les estructures cristal·lines de les línies
germinals amiloidogèniques λVL 6aJL2 (groc) i κVL κ1 O18/O8JK2 (vermell) [codi PDB 2W0K i 2Q20,
respectivament].LesregionsFRmostrenunaestructurasimilar,mentrequelesregionsCDRs(blau)mostren
diferènciessignificantsdegutal’elevadavariabilitatdeseqüència.TotesdueslíniescontenenelresiduTrp35
conservat (barresnegres), ies localitzamoltproperalpontdisulfur típicdelsdominisd’Igs (barresgrises).
FiguraadaptadadeBlancas‐Mejía,L.M.&Ramírez‐Alvarado,M.(2013).
Estudis demodelatge estructural amb seqüències VL de pacients d’AL, realitzats
perRamírez‐Alvaradoicol·laboradors,reportenquelamajoriademutacionseslocalitzen
en la interfíciedimèrica (cadenes‐βC, F iG), sobretotmutacions cap residusd’histidina
(Poshustaetal.2009,Petersonetal.2010).
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
42
En aquest sentit, la proteïna germinal κIO18/O8 cristal·litza en formadedímer
canònicmentrequelaproteïnaamiloidogènicaAL‐09,ambtresmutacionsnoconservades
dins o properes a la interfície, adopta una estructura de dímer alterat, ambuna rotació
entredominisde90°respectelagerminal(FiguraI.19‐A,B)(Badenetal.2008a).Elresidu
Tyr87 es troba conservat en més del 95% de les seqüències germinals λ i к. La seva
mutaciórestaurativa,capalresiduconservatdelaseqüènciagerminalenaquestaposició
(AL‐09H87Y),mostra que aquest únic canvi estabilitza la proteïna, retarda la formació
amiloideirecuperalaconformacióperapoderadoptarlainteracciódimèricacanònicade
κIO18/O8.
Figura I.19.Diferenciesen la interfíciedimèricaentreeldímerd’AL‐09 ide κIO18/O8.L’estructura
cristal·linadeldímerVL‐VLdelaproteïnagerminalκIO18/O8(a)adoptalainterfíciedimèricacanònicad’Igs,
mentrequelaproteïnaamiloidogènicaAL‐09mostraunainterfíciedimèricarotada90°Crespectelagerminal.
FiguraadaptadadeBaden,E.M.(2008).
Un altre exemple d’alteració de la interfície de dímers VL‐VL és la proteïna LEN,
implicada en mieloma múltiple. La proteïna LEN, amb dues mutacions puntuals, forma
dímers rotats 180° respecte la seva proteïna nativa degut a canvis electrostàtics en la
interfície (Pokkuluri et al. 1998). Resultats similars han obtingutDel PozoYauner et al.
comparantlaproteïnagerminalλ6aambelmutantpuntualλ6aR25G(delPozoYauneret
al. 2008). Sembla a ser que les cadenes LCs monomèriques interaccionen entre elles
adoptant diferents conformacions dimèriques, convertibles entre elles. Per fluctuacions
conformacionalsadopten la interfíciemés favorableenergèticament, ja sigui la interfície
canònica o alterada (Figura I. 20). Els residus situats a la interfície determinen quina
d’elles és més favorables, o si varies interfícies poden existir al mateix temps ja que
presentenunpanoramaenergèticsemblant(Petersonetal.2010).Pertant,determinades
mutacions en la interfície dimèrica estabilitzen dímers no canònic, fet que pot estar
relacionatambpotenciarl’amiloïdosi.
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
43
Figura I. 20. Promiscuïtat de la interfície dimèrica dels dominis VL amiloidogènics. Les mutacions
somàtiquesalsresidus34i87generenquatrepossiblesconformacionsdelainterfíciedimèrica.A)Malgratla
febleKd,lamutaciórecíprocaeneldominiκIO18/O8Y87Hpoblatansolsunaúnicaconformaciórotada180°
respectelacanònica.B)LainterfícieN34/Y87delalíniagerminalκIO18/O8permetmúltiplesconformacions,
onlacanònicaésmésfavorablequelesaltres(groc).C)EldominiamiloidogènicAL‐09(interfícieN34/H87)
també presenta diferents conformacions, sent favorable la rotada 90 ° respecte la canònica. D) Lamutació
restaurativadeAL‐09H87Y recupera la conformació canònicade la interfíciedimèrica.Figuraadaptadade
Peterson,F.C.(2010).
Pel que fa a cinètiques de fibril·lació, no existeix una clara correlació entre la
promiscuïtat a un tipus de interfície dimèrica i una major tendència amiloide. Tot fa
pensarquelescadenesLCsamiloidogèniquesadquireixenunaestructuradedímeralterat
exposant regions més propenses a l’agregació. Seria necessari estudiar els residus que
formenpartdenuclihidrofòbicdelesfibresd’ALperdeterminarquinscontactessónmés
amiloidogènics(Petersonetal.2010).
3.2.4. Futuresestratègiesterapèutiques.
Actualment,els tractamentscontra l’ALnosóncuratius (Blancas‐Mejia,Ramirez‐
Alvarado2013).Undiagnòsticacurat,determinarquinsòrgansestrobenafectats,ielrisc
associat a les diferents modalitats de tractament, és el primer pas per a poder fer un
tractamentadequatdelamalaltia.L’objectiudelstractamentscontral’amiloïdosid’ALés
aconseguirreduir laconcentraciódeLC lliureencirculació; sinoéscompletament, siel
mínimperaturarlaprogressiódelamalaltiaimillorarlafuncionalitatorgànica(Ramírez‐
Alvarado,Kelly&Dobson2010).
Els tractaments que es duen a terme inclouen la quimioteràpia i l’auto‐
trasplantament de cèl·lules mare, dirigits contra la població de cèl·lules plasmàtiques
II‐Introducció AmiloïdosioMalaltiesAmiloidogèniques
44
malignesdelmollde l’os, secretoresenexcésde lesLCs lliures.Tot iqueresulten força
eficaços,partdelspacientsd’ALmostrenintolerànciaidesencadenendisfuncióorgànica.
Totieltractamentactual,laimmunoteràpiacadacopestàagafantmésforçacoma
futuraestratègiaenlesmalaltiesamiloidogèniquesengeneral.Pelquefaal’AL,jahaestat
desenvolupada i avaluada, en ratolins model de l’AL, l’eficàcia terapèutica del anticòs
monoclonal murí mAB‐11‐1F4, que reconeix específicament les fibres amiloides de LC,
disminueix la quantitat total dipositada i millora el funcionament dels òrgans afectats
(Solomon,Weiss &Wall 2003, O'Nuallain et al. 2007). Tot i ser un avanç terapèutic, el
tractament requereix combinar‐se amb la quimioteràpia o l’auto‐trasplantament per a
podereliminarlescèl·lulesplasmàtiquesmalignes.
Delamateixamaneraqueenl’ADilamajoriadelesmalaltiesamiloidogèniques,en
elsdarrersanyss’hademostratquel’estatmonomèricol’intermediarioligomèricsoluble
sónlaprincipalespèciecitotòxicaenl’AL,mésquelesfibresinsolubles.Pelquefaal’AL,
les cadenes LC solubles són internalitzades dins de les cèl·lules renals o cardíaques, de
forma que s’altera l’homeòstasi, l’estat redox de la cèl·lula, i s’incrementa les espècies
reactives d’oxigen (ROS) i l’estrès cel·lular. Amés, també s’ha observat un dèficit en la
contraccióirelaxaciódelscardiomiòcits(Brenneretal.2004,Trinkaus‐Randalletal.2005,
Sikkink,Ramirez‐Alvarado2010).Recentments’havistque,lesproteïnesLCsderivadesde
pacientsd’AL,indueixenapoptosidelescèl·lulesdecardiomiòcitsatravésdelaviap38‐
MAPK. El tractament per inhibir selectivament aquesta via atenua, significativament,
l’estrèsoxidatiu,ladisfunciócel·lularil’apoptosidesencadenadaperlescadenesLCs(Shi
etal.2010).
Malgratqueelstractamentsactualscontral’ALesbasenenlaquimioteràpiacontra
les cèl·lules plasmàtiques secretores de LCs, o bé, en mAb específics de les fibres
amiloides, les futures estratègies terapèutiques han d’anar enfocades cap al
reconeixement específic de les espècies solubles, segrestant‐les per evitar la seva
citotoxicitat i evitar la seva associació en fibres amiloides. Malauradament, la ciència
actual encaraes troba llunyd’un tractament terapèutic curatiu.Per a aconseguir‐ho, cal
entendremillor la correlacióentre fibrogènesis i estabilitat termodinàmicadelsdominis
VL, així com unamillor identificació de les espècies citotòxiques i el seumecanisme de
danycel·lularitissular.Amés,pocesconeixsobreelpaperquejugal’entorncel·lularenla
modulaciódelgraudedeposicióamiloideilasevaespecificitatdeteixit.
II‐Introducció InteractomaiMalaltiesHumanes
45
4. INTERACTOMAIMALALTIESHUMANES.
Les patologies humanes en general, entre elles l’amiloïdosi, tenen un origen i
segueixenunmecanismemolecularpatològicespecíficquelescaracteritza.Elseuestudia
nivell local i molecular és indispensable per tal d’esbrinar l’etiopatologia de cada una
d’elles. Però, és evident, que dins de la complexitat del organisme humà,molts són els
processosqueparticipenadesencadenarelgranventalldepatologieshumanesoaferque
aquestesprogressiniafectinnegativamentalconjuntdelsistemahumà.Apartdelpuntde
vistamolecular, tal i coms’hadescrit enel casde l’ADo l’AL, ésnecessari adquirir una
visiómés general de com aquestes patologies alteren el perfecte entramat biològic que
sosté i regulaelsprocessosbiològicsessencialsqueesdonendins lacèl·lula, comara la
divisió cel·lular, l’obtenció d’energia o la transducció de senyals. Aquest entramat és
conseqüència de múltiples interaccions entre un gran nombre de biomolècules que es
trobeninterconnectadesentresiformantxarxesd’interaccióointeractomes.Lescèl·lules
demamíferscontenen,aproximadament,1biliódemolèculesproteiques,delesqualsun
10%es troben implicades enprocessos de transducció de senyal. (Good, Zalatan&Lim
2011). Entendre com les proteïnes interaccionen entre elles i realitzen funcions dins la
cèl·lula,alhoraquesónaltamentreguladesimodulades,ésessencialperacomprendreel
funcionamentglobaldelacèl·lulai,apartird’aquí,traçarnovesviesbiologiesiaprofundir
enlesmalaltiesrelacionades,sovintestudiadesanivellmolecular,sensetenirencompte
la repercussióo l’origenque tenendins la xarxa cel·lular o interactoma.És emergent la
necessitatd’entendrelesdiferentspatologieshumanesanivelldexarxesinterconnectades
a diferents estrats (proteòmic, genòmic, ambiental...), un punt de vista actualment
nomenatcomadiseasome,enanglès(FiguraI.21).Ienaquestsentit,laproteòmicahijuga
unpapermoltimportant(Rainetal.2001,Goh,Choi2012).
4.1. Proteïneshubidominismodulars.
La característica principal dels mapes d’interacció proteïna‐proteïna és la
presència de grans nodes centrals (o hub proteins) que actuen com a plataformes
d’interaccióentreelsdiferentsmòdulsenelsqualsestàorganitzatelproteoma(Zhang,Xu
&Xiao2013).Lesproteïneshubnoacostumenapresentaractivitatenzimàticaespecífica,
sinóquesónelementscentralsalvoltantdelsqualss’organitzatotelproteomacel·lular,
regulant i connectant els processos biològics entre si, tan física com temporalment
(Uversky2013).Esdevenenproteïnesdesuport(oscaffold)quecoordinenl’assemblatgei
l’especificitat del flux d’informació intracel·lular (Good, Zalatan & Lim 2011). A més,
aquestes proteïnes es troben molt conservades evolutivament (Vallabhajosyula et al.
II‐Introducció InteractomaiMalaltiesHumanes
46
2009).UnexempledeproteïnadesuportserialaproteïnadellevatSte5olademamífer
KSR,essencialsenlaviadesenyalitzacióMAPK(Mitogen‐ActivatedProteinKinase)(Figura
I. 22‐B), o bé la proteïna post‐sinàptica PSD‐95 de la família de proteïnes MAGUK
(MembraneAssociatedGuanylateKinase)(FiguraI.22‐A).
Figura I. 21.Representació de l’organització del flux d’informació cel·lular . A) El domini PDZ de la
proteïnapost‐sinàpticaPSD‐95controlaelsreceptorsdeglutamatNMDAiAMPAdelasinapsisneuronal.B)
LesproteïnessuportSte5,enllevats,iKSR,enmamífer,controlenlaviadesenyalitzacióMAPKintracel·lular.
FiguraadaptadadeGood,M.C.(2011).
Lesproteïneshubsovintexhibeixen regionsdesestructuradesomodulables,ésa
dir,noadoptenunplegamenttridimensionaldeterminatenelespai,raóperlaqualseles
pot classificar com a proteïnes o regions intrínsecament desestructurades (IDPs,
IntrinsicallyDisorderedProteins),onl’estatnatiuésdesordenat,ambunagranplasticitati
adaptabilitatestructural,crucialsperadaptar‐sealadiversitatfuncionalnecessàriapera
participariregulardiferentsviesd’informacióbiològica.(Huse,Kuriyan2002,Dunkeret
al.2008).Tendeixenaunatransicióconstantordenat‐desordenatcomaresultatd’unir‐se
i separar‐se del seu lligand altament específic i amb una constant d’afinitatmolt baixa.
Així,lesIDPsfàcilmentpodenunir‐seadiferentsproteïnescanviantlamanerad’associar‐
seambcadaunad’elles(Good,Zalatan&Lim2011).
II‐Introducció InteractomaiMalaltiesHumanes
47
4.2. DominisPDZ.
Les proteïnes hub estan organitzades en varis dominis associats,
conformacionalment independents, i units entre ells per diferents tipus de connectors
(Good,Zalatan&Lim2011).
Aquests dominis modulars deixen accessible la superfície de unió a les seves
dianes específiques i reconeixen una regió o motiu estructural específic que els fa
característic.
ElsdominisPDZsónundelsmòdulsd’interaccióproteïna‐proteïnamésabundant
enmamífers(FiguraI.22).Enhumans,mésde250tipusdedominisPDZformenpartde
150proteïneshubdiferents,esdevenintelementsessencialsdins lesxarxesd’informació
cel·lular(Ivarsson2012).
FiguraI.22.ExempledeproteïnesmultidominiquecontenendominisPDZ.ElsdominisPDZsónundels
mòdulsmésabundantsenproteïneshubdemamífers,esdevenintelementsessencialsperalesxarxesdeflux
d’informaciócel·lular.
Elseunomprovédelestresprimeresproteïnesenlesquevanseridentificats,farà
més de 20 anys:Post SynapticDensity protein‐95 (PSD‐95),Disc Large tumor supressor
(DLG),iZonula‐Occludens‐1(ZO‐1).Totesellessónproteïnesqueorganitzenprocessosde
transducciódesenyal,adhesióitràficcel·lular(Zhang2013).
Els dominis PDZ reconeixen els extrems C‐terminals d’una gran varietat de
proteïnes.Prenenespecialimportànciaenelmantenimentdelapolaritzaciócel·lularien
processos de transducció de senyal a través de la membrana plasmàtica, com ara la
II‐Introducció InteractomaiMalaltiesHumanes
48
sinapsis (Sierralta, Mendoza 2004). I recentment, s’han descrit certs aspectes
conformacionalsd’aquestsdominisquepodrienestar implicatsen la regulaciódenoves
funcions. Com per exemple, el segon domini PDZ de la proteïna ZO (zònula occludens)
regulalal’adhesiócel·lularatravésdelasevadimerització(Umedaetal.2006,Wuetal.
2007),oeltercerdominiPDZdelaproteïnaPSD‐95,quemodulal’afinitatil’especificitat
de la butxaca d’unió des de regions distants de la molècula, a través d’interaccions
al·lostèriquesintra‐domini(Lockless,Ranganathan1999,Jemth,Gianni2007).
4.2.1. CaracteritzacióestructuraldelsdominisPDZ.
ElsdominisPDZsónproteïnesglobularsrelativamentpetites,d’aproximadament
90residus.L’estructuracanònicadelsPDZconsisteixenunbarril‐β,formatpercincosis
cadenes (β1‐β6), rodejat per dues hèlix‐α, l’α1 més curta que l’α2 (Figura I. 23). Dins
l’estructura,elsextremsNiC‐terminalessituenmoltpropersentreells,facilitantlaseva
inserciódins laproteïna, ioposatsa la conservadabutxacad’unióal lligand,unacavitat
situadaentre lacadena‐β2i l’hèlix‐α2(Lee,Zheng2010).Tot icompartirelmateixnucli
estructural, els dominis PDZ difereixen entre ells per a la variabilitat de les regions
estructurades en loop, i poden presentar estructures secundàries addicionals (Ivarsson
2012).
FiguraI.23.RepresentaciódelplegamentcanònicdelsdominisPDZ.A)DominiPTP‐BLPDZ2(codiPDB
1GM1).B)DominiPDZde laproteasaD1(codiPDB1FC7).C)DominiGRASP55PDZ1(codiPDB3RLE).Les
cadenes‐βsituadesenelsextremsN‐iC‐terminalsestrobenmarcadesenblauivermell,respectivament.
Inicialment,elsdominisPDZhanestatclassificatssegonslanaturalesadelsquatre
últims aminoàcids C‐terminals dels lligands que reconeixen (Songyang et al. 1997, Lee,
Zheng2010).LataulaI.2resumeixelstrestipusdeclassescanòniquesdelsdominisPDZ.
II‐Introducció InteractomaiMalaltiesHumanes
49
TaulaI.2.ClassificaciódedominisPDZenfunciódelasevaespecificitatd’unió.DepenentdelmotiuC‐
terminaldelslligandsespecíficsquereconeixenelsdominisPDZ,aquestshanestatclassificatsenclasseI,IIi
III.(Xrepresentaqualsevolaminoàcid,iɸtansolsresidushidrofòbics).
Motiu C‐terminal Exemple de domini PDZ
Classe I [X‐(S/T)‐X‐(V/I)COOH] PSD95‐PDZ3 Classe II [X‐Ф‐X‐ФCOOH] GRIPP1‐PDZ3 Classe III [X‐(D/E)‐X‐ФCOOH] nNOS‐PDZ
Aquestaclassificació,però,noexplicalagranheterogeneïtatselectivadelsdominis
PDZ per a reconèixer extrems C‐terminals. L’existència d’altresmecanismesmoleculars
necessarisperamodularl’afinitatil’especificitatd’aquestsdominis,comaralaregulació
al·lostèrica intra‐domini, complementarien aquesta classificació inicial (Petit et al. 2009,
Camara‐Artigasetal.2010,Mostarda,Gfeller&Rao2012).
4.3. LaproteïnaPSD‐95.
La proteïna PSD‐95 (Post Synaptic Density protein‐95), també coneguda amb el
nom de SAP90 o Dlg4, és un exemple de sistemamultimodular hub i forma part de la
família de proteïnes MAGUK (Membrane Associated Guanylate Kinase). Es localitza a la
regió de densitat post‐sinàptica de les espines dendrítiques, on hi trobem un complex
supramolecular electro‐dens, d’aquí el seu nom, format per una gran concentració de
receptorsdeglutamatNMDAiAMPA.
LaPSD‐95organitza latransducciódesenyals icoordinaeltràficmoleculardela
sinapsis neuronal (Figura I. 24). La seva funció principal és la d’agrupar i localitzar
receptorsdemembranaNMDAiAMPA,icanalsiònicsdeNa+(Elias,Nicoll2007).També
interaccionaambvariesproteïnescitoplasmàtiques,comperexemplelaSintasaneuronal
d’Òxid Nítric (nNOS) implicada en la excitotoxicitat neuronal, o la proteïna CRIPT
(Cysteine‐Rich Interactor Protein); com també interactua amb proteïnes associades al
citoesquelet,comlaF‐actina(Passafaroetal.1999,Sheng,Sala2001).
LaproteïnaPSD‐95éslaproteïnahubmésabundantdeladensitatpost‐sinàpticai,
com totes les de la famíliaMAGUK, està formada per tres dominis PDZ, un domini SH3
(SRC Homology 3 Domain) i un domini GK (Guanilat Kinasa). Tots cinc actuen com a
dominis moduladors d’interacció proteïna‐proteïna. Els dominis SH3 i GK, es troben
implicatsen ladimeritzacióde laproteïnaPSD‐95.Launióde lligandsal loop entre tots
dosdominisprovocaelseucanviconformacionalipromoulaformaciód’homodímersde
PSD‐95(Nixetal.2000,McGeeetal.2001,McGee,Bredt2003).
II‐Introducció InteractomaiMalaltiesHumanes
50
FiguraI.24.Localitzaciópost‐sinàpticaiinteraccionsmolecularsdelaproteïnaPSD‐95.A)Laproteïna
PSD‐95eslocalitzaaladensitatpost‐sinàpticadelesespinesdendrítiques(S).Lafletxasenyalalapresenciade
receptorsNMDAmarcatsambpartículesd’or.B)Alaterminalpost‐sinàptica,laproteïnaPSD‐95interacciona
ambreceptorsdemembrana,canalsdesodi,iproteïnescitoplasmàtiquesnNOSiCRIPT.
PelquefaalsdosprimersdominisdelaproteïnaPSD‐95,PDZ1iPDZ2,presenten
una estructura i propietats d’uniómolt similars, i es troben separats per una seqüencia
d’aminoàcidsmoltcurta, inferiora5residus,rígidaimoltconservadaentrelesdiferents
especies.Elsdosdominisestableixencontactesentresi,formantuntàndemquepromoula
dimerització de receptors o canals iònics, necessària per a ser funcionals, o bé com a
mètodeselectiudel’especificitatd’unióamblamolèculadiana(Longetal.2003).
4.3.1. DominiPDZ3delaproteïnaPSD‐95.
EltercerdominidelaproteïnaPSD‐95,d’araenendavantanomenatPDZ3,ésuna
de les tresproteïnespresentadesenaquestaTesiDoctoral.Aquestdomini, igualqueels
altres dos, té la funció d’interaccionar amb diferents molècules diana. Però, el cas del
dominiPDZ3ésunclarexempledemodulaciódel’afinitatil’especificitatd’uniómésenllà
de laregiód’unióa lligands,a travésde interaccionsal·lostèriques intra‐domini.Laseva
plasticitat estructural i les propietats dinàmiques de plegament han fet que el domini
PDZ3hagi estatobjectedenombrososestudis termodinàmics a la fi d’aprofundir en les
característiques conformacionals dels dominis PDZ en general. La seva estructura
cristal·linavaserlaprimeradetotselsdominisPDZenserresolta(Doyleetal.1996).
II‐Introducció InteractomaiMalaltiesHumanes
51
4.3.1.1. Hèlix‐α3addicionaldeldominiPDZ3.
Anivelld’estructuraciócanònicadelsdominisPDZ,elPDZ3(residus302‐402)rep
especial atenció ja que conté unahèlix‐α addicional (α3, residus394‐402) a l’extremC‐
terminal, empaquetada contra l’estructura central del domini, concretament contra les
cadenesβ2iβ3d’unadelesduesfulles‐βqueformenelbarril‐β(FiguraI.25‐B)
Finsfapoc,elscristallsdelPDZ3erenmancatsd’aquestahèlix‐αaddicional,degut
a que la seqüència proteica contenia un artefacte de clonació a l’extrem C‐terminal
(residus403‐415),queadoptavaunaconformacióenβ‐hairpinantiparal·lel(cadena‐β5),
tal i coms’observaa la figura I.25‐A.Entred’altres,Cámara‐Artigas,A. i col·laboradors,
vanresoldre l’estructurarealdeldominiPDZ3(codiPDB3K82).Alcomparar‐loambels
resultatanteriors,vanveurequeaquestadiferènciaconformacionalmodificalaplasticitat
i funcionalitat de la proteïna PSD‐95, ja que l’hèlix‐α3 està totalment implicada en el
plegamentil’afinitatdeldomini(Petitetal.2009,Camara‐Artigasetal.2010).
Figura I.25.Estructuracristal·linadeldominiPDZ3.A)Primeraestructuraadquirida (residus302‐415)
ambl’artefactedeclonacióal’extremC‐terminalqueadoptaunaestructuraenβ‐hairpin(cadena‐β5).Figura
adaptadadeDoyle,D.A.(1996).B)EstructurarealdeldominiPDZ(residus302‐402)ambl’hèlix‐α3addicional
l’extremC‐terminal(blau)ilesdistànciesmésproperesalpèptidlligand(5.8ÅlaTyr397i6.9ÅlaPhe400).
Figura adaptada de Petit, C.M. (2009). Detall del pèptid lligand a la butxaca d’unió (β2‐α2) en groc (A) i
magenta(B).
Aquesta tercera hèlix‐α es localitza distant del centre actiu del domini i no
estableixuncontactedirecteambelC‐terminaldelpèptidaunir,elsresidusdel’hèlixmés
propersalpèptid,sonlaTyr397ilaPhe400,queessituena5.8Åi6.9Ådelpèptid,massa
distància per a establir algun tipus d’interacció (Petit et al. 2009). Recentment, ha estat
II‐Introducció InteractomaiMalaltiesHumanes
52
demostratquelafosforilaciódelaTyr397desestabilitzal’hèlix‐α3,desempaquetant‐ladel
dominiglobal.Conseqüentment, l’afinitatperal lliganddisminueix finsaquatrevegades
(Zhangetal.2011).Encaramés,ladeleciódelsúltims7residusdel’hèlix‐α3redueixfinsa
21 vegades l’afinitat per al lligand. La taula I. 3 mostra els paràmetres termodinàmics
obtingutsdelmutant∆7ct‐PDZ3.
Taula I. 3. Paràmetres termodinàmics de la interacció del domini PDZ3 i el pèptid lligand CRIPT. Dades
extretes de Petit, C.M (2009).
Proteïna Kd (μM) ∆Hd (kcal/mol) ‐T∆Sd (kcal/mol)
PDZ3303‐402 1.2 (0.1) ‐9.70 (0.12) 1.66 (0.06) ∆7ct‐PDZ3 25.7 (3.6) ‐10.27 (0.68) 4.00 (0.59)
A part del descens de l’afinitat respecte el domini sencer, el fet que els valors
d’entalpia(∆H)siguinpràcticamentigualsentreells,indicaqueladeleciódel’hèlixtéun
efecte purament entròpic (∆S), sense afectar les interaccions i el plegament natiu de la
proteïna.Ique,pertant,l’afinitatdinàmicadeldominiPDZ3estàreguladaal·lostèricament
perl’hèlix‐α3addicional(Petitetal.2009).
4.3.1.2. Loopβ2‐β3deldominiPDZ3.
A part de l’hèlix-α3, s’han identificat altres regions del domini PDZ3 que també
influeixendirectamentsobrelacapacitatd’unióapèptids.
Per simulació deDinàmicaMolecular, s’ha identificat quepart del pèptid lligand
interaccionadirectamentambelloopqueconnectalescadenesβ2iβ3,formatpelsresidus
Gly329‐Gly335 (GGEDGEG). Concretament, dos residus de Lys del pèptid lligand
estableixeninteraccióelectrostàticaambelGlu331il’Asp332(FiguraI.26‐A).
Aquests contactes són dinàmics, s’intercanvien entre ells en una escala de
nanosegons,raóperlaqualhaestatdifícildetectar‐les(Mostarda,Gfeller&Rao2012).
II‐Introducció InteractomaiMalaltiesHumanes
53
FiguraI.26.Representaciódelsresidusdelloopβ2‐β3deldominiPDZ3implicatsenlainteraccióamb
pèptids i l’hèlix‐α3addicional.A)ModeldeldominiPDZ3(groc)onesdetalla labutxacad’unióapèptids
(blau)ilainteraccióentreelsresidusAsp332iGlu331(loopβ2‐β3)amblaLys‐4delpèptid.B)Interaccions
iòniquesde l’hèlix‐α3(Glu401 iArg399)ambel loopα1‐β4(Lys355), iambel loopβ2‐β3(Glu334). Imatges
adaptadesdeMostarda,S. (2012). C)Detall de l’anell de succinimidina formatper el residuAsp332. Imatge
adaptadadeCámara‐Artigas,A.(2010).
Tot plegat demostra que el loop β2‐β3,molt proper a la butxaca d’unió, juga un
papercentralenl’afinitatdeldominiPDZ3iestrobaregulatal·lostèricamentperlaregió
distantiaddicionalα3,iquel’afinitatdeldominiPDZ3estrobaestabilitzatperunaxarxa
de contactes dinàmics intra‐domini i amb el pèptid, tan al·lostèrics com iònics i que
impliquendiferentspartsdelamolècula.
4.4. MalaltiesrelacionadesambelsdominisPDZ.
Elfetqueexisteixiungrannombredeproteïneshubiquejuguenunpapercrucial
en els processos biològics, no fa inesperat que moltes d’elles es trobin implicades en
patologieshumanes.Lapèrduadelseusrolsdónallocaunaextensavarietatdemalalties,
com ara càncers, malalties neurodegeneratives (l’AD i Parkinson), malalties
cardiovasculars, o diabetis tipus‐II (Rezaei‐Ghaleh, Blackledge & Zweckstetter 2012).
Totes elles relacionades amb proteïnes de reconeixement, regulació i/o senyalització
II‐Introducció InteractomaiMalaltiesHumanes
54
cel·lular, funcions que, tal i com s’ha descrit anteriorment, solen implicar regions o
proteïnesIDPs(Uversky,Fink2004,Uversky2013).
La gran quantitat de proteïnes humanes que contenen dominis PDZ, es troben
distribuïdes en regions especialitzades de la cèl·lula, principalment en els contactes
epitelials intracel·lulars. La estricta localitzaciód’aquestesproteïnes i les seves funcions
de regulació de la transducció de senyal i polaritat cel·lular, implica que qualsevol
alteració a nivell estructural o d’expressió resulti en el desenvolupament de malalties
humanes,sobretotpelquefaunagranvarietatdecàncers(Facciutoetal.2012).
En els darrers anys s’han identificat varietats de virus humans que codifiquen
proteïnesqueinteraccionenipertorbenlafunciódelsdominisPDZ,comaestratègiapera
lasevareplicació(Focant,Hermans2013).Unexempleéselcasdelvirusdelpapil·loma
humà, que expressa la proteïna oncogènica HPV‐E6, la qual conté, en el seu extrem C‐
terminal,elmotiudereconeixementdelsdominisPDZ(Pimetal.2012).
En el cas concret de la proteïna post‐sinàptica PSD‐95, s’ha vist implicada en
malaltieshumanes,comaral’Autismeol’AD.
Enelcasdel’Autisme,existeixundèficitdelfactordetranscripcióMEF‐2(Myocyte
Enhancer Factor‐2), el qual s’encarrega de regular el nombre de sinapsis neuronals
mitjançant la ràpida i selectiva eliminació de la proteïna PSD‐95, que estabilitza els
receptors AMPA, i afavoreix al pas d’informació augmentant el nombre d’espines
dendrítiquesespecialitzadesenrebre impulsossinàptics.Per tant, lasevanodegradació
selectivaesreflexaenunahiperexcitacióneuronal,hipersensibilitatsensorial i, finsitot,
enatacsepilèptics, totsells símptomesenpacientsdeSíndromeX fràgil (FXS), la forma
hereditàriaméscomunaderetràsmentaliautisme(Tsaietal.2012).
Pel que fa a la malaltia d’AD, recentment s’ha detectat una co‐localització de la
proteïnaPSD‐95amboligòmersdelpèptid‐Aβ,l’espèciecitotòxicacausantdel’AD.Amés,
laconcentraciódeproteïnaPSD‐95alcervelldepacientsd’ADéssignificamentmenorque
enindividussans,degutaqueelsoligòmersd’Aβ1‐42indueixenunadisminuciódelsnivells
dePSD‐95alhipocampicòrtexneuronal,sentunadelescausesdeladisfunciósinàpticai
la discapacitat cognitiva de l’AD (Deshpande et al. 2006, Cascella et al. 2013). Per al
contrari,altresautorsdefensen lahipòtesideque lasobreexpressióde laproteïnapost‐
sinàpticaPSD‐95, ino la sevamancança,ésunmarcadorde lamalaltiad’AD,que indica
unareorganitzacióestructuralenelscompartimentspre‐ipost‐sinàptics,comaresposta
compensatòriaalesdisfuncionssinàptiques(Preissmannetal.2012).
Tambéenl’AD,éssabutquel’α‐secretasa,laproteasaquetallalaproteïnaAPPde
formanoamiloidogènica,interaccionadirectamentamblaproteïnaSAP97,paràlogadela
PSD‐95(oSAP90)(Mulleretal.1995).Aquestainteraccióésnecessàriaperalocalitzarla
II‐Introducció InteractomaiMalaltiesHumanes
55
secretasa a la membrana post‐sinàptica i digerir l’APP. Així, interferir el complex α‐
secretasa:SAP97,redueixl’activitatdel’α‐secretasaidesplaçalaproteòlisisdel’APPcapa
la via amiloidogènica donant lloc a la formació del pèptidAβ. Així, la inhibició d’aquest
complexmolecularesdevéunanova i interessantestratègiapera treballarambratolins
model d’AD sense la necessitat de ser transgènics, imimetitza els primers estadis d’AD
esporàdic, ja que després de dues setmanes, els ratolins presenten patrons
neurodegeneratiu típics d’AD, un augment dels agregats d’Aβ i de proteïna Tau
hiperfosforil·lada,aixícomunapèrduaselectivadereceptorsglutamatdelaterminalpost‐
sinàptica(Saracenoetal.2013).
III. OBJECTIUS.
III‐Objectius
59
L’objectiugenerald’aquestatesidoctoralhaestat:
L’estudide lareorganitzacióconformacionaldelestatnatiu i l’agregacióen
fulla‐β ordenada de proteïnes implicades en diferents malalties
conformacionalshumanes.
Eltreballescentraenl’estudidetrestipusdeproteïneshumanesdiferents:
‐ unfragmentvariabled’immunoglobulinadecadenasenzilla,l’scFv‐h3D6.
‐ undominivariabled’immunoglobulina,l’AL‐12.
‐ undominimodulardelaproteïnahubPSD‐95,elPDZ3.
, en funció de cada proteïna, la tesi es troba dividida en diferents capítols, els objectius
específicsdelsqualssónelssegüents:
‐ scFv‐h3D6.
‐ Capítol1:
Expressió i purificació de l’scFv‐h3D6 natiu, i separació de les seves
diferentsformesscrambled.
Estudide lesdiferentsviesd’agregaciódelpèptidAβ1‐42 idelscFv‐h3D6,
aixícomladelcomplexAβ1‐42:scFv‐h3D6.
Caracterització de la reorganització estructural del scFv‐h3D6 cap a
l’agregacióenfulla‐βcreuadaaltamentordenadadetipusWL.
Estudidelefectedelfragmentd’anticòsscFv‐h3D6sobrelaviad’agregació
amiloide i la toxicitat del pèptid Aβ1‐42 en cultius cel·lulars de
neuroblastomahumàSH‐SY5Y,peravaluarelseupotencialterapèuticala
malaltiad’Alzheimer
‐ Capítol2:
Obtenció d’un model tridimensional de l’estructura de l’scFv‐h3D6 per
homologiadeseqüències.
Avaluació i caracteritzacióde l’estructurasecundaria i terciàriade l’scFv‐
h3D6.
Redisseny racional, a partir del model 3D, de la molècula per tal
d’incrementar la seva estabilitat i disminuir la tendència intrínseca a
III‐Objectius
60
l’agregació. Això ha de permetre millorar la producció recombinant i
disminuirladosiefectivajademostradaenratolinsmodelsd’Alzheimer.
‐ AL‐12.
‐ Capítol3:
Obtenció dels paràmetres termodinàmics de l’AL‐12, domini VL obtingut
d’una pacient amb Amiloïdosi de cadena lleugera, i dels seus mutants
restauratius.
Comparaciódelsparàmetrestermodinàmicsdel’AL‐12idelsseusmutants
restauratius amb la proteïna germinal кI O18/O8 i altres dominis VL
amiloidogènics.
Estudidelaviad’agregaciódelAL‐12idelsseusmutantsrestauratius.
Determinar l’efecte de les mutacions no‐conservatives en dominis VL
amiloidogènics mitjançant la caracterització de la bateria de mutants
restauratiusdel’AL‐12.
‐ PDZ3.
‐ Capítol4:
Estudidelaviad’agregaciódeldominiPDZ3idelseuefectecitotòxicsobre
cultiuscel·lularsdeneuroblastomahumàSH‐SY5Y.
AnàlisimoleculardelprocésdereorganitzacióestructuraldeldominiPDZ3
capal’agregacióenfulla‐βcreuadaaltamentordenada.
Estudidelpaperdel’hèlix‐α3addicional,presenteneldominiPDZ3,enel
plegamentil’agregaciódeldomini,mitjançantlacaracteritzaciódelmutant
∆10ct‐PDZ3mancatd’aquestmotiuestructural.
Estudi dels determinants estructurals implicats en el procés d’agregació
del domini PDZ3, mitjançant la caracterització d’una bateria de mutants
simples.
Determinació de la importància de la regió de regulació al·lostèrica del
dominiPDZ3,l’hèlix‐α3ielloopβ2‐β3,sobreelplegamentil’agregacióde
domini.
IV. MATERIALSIMÈTODESGENERALS.
EnelsegüentapartatdeMaterialsiMètodesGeneralss’hidescriuenelsfonamentsde
lesdiferentstècniquesdelaboratoriempradesenaquestatesidoctoral,aixícomelsprotocols
generals.Peraltrabanda,al’apartatdeMaterialsiMètodesdecadacapítols’hidetallenles
tècniquesielsprotocolsexactesdutsatermeamblesmostrespertinents.
IV‐MaterialsiMètodesGenerals AparellsGenerals
65
1. APARELLSGENERALS.
‐ AgitadorvòrtexHEIDOLPHReaxTop
‐ AgitadorsmagnèticsStuartStirCB161
‐ Agitadorplaquesd’elisaIKAMS3digital
‐ AutoclauP‐SELECTAAutoester‐E
‐ BalançaMETTLERTOLEDOPJ300
‐ BalançaMETTLERTOLEDOAB204‐S
‐ BanytermostàticP‐SELECTATectronBio
‐ BanytermostàticP‐SELECTATectron3000543
‐ BombaperistàlticaP‐1GE
‐ CabinadefluxlaminarCRUMA870FL
‐ Cabinad’extracciódegasosCRUMA
‐ CabinadebioseguretatITELSTARBV‐30/70
‐ CentrífugaBECKMANCOULTERJ2‐HS.RotorJA‐20
‐ CentrífugaBECKMANCOULTERAllegra6R.RotorGH‐3.8
‐ CentrífugaBECKMANCOULTERAvantiJ26‐XP.RotorJA25.50/JA‐14
‐ CentrífugaHERAEUSMegafuge1.0RThermo‐Scientific
‐ UltracentrífugaBECKMANCOULTEROptimaL‐100XP.RotorSTrp55Ti
‐ Congelador‐20ºC,‐80ºCSANYO
‐ Cubetesd’electroforesiperagelsd’acrilamidaMini‐ProteanBIO‐RAD
‐ Cubetesd’electroforesiperagelsd’agarosaECOGEN
‐ EspectrofotòmetreUV‐VisVarianCary100
‐ Espectròmetred’InfrarroigVarian660‐IR.Equipatambmòduldetermostatització
Peltier
‐ EspectrofotòmetreUV‐VisNanodrop2000ThermoScientific
‐ EspectropolarímetreJ‐715,JASCO.EquipatambmòduldetermostatitzacióPeltier
‐ Estufaincubadora37°Cdecultiuscel·lularsFormaScientific3111
‐ Estufaincubadora37ºCHERAEUS
‐ Estufaincubadora100ºCP‐SELECTA
‐ Fontd’alimentacióperaelectroforesisBIO‐RAD
‐ FluorímetreVarianCaryEclipse.EquipatambmòduldetermostatitzacióPeltier.
‐ FPLCAKTAPurifier
‐ Incubadord’aireambagitacióINFORS‐HTEcotron.
‐ Incubadord’aireambagitacióINNOVA43
‐ Lectorplaquesd’elisaVictor3PerkinElmer
‐ LiofilitzadorBenchtopSLCVirtis
IV‐MaterialsiMètodesGenerals AparellsGenerals
66
‐ LupabinocularOLYMPUS‐CK2
‐ MicrocentrífugaEPPENDORF5424
‐ Micropipetes0.2‐2,1‐10,10‐100,100‐200,100‐1000,500‐5000μlGILSON
‐ Micropipetesmulticanal2‐20μlGILSON
‐ Micropipetesmulticanal20‐200μlHTDiscoveryConfort
‐ MicroscopielectrònicdetransmissióHITACHI,modelH‐7000
‐ pHmetremicropH2000CRISON
‐ PipetaelectrònicaPipetboyINTEGRA
‐ SistemadedigitalitzacióiquantificacióperlàserEscànerGS‐800,BIO‐RAD
‐ Sistema d’exposició de quimioluminescència Molecular Imager Chemi Doc XRS,
BIO‐RAD
‐ SonicadorSONIFIER450BRANSON
‐ Speed‐VacThermoSAVANTVLP80
‐ TermocicladorTECHNETC‐512
‐ TermoblocTECHNEDri‐BlockDB‐2A
‐ TC10™AutomatedCellCounterBIO‐RAD
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesdeDNARecombinant
67
2. TÈCNIQUESDEDNARECOMBINANT.
2.1. Reaccióencadenadelapolimerasa,PCR.
LatècnicadePCR(reaccióencadenadelapolimerasa)vaserdesenvolupadal’any
1987 per KaryMullis (Mullis, Faloona 1987) i actualment és una de les tècniquesmés
emprades en la Biologia Molecular. És una tècnica ràpida i senzilla que permet
l’amplificació de DNA in vitro, amb l’objectiu de realitzar processos de clonatge o
mutagènesidirigidadeproteïnes.
LaPCRconsisteixen lahibridaciódeseqüènciescomplementaries(encebadorso
primers) a un fragment específic del DNAmotlle, del qual s’han separat prèviament les
dues cadenes, i la elongació d’aquestes seqüenciesmitjançant l’enzimDNA‐polimerasa i
els componentsnecessaris (dNTPs iel cofactorMg2+,principalment).Ésunprocés cíclic
controlat per canvis de temperatura adients per a cada fase . El correcte disseny dels
encebadorséscrucialperaquelatècnicaresultieficient.Laincorporaciódepolimerases
termostables així com aparells termocicladors capaços de realitzar canvis cíclics de
temperaturaaelevadavelocitathanpermèsoptimitzarelprocés.
2.1.1. Dissenyd’encebadorsdePCR.
Amb la finalitat d’obtenir el millor rendiment i minimitzar els productes
inespecífics,caltenirencompteunasèriedefactorsrespecteeldissenydelsencebadors:
‐ El reemplaçament d’aminoàcids ha d’implicar els mínims canvis de nucleòtids
possibles,sempretenintencomptel’úsdecodód’E.coliperacadaaminoàcid(ja
queaquestahaestatlasocausadaperalclonatgedeDNAiexpressiódeproteïna
alllargd’aquesttreballdoctoral).
‐ Laespecificitatieficàciadepèn,enpart,delalongituddelsencebadors,quehade
serd’entre20‐30nucleòtids.
‐ Latemperaturad’hibridació(Ta,od’annealing)d’ambdósencebadorshandeser
similars,amésd’igualosuperiora50°C.LaTasolconsiderar‐se5°Cpersotadela
temperaturadefusió(Tm,odemelting)delsencebadors;ipotcalcular‐sesegons
lafórmula:
4 2
on G, C, A i T indiquen, respectivament, el nombre de nucleòtids de guanina,
citosina,adeninaitiminaenlaregiódesolapament.
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesdeDNARecombinant
68
‐ Els encebadors han de contenir un 45‐60 % en G/C, sobretot a l’extrem 3’,
intentantevitarquatreomésA/Tconsecutives.Aquestdetallés importantpera
l’estabilització del híbrid de DNA i la unió de la polimerasa, ja que aquests dos
nucleòtidsestableixenuntripleenllaçd’hidrogenentreells,mentrequelaparella
A/Ttansolsdos.
‐ Els encebadorshande complementaris a una seqüènciaúnica en elDNAmotlle,
peraixíevitarinespecificitats.
‐ Minimitzarlesestructuressecundariesintramolecularsilespossibleshibridacions
entreambdósencebadors.
2.1.2. MutagènesiDirigida.
2.1.2.1. Reacciódemutagènesi.
LamutagènesidirigidaésunadelesmúltiplesaplicacionsdelaPCR,laqualpermet
introduir canvis específics dins la seqüència de nucleòtids d’un determinat gen, amb la
finalitat d’obtenir una proteïna mutant en un o més residus. El procés es realitza
directament sobre un DNA plasmídic sencer com amotlle, de forma que s’estalvien els
passosdelligacióposterior.
Per a realitzar mutagènesi dirigida s’ha fet ús del kit Quikchange® Multi Site‐
DirectedMutagenesi(Agilent).Adiferènciad’altresmètodes,aquestkitutilitzatansolsun
únicencebadorquecontéelcanvinucleotídic,elqualestraduiràenelcanvid’aminoàcid
desitjat,iquehibridasobreunDNAplasmídicdecadenasenzilla(ssDNA).
Seguint les instruccionsdelManualQuikchange®, s’ha realitzat la següentmescla
dereacciódePCRmutagènica:
2.5 μl de tampó de reacció 10x QuikChange Multi reaction buffer
0.75 μl de QuikSolution
x μl de dsDNA motlle (100 ng)
x μl d’encebador mutagènic (100 ng)
1 μl de barreja de nucleòtids trifosfats (dNTPs) QuickChange
x μl d’aigua Milli‐Q estèril (fins a un volum final de 25 μl)
1 μl de polimerasa QuikChange® Multi enzyme blend
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesdeDNARecombinant
69
Acontinuació,lareacciós’incubaaltermocicladorsseguintelcicledePCRsegüent:
Fase n° de cicles Temperatura (°C) Temps (min) Descripció
1 1 95 1 Desnaturalització inicial
2 30
95 1 Desnaturalització
55 1 Hibridació
65 2/Kb plasmidi Elongació
3 1 65 5 Extensió final
És necessari, sobretot al realitzar per primera vegada una mutagènesi dirigida,
realitzarcontrolspositiusdelareaccióidelatransformació.Elmateixkitdemutagènesi
conté DNAmotlle i encebadors control per a verificar l’eficiència de la PCR i dels seus
components.
2.1.2.2. DigestióambDpnI.
Uncopfeta lamutagènesi,és importanteliminar lescadenesdeDNAparental, ja
queaquestesnocontenenlamutaciói,totisermínimalaquantitatrespecteelproducte
de PCR final, podrien donar lloc a colònies transformants nomutades. El DNA parental
difereixende lessintetitzadesperPCRen lametilació, jaque lesmetilasescel·lulars(els
enzimsencarregatsdelametilació)nosónpresentsalareacciódePCR,demaneraqueles
cadenessintetitzadesinvitro(imutades)noestrobaranmetilades.L’enzimendonucleasa
DpnI reconeix i talla el DNA metilat, evitant falses colònies en la transformació dels
productesdePCRaE.coli.
Segons les instruccions del manual de Quikchange, es realitza la digestió dels
productesdePCRindicada:
‐ Afegir1uLdel’enzimderestriccióDpnIacadareacciód’amplificació.
‐ Pipetejarsuaumentlamesclaiincubar‐laimmediatamenta37°Cdurant1h.
2.1.2.3. TransformacióproductesdePCR.
El kit Quikchange® Multi Site‐Directed Mutagenesi conté, també, les cèl·lules
utracompetents XL10‐Gold® ja preparades per a rebre el ssDNA producte de PCR. De
maneraque, invivo,es forma i s’estabilitza la doble cadenadeDNAplasmídic (dsDNA),
obtenintcolòniestransformantsapuntperseranalitzadesoperextraure’nelDNAmutati
prosseguirambelprocésd’expressióipurificaciópertinent.
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesdeDNARecombinant
70
Elprotocoldetransformacióésmoltsemblantaldescrital’apartatsegüent(2.2.2),
exceptealgunpetitcanvidetallatenelManualQuikchange®.
2.2. IntroducciódeDNAforaniacèl·lulesbacterianes.
Existeixenvarismètodes(conjugació,transducció...)peraintroduirunvectoramb
elgend’interèsdinsd’unasocabacteriana,peròlamésempradaéslatransformació,degut
a la seva senzillesa i varietat de controls a realitzar. La transformació consisteix crear
porus a la paret bacteriana que permetran l’entrada del DNA forani a l’interior de la
cèl·lula.
2.1.3. Preparaciódecèl·lulescompetentsd’E.coli.
Peralatransformació,calquelescèl·lulessiguincompetents,ésadir,hand’estar
preparades per a poder introduir elDNA extern i s’aconsegueixdebilitant la sevaparet
cel·lular,elmètodemésutilitzatésdelCaCl2(Hanahan1983)iconsisteixen:
1. Picarunacolòniaenplacadelasocamareiinocularen5mLdemediLBestèril.
2. Incubarmàxim15henagitacióforta(250rpm)a37°C,perpromoureuncultiusaturat.
3. Inocular,enunvolumfinalde50mL,unadilució1:100enmediLBiincubaralesmateixes
condicionsanteriorsfinsarribaraunaDO600̴0.4,puntdecreixementexponencial.
4. Transferirelcultiuauntubdepropilèestèrilirefredatprèviament.Deixarengelmínim15
min.
5. Centrifugarelcultiua3000gdurant15min,a4°C.
6. Eliminarelsobrenedantperdecantacióiassecarelprecipitatperinversiódurant5min.
7. Resuspendre el precipitat suaument amb 25mL de CaCl2 100mM, estèril i prèviament
refredat.Deixarengelmínim15min.
8. Centrifugarelcultiurepetintelspassos5i6.
9. Resuspendre el precipitat suaument amb 2.5mL de CaCl2 100mM, estèril i prèviament
refredat.Deixarengelmínim1h.
10. Aliquotar 100 μl de competents en eppendorfs estèrils on s’hi ha afegit, prèviament,
glicerolestèrilperaobtenirunaconcentraciófinaldel15%.
11. CongelarambN2‐líquidiguardaralíquotesa‐80°C.
2.1.4. Transformaciódecèl·lulescompetentsd’E.coli.
En aquest treball de tesi s’ha utilitzat el mètode de xoc tèrmic, basat en canvis
bruscs de temperatura per a afavorir l’entrada del vector dins la cèl·lula competent. El
protocolaseguiréselsegüent:
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesdeDNARecombinant
71
1. Descongelar les alíquotes de competents necessàries (cada alíquota servirà per a una
transformació)deixant‐lesengelaproximadament20min.
2. Afegiral’alíquota50ngdeDNAimesclarperinversiósuaument.
3. Incubarengeldurantmínim30min.
4. Xoctèrmic:
‐ Transferirl’alíquota2minalbanya42°C.
‐ Transferirràpidamentagelimantenir‐lesdurant5min.
5. Afegirun1mLdemediLBestèril,escalfatprèviamenta37°C,acadaalíquotaiincubar1h
albanya37°Ciambagitaciósuau.
6. Plaquejar100μldelasolucióenplacadeLBsòlidambl’antibiòticadequatideixarreposar
atemperaturaambient(TA).
7. Incubarlaplacaa37°Cdurantaproximadament16h.
Encasd’esperarunbaixrendimentdetransformació,ésaconsellableconcentrarla
solució10vegadesabansdeplaquejar‐la.Perfer‐ho,centrifugarlasolució30sega6000g
iextraurelaquantitatnecessàriadesobrenedantpertalderesuspendrelescèl·lulesenun
volumde100μl,iplaquejar.
A més, és recomanable realitzar controls de transformació. Un control negatiu
senseafegirDNAalescèl·lulescompetents,iuncontrolpositiutransformantambunDNA
jacomprovatprèviament.
2.2. ExtracciódeDNAplasmídicdecèl·lulesd’E.coli.
Unaminiprepésl’extracciódeDNAplasmídicdel’interiordecèl·lulesbacterianes,
en aquest cas d’E. coli, partint d’un volum de cultiu petit. Per a fer‐ho, es parteix d’un
inòculde5mLdemediLBestèril,incubatmàxim15henagitacióforta(250rpm)a37°C,
per promoure la saturació del cultiu. A partir d’aquí, s’ha utilitzat el kit RealMiniprep
TurboKit(REALLaboratory),basatenelmètodedellisialcalina(Birnboim,Doly1979).
2.3. SeqüenciaciódelDNA.
LaseqüenciaciódeDNAs’harealitzatamblafinalitatdecomprovarlesmutacions
introduïdespermutagènesidirigida, ielclonatgesatisfactoridegenscodificantsdinsde
diferentsvectorsd’expressió.
La seqüenciació s’ha dut a terme per el Servei de Genòmica de la UAB o de la
ClínicaMayo(USA),totsdosmitjançantelmètodedeSanger(Sanger,Coulson1975).
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesdeDNARecombinant
72
2.4. DeterminacióespectrofotomètricadelaconcentraciódeDNA.
La concentració d’una mostra de DNA es pot mesurar mitjançant
l’espectrofotòmetre,utilitzantunacubetadequars,obémitjançantelnanodrop,enelque
s’aplica2μldemostra.L’espectred’absorbàncias’enregistrade200a320nm.Unaunitat
d’absorbànciaa260nmequivalaproximadamenta50μg/mLdeds‐DNAia30μg/mLde
ss‐DNA.LapuresadelDNAespotvalorarambelscoeficientssegüents:
Coeficient Valor Indicador de puresa
260/280
1.8 DNA pur
< 1.8 Contaminació per proteïnes
> 1.8 Contaminació per RNA
260/230 1.8 – 2.2 DNA pur
< 1.8 Contaminació per sals.
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
73
3. SISTEMESD’EXPRESSIÓIPURIFICACIÓ.
3.1. Soquesd’Escherichiacoli.
Totes les soquesd’E. coliutilitzadesper a l’expressióheteròlogade lesdiferents
proteïnes treballades durant aquesta tesi doctoral són sistemes del tipus DE3, que
contenenelgendelaRNApolimerasadelbacteriòfagT7(DE3)inseritalseugenomasota
el control del promotor de l’operó lac, induïble per IPTG. D’aquesta manera, s’evita
l’expressió basal del gen d’interès i la inducció és iniciada externament a condicions
òptimes.
3.1.1. Soquesd’E.coliperalclonatgeiextracciódeDNAplasmídic.
‐ XL‐1blue.
Genotip:recA1endA1gyrA96thi‐1hsdR17supE44relA1 lac [F´proAB lacIqZΔM15
Tn10(TetR)].
AquestasocaésdeficientenlaendonucleasaendA,elqualmilloramoltlaqualitat
delesminiprepsdeDNA.TambéésdeficientenelgenderecombinaciórecA,augmentant
l’estabilitatdelsinserts.LamutacióhsdRpreveul’acciódelaendonucleasaEcoKsobreel
DNAclonat.Presentaresistènciaatetraciclina.
‐ XL10‐Gold.
Genotip: TetR Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB‐hsdSMR‐mrr)173 endA1 supE44 thi‐1 recA1
gyrA96relA1lacHte[F´proABlacIqZΔM15Tn10(TetR)AmyCamR].
Aquesta soca ha estat dissenyadaper a transformarmolècules deDNAambuna
elevadaeficiència,gràciesalfenotipHte(Hightransformationefficiency).Sónidealspera
la construcció de llibreries de DNA plasmídic. Presenten resistència a tetraciclina i
cloramfenicol; i, com la XL1‐blue, és deficient en endA i mutada en hsdR, millorant la
qualitatdelesminiprepsiestabilitzantelDNAclonat.
3.1.2. Soquesd’E.coliperal’expressióheteròlogadeproteïnes.
‐ Origami2(DE3).
Genotip:Δ(ara‐leu)7697ΔlacX74ΔphoAPvuIIphoRaraD139ahpCgalEgalKrpsL
F′[lac+lacIqpro](DE3)gor522::Tn10trxB(StrR,TetR).
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
74
Aquesta soca derivada de l’E. coli K12 presenta mutacions en els gens de la
tiorredoxina reductasa (trxB) i de la glutatió reductasa (gor). Ambdós deficiències
afavoreixen un ambient oxidatiu en el citoplasma d’E. coli, beneficiant el correcte
plegamentdeproteïnesquepresentenpontsdisulfur.Presentaresistènciaalatetraciclina
i l’estreptomicina, però a diferència de la soca Origami(DE3) original, és sensible a la
kanamicinadegutalamutaciógor.
‐ soluBL21(DE3).
Genotip:F‐ompThsdSβ(rβ‐mβ‐)galdcm(DE3).
AquestasocacontédelecionsdelesproteasesOmpT i lon,reduintelpotencialde
degradació de proteïnes recombinants dins la cèl·lula. A diferència de l’original
BL21(DE3), conté mutacions no caracteritzades que afavoreixen la solubilització de
proteïnesquehabitualments’expressendeformainsoluble.
‐ C41(DE3).
Genotip:F‐ompThsdSβ(rβ‐mβ‐)galdcm(DE3).
AquestasocaderivadelaBL21(DE3),tambépresentalesdelecionsalesproteases
Ion i OmpT; i, com a mínim, té una mutació no caracteritzada, la qual preveu la mort
cel·lularassociadaal’expressiódeproteïnesrecombinantstòxiques.
3.2. Mantenimentsoquesbacterianes.
Lessoquesbacterianes,jasiguintransformadesono,espodenconservarenplaca
demediLBsòliddurantunperíodede15diesa4°C.
3.2.1. Glicerinats15%.
Peraconservar‐lesllargsperíodesdetemps(mésde2anys),ésnecessariguardar
les soques en forma de glicerinats al 15%. Així, en un crio‐vial esmesclen 300 μL de
glicerol 50% estèril i 700 μL de cultiu saturat. Es barreja suaument i es congela
ràpidamentenN2‐líquidperaguardar‐hoa‐80°C.Al’horadenecessitar‐ne,sensearribar
adescongelarlasolució,espicaelglicerinatambunanansadeKolleestèrilis’inoculaen
mediLBlíquid.
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
75
3.3. Medisdecultiu.
Peralcreixementbacteriàs’usaunmedidecultiu,sòlidoensolució,apHfisiològic
iquecontéelsnutrientsnecessarisperaladivisiócel·lular.
3.3.1. Medilíquid.
3.3.1.1. MediLB.
Elmedidecultiuméshabitual i empratde formageneralenaquesta tesi és l’LB
(Luria‐Bertani).Peralapreparaciód’1Ld’LB:
10 g de triptona
5 g d’extracte de llevat
10g de NaCl
900 mL d’aigua Milli‐Q
Agitarfinsadissoldrecompletament,ajustarapH7.4ienrasarfinsa1Lambaigua
Milli‐Q. Seguidament s’esterilitzaper un cicled’autoclau i, si cal, es guarda a4 °C fins a
usar‐lo.
3.3.1.2. Medi2xYT
Adiferènciadel’LB,l’2xYTésmésricennutrients,resultantenunamajordensitat
cel·lulariperíodesdecreixementd’E.colimésllargs.Peraixò,l’2xYTésútilperaobtenir
majorsrendimentsd’expressiódeproteïnes.Lasevareceptaperaun1Léslasegüent:
16 g de triptona
10 g d’extracte de llevat
5g de NaCl
900 mL d’aigua Milli‐Q
Agitar fins a dissoldre’s, ajustar a pH 7.4 i enrasar fins a 1 L amb aiguaMilli‐Q.
Seguidaments’esterilitzaperuncicled’autoclaui,sical,esguardaa4°Cfinsausar‐lo.
3.3.2. Medisòlid.
Per aïllar colònies d’E. coli després de ser transformades o crescudes en medi
líquid,ésadequatl’úsdeplaquesdepetriambmedidecultiusòlidd’LB.Elprocedimentés
elmateixqueelprotocoldemedilíquidd’LBperòs’hiafegeixagaral15%(p/v),insoluble
a TA. Seguidament, la mescla s’autoclava aconseguint la dissolució de l’agar i
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
76
l’esterilització. Al temperar‐se, s’afegeixen els antibiòtics pertinents i es plaqueja en
condicionsestèrils.Uncopelmedis’harefredatigelificat,esdesenlesplaquesa4°Cfinsa
ser usades. Es recomana no guardar les plaquesmés enllà dels 20 ‐ 30 dies de la seva
preparació.
3.3.3. Antibiòtics.
Elsantibiòticssónsubstànciesquímiquesqueinhibeixenelcreixementbacteriào
directamentcausenlasevamort,jaqueinterfereixensobreprocessoscel·lularsvitals.Els
DNA plasmídics de clonatge i expressió contenen un gen de resistència per a un
determinatantibiòtic,deformaquepermetenunaselecciópositivad’aquellessoquesque
hanintroduïtoexpressenelgenforani.
Elsantibiòticsmésutilitzatsenlabiologiamolecularestrobendetallatsalataula
següent,aixícomelseumecanismed’acció:
Antibiòtic Concentració de
treball (μg/ml) Dissolvent Mecanisme d’acció
Cloramfenicol
(Cm) 170 Etanol 100%
Inhibició del ribosoma per unió a la
seva subunitat 50s.
Kanamicina
(Kn) 50 Aigua Milli‐Q
Inhibició del ribosoma per unió a la
seva subunitat 30s.
Tetraciclina
(Tet) 50 Etanol 50%
Inhibició del ribosoma per unió a la
seva subunitat 30s.
Ampicil∙lina
(Amp) 50 Aigua Milli‐Q Inhibeix la síntesi de peptidglicà.
Estreptomicina
(St) 60 Aigua Milli‐Q
Inhibició del ribosoma per unió a la
seva subunitat 30s.
3.4. Vectorsd’expressió.
Els vectors d’expressió usats en aquestes tesi doctoral són DNA plasmídics
optimitzatsperaunafàcilinsercióiexpressiódegensespecíficsdinslacèl·lulahoste.Els
vectors solen ser de grandària petita (de 3 a 6 kb), i contenir poc més que els gens
essencialsperalclonatgedeDNA:unorigendereplicació(ORI),ungenderesistènciaa
antibiòtic (per exemple TetR), la regió d’inserció de DNA exogen (MCS,MultipleCloning
Site),iunterminadordelatranscripció.
Tots els vectors utilitzats per a l’expressió heteròloga de les diferents proteïnes
treballadesdurantaquesta tesidoctoralsónderivatsdelsistemadevectorspET(origen
de replicació pBR322), sent compatibles per a ser expressats en soques DE3 ja que el
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
77
sistemapETcontéelpromotorT7il’operólac,específicsdelgendelaRNApolimerasaT7,
inclòsenelgenomadelasoca.
‐ pETtrx_1a.
El vector pETtrx_1a (FiguraM. 1‐A) és relativament gran, de 6401 pb, i permet
seleccionarelsclonstransformantsgràciesa lasevaresistènciaa l’antibiòtickanamicina
(KnR).Aquestplasmidipermetl’expressiócitoplasmàticadelaproteïnarecombinantscFv
coma fusió a la tioredoxina (trx), la qual presenta, amésd’activitat disulfur‐isomerasa,
activitatxaperona(Jurado,deLorenzo&Fernandez2006).Amésdelmòdulproteic trx,
conté un cua d’histidines (His6) i la diana específica de la proteasa Tev, necessària per
obtenirlaproteïnascFvfinal.Elgensintèticcodificantperal’scFv‐h3D6,de750pb,vaser
clonatenNcoI‐NotI,reemplaçantelgenGFPnaturaldelvectoridonantllocalconstructe
gènicdelaproteïnaprecursora:(His6)‐trx‐dianaTEV‐scFv.
‐ pET‐12a.
El vector pET‐12a (Figura M. 1‐B), de 4674 pb, permet seleccionar els clons
transformantsgràciesalasevaresistènciaal’antibiòticampicil·lina(AmpR).Aquestvector
contéel genompT, que codificaperunmòdulproteic, fusionata l’extremN‐terminalde
l’AL12, i potencia l’exportació cap a l’espai periplasmàtic, on la proteïna és soluble. A
diferència de la proteïna precursora d’scFv‐h3D6, aquest constructe no necessita una
dianaderestricció jaqueompTeseliminadaper lasevaproteasaespecíficaalcreuar la
membranacitoplasmàtica.
FiguraM.1.Mapadelsvectorsd’expressiópET‐trx1aipET‐12a.
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
78
‐ pMHTΔ238.
Aquest vector, derivat del plasmidi pQE30, també amb origen de replicació
pRB322,iambresistènciaal’antibiòticKn,contélaregiócodificantMHT,quesintetitzala
proteïna MPB‐dianaTEV‐(His)7‐TEV. Δ238 indica que tots els residus del extrem C‐
terminaldelaMPB(MaltoseBindingProtein),apartirdelresidu238,hanestateliminats
pertald’augmentarlaquantitatdeproteïnasoluble.Amés,contélamutacióS219Vpera
limitarlasevaauto‐inactivació(vandenBergetal.2006).
3.5. Expressióheteròlogadeproteïnes.
Depenent de les propietats de cada tipus de proteïna, el protocol d’expressió
heteròlogaésdiferent.Elpasde creixementdel cultiu cel·lular i la sevaexpressióésun
delspassos limitantspertald’obtenirunbonrendimentfinalenelprocésdepurificació
deproteïnes.Al’hd’expressarunaproteïnaexògena,s’hadetenirencomptesilaproteïna
es dirigeix al citoplasma, periplasma, o a l’exterior de la cèl·lula, i sobretot, si esmanté
solubleoinsoluble.Inclús,certesproteïnesexpressadespodenarribarasertòxiquespera
les cèl·lules. Depenent d’aquests factors, i dels constructes emprats, la temperatura i el
tempsdecreixementiinducciódelcultiucel·lularvariaranentreproteïnes.
Els protocols d’expressió i purificació de les diferents proteïnes treballades en
aquesta tesi doctoral es troben detallades a l’apartat de Materials i Mètodes de cada
capítol.
3.5.1. Inducciódel’expressió.
Malgrathaverprovatsistemesd’expressióenmedisauto‐induïbles,l’expressióde
les proteïnes d’aquesta tesi doctoral ha estat induïdamitjançant IPTG (Isopropil β‐D‐1‐
tiogalactopiranòsid), un substrat químic capaç d’unir‐se al repressor lac, permeten
l’expressiódelsgensqueestrobensotacontroldelpromotorlac.Elmomentòptimperala
inducció és quan el cultiu d’E. coli ha assolit la fase exponencial de creixement, i és
determinada espectroscòpicament quan laDO600 és de 0.6‐0.8. És llavors quan s’afegeix
l’inductor IPTGaunaconcentració finalgeneralmentde0.5‐1mM, iesdeixaenagitació
constant(unes200rpm)finsunmàximde15h,incubantalatemperaturarequerida(20‐
37°C).
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
79
3.5.2. Obtenciódelextractecel·lular.
Capdelesproteïnesamblesqualss’hatreballatésexpressadaextracel·lularment,
pertant,uncopinduïdal’expressió,calrecuperarl’extractecel·lulardelcultiud’expressió
percentrifugacióa5520gdurant30mina4°C,idescartarelsobrenedantperdecantació.
El pellet de cèl·lules serà resuspès en el tampó adient per a seguir amb el procés de
purificació,obépotsercongelatambN2‐líquidiguardata‐20°C.
3.6. Tècniquesdecromatografialíquida.
Per a la purificació de les diferents proteïnes s’ha emprat una o varies de les
tècniquescromatogràfiquesdescritesacontinuació.Cadacolumnaesbasaenunmètode
de separaciódiferent, algunesmés indicadesper apassos inicialsdepurificació, i altres
mésindicadesperarefinarlapuresadelamostra,obé,preparar‐laperalsexperiments
posteriors. Les cromatografies d’alta resolució estan optimitzades per ser usades en
aparells d’FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography). L’acoblament de les columnes a
aquestssistemespermetl’automatitzaciódelprocés,aixícomlapossibilitatdetreballara
pressionssuperiorsal’atmosfèrica,definirprotocolsespecíficsoncontrolarelsfluxosiels
temps de les corregudes, com també indicar els volums de recol·lecció de mostra
automàtica.Altrescolumnessónacobladesaunabombaperistàtica(P‐1)peracontrolar
elfluxdelacolumna,obé,simplements’utilitzenapressióatmosfèrica.
Elsprotocols,condicionsitamponsempratsperalesdiferentscromatografieses
trobendetallatsal’apartatdeMaterialsiMètodesdecadacapítol,enfunciódelprocésde
purificaciódecadaunadelesproteïnestreballadesenaquestatesidoctoral.
3.6.1. Cromatografiad’afinitat
3.6.1.1. Cromatografiad’afinitatambhistidines.
La tècnica d’IMAC (ImmobilizedMetal ion Affinity Chromatography) es basa en
l’afinitatde cadenes lateralsespecífiquesderesidusproteicsper interaccionaramb ions
metàl·lics immobilitzats a la reïna cromatogràfica. Aquestes columnes són ràpides i
senzillesd’usar,iresultenmoltútilsenelsprimerspassosdepurificació,jaqueenunsol
pass’eliminengranpartdeproteïnescontaminants.
Peradiferentsprocessosdepurificaciódescritsalllargdelatesi,s’haempratles
columnesd’IMACHisTrapTMHP‐5mLambunareïnadeSepharosequecontéionsNíquel
immobilitzats (GEHealthcare), que interacciona específicament amb residus d’histidina.
Sovint, a les proteïnes recombinants, se’ls hi afegeix una cua d’histidines (His6‐tag)
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
80
normalmental’extremN‐terminal,pertald’assegurarunafortainteraccióamblacolumna
i, així, facilitar la sevapurificació respecte la restadeproteïnesdel extracte cel·lular.La
capacitatd’uniód’aquestescolumnesésde40mgd’(His)6‐tag/mLdereïna.Uncopfetala
separació,lacuad’histidinesseràeliminadaperproteòlisiespecífica.
La recuperacióde lesproteïnesunides específicament a la reïna, esduua terme
mitjançant l’aplicació de tampons amb concentracions creixents d’imidazol, l’anell
aromàticpresentalescadeneslateralsd’histidinaielquecompeteixperelsionsmetàl·lics
delareïna.
Aquestatècnicahaestatempradaperalapurificaciódelfragmentd’anticòsscFv‐
h3D6ilaproteasaTEV,ielseuprotocolexacteestrobadetallatal’apartatdeMaterialsi
MètodesdelCapítol1.
3.6.1.2. Cromatografiaatmosfèricad’afinitatperlipopolisacàrids.
Peral’extracciódelipopolisacàrids(LPSs)delesmostresproteiques,s’hanemprat
lescolumnesd’afinitatd’LPSsDetoxi‐gelendotoxinremovingcolumns(ThermoScientific).
Aquestescolumnescontenenunareïnad’agarosaenlaqueestrobaimmobilitzatellligand
polimixinaB, el qual uneix la porció de lípidAdels LPSs. La columna és capaçd’unir ≥
9995UE (unitatsd’endotoxina)d’unvolumdemostrade5mLqueconté10000UE.La
quantitatd’LPSpermLdemostraproteicadepèndelvolumdecultiud’expressiócel·lular
inicial, i s’haurà de tenir en compte en el moment de la seva extracció. La columna es
regeneraambeldetergentsodidesoxicolatal1%, iéstambéambaquestambelquales
trencalainteraccióentreelsLPSsilareïna,extraient‐losdelacolumna,uncoplamostra
ja ha passat per la columna sense interaccionar i ha alliberat els LPSs. Un dels
inconvenientsd’aquestacromatografiaésladificultatdequantificarelsLPSs,pertant,s’ha
deseguirunprotocolestricteirepetitiuperassegurarquelamostraéstroballiured’LPSs
isensetracesdeldetergentques’usapertald’equilibrarlacolumnainicialment.
Aquestatècnicahaestatempradaperalapurificaciódelfragmentd’anticòsscFv‐
h3D6,ielseuprotocolexacteestrobadetallatal’apartat3.6.1deMaterialsiMètodesdel
Capítol1.
3.6.2. Cromatografiadebescanviiònicd’altaresolució.
La cromatografia de bescanvi iònic separa biomolècules en funció de la seva
càrrega neta superficial. És una de les tècniques més usades per a la purificació de
proteïnes,tanenetapesinicialscomfinals,jaquetéunaelevadacapacitatd’unióiésmolt
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
81
resolutiva.Lesproteïnes,enfunciódelcontingutenresidusàcidsobàsics,presentenuna
granvarietatdecàrregasuperficial,iexhibeixendiferentsgrausd’interaccióamblareïna
cromatogràfica,carregadapositivaonegativament.Cadaaminoàcidionitzableposseeixun
valordepKadiferent,per tant, lacàrregasuperficiald’unaproteïnadependrà totalment
delpHdelentorn.Segonsaixò,quanelpId’unaproteïnaés igualalpHdelmedi, llavors
aquestanopresentaràcarrega.QuanelpHestrobapersotadelpI,laproteïnapresentarà
unacàrregaglobalpositiva,iviceversa.
FiguraM.2.Cromatografiadebescanviiònic.Exempleil·lustratiud’unacolumnadebescanvianiònic,onla
proteïnacarregadanegativamentinteraccionaamblareïnadecargapositiva.PergradientdeNaCl,aquestes
seraneluïdes.DepenentdelpHdelmedi, i delpIde laproteïna, aquesta tindràunacàrreganetapositivao
negativai,enfunciód’aquesta,caldràempraruntipusdeterminatdecromatografiaiònica.
Depenent de la càrrega de la proteïnad’interès, utilitzaremun cromatografia de
bescanvi catiònic o CEX (Cation EXchange chromatography), amb reïna carregada
negativament que uneix proteïnes de carga positiva; o bé al contrari, una columna de
bescanvi aniònic o AEX (Anion EXchange chromatography), amb reïna carregada
positivamentqueuneixproteïnesdecarganegativa(FiguraM.2).
L’elució de proteïnes unides s’aconsegueix incrementant la força iònica (o
concentraciód’NaCl)deltampó,obé,canviantelseupH.Alaugmentarlaforçaiònica,els
ionsNa+oCl‐competeixenperlescàrreguessuperficialsdelesproteïnesunides,trencant
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
82
la interacció amb la reïna i eluint‐les. Mitjançant diferents formes de gradient de força
iònica (lineal, escalat...), les proteïnes seran eluïdes diferencialment, sent les de menor
càrreganetalesprimeresensortirdelacolumna.Unacaracterísticaimportantd’aquestes
cromatografiesésquelamostras’elueixconcentradarespecteelsvolumsinicials.
Aquestatècnicahaestatempradaperalapurificaciódelfragmentd’anticòsscFv‐
h3D6(CEX)ideldominivariableAL‐12(AEX),ielseuprotocolexacteestrobadetallata
l’apartatdeMaterialsiMètodesdelCapítol1i3,respectivament.
3.6.3. Cromatografiad’exclusiómolecular.
3.6.3.1. Cromatografiad’exclusiómoleculard’altaresolució.
La cromatografia d’exclusió molecular (Size Exclusion Chromatography, SEC),
tambénomenadadegel filtració,esbasaen la separaciódemolèculesen funciódel seu
pesmolecular.Adiferènciade les altres cromatografies, lesmolècules no s’uneixen a la
reïna per afinitat ni interacció iònica, sinó que lamostra de proteïna avança dins d’una
matriuporosaformadaperpartículesesfèriquesinertes.
FiguraM.3.Cromatografiad’exclusiómolecular.Exemple il·lustratiude la fasesòlidaamb lespartícules
porosesatravésdelesqualslesproteïnesavancen,idepenentdelseupesmolecularsóneluïdesmésomenys
ràpidament.
Lesproteïnesdegrandàriapetitapodenpassarperdinselsporusdelespartícules,
deformaqueelseupasperlacolumnaésretingut,mentrequelesproteïnesgranseviten
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
83
els porus i elueixenmés ràpidament. Les columnes de SEC difereixen en la grandària o
límit d’exclusió dels porus de les partícules, per tant, depenent del pesmolecular de la
proteïna d’interès, caldrà emprar un determinat tipus de columna (Figura M. 3). La
columnaestrobaequilibradaambelmateixtampódelamostra,omplintelsespaisdela
matriu (fasemòbil) i l’interior de les partícules (fase estacionaria). Lamostra és eluïda
isocràticament,pertant,noésnecessaril’úsdediferentstamponsdurantlaseparació.La
composiciódeltampónoafectadirectamentalaresoluciódelacromatografia,sempreque
tingui una certa força iònica que eviti la interacció inespecífica de les proteïnes amb la
reïna. S’obté una resolució òptima quan la mostra ha estat prèviament purificada amb
altres tècniques cromatogràfiques, de forma que ja s’han eliminat gran part de les
proteïnes de pes similar. Per tant, és recomanable usar la SEC en els últims passos de
purificació,jaqueambellaespodensepararmonòmersd’agregatsiobtenirlaproteïnaen
el mateix tampó de magatzematge. Els únics inconvenients d’aquest tipus de
cromatografiasónquelamostras’had’aplicarenunvolumpetitiéseluïdaenunvolum
major.
AquestatècnicahaestatempradaperalapurificaciódeldominivariableAL‐12,i
elseuprotocolexacteestrobadetallatal’apartatdeMaterialsiMètodesdelCapítol3.
3.6.3.2. Cromatografia atmosfèrica d’exclusió molecular per intercanvi de
tampó.
Perarealitzarcanvisdetampód’unamostradevolumpetit,obédessalar‐la,s’han
emprat les columnes d’exclusió molecular PD‐10 Desalting columns (GE, Healthcare).
Aquestes columnes contenen una matriu de Sephadex G‐25 Medium, la qual permet
separargrupsdepesmoleculargran(majorsde5kDa)desubstàncies inferiorsa1kDa
(enelnostre cas, eldetergent sodidesoxicolat1%queprovéde l’eliminaciódelsLPSs),
mitjançantuncanvidetampó.
LaPD10ésunatècnicasenzilla,ambunprotocolestàndardontansolsvariaràel
tampó per el que es vol intercanviar lamostra, i és el següent, expressat en volums de
columna(1VC=5mL):
1. Rentarlacolumnaamb5VCd’aiguaMilli‐Qpertald’eliminarl’etanolempratperalaseva
conservacióa4°C.
2. Equilibrarlacolumnaamb5VCdetampód’elució.
3. Afegirunvolummàximde2.5mLdemostra(sielvolumdemostranoéssuficient,afegir
finsa2.5mLambtampóPBSpH7.4).
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
84
4. Pergravetat,eluiridescartarlafracciódemostranoatrapadaalacolumna(corresponent
almateixvolumdemostraafegit).
5. Pereluirlamostra,afegir3.5mLdetampód’elucióirecol·lectar‐laenfraccionsd’1mL.
6. Rentarlacolumnaamb5VCd’aiguaMilli‐Qiconservarlacolumnaa4°Cenetanolal25%.
3.7. Mètodesd’intercanvidetampóoextracciódesals.
Sovint és necessari realitzar un canvi de tampó o extraure les sals de lamostra
(NaCl, Imidazol...) entre les diferents tècniques del procés de purificació, o bé, per a
guardarlamostraproteicapuraeneltampóadequat.
Ambaquesta finalitats’hanempratdosmètodesdiferents,depenentdelprotocol
de purificació: la cromatografia atmosfèrica d’exclusió molecular (PD‐10), explicada a
l’apartatanterior,iladiàlisi.
3.7.1. Diàlisi.
Ladiàlisi consisteix en aplicar lamostradinsd’un sacdediàlisi omembranade
cel·lulosa,ambporusdegrandàriainferioraldelamostraproteica,deformaquepermet
l’intercanvidetampómentre lamostraquedadinselsac.Ladiàlisiesrealitzaa4°C,en
agitaciósuau,ienfrontunvolumdetampó500copselvolumdelamostra,durantmínim
3h.Perassegurarunabonadiàlisi, es recomana fer‐neduesen sèrie jaqueel factorés
multiplicatiu.
Lesproteïnesempradesenaquest treball sónmajorsde12kDa,així, els sacsde
diàlisiempratshanestatd’unamidad’exclusióde12‐14kDa(MedicellMembranesLtd).
Peradialitzarmostresdevolumsinferiorsa200μl,s’hanempratelstubsdediàlisi
MINIDialysisUnits(G‐Biosciences),ambunamidad’exclusióde8kDso15kDa,depenent
delaproteïnadialitzada.
3.7.1.1. Pretractamentdelssacsdediàlisi
Els sacs de diàlisi han de ser preparats abans de ser emprats. Per a fer‐ho es
segueixelprotocoldescritacontinuació:
1. Albunsen,bullir2‐3mdesacdediàlisidinsd’unerlenmeyeramb2LdetampóEDTA5
mM,pH8.0.
2. Arribaralpuntd’ebullicióimantenir‐lodurantuns5min,deixarrefredar.
3. Decantareltampóirepetirelprocés.
4. RentarelssacsambaiguaMilli‐Qabundant.
5. Guardarelssacspretractatsa4ºCen1Ld’aiguaMilli‐Q,afegir‐hi5gotesdecloroform.
6. Abansd’usar,rentarelssacsambaiguaMilli‐Qiambeltampóenelqualesfaràladiàlisi.
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
85
3.8. Concentraciódelvolumdelesmostresproteiques.
Per a treballar amb volums de mostra més manejables, o bé, per arribar a la
concentració de proteïna necessària per a realitzar diferents tècniques, s’han usat els
concentradorsperacentrífugaCentrifugalFiltersUnitsAmiconUltra‐15mLoUltra‐4mL
(Millipore).Elsconcentradorssóntubsquecontenenal’interiorunamembranaambuna
mida d’exclusió de 10 kDa, on s’aplica lamostra. Per centrifugació, normalment a 2500
rpm i a 4 °C, es concentra la mostra de proteïna. El temps de centrifugació depèn del
volumdemostrainicialidelasevaconcentració.
3.9. ElectroforesienSDS‐PAGE.
L’electroforesienSDSésundelsmètodesmésusatsenl’anàlisideproteïnes, ies
basaenlaseparaciódeproteïnessegonselseupesmolecular,dinsd’uncampelèctric.És
unaelectroforesidesnaturalitzant, jaqueeldetergentSDS,carregatnegativament, forma
una pel·lícula al voltant de les proteïnes, emmascarant la seva càrrega intrínseca i
desplegant‐les(Shapiro,Vinuela&Maizel1967).Comquelaquantitatdedetergentunités
proporcionalalagrandàriadelamolècula,aquestesavançarandinsdelgelenfunciódela
sevamassamolecular,sentlesproteïnesméspetiteslesdemajormobilitat.L’electroforesi
es realitza sobre un suport o gel d’acrilamida, una substància que polimeritza gràcies a
l’addició de Persulfat amònic (PA) i TEMED (N, N, N’, N’‐tetrametilè‐diamí), creant una
mallaporosa,eldiàmetredelqualdependràdelpercentatged’acrilamidausat.
El geld’acrilamidamésusatéseldiscontinu, formatperdues fases (ogels) amb
percentatgesd’acrilamidaipHdiferents:
‐ Gel separador o inferior: conté un percentatge d’acrilamida depenent de la
mostraasepararienellessepararanlesmolèculessegonselseupesmolecular:
% Acrilamida Rang de separació (kDa)
7 50 ‐ 500
10 20 – 300
12 10 – 200
15 3 ‐ 100
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
86
‐ Gelconcentradorosuperior:contéuntantpercentd’acrilamidaestàndard,del
4‐5%,iunpHmésàcidqueelgelseparador.Enellesformenelspousdecàrrega
deproteïna,permetlaconcentraciódelamostracarregadaiproporcionaunpunt
departidaigualperatoteslesmostresalaplicarelcampelèctric.
3.9.1. Preparaciódelgeld’acrilamida.
Peralapreparaciódelsgelss’utilitzenlessolucionssegüents:
‐ SolucióA:40%acrilamida/bisacrilamida37.5/1
‐ SolucióB:Tris/HCl1.5M,SDS0.4%,pH8.8
‐ SolucióC:Tris/HCl0.5M,SDS0.4%,pH6.8
‐ PA:Persulfatamònical10%(p/v)
‐ TEMED
Perapreparardosgelsd’acrilamidaal12,essegueixlareceptasegüent:
Gel separador A B H2O TEMED PA
12% 4 mL 2,5 mL 3.5 mL 10 μl 100 μl
Gel concentrador A C H2O TEMED PA
4% 0.65 mL 1.25 mL 3 mL 5 μl 50 μl
Lasoluciós’abocadinsd’unsuportdevidre,de0.75mmd’espaibuit, iposterior
ampladadelgel.Primers’afegeixelgel separador, seguitd’unesgotesd’isopropanolper
tald’eliminarpossiblesbombolles,evitarelcontacteambl’oxigenatmosfèric,iassegurar
queelgelinferiorpolimeritzirecte.UncoppolimeritzataTA,esdescartal’ispropanolper
decantacióivarisrentatsambaiguaMilli‐Q,is’afegeixasobreelgelconcentradorambla
pintacomamotlledelspousdecàrrega.UncopelgelhapolimeritzataTA,escol·locadins
lacubetad’electroforesi,laquals’had’omplirdetampód’electroforesi(TE)adientperala
circulaciódelcorrentelèctric:
‐ Tampód’electroforesiTE10x,1L:
30 g de Tris/HCl 0.25 M
140 g de Glicina 2 M
10 g d’SDS 1 % (p/v)
IV‐MaterialsiMètodesGenerals Sistemesd’ExpressióIPurificació
87
Abansdecarregarlesmostresalgel,espreparenambtampódecàrregais’incuben
5mina100°C,pertaldedesplegarcompletamentlesproteïnes.
‐ Tampódecàrrega4x,5ml:
0.12 g de Tris/HCl 0.2 M
2.5 g de Glicerol 50 % (p/v)
0.5 g d’SDS 10 % (p/v)
0.02 g de blau de bromofenol 0.4 %
(p/v)
300 μl β‐mercaptoetanol 15 % (v/v)
, que conté l’SDS (dodecilsulfat sòdic) per carregar negativament les proteïnes i
desplegar‐les, β‐mercaptoetanol per reduir possibles ponts disulfur, glicerol per a
introduir lamostradinsdelgelaugmentant ladensitat, ielcolorantblaudebromofenol
peraseguirelfrontd’avançamentdel’electroforesi.
Un cop carregades les mostres, s’aplica un amperatge constant de 25 mA/gel,
aproximadamentdurant1h,finsqueelfrontarribialfinaldelgel.
3.9.2. Tincióidestinciódelgeld’acrilamida.
Quan la separació ja ha finalitzar, es retira el gel de la cubeta i es disposa a ser
tenyit.Elsgelsd’acrilamidaes tenyeixenambel colorantblaudeCoomassie,enagitació
suaudurantaproximadament15min,aTA.
‐ TampódeTinció:
45 % de metanol
10 % d’àcid acètic
45 % d’aigua destil∙lada
0.2 % (p/v) de Coomassie Brilliant Blue
Per a destenyir el gel, es deixa en agitació en àcid acètic 10 %, o bé, en aigua
destil·lada,finsaobservarbélesbandesdeproteïnes.
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesEspectroscòpiques
89
4. TÈCNIQUESESPECTROSCÒPIQUES.
4.1. Determinaciódelaconcentraciódeproteïna.
La concentració de proteïna, igual que la de DNA, es pot mesurar mitjançant
l’espectrofotòmetre,utilitzantunacubetadequarsd’1mL,obémitjançantelnanodrop,en
el que s’aplica 2 μl demostra. Les proteïnes absorbeixen llum al ultraviolat gràcies als
anellsaromàticsdelsresidustriptòfan,fenilalaninaitirosina,iunacertacontribuciódels
cadenescistinil,ambunmàximd’absorbànciaalvoltantde280nm,enfunciódelnombre
deresidusTrp,TyriPhequecontécadaproteïna.Coneixentelcoeficientd’extinciómolar
de la proteïna (ε) a 280 nm, i aplicant la llei de Lambert‐Beer, es pot determinar la
concentracióensoluciódeproteïnapura.
,oncés laconcentraciódeproteïna,enmols/L; i léselpasdellumdelacubeta
emprada,encm.
Enfunciódelaproteïna,elscoeficientd’extinciómolarusatshanestat:
‐ scFv‐h3D6: ε 45330u. Abs. M cm
‐ scFv‐h3D6experimental: ε 39997u. Abs. M cm
‐ VL‐AL12imutants: ε 13610u. Abs. M cm
‐ ProteasaTEV: ε 13840u. Abs. M cm
4.2. DicroismeCircular.
El Dicroisme Circular (CD) és una de les tècniques espectroscòpiques emprades
per a determinar l’estructura de proteïnes. Freqüentment, s’utilitzen longituds d’ona
corresponents al ultraviolat llunyà (de 260 a 190 nm), obtenint l’espectre d’estructura
secundària. Però també es pot determinar l’estructura terciària si s’utilitzen longituds
d’onadelultraviolatproper.
La tècnica de CD utilitza un espectrofotopolarímetre, el qual incideix llum
polaritzada circularment sobre lamostraproteica.Depenentde la geometriadel l’enllaç
peptídic de la mostra, aquesta absorbirà la llum i la dispersarà donant un espectre de
plegamentdeterminat (Johnson1988).Amés, el contingut en residus aromàtics i ponts
disulfur d’una proteïna, també contribueixen, de forma important, a l’espectre de CD
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesEspectroscòpiques
90
(Sreeramaet al. 1999). Ladesnaturalització tèrmicaperCD llunyà consisteix enobtenir
l’evoluciód’unpuntdeterminatdel espectre en funcióde la temperaturade25a90 °C,
relacionant‐se amb canvis en l’estructura secundària. Un cop la proteïna es troba
desplegada, es pot determinar el seu grau de reversibilitat registrant l’espectre de
renaturalitzacióatemperaturade25°C,obétotalacorbasencera.
LafiguraM.4mostral’espectredeCDtípicdel’estructurasecundàriadeproteïna
enhèlix‐α,fulla‐β,orandom‐coil.
FiguraM.4.EspectredeCDdediferentsestructuressecundàriesdeproteïnes.Hèlix‐α (negre), fulla‐β
(vermell)irandomcoil(verd).Figuraadaptadadewww.ap‐lab.com.
La tècnica de CD ha estat emprada per l’estudi de l’estructura secundària del
fragmentd’anticòsscFv‐h3D6ideldominivariableAL‐12,lescondicionsdelamostraiels
paràmetres d’adquisició dels diferents espectres es troben detallats a l’apartat de
MaterialsiMètodesdelCapítol1i3,respectivament.
4.3. Fluorescènciadelsresidusdetriptòfan.
La fluorescència consisteix en l’emissió de radiació electromagnètica per part
d’una molècula que passa d’un estat d’energia excitat, produït per l’absorció a una
determinadalongitudd’ona,alestatfonamental.
La fluorescència intrínseca dels residus aromàtics (Trp, Tyr i Phe) és una de les
propietats proteiques més emprades per a monitoritzar, mitjançant un fluorímetre,
processosdeplegament idesplegamentdeproteïnes.Concretament, la fluorescènciadel
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesEspectroscòpiques
91
residu triptòfan resulta molt sensible a pertorbacions en l’estructura terciària de
proteïnes, ja que sovint es troba força enterrat dins el nucli hidrofòbic. El seu anell
aromàtic,alserexcitataunalongitudd’onade290nm,emetfluorescènciaaunalongitud
d’onad’entre335i355nm.Deformageneral,esconsideraqueelmàximd’emissiódelTrp
al’estatnatiuésa240nm,mentrequeal’estatdesplegatésa255nm,degutal’exposició
del residu al solvent. La magnitud de desplaçament del màxim depèn de com estava
d’enterrat el Trp a l’estat natiu, i de si la proteïna arriba a desplegar completament, o
nomésparcialment.Totiaixò,laintensitatdel’emissiódefluorescènciadepèndel’entorn
localdelsresidusTrpdinsl’estructuraproteica,i,peraquestaraó,noespotpredirenquin
sentit variarà la fluorescència de cada residu Trp de la proteïna durant el procés de
desplegament.Degutaqueunresiduconcretpotaugmentar la seva intensitatdurantel
procésdedesplegament,mentrequeunaltrelapotdisminuir,quanenunaproteïnahiha
més d’un residu Trp la mesura de la intensitat de fluorescència no pren sentit, i és el
desplaçamentdelmàximcapalvermellelqueensdonaràinformacióútil(Royer1995).
Així com la desnaturalitzacióper CDens aporta informació anivell de canvis en
l’estructura secundària, la fluorescència ens permet seguir els canvis que pateix
l’estructuraterciàriadurantelprocésdedesnaturalitzacióorenaturalització.
Latècnicadefluorescènciahaestatempradaper l’estudide l’estructuraterciària
delfragmentd’anticòsscFv‐h3D6ideldominivariableAL‐12,lescondicionsdelamostrai
els paràmetres d’adquisició dels diferents espectres es troben detallats a l’apartat de
MaterialsiMètodesdelCapítol1i3,respectivament.
4.3.1. Desnaturalitzacióquímicaiobtenciódeparàmetrestermodinàmics.
Ladesnaturalitzacióquímica,mitjançanturea,ésundelsprincipalsmètodespera
estudiarl’estabilitatproteicaielprocésdedesplegamentdeproteïnes,ilapossibilitatde
detectar estats intermediaris de la via de plegament. La corba de desnaturalització
química pot ser adquirida mitjançant l’espectroscòpia de fluorescència o de CD,
enregistrant l’efecte de la urea sobre l’estructura terciària i secundària de la molècula,
respectivament.
A partir del ajust de corba de desnaturalització, seguida per fluorescència dels
residus Trp, a una equació de dos o tres estats, per exemple, es poden extraure els
paràmetres termodinàmics de la proteïna, com ara el valor de [D]50% (concentració de
desnaturalitzantenlaqualel50%delaproteïnaestrobadesplegada),de∆GN‐U(energia
lliuredeplegament),ielvalordemN‐U(diferènciaenl’accessibilitatalsolvententrel’estat
natiuieldesplegat,idirectamentrelacionatamblacooperativitatdelamolècula).
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesEspectroscòpiques
92
Totiserd’úsgeneral,labasemolecularperlaquallaureadesnaturalitzaproteïnes
ésdesconegut.Existeixenduesvessantsteòriques,laprimeradefensalainteracciódirecte
entre la urea i lamolècula, on la urea competeix amb les interaccions natives per pont
d’hidrogen i salines, afavorint el desplegament i estabilitzant l’estat desnaturalitzat. Per
altra banda, la segona teoria proposa que la urea afecta indirectament a la proteïna
alterantelseuentornosolvent,segrestantl’aiguadesolvatació,ifacilitantl’exposicióde
residushidrofòbicsenterrats(Bennion,Daggett2003,Das,Mukhopadhyay2009).
La tècnica de fluorescència ha estat emprada per a registrar la corba de
desnaturalització química del domini variable AL‐12. Les condicions de la mostra i els
paràmetresd’adquisiciódelsdiferentsespectres,aixícomelsajustosperal’obtenciódels
diferentsparàmetrestermodinàmics,estrobendetallatsal’apartatdeMaterialsiMètodes
delCapítol3.
4.4. FluorescènciadelsfluoròforsTioflavinaTiANS.
A part de la fluorescència intrínseca de les proteïnes, deguda als seus residus
aromàtics, és possible estudiar els canvis conformacionals de les proteïnes mesurant
l’emissió de fluoròfors que interaccionen específicament amb certes regions o estats
conformacionalsdelesmolècules.
Enaquestatesis’hanempratelsfluoròforsTioflavinaTiANS.
‐ Tioflavina‐T(ThT).
La ThT incrementa la seva intensitat de fluorescència al unir‐se a agregats
amiloides, per això és dels reactius més usats per a estudiar cinètiques de formació
amiloide.Elfluoròforésexcitataunalongitudd’onade450nm,elseuespectred’emissió
vade470a530nm,ambunmàximdefluorescènciaa482nm.
‐ ANS.
L’ANS (àcid 8‐anilin‐naftalè‐sulfònic) és un compost aromàtic que interacciona
amb regions hidrofòbiques exposades al solvent, donant lloc a un augment de la seva
fluorescència. La longitud d’ona d’excitació del ANS és a 388 nm, donant un espectre
d’emissióde400a600nm,ambelmàxima470nm.
La tècnica de fluorescència per ThT i ANS ha estat emprada per als assajos
d’agregació del fragment d’anticòs scFv‐h3D6. Les condicions de la mostra i els
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesEspectroscòpiques
93
paràmetres d’adquisició dels diferents espectres es troben detallats a l’apartat de
MaterialsiMètodesdelCapítol1.
4.5. Espectroscòpiad’infraroigambtransformadadeFourier(FTIR).
L’espectroscòpia d’infraroig és un dels mètodes clàssics per a determinar
l’estructurademolècules,degutalasevasensibilitatalacomposicióquímicaivariacions
en l’entorn. L’absorció de radiació infraroja dóna lloc a transicions vibracionals dels
enllaços covalents de les molècules. Per a l’estudi de proteïnes és treballa a l’infraroig
mitjà, concretament a la regió de vibració del enllaç amida I, situada entre els nombres
d’ona1700i1600cm‐1.Lafreqüènciavibracionaldel’amidaIésdeguda,principalment,al
grup carbonil (C=O) de cada enllaç peptídic de la proteïna, i la seva força depèn
directament de la conformació de l’esquelet polipeptídic, relacionat amb l’estructura
secundària.
La tècnica de FTIR és de les poques que permet estudiar l’estructura d’agregats
insolubles, com ara la de les fibres amiloides. Degut a que la conformació en fulla‐β és
característicadelsdiferentstipusd’agregatsproteics,monitoritzarelsseuscanvisdurant
elprocésd’agregaciópermetdescriureelpanoramaconformacionaldelaviad’agregació.
De forma general, durant el procés d’agregació, la posició del màxim de l’amida I es
desplaçacapanombresd’onamésbaixos,degutal’incrementdepontsd’hidrogen,dela
longituddelafulla‐βestesa,odelnúmerodecadenes‐β(Zandomeneghietal.2004).Per
aquestaraó,aquestatècnicaésmoltapropiadaperadiferenciarfulles‐βambdiferentgrau
d’empaquetamentiseguirprocessosd’agregació.
Un dels passos limitants del FTIR, és l’assignació dels components de la banda
d’amida I’ als diferents elements d’estructura secundària de la proteïna, sent molt
importantperaunacorrecta interpretaciódelsresultatsobtinguts(Arrondoetal.1993,
Arrondo,Goni1999).
L’espectroscòpiad’infraroig requereixd’una gran concentraciódemostraper tal
dequelarelaciósenyal/sorollsiguisuficientmentelevadaisignificativa.Amés,labanda
de vibració de l’enllaçO‐Hde lesmolècules d’aigua, localitzada a l’amida II (centrada a
1545 cm‐1), emmascara la zona d’absorció del enllaç amida I, dificultant l’obtenció de
informaciósobrelesconformacionsproteiques.Peraquestaraó,calintercanviarelsàtoms
d’hidrogen per deuteri, o aigua deuterada (D2O), mitjançant els tubs de diàlisi MINI
DialysisUnits (G‐Biosciences),obé, liofilitzant lesmostres iresuspesesenD2O.Labanda
amida Iobtingudaapartirdemostresdeuteradesesdenominaamida I’.Lesmostreses
col·loquen entre dos finestres de CaF2, separades mitjançant un espaiador de 50 μm
(ReflexAnalytical).
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesEspectroscòpiques
94
Peral’obtenciódelsespectress’haempratl’espectròmetreVarianResolutionsPro,
registrantl’espectrede4000a400cm‐1,aunavelocitatde95cm−1/min,unaresolucióde
2 cm‐1, i fent la mitjana de 1000 acumulacions. L’espectre va ser inicialment corregit
contraelsorolldefons(obackground),ilasenyaldeltampóidelvaporvanserrestades
abansdeprocedirambeltractamentdelesdades.
La tècnica de FTIR ha estat emprada per l’estudi de l’estructura i agregació del
fragment d’anticòs scFv‐h3D6, del domini variable AL‐12, i del domini PDZ3. Les
condicionsde lamostra,elsparàmetresd’adquisiciódelsdiferentsespectres,aixícomel
tractament de les dades i la deconvolució de la banda d’amida I’, es troben detallats a
l’apartatdeMaterialsiMètodesdelCapítol1,3i4,respectivament.
4.6. Microscòpiaelectrònicadetransmissió(TEM).
Lamicroscòpiaelectrònicapermetmagnificarmostres finsaunmiliódevegades
ambun límitde resolucióde2nm.Aquestamagnificació s’aconsegueixemprantun feix
d’electrons, modulat per una sèrie de lents electromagnètiques, de forma que incideix
sobre lamostraque es vol visualitzar. Part dels electrons seran capaçosde travessar la
mostra,mentrequealtresserandispersats,obtenintlaimatgeamplificada.Pertaldeque
elselectronsnosiguindispersatspermolèculesd’aire,totelsistemahad’estartotalment
albuit.
4.6.1. TinciónegativadelesmostresdeTEM.
Lesmostres han estat preparades amb tinció negativa d’acetat d’uranil al 1% i
disposades sobre reixetesde coure recobertesd’una capade carboni. La tinciónegativa
recobreixlamostraidispersaelselectrons,obtenintunboncontrastenlaimatge.
Elprotocolseguitperlapreparaciódemostres,haestatelsegüent:
1. Siconvé,diluirlamostra(1/10),ambelmateixtampó,pertaldevisualitzarcorrectament
lesestructuresd’interès.
2. Aplicar5μldemostrasobrelacapadecarbonidelareixeta,deixar‐horeposar2minaTA.
3. Absorbirl’excésdemostratocantlagotamitjançantpaperdefiltre.
4. Tenyirlamostraamb5μld’Acetatd’Uranil1%,deixarreposar2minaTA.
5. Absorbirl’excésd’acetatd’uraniltocantlagotaambunpaperdefiltre.
6. Assecar lamostra2minaTA.Lesmostrespodenservisualitzadesimmediatament,obé,
guardadesencondicionsdebuit.
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesEspectroscòpiques
95
Lesmostres han estat visualitzades al microscopi Hitachi H‐7000, del servei de
microscòpiadelaUABianalitzadesambelsoftwareDigitalMicrograph(Gatan).
La tècnica de TEM ha estat emprada per a l’estudi de l’agregació del fragment
d’anticòsscFv‐h3D6ideldominiPDZ3.Lacondicióieltractamentdelesmostresprevia
ser dipositades a la reixeta, es troben detallats a l’apartat de Materials i Mètodes del
Capítol1,i4,respectivament.
IV‐MaterialsiMètodesGenerals CultiusCel·lulars
97
5. CULTIUSCEL·LULARS.
Treballar ambcultius cel·lularsésunade lesopcionsmésempradesactualment,
comaprimeraaplicacióbiomèdica.Totique,realment,consisteixenunmètode invitro,
els cultius cel·lular és la primera aproximació real als experiments in vivo, com per
exemple, els models ratolins, i els seus resultats són considerats necessaris abans de
passarasistemesinvivo.
Lescondicionsde treballambcultiuscel·lularshandeser totalmentestèrils,per
aixòs’hatreballatdinslasaladecultiusdenivelldebioseguretatII,iencabinadecultius
denivelldebioseguretatI(DepartamentdeBioquímicaiBiologiaMoleculardelaUAB).
5.1. Líniacel·lulardeneuroblastomahumàSH‐SY5Y.
Perarealitzarelsdiferentsexperimentsdeviabilitat,s’hausatlalíniacel·lularde
neuroblastoma humà SH‐SY5Y (Cell Line Services, GmbH). Aquesta línia prové d’una
pacientambmetàstasialmolldel’os,ieslocalitzàalcervell.Lescèl·lulessónadherentsi
creixenformantagregats(oclústers),ambmúltiples,curtesifinesneurites;sensearribara
formarunamonocapaconfluent.
Peralseumantenimentipropagació,lescèl·luleshanestatincubadesa37°C,en
un5%deCO2,enflasconsde75cm2desuperfície(Sarstedt)ienmedidecultiuDMEM/F‐
12(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium/NutrientMixtureF‐12Ham); complementatamb
un10%deFBS(FetalBovineSerum),un1%deNAA(Non‐essentialAminoacids),iun1%
d’antibiòtics penicil·lina/estreptomicina (tot ells adquirits a Sigma‐Aldrich). El canvi de
medi s’ha fet cada 2 dies, realitzant dos rentats amb tampó PBS, pH 7.4, estèril, abans
d’afegirmedide cultiu fresc. És important temperar, al bany a37 °Cdurant20‐30min,
toteslessolucionsabansdeserusades.
5.2. Subcultiucel·lular.
Elsubcultiucel·lular,opassatge,esrealitzaquans’assoleix,aproximadament,el70
%deconfluència al flasc (pera la línia cel·lular SH‐SY5Y,uns4‐5dies).Al seruna línia
adherent, cal desenganxar les cèl·lules amb1mLdeTripsina‐EDTA1X (Sigma‐Aldrich),
incubant‐les durant 3min a 37 °C. La tripsinització s’inhibeix afegint 4mL demedi de
cultiufresc.Peradesferpossiblesagregatscel·lulars,esresuspenenlescèl·lulessuaument
iespassenaunflascnou,aunadiluciód’entre1/20i1/50.
IV‐MaterialsiMètodesGenerals CultiusCel·lulars
98
5.3. Reservoridelalíniacel·lular.
Les línies cel·lulars poden ser conservades durant més de 2 anys congelades i
guardadesentancsdeN2‐líquid.Ésimportantmantenirunreservoridecèl·lules,jaqueles
característiques neuronals es van perdent a mesura que augmenta el nombre de
passatges.Amés,ésunrecanvinecessarienpossiblescasosdecontaminació.
‐ Criopreservació.Calpartird’unaelevadaconfluènciaperassegurarunamínima
viabilitataltornar‐lesadescongelar.Uncoplescèl·luleshanestatdesenganxades
del flasc i diluïdes amb medi de cultiu, es centrifuguen (5 min, a 1280 g), es
descartaelmediperaspiració, iesresuspenenamb1mLdemedidecultiufresc
complementat amb un 5 % de DMSO. Cada mL de cèl·lules, es disposa en un
criotubsde2mL,escongelena‐80°C,iméstardsónemmagatzemadesaltancde
N2‐líquid.
‐ Descongelació. Per a recuperar una línia congelada, s’extrau un criotub de
cèl·lulesguardades, esdeixa temperar2minaTA i seguidamentesdescongelen
completament al bany a 37°C. El mL de cèl·lules descongelades, es passa
automàticament a un flasc nou (recomanable que sigui de 25 cm2, per facilitar
l’adhesió) diluint‐les 1/10 en medi de cultius fresc. Quan les cèl·lules s’hagin
adherit(unes5h),aspirarelmediiafegir‐nedenoupereliminartoteslesrestes
deDMSO.
5.4. Comptatgedecèl·lules.
Sovintésnecessariquantificarelnombredecèl·lulesenunvolumdeterminatpera
prosseguirambexperimentsdecultius,comenelnostrecasdedeterminaciódeviabilitat
cel·lular.Inicialments’haviaempratlaCambradeNeubauer,peròelcomptatgeautomàtic
mitjançantl’aparellTC10™AutomatedCellCounterresultamoltútilpersersenzill,fiablei
ràpid.
Per a experiments de viabilitat, cal partir d’una elevada confluència cel·lular per
assegurar una concentració de mostra suficient. Un cop les cèl·lules han estat
tripsinitzadesidiluïdesambmedidecultiu,escentrifuguen(5min,a1280g),esdescarta
el medi per aspiració, i es resuspenen en un volum estimat per assolir la concentració
mínima(uns10mL).Esmesclen100μLdecèl·lulesresuspesesamb100μLdecolorant
Trypan‐blue,iesdisposen10μLalportadelecturaautomàtica,quetéunrangdedetecció
de 5·104 – 1·107 cèl·lules/mL. A partir del resultat obtingut, es calcula la dilució de la
mostranecessària.
IV‐MaterialsiMètodesGenerals CultiusCel·lulars
99
5.5. Experimentsdeviabilitatcel·lulardeSH‐SY5Y.
Per als experiments de viabilitat s’han emprat plaques d’ELISA de 96 pous
(Sarstedt),enelsques’hihaafegit2·104cèl·lules/pou,en100μLdemedidecultiu.Les
plaquess’handeixatincubant24ha37°Cpera latotaladhesiódelescèl·lules.Deguta
quel’FBSpotinterferirenelsresultatsdeviabilitatcel·lular,abansdetractarlescèl·lules,
s’hareemplaçatelmediamb90μldemedidecultiuambnomésun2%d’FBS.Decada
una de les condició experimentals, s’han realitzat rèpliques de 6 pous, afegint 10 μl
mostra/pou(diluciómostra1/10).Lesplaquess’handeixat,denou,incubantdurant24ha
37 °Cper tald’assegurar l’efecte sobre les cèl·lules.Mitjançant elmètodede l’MTT, s’ha
mesuratlaviabilitatcel·lular.
5.5.1. AssajosdeviabilitatperMTT.
L’assaig per MTT quantifica l’activitat de l’enzim mitocondrial succinat
deshidrogenasa,mesurantdirectamentlaviabilitatcel·lular.L’MTTésunasoluciógrogosa
que,peractivitatdel’enzimmitocondrial,ésprecipitadaenformadeformazaninsoluble,
decolorblaufosc.
Acadaundelspousdelaplacad’ELISA,s’hiafegeixen10μld’MTT,a5mg/mLen
PBS (0.5 mg/mL al pou) i filtrat amb filtres estèrils de PDVF de 0.22 μm . La reacció
s’incuba4ha37°C.Peraspiració,s’eliminaelsobrenedant,ielscristallsdeformazansón
solubilitzatsamb100μldeDMSO,agitantdurant10minaTA.Laintensitatdecadapoués
mesuradacolorimètricamenta540nmia620nm,mitjançantellectordeplaquesd’ELISA
Victor3(PerkinElmer).Ladiferènciaentretotesduesmesureshaservitperacalcularel
tant per cent de viabilitat, fent la mitjana de les 6 rèpliques per placa i de, mínim, 2
experimentsindependents,indicantl’errorSEM(StandardErroroftheMean).
Els experiments de viabilitat per MTT han estat emprats per a l’estudi de
citotoxicitat del pèptid Aβ1‐42 i l’efecte del fragment d’anticòs scFv‐h3D6, així com del
dominiPDZ3.Lacondicióieltractamentdelesmostrespreviaserafegidesalcultiud’SH‐
SY5Y, es troben detallats a l’apartat de Materials i Mètodes del Capítol 1, i 4,
respectivament.
IV‐MaterialsiMètodesGenerals TècniquesBioinformàtiques
101
6. TÈCNIQUESBIOINFORMÀTIQUES.
6.1. Modelatgetridimensionaldel’scFv‐h3D6.
Elmodelatge tridimensional de proteïnes esdevé unamolt bona alternativa a la
cristal·lització,quesovintresultadifícild’aconseguir(Bramuccietal.2012),ialaresolució
d’estructuresperressonànciamagnèticanuclear(RMN),quetélalimitaciódelagrandària
de la cadenapolipeptídica (màximuns200 residus) i és incompatible amb la presència
d’agregats (Wuthrich 2001). A partir d’un modelatge proteic s’obté una fiable
caracteritzaciódelaproteïna,tananivelld’estructurasecundària icomterciària,encara
que els residus que no tenen identitat amb el motlle del model poden quedar en una
orientació inadequada. Determinar residus conservats, exposats o enterrats, reconèixer
interaccions locals o distants dins la molècula, o localitzar, dins de l’estructura
tridimensionaldelamolècula,lesregionsambtendènciaal’agregaciópreditesapartirde
la seqüència, són dades molt útils per a entendre el comportament de la molècula i
millorar‐ne l’experimental.Amés, la sevapossibilitatde rotacióen3Dpermet localitzar
cadenes lateralsquepodensercausadebaixaestabilitat i/osolubilitatde lamolècula, i
facilitaeldissenydepossiblesmutantsdelaproteïna.
En el nostre cas, s’ha construït un model de l’estructura tridimensional del
fragmentd’anticòsrecombinantscFv‐h3D6.Peralseudissenys’hafetúsdelestècniques
bioinformàtiquesdescritesal’apartatdeMaterialsiMètodesdelCapítol2.
6.2. ExPASy.
L’ExPASyésunportalderecursosbioinformàtics(SwissInstituteofBioinformatics,
SIB)elqualdónaaccésadiversesbasesdedadesieinescientífiques.Algunsexemplessón:
‐ ProtParam. Consisteix en una eina que permet obtenir varis paràmetres físics i
químicsapartird’unadeterminadaseqüènciaproteica,comaraelpesmolecular,
elpI,elcoeficientd’extinciómolar,etc.S’hadetenirencompte,però,queaquests
sónvalorsteòricsiaproximatsquepodenservircomaideageneraliinicial.
‐ Reverse/Translate.Permetferanàlisideseqüènciadenucleòtidsid’aminoàcids,
sobretotal’horadecomprovarresultatsdeseqüenciaciódeDNA.
‐ BLAST.Empratperalarecercad’homologiadeseqüènciesdipositadesenelPDB
(ProteinDataBank).
V. CAPÍTOLS.
CAPÍTOL 1: Un fragment variable de cadena senzilla
(scFv‐h3D6) anti‐Aβ impedeix la formació de fibres
amiloides i la citotoxicitat del pèptid Aβmitjançant la
retiradad’oligòmersdelaviaamiloide.
ARTICLESRELACIONATS:
Ananti‐Aβ(amyloidβ)single‐chainvariablefragmentpreventsamyloidfibrilformationandcytotoxicitybywithdrawingAβoligomersfromtheamyloidpathway
Marin‐Argany,M.*,Rivera‐Hernández,G.*,Martí‐Clua,J.&Villegas,S.
BiochemicalJournal437,25–34(doi:10.1042/BJ20101712)2011
*Firstco‐author
Earlyinterventioninthe3xTg‐ADmicewithanamyloidβ‐antibodyfragmentamelioratesfirsthallmarksofAlzheimerdisease.
Giménez‐Llort,L.,Rivera‐Hernández,G.,Marin‐Argany,M.,Sánchez‐Quesada,JL.&Villegas,S.
mAb5:5,665–677(doi:10.4161/mabs.25424)2013
V‐Capítol1 Resum
107
1. RESUM.
La immunoteràpia anti‐Aβ s’ha revelat com una eina esperançadora en el
tractament de la malaltia de l’AD. L’administració de fragments variables de cadena
senzilla(single‐chainvariablefragment,scFv)noprodueixelsefectesadversosobservats
en l’administració d’anticossos complets. En el següent capítol, es presenta l’expressió
recombinantdelscFv‐h3D6,derivatd’unmAbhumanitzatespecíficperaβ‐oligòmers,així
comlademostraciódelasevacapacitatperanul·larlatoxicitatinduïdaperelpèptidAβ1‐42
a la línia cel·lular de neuroblastoma humà SH‐SY5Y. Per a conèixer els canvis
conformacionals de l’scFv‐h3D6 relacionats amb la prevenció de tal toxicitat, es descriu
l’espaiconformacionaldel’scFv‐h3D6sotapertorbaciópertemperatura.L’escalfamentdel
estatnatiunocondueixacapgraudedesplegamentdelaproteïna,sinódirectamentaun
estatintermediarireorganitzatqueiniciaunaviad’agregació.Aquestaviad’agregacióno
és una via amiloide, com la que segueix el pèptid Aβ, sinómés aviat una via en la que
apareixen fibres worm‐like que, notablement, resulten ser no tòxiques. En condicions
fisiològiques, aquesta via es troba termodinàmica i cinèticament afavorida quan l’scFv‐
h3D6 i elsoligòmers‐Aβ1‐42 formenuncomplex, elqueexplica com l’scFv‐h3D6retirael
pèptidAβdelaviaamiloide.Aquestaéslaprimeradescripciód’unmecanismemolecular
pelqualunscFvevitalatoxicitatdelsoligòmersformatspelpèptidAβ.
V‐Capítol1 Introducció
109
2. INTRODUCCIÓ.
Des del primer indici de neurotoxicitat induïda pel fragment C‐terminal, de 105
residus, de la proteïna APP (Amyloid Precursor Protein) (Yankner et al. 1989), fins a
l’actualitat,moltessónlesevidències,ivanenaugment,dequeelsoligòmerssolublesdel
pèptidamiloideAβsónlacausadelapèrduadesinapsisideldanyneuronalcaracterístic
delamalaltiadel’AD(AD)(Lansbury,Lashuel2006).Conseqüentment,s’havistquecerts
problemescognitiusapareixenabansdequeelsdipòsitsamiloidess’haginformat(Dineley
etal.2002).Amésamés, laseveritatd’aquestsdèficitsestrobencorrelacionatsambels
nivells d’Aβ soluble, i no amb la presència de plaques amiloides (McLean et al. 1999).
Ambduesobservacionsindiquenquelaneurodegeneracióésprèviainocomaresultatde
ladeposicióamiloide.D’acordambaixò,existeixlanecessitatdetrobarnovesteràpiesque
capturinelsoligòmersd’Aβenllocdelesfibresamiloides.
Deformanatural,enellíquidcerebroespinalhumàienelplasmad’individussans,
hisónpresentsanticossoscontraelpèptidAβ39‐42,elsnivellsdelsquals,però,esredueixen
significativament en pacients d’AD, suggerint que la patologia pot tenir una base
immunodeficient (Solomon 2009). Les primeres descripcions respecte el potencial
terapèutic dels anticossos anti‐pèptid Aβ es basaven en la inhibició de la fibril·lació in
vitro,ienlaprevenciódelaneurotoxicitatdelpèptidAβ1‐40encultiuscel·lulars(Solomon
et al. 1997). Laprimerademostracióde l’efectivitat de la immunoteràpia contra l’Aβ, in
vivo, es va obtenir en ratolins PDAPP transgènics, els quals sobreexpressen la proteïna
humanaAPPmutadaenelresiduVal717perFenilalanina(V717F)(Schenketal.1999).En
aquestcas, la immunitzacióactiva,ambelpèptidAβ1‐42, redueixdràsticament lacàrrega
amiloide del còrtex cerebral i del hipocamp. Subseqüentment, l’efectivitat de la
immunoteràpia passiva (comper exemple, administrant anticossos dirigits contra l’Aβ),
tambévasertestadaenelsmateixosratolins(Bardetal.2000).Uncopesvaaconseguir
superarlesdiferentsfasesclíniquesambmodelsanimals,esvaprosseguiramblesproves
ambhumansvacunatsactivamentambelpèptidAβ1‐42(Schenk2002).Noobstant,lafase
clínica, nomenadaAN‐1792, va ser aturada degut a l’aparició de complicacions de tipus
meningoencefalítiques (Nicoll et al. 2003). Tot i que el tractament va ser parat, aquells
pacients que van ser inicialment immunitzats van continuar sent monitoritzats, i es va
detectarunimportantretarddeladavalladacognitiva,finsitotunanydesprèsdel’última
dosi (Hocket al.2003).Apartde lameningoencefalitis,unaltredelsefectes secundaris
d’administrar l’anticòs sencer, és que agreuja la angiopatia amiloide cerebral (CAA), un
trastorn dels vasos sanguinis del SNC caracteritzada pel depòsit dematerial β‐amiloide
sobrelesparets(Pfeiferetal.2002).
V‐Capítol1 Introducció
110
Desprésdenombrososestudisperaprevenirels efectes secundarisnodesitjats,
lesprovesclíniquesqueméshanavançatsónlesdelavacunaACC‐001,queconsisteixen
un derivat del pèptid Aβ, i les del anticòs AAB‐001, o Bapineuzumab, un anticòs
monoclonal(mAb)murídirigitcontraelsresidus1‐5del’extremN‐terminaldelpèptidAβ
(mAb‐h3D6), el qual és específic dels oligòmers d’Aβ (Jacobsen 2006, Wisniewski,
Konietzko 2008, Nitsch, Hock 2008). Malgrat les grans expectatives, aquest últim
tractamentvaseraturatenfaseclínicaIII,degutaresultatscontradictoris(Thomas2012).
En faseclínica II,elsefectesadversosdelBapineuzumaberen lleus i transitoris,peròva
causaredemavasogènic(Rinneetal.2010).Aquestefectevaserrelacionatambladoside
fàrmac, i lamajoria dels casos eren portadors de l’al·lelAPOE4. Desafortunadament, les
restriccions de dosi i el reclutament de pacients amb l’al·lelAPOE3, elmés freqüent en
humansinorelacionatambl’ADesporàdic,novansersuficientsperaseguiramblafase
III (Thomas 2012). Cal mencionar que aquestes proves van ser realitzades en pacients
ambundiagnòsticde lamalaltiamassaavançat, tal icomreivindica larevistaWorldAD
Report2011(Prince,Bryce&Ferri2011).
Per aquests raó, la immunització passiva amb fragments variables de cadena
senzilla (single‐chain variable Fragment, scFv), és a dir, anticossos mancats de la regió
costant Fc, resulta ser una estratègia terapèutica molt esperançadora per a la malaltia
d’AD,jaquenoactivalamicròglia,noprodueixhemorràgiacerebral,niedemavasogènic,i
ha estat demostrat ser tan potent i específica com la realitzada amb elsmAb parentals
(Fukuchietal.2006,Zameeretal.2008,Robertetal.2009).Noobstant, laquantitatde
proteïnascFvrecombinantobtingudadesprésde lasevapurificació,és,engeneral,molt
baixa,degutalessevespropietatsdeplegamentiestabilitat(Zheng,Baumann&Reymond
2003). De forma habitual, la producció de les diferents variants d’scFv és realitzada en
sistemes dephage‐display (Fukuchi et al. 2006, Zameer et al. 2008), o bé per expressió
periplasmàticaenE.coli(Wall,Pluckthun1999,Robertetal.2009).Pocssónelscasosque
aconsegueixen una expressió soluble d’scFv i, per a fer‐ho, l’expressen en forma
precursora o, altrament dit, l’scFv unit a una proteïna fusió (o protein tag), dins del
citoplasmad’Origami(DE3),untipusdesocad’E.coliqueafavoreixl’ambientoxidatiuen
elcitoplasma,beneficiantelcorrecteplegamentdeproteïnesquepresentenpontsdisulfur
(Zheng,Baumann&Reymond2003,Jurado,deLorenzo&Fernandez2006).
Enelsegüentcapítols’exposaparttreballrealitzatdurantaquestatesidoctoral,en
elques’hafetservirlaseqüènciadelanticòsmAb‐h3D6.v2peraconstruirungensintètic,
consistent enundomini variablede cadenapesada (VH) i undomini variablede cadena
lleugera (VL) units per un connector del tipus (Gly4Ser)3, l’scFv‐h3D6. L’expressió de la
proteïna precursora, (His)6‐trx‐dianaTEV‐scFv‐h3D6, s’ha realitzat en la soca
V‐Capítol1 Introducció
111
Origami2(DE3).Laproteïnadefusió,latioredoxina(trx),haestateliminadaeficientment
perlaproteasaTEV(TobaccoEtchVirus)(Nallamsettyetal.2004).
L’efectivitatdelscFv‐h3D6perarevertir la toxicitatde l’Aβ,haestatdemostrada
enlalíniacel·lulardeneuroblastomahumàSH‐SY5Y.Seguidament,s’haobtingutelperfil
conformacionalde l’scFv‐h3D6un cophaestatpertorbatper temperatura, ladescripció
delqualenshapermèscomprendremillorelmecanismemolecularperelquel’scFv‐h3D6
és capaç de capturar oligòmers d’Aβ1‐42. El tractament amb temperatura indueix la via
d’agregació de l’scFv‐h3D6, caracteritzada per un estat intermediari ric en estructura‐β
queagregaenformadefibresworm‐like(WL).Aquestesfibressóndiferentsdelesfibres
amiloides formades pel pèptidAβ, especialment a nivell de citotoxicitat i de precursors
oligomèrics.Amés,laformaciódefibresWL,perpartdel’scFv‐h3D6,ésafavoridacinètica
i termodinàmicamentquan s’uneix específicament als oligòmersd’Aβ1‐42, fet que explica
com l’scFv‐h3D6 retira els oligòmers d’Aβ1‐42 de la via amiloide i, conseqüentment, com
evitalasevacitotoxicitat.
En referència a la tesi doctoral en redacció de Rivera‐Hernández, G. (Rivera‐
Hernandez 2013), els bons resultats obtinguts en experiments de cultiu cel·lulars, ha
portatalnostregrupderecercaainvestigarelpotencialpreventiudel’scFv‐h3D6invivo,
mitjançant l’administració intraperitoneal de l’scFv‐h3D6 en ratolins 3xTg‐AD de cinc
mesos d’edat, un treball recent del nostre grup de recerca en el que s’han obtingut
resultatsmoltesperançadors(Gimenez‐Llortetal.2013,Esquerda‐Canalsetal.2013).
V‐Capítol1 MaterialsiMètodes
113
3. MATERIALSIMÈTODES.
3.1. Expressióipurificaciódel’scFv‐h3D6.
Lasocad’E.coliempradapera l’expressió intracel·lularde l’anticòsrecombinant
scFv‐h3D6haestat l’Origami2(DE3),mitjançantelvectord’expressiópETtrx‐1a(veure
apartats3.1i3.4deMaterialsiMètodesGenerals).Apartirdel’expressió,s’hapurificatla
proteïna de fusió (His)6‐trx‐dianaTEV‐scFv‐h3D6 (40.6 kDa) de la fracció citosòlica
insolublei, finalment,s’haobtingutl’scFv‐h3D6pur(26.4kDa)mitjançanteltallambla
proteasaTEVicromatografiesd’afinitatidebescanviiònic.Ésimportantmencionarque,
unapartde laproteïna s’obtinguédirectamentde la fracció soluble, encaraqueambun
rendimentmoltbaix.Peraquestaraós’hatreballatúnicamentamblafraccióinsoluble.
3.1.1. Expressióheteròlogadel’scFv‐h3D6.
Peral’expressiódelfragmentd’anticòsscFv‐h3D6s’haseguitelsegüentprotocol:
1. Transformació de les cèl·lules competents Origami2(DE3) amb DNA vector
pETtrx_1a::scFv‐h3D6(veureapartat2.2MaterialsiMètodesGenerals).
2. Picarunacolòniaen5mLdemediLBlíquidsuplementatambelsantibiòticsTet(selecció
delasoca)iKn(selecciódelvector).
3. Incubarmàxim15henagitacióforta(250rpm)a37°C,perpromoureuncultiusaturat.
4. Pre‐inocular, enunvolum finalde50mLdemediLBambantibiòtics,unadilució1:10 i
incubaralesmateixescondicionsanteriorsfinsarribaraunaDO600de0.2‐0.4.
5. Inocular,enunvolumfinald’1LdemediLBambantibiòtics,unadilució1:100iincubara
les mateixes condicions anteriors fins arribar a una DO600 de 0.6‐0.8. (Per a obtenir
suficientquantitatdeproteïna,normalments’hanexpressat4erlenmeyersde2Lamb1L
deLBpererlenmeyer)
6. Disminuirlatemperaturadelincubadora20°Ciinduirl’expressióambIPTG0.5mM.
7. Incubar15ha20°C,enagitacióconstantde200rpm.
3.1.2. LLisiCel·lular.
Un cop s’ha recuperat l’extracte cel·lular (veure apartat 3.5.2 de Materials i
Mètodes Generals), s’ha prosseguit amb el protocol de llisi cel·lular següent, per tal de
recuperarlafracciócitosòlica:
1. Resuspendreelpelletdecèl·lulesamb40mLdeTampódellisi(Tris/HCl160mM,NaCl4
M, pH 8.5, prèviament refredat a 4 °C) per L de cultiu expressat, fins a ser totalment
homogeni.
2. Sotmetrelescèl·lulesa3ciclesdecongelacióambN2‐líquididescongelacióaTA
V‐Capítol1 MaterialsiMètodes
114
3. Sonicarlasoluciómitjançant6ciclesde45segons,apotència9iunafreqüènciadel50%,
mantenintlamostrasempreengelireposant3minentrecicles.
4. Centrifugar a 43700 g durant 40min a 4 °C, per a separar la fracció total soluble de la
insoluble.
5. Descartarelsobrenedantperdecantacióimantenirelpelletengel.
3.1.3. Solubilitzaciódelafraccióproteicainsoluble.
Totiquepartdelaproteïnaexpressadaestrobaenlafracciócitosòlicasoluble,el
rendimentobtingutdepurificaraquestafraccióésbaixis’haoptatperarecuperartansols
la fracció insoluble. Per a fer‐ho, es resuspèn el pellet amb 10 mL de Tampó de
Solubilització (Urea 8 M en Tris/HCl 100 mM, Glutatió reduït (GSH) 10 mM, pH 8.5,
prèviamentrefredata4°C)perLdecultiuexpressat,finsaserpràcticamenthomogeni.El
pellets’acabaderesuspendreperagitacióorbitala4°Cdurantmínim2h.Acontinuacióes
centrifuga a 43700 g durant 40min a 4 °C, per a separar la fracció solubilitzada de la
insoluble, es recupera el sobrenedant per decantació, i es filtra la mostra per un filtre
PVDFde0.45μm.
3.1.4. Replegamentgotaagotadelafraccióproteicasolubilitzada.
Peral replegament, la fracciósolubilitzadaenurea, iquees trobadesplegada,es
dilueix(dilució1:10)en90mLTampódeReplegament(Tris/HCl100mM,L‐Arginina100
mM,Glutatióoxidat(GSSG)0.15mM,pH8.5,prèviamentrefredata4°C)perLdecultiu
expressat.Ladilucióesrealitzaa4°C,perdegoteiglentambunapipetaPasteur,iagitació
suaudeltampó;iaixíafavorirelreplegamentdelaproteïnaenelnouentornoxidatiu.Un
copreplegatdurantunes36h,a4°Ciagitaciósuau,escentrifugaa43700gdurant40min
a4°C,perasepararlafracciósolublereplegadadel’encarainsoluble.
3.1.5. DigestióambproteasaTEV.
Uncoptenimlafraccióreplegadaisolubilitzada,calrealitzareltallespecíficamb
laproteasaTEV(Nallamsettyetal.2004),pertald’aïllarlaproteïnascFv‐h3D6delaseva
forma precursora, o de la proteïna fusió (His)6‐trx. Per a realitzar el tall amb TEV cal
dialitzarlamostraaTampódeDigestióambTEV(Tris/HCl20mM,NaCl100mM,EDTA
0.5mM,pH8.3).Enaquestpuntsovintcalcentrifugarlamostraa43700gdurant40mina
4°C,pertald’eliminarpossiblesprecipitats.
V‐Capítol1 MaterialsiMètodes
115
ReacciódeTallambTEV:
‐ Lareaccióde tall es faenpresènciadelpar redoxGSH/GSSGaunaconcentraciófinalde3mMi0.3mM,respectivament.
‐ Larelacióproteïna:proteasaésde1:50.
‐ AjustarelpHa8.3.
‐ Incubara30°C,durant4henagitaciósuau.
3.1.6. Cromatografiad’afinitatambhistidines.
PertaldesepararelsproductesdeltallambTEV,s’hautilitzatunacolumnad’IMAC
HisTrap(veureapartat3.6.1.1deMaterialsiMètodesGenerals).Deformaquelaproteïna
precursoranotallada,laproteïnadefusió(His6‐trx)ilamateixaTEV,quedenatrapadesa
lacolumnaperafinitatdelacuad’histidines;mentrequel’scFv‐h3D6éseluïtirecuperat
directament de la columna juntament amb altres proteïnes del cultiu cel·lular. Per tant,
caldrà un pas més de purificació (columna de bescanvi catiònic, CEX) per a obtenir el
fragmentd’anticòstotalmentpur.
Elstamponsutilitzatsperalacromatografiasónelssegüents:
‐ TampódeCàrrega:NiSO450mM.
‐ Tampód’UnióideRentat:Tris/HCl20mM,NaCl150mM,pH8.3.
‐ Tampód’Elució:Tris/HCl80mM,NaCl4M,Imidazol2M,pH8.3.
ElfluxdelacromatografiahaestatcontrolatmitjançantunabombaperistàlticaP‐
1,onmanualmentescanvia lamostra,oel tampó, i lavelocitatd’injecció,quehadeser
d’entre 1 i 2mL/min. Per tal d’assegurar que tota la fracció de proteïna que conté cua
d’histidiness’uneixialacolumna,s’hanacoblatduescolumnesd’IMAC,obtenintunvolum
decolumnafinalde10mL(1VC=5mLx2)iunadoblecapacitatd’unió.
Elprotocolseguitperarealitzarl’IMAC,expressatenvolumsdecolumna(VC),és
elsegüent:
1. Rentarlacolumnaamb10VCd’aiguaMilli‐Qpertald’eliminarl’etanolempratperalaseva
conservacióa4°C.
2. Regenerar la columna amb10VC deNiSO4 50mM i rentar‐ne l’excés amb5VC d’aigua
Milli‐Q.
3. Equilibrarlacolumnaamb10VCdetampód’unió.
4. Filtrar la mostra amb filtres de PVDF de 0.45 μm i injectar‐la a un flux constant de 2
mL/min.
V‐Capítol1 MaterialsiMètodes
116
5. Recollirlafracciódeproteïnanounidaacolumnaiguardar‐laa4°C.Aquestafraccióconté
la proteïna scFv‐h3D6 aïllada de la forma precursora, juntament a altres proteïnes
contaminants.
6. Rentar lacolumnaamb5VCdetampód’unió,perarecuperar la totalitatdeproteïnano
unidaiguardar‐laa4°C.AquestafracciócontélaproteïnascFv‐h3D6aïlladadelaforma
precursora,juntamentaaltresproteïnescontaminants.
7. Eluiridescartarlafracciódeproteïnaunidaamb5VCdetampód’elució.Aquestafracció
contélaproteïnafusióHis6‐trx.
3.1.7. Cromatografiadebescanvicatiònic.
Per a l’últim pas de purificació de l’scFv‐h3D6, s’ha emprat una columna de
bescanvicatiònic(CEX)ResourceS‐6mL(GEHealthcare)(veureapartat3.6.2deMaterials
iMètodesGenerals),mitjançant laqual es separen la fracciód’scFv‐h3D6nativa de les
formes scrambled. Les formes scrambled són totes aquelles combinacions en que es
podenformarelspontdisulfur,tantnatiuscomnonatius.Alaseqüènciadel’scFv‐h3D6hi
trobemquatrecisteïnes,pertantexisteixenfinsanouformesscramblesteòriques.LaCEX
és capaçde separar lesdiferents espècies scrambled quepresenta l’scFv‐h3D6,obtenint
finalmentl’scFv‐h3D6100%natiuipur.
Peralacromatografia,caldialitzarlamostraaTampód’UniódeCEX(Na2HPO48.3
mM,pH6.5).
Elstamponsutilitzatsperalacromatografiasónelssegüents:
‐ Tampód’UnióideRentat(A):Na2HPO48.3mM,pH6.5.
‐ Tampód’Elució(B):Na2HPO48.3mM,NaCl1M,pH6.0.
ElpIteòricdelaproteïnaésde8.3,alutilitzaruntampóapH6.5,lamostraestarà
carregadapositivamenti interaccionaràamblareïnanegativa.Peral’eluciódeproteïna,
s’hautilitatungradientlinealambunincrementdelaforçaiònicadeΔ10%B/28CV(o
bé,0.06%B/mL).Lacapacitatd’uniódelacolumnaésde270mg(BSA,67kDa),pertant,
elvolumdemostrainjectatdependràdelaquantitatdeproteïnaenella.
ElprotocolseguitperarealitzarlaCEX,expressatenvolumsdecolumna(1VC=6
mL),éselsegüent:
1. Rentarlacolumnaamb10VCd’aiguaMilli‐Qpertald’eliminarl’etanolempratperalaseva
conservacióa4°C.
2. Equilibrarlacolumnaamb5VCdetampóA.
3. Filtrar lamostraperunfiltrePVDFde0.45μmi injectar‐la,via loopde50mL, aunflux
constantde2mL/min.
V‐Capítol1 MaterialsiMètodes
117
4. Rentar lacolumnaamb5VCdetampóA,peratald’eliminarcompletament lafraccióde
proteïnanounidaacolumna.
5. Aplicar un gradient d’elució de Δ 10% B/28 VC, a un flux constant de 1 mL/min, fins
arribaral100%d’aquesttampó.Recol·lectarfraccionsd’1mL.
6. Rentarlacolumnaa100%detampóBdurantun1VC,aunfluxconstantde2mL/min,per
acabard’eluirtotalafracciódeproteïnaunida.
7. Re‐equilibrarlacolumnaal100%detampóAamb1VC,aunfluxconstantde2mL/min.
La proteïna scFv‐h3D6 elueix a un 7‐9% de tampó B (aproximadament 80mM
d’NaCl),donantllocadospicsforçasolapats.Elprimerpiccorresponalafracciód’scFv‐
h3D6natiu, ielsegonalafraccióscrambled;alesfraccionscorresponentsalsolapament
de pics hi trobem una mescla d’ambdues poblacions. És molt important separar
correctamentelsdospics,perassegurarqueelpooldeproteïnascFv‐h3D6estroba100%
plegada nativament. La fracció scFv‐h3D6‐h3D6 pura es dialitza a tampó PBS pH 7.4,
s’aliquotaeneppendorfsd’1mL,iescongelaambN2‐líquidperaguardar‐laa‐20°C.
3.2. ExpressióipurificaciódelaproteasaTEV.
Lasocad’E.coliempradaperal’expressióintracel·lulardelaproteasaTEVhaestat
la C41(DE3), mitjançant el vector d’expressiópMHTΔ238 (veure apartats 3.1 i 3.4 de
Materials i Mètodes Generals). De l’expressió, s’ha purificat la proteïna de fusióMBP‐
dianaTEV‐(His)7‐TEVdelafracciócitosòlicasoluble,laquals’auto‐digeriràdonantlloca
laproteïna(His)7‐TEV,purificadamitjançantunpasdecromatografiad’afinitat.
3.2.1. ExpressióheteròlogadelaproteasaTEV.
Peral’expressiódelaproteasaTEVhaestats’haseguitelsegüentprotocol,extret
deBlommel,P.G.etal.(Blommel,Fox2007):
1. Transformació de les cèl·lules competents C41 amb DNA vector pMHTΔ238::TEV (veure
apartat2.2MaterialsiMètodesGenerals).
2. Picar una colònia en 5 mL de medi LB líquid suplementat amb l’antibiòtic Kn (selecció del
vector).
3. Incubarmàxim15henagitacióforta(250rpm)a37°C,perpromoureuncultiusaturat.
4. Inocular,enunvolumfinald’1LdemediLBambantibiòtics,unadilució1:100,iincubarales
mateixes condicions anteriors fins arribar a una DO600 de 0.6‐0.8. (Per a obtenir suficient
quantitatdeproteïna, normalment s’hanexpressat4 erlenmeyersde2L amb1LdeLBper
erlenmeyer).
5. Disminuirlatemperaturadelincubadora25°Ciinduirl’expressióambIPTG0.5mM.
6. Incubarunmàxim4ha25°C,enagitacióconstantde200rpm.
V‐Capítol1 MaterialsiMètodes
118
3.2.2. PurificaciócitoplasmàticadelaproteasaTEV.
Elprotocoldellisicel·lularperalapurificaciódelaproteasaTEVéselmateixque
l’emprat per a llisar les cèl·lules Origami2(DE3)+pETtrx_1a::scFv (veure apartat 3.1.2),
ambl’únicadiferènciaqueelvolumdetampódellisiusatsegueixunarelacióde6mLde
tampópergrd’extractecel·lularrecuperatdel’expressió.
3.2.3. Cromatografiad’afinitatambhistidinesd’altaresolució.
Un cop s’ha separat i recuperat la fracció citoplasmàtica soluble, es purifica la
proteasa(His)7‐TEV,jaauto‐digeridaialliberadadelaproteïnadefusióMBP,mitjançant
2 columnesd’IMAC‐Histrapde5mL, acoblades al sistemad’FPLCper a l’automatització
(veureapartat3.6.1.1deMaterialsiMètodesGenerals).
Elstamponsusatsperaquestacromatografiahanestat:
‐ Tampód’UnióideRentat(A):Na2HPO420mM,NaCl500mM,pH7.5.
‐ Tampód’Elució(B):Na2HPO420mM,NaCl350mM,500mMImidazol,pH7.5.
Un cop injectada la mostra, s’ha utilitat un gradient d’elució no lineal amb 4
increments escalats d’imidazol, on la proteïna TEV pura eluirà al 100 % de Tampó
d’Elució:
‐ Rentatdecolumna:0%B/4VC
‐ Elució1:15%B/8VC
‐ Elució2:100%B/10VC
‐ Re‐equilibratdecolumna:0%B/4VC
Posteriormentalapurificació,s’hanusatlescolumnesd’exclusiómolecularPD‐10
Desalting columns (veure apartat 3.6.3.2deMaterial iMètodesGenerals)per a extraure
l’imidazol de lamostra i guardar la proteïna alTampódeDigestiódeTEV (Tris/HCl20
mM,NaCl150mM,Glicerol10%,pH7.3).
3.3. Determinaciódel’estructurasecundàriadel’scFv‐h3D6.
Aquests experiments han estat desenvolupats per el meu company de laboratori
Rivera‐Hernández, G., i es troben detallats a la seva tesi en redacció (Rivera‐Hernandez
2013). Els resultats obtinguts ha estat necessari detallar‐los en aquest capítol per tal
d’entendrecompletamenteltreballseguidamentexposat.
V‐Capítol1 MaterialsiMètodes
119
Pelque faals fonamentsde les tècniquesdescritesacontinuació(espectroscòpia
de CD, de fluorescència i de infraroig) es troben detallats a l’apartat 4 de Materials i
MètodesGenerals.
3.3.1. EspectredeCDalUV‐llunyà.
Peraobtenirl’espectredeCDd’estructurasecundàriadel’scFv‐h3D6,s’hautilitzat
l’espectrofotopolarímetre Jasco J‐715.Laconcentracióexperimentaldeproteïnahaestat
de 20 μM (0.54 mg/mL), disposada en una cubeta de quars de 0.2 cm. Per a mesurar
l’espectre de 260 a 190 nm, s’han enregistrat 20 acumulacions a una velocitat de 50
nm/min,unarespostade2seg,unaampladadebandad’1nm,iunaresolucióde0.1nm.
L’espectre del plegament natiu de l’scFv‐h3D6 ha estat determinat a 25 °C. Amés, s’ha
registrat l’espectre de l’estat desplegat (a 90 °C) i, tornant a la temperatura inicial, s’ha
determinat si la desnaturalització tèrmica de la proteïna és reversible completa,
parcialmentonul·la.
3.3.2. Espectred’infraroigambtransformadadeFourier.
Peral’estudid’agregaciódel’scFv‐h3D6perFTIR,lesmostreshanestatdialitzades
enfrontPBS‐D2O,pH7.4,aunaconcentracióde100μM(2.6mg/mL).Esvanadquirirels
espectresa25,37i60°C,temperantlesmostresdurant5min.Eltractamentdedadesila
deconvolució de la banda d’amida I’ s’ha realitzat segons descrit per Arrondo i
col·laboradors (Arrondo, Goni 1999). Resumidament, el nombre i posició de les
componentsdelabandahanestatobtingutsperdeconvoluciósobrecorbesLorentzianes
ambunaampladaentre16‐20cm‐1iunaapoditzaciódetipusBesselambunaconstant(K)
entre1.6‐2.5.Elsajustosdelescomponentss’hanrealitzatsobrecorbesGaussianesis’han
obtingutperduesetapesd’iteració:laprimerafixantlaposiciódelesbandesi,lasegona,
alliberant‐les.Lesdadesfinals,s’hanexpressatentantpercentd’estructurasecundària.
3.3.3. Desnaturalitzaciótèrmica.
La desnaturalització tèrmica s’ha seguit per espectroscòpia de CD al UV‐llunyà i
per fluorescència dels residus de triptòfan (fluorímetre Varian Cary Eclypse), a una
concentraciód’scFv‐h3D6de20i2μM,respectivament,disposadesencubetesdequarsde
0.2 i 1 cm, respectivament. Els experiments s’han registrat des de 25 °C a 90 °C, a una
velocitatde1°C/min,seguintl’el·lipticitata218nm,ilafluorescènciadeltriptòfana338
nm (longitud d’ona d’excitació a 290 nm, i una obertura de les finestres d’excitació i
d’emissióde5nm).Alesdesnaturalitzacions,perCDifluorescència,esvanenregistrarels
espectresa25°C,90°Ci,tornantarefredarlamostra,a25°C.
V‐Capítol1 MaterialsiMètodes
120
3.4. PreparaciódelpèptidAβ1‐42.
El pèptid sintètic Aβ1‐42, purificat amb HCl com a contraió (Caslo Laboratories,
ApS), es va dissoldre a 200 μM en HFIP (1,1,1,3,3,3‐hexafluoro‐2‐isopropanol), un pre‐
tractamentquepermetdesferestructuresenfulla‐βitrencarforceshidrofòbiques,donant
lloc a preparacions de pèptid monodisperses (Dahlgren et al. 2002). Es van preparar
alíquotes de 150 μl, l’HFIP va ser eliminat per evaporació al buitmitjançant l’SpeedVac
(Savant Instruments), i el film resultant va ser guardat a ‐80 °C fins a ser utilitzat. Al
moment de requerir‐lo, el film de pèptid va ser resuspès en 6 μl de DMSO (5 mM de
pèptid),idiluït,seguidament,finsa300μlambtampóPBSpH7.4(100μMdepèptid).
DegutalmètodedepreparaciódelpèptidAβ,lesmostresinicialscontenienun2%
(v/v)deDMSO,pertant,toteslesmostresutilitzadesperaestudiarl’efectedel’scFv‐h3D6
sobrel’agregacióilacitotoxicitatdelpèptidAβ,incloseslesmostrescontrols,contenienel
mateixtantpercentdeDMSO.Calremarcarque,desprésdelaincubació,lesmostresvan
serdiluïdes10vegadesperaprosseguirambelsexperimentsdeviabilitat,unióaThT i
ANS, i TEM. Per tant, les mostres finals contenien un 0.2 % de DMSO. A més, vam
corroborarqueun2%DMSOnotéefectesobre l’espectredeCDalUV‐llunyàde l’scFv‐
h3D6.
3.5. AgregaciódelpèptidAβ1‐42il’scFv‐h3D6.
Laoligomerització,tantdelpèptidAβ1‐42,del’scFv‐h3D6,comdelcomplexAβ1‐42‐
scFv‐h3D6, en tampó PBS pH 7.4 i 2% deDMSO, va ser induïda per incubació a 37 °C
durantdiferentsperíodesdetemps,mentrequelafibril·lacióvaserinduïdaescalfantles
mostresa90°Cdurant5min.
3.6. Assajosdecitotoxicitat.
Els assajos de citotoxicitat es van realitzar mitjançant la línia cel·lular de
neuroblastomahumàSH‐SY5Y(veureapartat5.5deMaterialsiMètodesGenerals).
Primerament,esvanrealitzarassajosdeviabilitatperadeterminarlaconcentració
òptima de pèptid Aβ1‐42 per a generar màxima toxicitat cel·lular. Es va induir la
oligomeritzaciódelpèptidaconcentracionscreixents,de0a200μM,iesvaaddicionar10
μLacadapou,deformaquelaconcentraciófinaldepèptidvaserde0a20μM.
Per a determinar la capacitat del fragment d’anticòs scFv‐h3D6 per a inhibir la
citotoxicitatdelpèptidamiloideAβ1‐42,esvancoincubarmostresaconcentracióconstant
depèptid(100μM)ambconcentracionscreixentdelfragmentd’anticòsscFv‐h3D6(0,1,
10,50i100μM),tractadesiassajadestalicoms’hadescrital’apartatanterior.
V‐Capítol1 MaterialsiMètodes
121
Per ambdós casos, es van extraure els valors de toxicitat seguint el protocol
d’assaig per MTT (veure apartat 5.5.1 de Materials i Mètodes Generals). Cada condició
consistiaen6rèpliquesperexperiment,i4experimentsindependentsvanseranalitzats
estadísticament per nivell de significança (test de rangs signats de Wilcoxon, SPSS),
desprésdenormalitzar lesdadesusant la concentracióde la condició tampóPBScoma
referència.Elsresultatsrepresentenl’errorSEM(StandardErroroftheMean).
3.6.1. Preparaciómostresd’scFv‐h3D6peralsassajosdecitotoxicitat.
Elslipopolisacàrids(LPSs)sónbiomolèculesqueformenpartdelaparetcel·lular
d’E.colii,durantelprocésdepurificaciódel’scFv‐h3D6,sónarrossegatsjuntamentambla
proteïna.ElsLPSssónlesprincipalsendotoxinesdelesbactèriesgram‐negativesipoden
provocar resposta cel·lular en cultius (s’ha detectat una viabilitat superior al 300% en
assajosd’MTT).Ésperaixòque,abansderealitzarexperimentsdeviabilitatcel·lularen
cultius de neuroblastoma humà SH‐SY5Y, cal extraure la fracció lipopolisacàrida de la
mostrad’scFv‐h3D6ievitar,així,falsospositiusenelsresultatsobtinguts.
De la mateixa manera, també s’han extret els LPSs de la mostra d’scFv‐h3D6
injectada en ratolins triple‐transgènics 3xTg‐AD, models d’AD. Els resultats dels
experiments in vivo han estat estudiats per Rivera‐Hernández, G. (Gimenez‐Llort et al.
2013,Rivera‐Hernandez2013).
Pera l’extracciódelsLPSs,s’hanemprat lescolumnesd’afinitatd’LPSsDetoxi‐Gel
Endotoxin Removing Columns (Thermo Scientific) (veure apartat 3.6.1.2 de Materials i
Mètodes Generals). La quantitat d’LPS per mL de mostra proteica depèn del volum de
cultiud’expressió cel·lular inicial, i s’hauràde tenir en compte en elmomentde la seva
extracció.Així, per cadaLde cultiu expressat s’apliquen5mLdemostraproteica auna
columnad’afinitat.
Elstamponsutilitzatsperalacromatografiasónelssegüents:
‐ TampódeRegeneracióid’Eluciód’LPSsunits:detergentsodidesoxicolatal1%enaiguaMilli‐Q.
‐ Tampód’Equilibratid’Eluciód’scFv‐h3D6nounit:tampóPBS,pH7.4.
Elprotocolseguitperal’eliminaciód’LPSs,expressatenvolumsdecolumna(1VC
=1mL),éselsegüent:
1. Rentarlacolumnaamb5VCd’aiguaMilli‐Qpertald’eliminarl’etanolempratperalaseva
conservacióa4°C.
V‐Capítol1 MaterialsiMètodes
122
2. Regenerarlacolumnaamb5VCdedetergentsodidesoxicolatal1%.
3. Rentarl’excésdedetergentamb4VCd’aiguaMilli‐Q.
4. Equilibrarlacolumnaamb4VCdetampóPBSpH7.4.
5. Afegir a la columna, un volummàxim de 5mL demostra (provinent d’ 1 L d’expressió
cel·lular),aunaconcentracióde0.5mg/mLaproximadament.
6. Per gravetat, recol·lectar, en fraccionsd’1mL, lamostra sortintde la columna, ja que la
proteïnanoésretinguda.DescartarelprimermLd’elució.
7. Per assegurar la completa recuperació de la mostra d’scFv‐h3D6 lliure d’LPSs, afegir el
mateixvolumdetampóPBSpH7.4quedemostraafegida;irecol·lectar‐laenfraccionsd’1
mL.
8. Rentarlacolumnaamb2VCdetampóPBSpH7.4peracabard’eluirtotalamostrad’scFv‐
h3D6,recol·lectar‐laenfraccionsd’1mL.
9. Per a eluir els LPSs units a columna, rentar la columna amb 5 VC de detergent sodi
desoxicolatal1%.
10. Conservarlacolumnaa4°Cenetanolal25%.
És recomanable realitzar una columna d’exclusió molecular PD‐10 cap a tampó
PBSpH7.4,pertald’eliminarrestesdedetergentsodidesoxicolatal1%arrossegatamb
la mostra d’scFv‐h3D6 eluïda, que poden afectar l’estructura de la proteïna així com
interferirenelsmètodesdequantificacióodeviabilitatcel·lular(veureapartat3.6.3.2de
MaterialiMètodesGenerals).
3.7. Microscòpiaelectrònicadetransmissió(TEM).
PerTEM, s’ha visualitzat la viad’agregaciódel pèptidAβ1‐42, de l’scFv‐h3D6, així
comdelcomplexAβ1‐42‐scFv‐h3D6, totesellesaunaconcentració finalde100μM.Pera
induirlaoligomerització,lesmostreshanestatincubadesa37°C,durant0,3i48h;pera
la formació amiloide, s’han seguit incubant a 90 °C, durant 5 min. A més, també s’ha
visualitzat lamostraincubadaa60°C,durant10min,pertald’obtenir informaciósobre
l’estatintermediariinduïtpertemperatura.
Lesmostresvanserdiluïdes1/10entampóPBS,absorbidesenreixetesdecoure
recobertesdecarboni,itenyidesnegativamentambacetatd’uranilal1%(veureapartat
4.6.1 deMaterials iMètodes Generals). Lesmostres van ser visualitzades almicroscopi
Hitachi H‐7000, del servei de microscòpia de la UAB, i analitzades amb el software
DigitalMicrograph(Gatan).
V‐Capítol1 MaterialsiMètodes
123
3.8. Assajosd’agregacióperfluorescència.ThTiANS.
Els fluoròfors ThT (Tioflavina‐T) i l’ANS (àcid 8‐anilo‐1‐naftalè‐sulfònic) van ser
empratsperaquantificarl’agregaciódelesmostresvisualitzadesperTEM(veureapartat
4.4deMaterialsiMètodesGenerals).
Mostresde10μlvansermescladesamb90μldeThTa27.78μM(concentració
final de 25 μM), o bé, amb 90 μl d’ANS a 56 μM (concentració final de 50 μM), i
monitoritzadesa25 °C.La longitudd’onad’excitacióde laThTvaser450nm(espectre
d’emissióde470a530nm),idel’ANSvaserde388nm(espectred’emissióde400a600
nm).Laoberturadelesfinestresd’excitacióiemissió,entotsdoscasos,vaserde10nm,i
esvanregistrar10espectres,obtenint‐nelamitjana.Lesintensitatsvanserquantificades
a482nmperlaThT,ia470nmperal’ANS.Cadacondicióconsistiaentresrèpliquesper
experiment, i sis experiments independents van ser analitzats, obtenint‐ne la mitjana,
desprésdenormalitzarlesdadesusantlamesuraatemps0comareferència.
Durantladesnaturalitzaciótèrmicadelestresmostresaunavelocitatde60°C/h,
esvaseguinlescinètiquesd’unióaThTiANSaunmàximd’emissióde482nmi470nm,
respectivament.
El grapat de bons resultats obtinguts en aquest capítol de la tesi doctoral han estat assolits
gràcies al treball en conjunt amb el meu company de laboratori i futur doctor Geovanny Rivera‐
Hernández. Una col∙laboració mútua, i inicialment necessària per arrencar de zero i tirar
endavant la primera línia d’investigació del nostre grup de recerca, Protein Folding & Stability
Group, sota direcció de la Dra. Sandra Villegas. Els resultats aquí exposats es troben
íntimament lligats, i alguns en formen part, amb la tesi doctoral del meu company Rivera‐
Hernández, G., i, per tant, aquesta serà referenciada al llarg del capítol.
V‐Capítol1 Resultats
127
4. RESULTATS.
4.1. Expressióipurificaciódel’scFv‐h3D6.
Esvadissenyar i sintetitzar (GenScript) el fragment codificantper a l’scFv‐h3D6
(VH‐(Gly4Ser)3‐VL)apartirdelaseqüènciadelanticòsmonoclonalhumanitzath3D6.v2.El
genconsisteixenunfragmentde750pb,amblesdianesdetallespecífiquesdelsenzims
derestriccióNcoI‐NotIalsextrems,peralseuclonatgeavectors.
La quantitat de proteïna scFv recombinant obtinguda després de la seva
purificació, és, en general, molt baixa, degut a les seves propietats de plegament i
estabilitat(Zheng,Baumann&Reymond2003).Seguintamblamateixaproblemàticaenel
nostre grup de recerca, al final del procés depurificació de l’scFv‐h3D6, la quantitat de
proteïnaextretadelafracciócitoplasmàticasolubleerad’aproximadament1mg/mLperL
decultiu.Peraquestaraó,iambladificultatd’iniciarunalíniaderecerca,inicialmentesva
provarunagranvarietatdesistemesd’expressióendiferentssoquesd’E.coli,subclonata
diferents vectors d’expressió, i fusionat a diferents proteïnes tag (Rivera‐Hernandez
2009).Resumidament,elfragmentgènicd’scFv‐h3D6,vaserclonatdinsdevarisvectors
derivatsdel sistemapET,elsquals conteniencuesd’histidines (His‐tag),pèptidssenyals
(DsbA, DsbC o PelB), o bé proteïnes fusió [MBP (maltose‐binding protein), Ztag, GB1
(proteinGB1domain),GST(glutathionetransferasa),trx(tioredoxina),oNusA],aixícomla
dianaespecíficaperalaproteasaTEV.Pelquefaalstipusdesoquesd’E.coli,esvausarla
socaBL21(DE3)perasecretarlaproteïnarecombinantalperiplasma,mentrequelasoca
Origami2(DE3)vaserempradaperalcorrecteplegamentdelaproteïnaalcitoplasma,ja
que afavoreix l’ambient oxidatiu en el citoplasma i facilita el correcte plegament de
proteïnes que contenen ponts disulfur, com ara l’scFv‐h3D6, que enpresenta un a cada
domini.
Malgratlagranvarietatdesistemaprovats,capd’ellsdonavallocaunaproducció
final d’scFv‐h3D6 alta. De totes les possibles construccions, es van seleccionar les dues
següents,totsduesexpressadesenOrigami2(DE3):
‐ (His)6‐trx‐dianaTEV‐scFv‐h3D6de40.6kDa.
Inicialment, es va treballar amb aquesta construcció, obtenint un rendiment d’1
mg/mLperLde cultiude la forma soluble, i aproximadament4mg/mLperLde cultiu
obtingutsapartirdelreplegamentdelafraccióinsoluble.Totiaixò,esvaobservarcerta
proteòlisi inespecíficadurant lapurificació, seguramentdegutaunmalempaquetament
deldomini trx i l’scFv‐h3D6, iquepermetia l’acciód’algunametal·loproteasad’E.coli, ja
queaquestaactivitaterainhibidaambEDTA.
V‐Capítol1 Resultats
128
‐ (His)6‐NusA‐dianaTEV‐scFv‐h3D6de83.4kDa
Comaalternativa,esvatreballarambelconstructedeNusA,ambelqualnoesva
observar cap proteòlisi inespecífica, i es va obtenir un rendimentmés alt a partir de la
fracció soluble, 7 mg/mL per L de cultiu, fent innecessari el replegament de la fracció
insoluble.
4.1.1. Dimeritzacióiformesscrambleddel’scFv‐h3D6.
Es sabut que les molècules d’scFv, en general, tendeixen a dimeritzar per
intercanvi de dominis (o swapping) (Arndt, Muller & Pluckthun 1998). Aquests dímers
cauenentrampescinètiquesdurantelprocésd’expressiódelaproteïnarecombinant,de
formaque,apartdedisminuirelrendimentfinal(alvoltantd’un15%),vasernecessari
unúltimpasdepurificaciópercromatografiad’exclusiómolecular(SEC,Superdex‐75)per
asepararlaformadimèricadelamonomèrica.
Abandadelsdímersd’scFv‐h3D6,undelsprincipals inconvenientsquehahagut
d’afrontar el grup de recerca, i que es troba detallat a la tesi doctoral en redacció de
Rivera‐Hernández, G., i en el treball demàster deBlasco‐Moreno, B. (Rivera‐Hernandez
2009,Blasco‐Moreno2011,Rivera‐Hernandez2013),éslaformaciódeformesscrambled
perpartde l’scFv‐h3D6aïllat. Les formes scrambled són totesaquelles combinacionsen
quèespodenformarelspontsdisulfur,tantnatiuscomnonatius.Enelcasdel’scFv‐h3D6,
trobemquatre cisteïnes susceptiblesde formarpontsdisulfur, per tant existeixen fins a
nouformesscrambledteòriques,talicomesrepresentaalafigura1.1.
Figura1.1.Representacióde lesdiferents formesscrambledde l’scFv‐h3D6.L’scFv‐h3D6, ambquatre
residuscisteïna,dosperdomini(VH,blauiVL,verd),potformarfinsanouformesdiferentsdepontsdisulfur,
sentlaprimera(N)laformanativa.Envermellesrepresentaelconnectorentretotsdosdominis.
V‐Capítol1 Resultats
129
A partir del model 3D de l’scFv‐h3D6, descrit en el Capítol 2 d’aquesta tesi
doctoral,esvaveurequeelspontsdisulfurnatiuss’estableixenentreunacadena‐βmolt
exposada i una altra de molt enterrada, cadascuna situada a una de les fulles‐β que
conformenelbarril‐β, compactanteldomini.Les formesscrambledmodifiquenaquestes
interaccionsintradomini,alterantdràsticamentl’estabilitatglobaldelamolècula,mentre
que el plegament globular no es veu quasi afectat. La presència de formes scrambled
explica les diferents tendències a l’agregació obtingudes amb el mateix scFv‐h3D6,
depenent del sistema d’expressió i purificació emprat. D’altra banda, aquest fet també
explicalaimportantprecipitaciódelamostraalllargdelprocésdepurificació.
Totiquevamsercapaçosdeseparalesformesscrambledobtingudesapartirdel
constructe (His)6‐NusA‐dianaTEV‐scFv‐h3D6, finalment es va optimitzar el protocol de
purificació de l’scFv‐h3D6, evitant la proteòlisi inespecífica, i separant les formes
dimèriques iscrambled,utilitzantel constructe (His)6‐trx‐dianaTEV‐scFv‐h3D6, tal i com
s’haexplicatal’apartatdeMaterialsiMètodes3.1.delCapítol,obtenintunrendimentfinal
de proteïna scFv‐h3D6 pura i nativa de 4 mg/mL per L de cultiu, gràcies a la seva
purificaciópercromatografiadebescanvicatiònic(CEX).La figura1.2‐Amostra l’elució
de l’scFv‐h3D6, el qual està format per dos pics solapats, el primer consisteix en l’estat
natiu iel segonen les formesscrambled.Perdesnaturalització tèrmica(figura1.2‐B)es
pot observar la diferència en la tendència a l’agregació entre totsdos; com tambéde la
fracciósolapada,quemostrauncomportamentintermedi.
Figura1.2. Identificacióde l’scFv‐h3D6natiu i les formes scrambled.A) Separació per cromatografia
d’intercanvicatiònicdelesformanativa(primerpic)ilesscrambled(segonpic),mitjançantungradientlineal
deNaCl.B) Identificació,per fluorescènciadels triptòfans,de la fracciónativa (blau) i les formes scrambled
(vermell).Laregiódesolapamentdepics(verd)téunatendènciaalaagregaciómitja,sentl’estatnatiuelque
necessitamajortemperaturaperagregar.
V‐Capítol1 Resultats
130
Identificar i aïllar les formes scrambled ha estat indispensable per a obtenir uns
resultats físico‐químics raonables i fiables, i per evitar la gran variabilitat experimental
obtingudafinsaleshores.
4.2. Identificaciódel’intermediarid’agregacióWLdel’scFv‐h3D6.
A partir dels anàlisi d’estructura secundària i la desnaturalització tèrmica de
l’scFv‐h3D6,desenvolupats,principalment,pelcompanydelaboratori, idetallatalaseva
tesidoctoralenredacció,Rivera‐Hernández,G.,esvaidentificar,durantlaviad’agregació
induïda per temperatura de l’scFv‐h3D6, l’existència d’un estat intermediari ric en
estructura‐β, i el qual serà determinant en l’estudi de l’efecte de l’scFv sobre la via
d’agregacióamiloidedelpèptidAβ1‐42.
Deformaresumida,l’obtenciódelsespectresdeCD‐llunyàideFTIRvanpermetre
determinarquel’scFv‐h3D6natiuadoptalaestructurasecundàriaenfulla‐βtípicad’Ig.A
mésd’unmínimd’el·lipticitata218nmiunmàxima200nm(Figura1.3), l’espectrede
CD‐llunyàmostraunsegonmínima230nmiunmàxima237nm.Aquestesparticularitats
del espectre poden correspondre a la contribució de les cadenes laterals dels residus
aromàticsi/ocistinil(Byler,Susi1986,Sreeramaetal.1999,Waltheretal.2010).Enelcas
de l’scFv‐h3D6però, ha quedat demostrat que són els residus triptòfan conservats dels
nuclis hidrofòbics els responsablesd’aquestes anomalies (Rivera‐Hernandez et al. 2013,
Montoliu‐Gaia2013)
Figura 1. 3 Espectrede CD alUV‐llunyà de l’scFv‐h3D6 a diferents temperatures. L’espectre a 25 °C
mostra dosmínims d’el·lipticitat (218 nm i 230 nm), i dosmàxims a 200 nm i a 237 nm. Aquest espectre
particularesperdapartirdels60°Cafavordelaconformaciódefulla‐βcanònica(mínima215nm),elquales
mantéa90°Cidesprésdelarenaturalitzacióa25°C(dadesnomostrades).
V‐Capítol1 Resultats
131
Apartirdels60°Cl’espectredeCDnatiuesperdafavordelaconformacióenfulla‐
βcanònica,queésmantéals90°Cialretornarals25°C(dadanomostrada).Elfetdeque,
enlloc d’adoptar el patró de proteïna desplegada (o random coil), s’adopti l’estructura
canònica en fulla‐β (mínim a 215 nm), fa pensar en una agregació ordenada i rica en
estructura‐β,característicadel’agregacióamiloide.
DegutalparticularespectreobtingutperCD,nohaestatpossibledeconvolucionar
loperaobtenirel%d’estructurasecundària.Peraquestaraó,s’harealitzatunanàlisiper
FTIR a diferents temperatures. La figura 1. 4 mostra la deconvolució de l’espectre
d’infraroig a la regiód’amida I’. A25 °C, apareixen tresbandesprincipals localitzades a
1681,1660,i1636cm‐1;iunabandamenora1612cm‐1(figura1.4‐A).Lescomponentsde
fulla‐βantiparal·lelad’altaibaixafreqüència,típiquesdelplegamentd’Igs,éscorresponen
alesbandesde1681i1636cm‐1,respectivament;ielsgirs‐βiloopsescentrena1660cm‐1
(Byler,Susi1986,Waltheretal.2010).
Figura 1. 4. Deconvolució de l’espectre de FTIR de la regió d’amida I’ de l’scFv‐h3D6 a diferents
temperatures.A)L’espectrea25°Cgeneraquatrebandesprincipals,mentrequel’espectrea60°C(B)genera
finsavuitbandesdiferents.Labandavermelladiscontinuaindicalacomponentenagregats‐βa1626cm‐1.
L’espectredeFTIRa60°C(Figura1.4‐B),generabandesaddicionalsalestípiques
delplegamentd’Igadquiridesa25°C,quedisminueixenelseutantpercent,sobretot la
component en fulla‐β antiparal·lela nativa (1636 cm‐1) i els loops/girs‐β (1660 cm‐1). El
canviméssignificatiua60°C,ésl’apariciódelabandaa1626cm‐1, laqualjahaviaestat
V‐Capítol1 Resultats
132
reportada com a correspon a les fibres WL (Jahn, Tennent & Radford 2008). A part,
l’incrementdelabandaa1615cm‐1,corresponentafibresamiloides(Zandomeneghietal.
2004),vafernecessaricomprovarperassajosd’agregació(ThTiANS)iperTEMeltipus
d’agregatsdel’scFv‐h3D6.
Lafigura1.5‐Amostraladesnaturalitzaciótèrmica,seguidaperCD,iquedescriu
una transició conformacional de l’scFv‐h3D6 als 60 °C. Elmínim a 218 nm, augmenta a
partir dels 45 °C, de talmanera que el plegament guanya contingut en fulla‐β. A 60 °C,
però,esdevéunatransicióenlaqualesperdpartd’aquestaestructura‐βadquiridaapartir
del’estatnatiu,ielsenyals’estabilitzapersobredels65°C.Lamodificacióconformacional
descritapertemperatura,s’associaaunareestructuraciódelafulla‐βnativa,sensepassar
per un estat desplegat, donant lloc a una agregació parcial i la conseqüent pèrdua del
senyal. Aquesta reestructuració dóna lloc a l’aparició, als 60 °C, d’un estat intermediari
d’unaviad’agregació,elqualseràelprecursordelsagregatsdel’scFv‐h3D6.
Figura 1. 5. Desnaturalització tèrmica de l’scFv‐h3D6. A) Desnaturalització tèrmica per CD seguint el
mínim d’el·lipticitat a 218 nm. B) Desnaturalització tèrmica seguint el desplaçament del màxim de
fluorescènciaa338nm,aunaconcentracióde20μM(negre)i2μM(gris).
Les fibres amiloides i lesWLsón formadesapartirdediferentsviesd’agregació
que porten a un estat final diferent: les amiloides són rectes i llargues, i segueixen una
cinèticadepenentdenucleació,mentrequelesfibresWLsóncorbadesicurtes,iesformen
seguint una cinètica independent de nucleació (Gosal et al. 2005). La desnaturalització
tèrmica (Figura 1. 5‐B), seguida per fluorescència, a dues concentracions de proteïna
V‐Capítol1 Resultats
133
diferents(2 i20μM),mostra lamateixatransicióa60°C, i lespendentsabansidesprés
d’aquestpuntnoesveuenalteradesperlaconcentraciódeproteïna,laqualcosaimplica
que l’agregacióde l’scFv‐h3D6 segueixuna cinèticanodepenentde concentració , o, dit
d’unaaltramanera,denucleació, i,pertant, les fibres formadesper l’scFv‐h3D6,sóndel
tipusWL.
Uncopidentificatelplegamentnatiudel’scFvilasevaviad’agregacióiniciadaper
un intermediari tèrmic, ja es pot assajar i entendre el seu efecte sobre la toxicitat del
pèptidAβ1‐42acondicionsfisiològiques.
4.3. Prevenciódelatoxicitatdel’Aβ1‐42perl’scFv‐h3D6.
Primerament, es va determinar la concentració òptimadepèptidAβ1‐42, en estat
oligomèric,peragenerarmàximatoxicitatenlalíniacel·lulardeneuroblastomahumàSH‐
SY5Y,determinatpelmètoded’MTT.Lafigura1.6‐Amostraque10i20μMdepèptidAβ1‐
42sónlesconcentracionsmésefectivesperareduirlaviabilitatdelcultiucel·lular, finsa
un60%.
Figura 1. 6. Assaig de viabilitat perMTT de la línia cel·lular de neuroblastoma humà SH‐SY5Y. A)
ToxicitatinduïdaperdiferentsconcentracionsdepèptidAβ1‐42.*P≤0.068comparatambel0μMd’Aβ1‐42.B)
Recuperació de la viabilitat cel·lular en presencia de 10 μM de pèptid Aβ1‐42 per addició de diferents
concentracionsd’scFv‐h3D6.S:10μMscFv‐h3D6sensepèptidAβ1‐42;B:tampó(sensescFv‐h3D6niAβ1‐42).*P
≤0.068comparatambel0μMd’scFv‐h3D6.Lesbarresd’error signifiquen±S.E.M.La significançahaestat
calculadausanteltestderangssignatsdeWilcoxonperaquatreexperimentsindependents,isisrepliquesde
cadacondicióperexperiment.
V‐Capítol1 Resultats
134
Amesuraquedisminueixlaconcentraciódepèptid,laviabilitatcel·lularaugmenta
quasiproporcionalment,assolintjael100%aconcentracionsmoltbaixes(0.01μM),ones
podriaconsiderarqueelpèptides trobaen formamonomèricano tòxica,malgrathaver
induïtlaoligomerització.
Elfetdequelaconcentraciódepèptida20μMnosiguiméstòxicaquea10μM,pot
resultar contradictori,peròcobra sentit si s’observadesdel puntdevista cinètic.Auna
major concentració, la via d’agregació és troba desplaçada cap a la formació de fibres
amiloides, enlloc de poblar espècies oligomèriques citotòxiques, ja que la cinètica de
formació de fibres amiloides segueix un procés depenent de nucleació, i per tant, de la
concentracióinicialdeformesmonomèriques.
Apartird’aquestprimerresultat,s’haempratlaconcentraciódepèptid10μMamb
l’objectiuderevertir la toxicitatdelpèptidAβ1‐42.Per incubacióa37°C,durant3h,s’ha
induïtlaoligomeritzaciódelpèptidAβ1‐42,coincubatambconcentracionscreixentsd’scFv‐
h3D6.Amés,comacontrolpositiu, i conscientsde la tendènciaa l’agregaciódelmateix
scFv‐h3D6, aquest també ha estat sotmès, individualment, a les condicions
d’oligomerització,pertaldedemostrarquenogeneratoxicitat.
Talicommostralafigura1.6‐B,l’scFv,aunaconcentracióigualaladelpèptid(10
μM), no produeix cap efecte citotòxic sobre les cèl·lules, donant lloc a un 100 % de
viabilitatrespecteelblancdePBS.Lacombinaciódetotesduesmolècules,elcomplexAβ1‐
42‐scFv‐h3D6, recupera la viabilitat cel·lulard’unamaneradepenentde concentració. La
relació2:1,ésadir,10μMd’Aβ1‐42/5μMd’scFv‐h3D6,éssuficientperaobservarunefecte
significatiudel’scFvsobrel’Aβ1‐42.Aconcentracionsequimolars,pràcticaments’anul·lala
toxicitatinduïdapelpèptidAβpercomplet.
Degutalpotencialterapèuticdell’scFv‐h3D6,ésnecessariaprofundirenelscanvis
conformacionalsqueprovoquen laprevencióde la toxicitatde l’Aβ1‐42perpartd’aquest
fragment d’anticòs. Donat que l’Aβ1‐42 segueix la via amiloide, i l’scFv segueix la via de
fibresWL,talicoms’hadescritanteriorment,resultaindispensableestudiarambduesvies
demisfoldingperseparat,iaixípoderestudiarientendredetalladamentqueesdevéquan
esformaelcomplexAβ1‐42‐scFv‐h3D6.
V‐Capítol1 Resultats
135
4.4. MisfoldingdelpèptidAβ1‐42.
A partir de que va ser establert que l’anticòs monoclonal sencer mAb‐h3D6
reconeixespecíficamentelsoligòmersd’Aβ(Jacobsen2006,Wisniewski,Konietzko2008,
Nitsch, Hock 2008), els quals són els precursors de les fibres amiloides i les espècies
citotòxiques,vamdecidirtreballarsotacondicionsenlesqualss’induísl’estatoligomèric
delpèptidAβ1‐42.Laidead’arribaratractarratolinsinvivo,ensvaacabardedecantarper
optimitzaraquestescondicionsalesfisiològiques.Finalment,l’agregaciódelpèptidabans
deserafegitalcultiucel·lular,odemesclar‐loambl’scFv‐h3D6,haestatentampóPBS,pH
7.4, durant 3 h a 37 °C. Mitjançant TEM, es va demostrar que, en aquestes condicions,
realmentesformenelsoligòmersd’Aβ(Figura1.7‐A).
TalicomesveuperlesimatgesdeTEM,elsoligòmersd’Aβsónvisualitzatsdesdel
momentenqueelfilmdepèptidésresuspèsenDMSOitampóPBS(veureapartat3.4de
MaterialsiMètodesdelcapítol),iesmantenenalllargdelaincubacióa37°Csenseindicis
de formació amiloide. Això no vol dir que ens trobem fora de la via amiloide, ja que el
tractamentdelamostraaelevadatemperatura,60i90°C,indueixlaformaciódefibres.
ElstractamentsadiferentstemperaturesutilitzatsperalesimatgesdeTEM,també
vanserempratsperaquantificaciól’agregaciódelpèptidperfluorescència,atravésdela
sevaunióals fluoròforsThTiANS.LaThTésconsideratunmarcadorespecíficdefibres
amiloides (Naiki et al. 1989), mentre que l’ANS és usat, extensament, degut a la seva
capacitatd’unir‐searegionshidrofòbiquesdeproteïnes(Ray,Singh&Balaram2001).
Enlescondicionsenlesques’hatreballat,elpèptidAβ1‐42inicialmentjauneixcerta
ThT, i augmenta la fluorescència d’aquesta a mesura que s’allarga la incubació a 37 °C
(Figura1.8‐A).A60°C, tot iqueperTEMjas’haviadetectat lapresènciadecomponent
fibril·lar,launióaThTsegueixsentlamateixaquea48ha37°C.Ésambeltractamenta
90°C,quanaugmentalafluorescènciapràcticamenteldobledelsenyalanterior.Pelquefa
alafluorescènciadel’ANS,esdetectennivellsd’uniómoltbaixos,inclúsdesprésd’escalfar
elpèptid(Figura1.8‐B).Aquestsresultatsindiquenque,efectivament,elpèptidAβ1‐42,es
trobadinslaviad’agregacióamiloide.
V‐Capítol1 Resultats
136
Figura1.7.FormaciódefibresamiloidesiWLperpartdel’Aβ1‐42,l’scFv‐h3D6ielcomplexAβ1‐42:scFv‐
h3D6,en funcióde la temperatura i lapresenciadeDMSO. Imatges adquiridesper TEMdeA) 100μM
d’Aβ1‐42, B) 100 μMd’scFv‐h3D6, C) 100 μMd’scFv‐h3D6 en absència deDMSO,D) 100 μMd’Aβ1‐42:scFv‐
h3D6,adiferentstempsi temperaturesd’incubació.A)Elsoligòmerscitotòxicsd’Aβ1‐42sónvisualitzatsa37
°C,iescalfantamajorstemperaturess’indueixlaformaciódefibresamiloides.B)L’scFv‐h3D6noformafibres
WLenpresenciadeDMSO.C)L’scFv‐h3D6enabsènciadeDMSOformapetitsoligòmersa37°C,ia60°C(onla
població de l’intermediari tèrmic és més màxima) s’inicia la formació fibres WL, que es troben més
estructuradesa90°C.D)ElcomplexAβ1‐42:scFv‐h3D6formadirectamentfibresWLa37°C,iatemperatures
majorséstrencaelcomplex,donantllocaprotofilamentsamiloidesioligòmers.Labarraindica20nm.
V‐Capítol1 Resultats
137
4.5. Misfoldingdel’scFv‐h3D6.
Talicoms’hamencionatanteriorment,pertractamenttèrmic,l’scFv‐h3D6iniciala
viad’agregaciócaracteritzadaperunintermediariricenestructura‐β,elqualdónalloca
agregatsenformadefibresWL.Inesperadament,aquestesfibresWLnosónvisualitzades
per TEM, quan l’scFv‐h3D6 és assajat individualment, sinó que apareixen espècies
oligomèriquesentoteslescondicionstractades(Figura1.7‐B).
Ésimportantmencionarque,totselsexperimentsrealitzatsperdeterminarl’efecte
del’scFv‐h3D6sobrelatoxicitatil’agregaciódelpèptidAβ1‐42,contenenun2%deDMSO
durantlaincubació(0.2%DMSOalesmostresfinals),amblafinalitatdepodercomparar,
adequadament, els resultats obtinguts amb el pèptid Aβ, el qual, inevitablement, conté
aquesttantpercentdeDMSO(veureapartat3.4deMaterialsiMètodesdelcapítol).Pera
comprovarfinsaquinpuntelDMSOpotinterferiralaviad’agregaciódel’scFv‐h3D6,esva
decidir visualitzar perTEM el procés en absència deDMSO. Com era d’esperar, quan el
DMSOnoéspresentalamostrad’scFv‐h3D6,lesfibresWLapareixenuncoplamostraha
estatincubadaa60°C,iresultenmésevidentdesprésdeltractamenta90°C(Figura1.7‐
C). Aquest resultat, a més, concorda amb l’anàlisi de FTIR discutit anteriorment, on la
bandacaracterísticadefibresWLapareixals60°C(Figura1.4‐B).
Figura1.8.Assaigd’agregacióper fluorescènciadeTioflavinaT iANS.Estudide l’agregaciódelpèptid
Aβ1‐42,l’scFv‐h3D6,idelcomplexAβ1‐42:scFv‐h3D6peruniódelfluoròforTioflavinaT(A)iANS(B),adiferents
tempsitemperaturesd’incubació.Lesbarresd’errorsignifiquen±S.E.M.
V‐Capítol1 Resultats
138
Pelquefaalafluorescència,l’scFv‐h3D6sol,nouneixThT,ilatemperaturaindueix
uncertaugmentdelsenyal,especialmentalatemperaturaenlaquals’indueixlaformació
de l’estat intermediari (Figura 1. 8‐A). L’ANS, en canvi, emet fluorescència en totes les
condicions,tambédeformamésnotòriaquanl’intermediariéspresent(Figura1.8‐B).El
comportament d’ambdues fluorescències és pràcticament igual en absència de DMSO
(dadesnomostrades),dadaque fapensarque tant laThTcom l’ANSnosóncapaçosde
distingirentreoligòmersifibresWLformadesperl’scFv‐h3D6.
Figura1.9.Assajosd’agregacióinduïdapertemperaturaperfluorescènciadeTioflavinaTiANS.Estudi
del’agregaciódelpèptidAβ1‐42,l’scFv‐h3D6,idelcomplexAβ1‐42:scFv‐h3D6seguintelmàximdefluorescència
delaTioflavinaTa482nm(A),ielmàximdel’ANSa470nm(B),amesuraqueaugmentalatemperatura.
Amb la intenció de confirmar la importància de l’intermediari, induït per
temperatura,dins laviad’agregacióde l’scFv‐h3D6,s’haassajat launiódeThT iANSen
funciódelatemperatura,isenseagitació(Figura1.9‐A,B).Efectivament,a60°C,totsdos
fluoròforsuneixenl’estatintermediarii,amajortemperatura,elsenyalesperddegutala
formaciód’agregatsinsolubles.
4.6. MisfolgingdelcomplexAβ1‐42‐scFv‐h3D6.
La coincubació del fragment d’anticòs scFv‐h3D6 amb el pèptid Aβ1‐42, en una
relacióequimolar,preveulaformaciód’oligòmersd’Aβi,alseulloc,inicialaformacióde
fibresWL,talicoms’observaperTEM(Figura1.7‐D).Ales3ha37°C,lesfibresWLja
sónformades,pertant,aquestahaestatlacondicióusadaperalsassajosdecitotoxicitat,i
V‐Capítol1 Resultats
139
onlatoxicitatdelsoligòmersd’Aβhaestatrevertida(Figura1.6‐B).QueelcomplexAβ1‐
42:scFv‐h3D6 segueix la via d’agregació WL, resulta més evident a llargs períodes
d’incubació(48ha37°C).
Quanelcomplexassoleixels60°C, temperaturaen laqualapareix l’intermediari
d’agregaciódelscFv‐h3D6quanaquestésincubatenabsènciadepèptidAβ1‐42,elcomplex
esdissocia,ials90°C,apareixentantprotofilamentsamiloidescomoligòmers.Teninten
compteque les fibresWLsónespèciesatrapadescinèticament, la temperaturadespobla
aquestestat,alliberantoligòmersd’AβlliuresipermetentqueelpèptidAβ1‐42retorniala
sevaviaamiloide.
Al contrari del que passa amb l’scFv‐h3D6 aïllat, quan es mesclen totes dues
molècules, la unió a ThT i ANS augmenta progressivament a mesura que augmenta la
temperatura, especialment als90 °C (Figura1. 8‐A,B).Aquest resultat concordaamb la
presènciadefibresWLabansd’escalfar,lesqualséssabutqueuneixentotsdosfluoròfors
(Ray, Singh& Balaram 2001, Gosal et al. 2005); i amb la presència d’oligòmers i fibres
amiloides,uncopescalfats.
Per tant, sembla a ser que, tot i que la formació de fibresWL és una propietat
intrínseca de l’scFv‐h3D6, aquelles que resulten del complex Aβ1‐42‐scFv‐h3D6 sónmés
estables que les formades per l’scFv‐h3D6 sol, perquè apareixen sense necessitat de
tractamentambtemperaturai,amés,esformensotalapresènciadeDMSO.
V‐Capítol1 Discussió
141
5. DISCUSSIÓ.
EnaquestCapítol1,s’hadescritlaproduccióiladeterminaciódelaviad’agregació
de l’scFvdissenyatapartirde la seqüènciad’unmAbd’interès terapèuticpera l’AD.La
immunitzaciópassivaambscFvesdevéunaestratègiaterapèuticaatractivadegutaqueno
produeixelsefectessecundarisinesperatsqueprovocal’administraciódelanticòssencer
i,al’hora,mantél’efectivitatd’aquest.
5.1. Expressiódel’scFv‐h3D6il’activitatdelaxaperonatrx.
Avui endia, laproducció recombinantde fragmentsd’scFvesdevépocefectiva, ,
deguta ladificultatdeplegamentdelsdosdominisambpontdisulfur ia lapresènciade
cincresidustriptòfan.Enaquest treball s’hanobtingut, finalment,quantitatsacceptables
d’scFv‐h3D6 a partir del replegament de la fracció insoluble obtingudadins del sistema
d’expressiód’E.coliOrigami2(DE3)ilaproteïnadefusiótrx,posteriormenteliminadaper
la proteasa específica TEV. La tioredoxina (trx), ha estat emprada satisfactòriament per
l’expressió ipurificaciód’altresmolèculesd’scFv, i lasevacapacitathaestat relacionada
amblasevaactivitatxaperona,mésqueambl’activitatcomadisulfur‐isomerasa(Jurado,
deLorenzo&Fernandez2006).Altressistemesd’expressió,comara,laproteïnadeNusA,
han donat alts rendiments de proteïna scFv‐h3D6 citoplasmàtica soluble, tal i com
s’explica a la tesi en redacció de Rivera‐Hernández (Rivera‐Hernandez 2009, Rivera‐
Hernandez2013),obtenintfinsa7mg/mLperLdecultiu.Peròlapresènciadelesformes
scrambleddifícilsdeseparardelaformanativaemprantaquestsistemad’expressió,hafet
queelreplegamentdelafraccióinsolubleapartirdetrxsiguilamanerad’obtenirl’scFv‐
h3D6 totalment pur i en el seu estat natiu, necessari per a una alta fiabilitat i
reproductivitatdelsexperimentsdutsaterme.
5.2. Perfildeplegamentdel’scFv‐h3D6sotapertorbaciótèrmica.
L’scFv‐h3D6mostralatípicaestructurasecundàriadelplegamentd’Ig,ambun60
%decomponentenfulla‐βantiparal·lelaiun30%deloops/girs‐βsegonsladeconvolució
dels espectres de FTIR, i mostra un espectre de CD anòmal, també reportat en altres
estudis d’scFv o dominis VL (Sreerama et al. 1999, Baden et al. 2008a, Jahn, Tennent&
Radford2008).
La desnaturalització tèrmica de l’scFv‐h3D6dóna lloc a agregació, tal i com s’ha
pogut veure per CD i fluorescència dels triptòfans. En el punt mig de la transició del
espectre de CD, que correspon als 60 °C, es pobla un estat intermediari amb una
V‐Capítol1 Discussió
142
conformació similar a l’adquirida per l’estat agregat, a 90 °C. Aquest intermediari és
generatperunareorganitzaciódirectadel’estatnatiu,pertant,noésnecessaripassarper
un estat desplegat per tal de saltar de l’embut de plegament natiu al d’agregació.
L’intermediari,ricenestructura‐β,s’acumulaindependentmentdelaconcentració,seguint
unacinèticanodepenentdenucleació.Amés,perTEMs’hacomprovatquel’agregacióper
temperaturade l’scFv‐h3D6esdevéen la formacióde fibresWL,enllocde formar fibres
amiloides.És sabutque les fibresWLsegueixenunacinètica independentdenucleació i
queuneixen tantThTcomANS (McParlandet al.2000,Gosal et al.2005).L’espectrede
FTIRcorroboralaformaciódefibresWL,ambl’apariciódelabandaa1626cm‐1,similara
la de 1622 cm‐1 característica de les fibresWL de la proteïna β2‐microglobulina (Jahn,
Tennent&Radford2008).
Latendènciaal’agregaciópertemperaturadelsscFvhaestatprèviamentreportat
peraltresestudis(Worn,Pluckthun1999,Pedrosoetal.2002).Altresproteïnes,ambun
plegamentsimilaral’scFv,tambéagregueninvivoformantfibresamiloides,coméselcas
de les cadenes lleures d’Ig, especialment aquelles que es troben en forma de domini
variable aïllat (VL) (Baden et al. 2008a), o bé la ja mencionada β2‐microglobulina
(McParland et al. 2000), que per a que formi fibres WL, enlloc d’amiloides, requereix
d’unescondicionsdepHàcidod’elevadaforçaiònica(Gosaletal.2005).
L’apariciódelagregatsWLformatsacondicionsfisiològiqueshaestatdescritaper
primeravegadaenaquesttreballdetesi.
5.3. Efectedel’scFv‐h3D6sobrelafibril·lacióicitotoxicitatdelpèptidAβ1‐42.
Jaavuiendia,ésevidentqueuntractamentterapèuticqueredueixilesfibresd’Aβ
a costa d’augmentar les espècies no fibril·lars, incloent els β‐oligòmers, pot resultar
perjudicial(Chengetal.2007).L’anticòsmonoclonalapartirdelquals’haderivatl’scFv‐
h3D6reconeixespecíficamentelsoligòmersd’Aβ(Jacobsen2006).
Quanelcultiucel·lularéstractatambmostresinduïdesal’oligomerització,l’scFv‐
h3D610μMnoprodueixcapefecte,elpèptidAβ1‐4210μMredueixlaviabilitatal60%,ila
coincubaciódel’scFv‐h3D6ambelpèptidAβanul·laelseuefectetòxicsobrelescèl·lules
d’unamaneradepenentdeconcentració.Enlescondicionsempradesenaquestestudiper
alsassajosdecitotoxicitat, elsoligòmersd’Aβsón formats, tal i coms’hacomprovatper
TEM.ElfetdequelesfibresWLesformenalmesclarelpèptidAβambl’scFv‐h3D6,sense
lanecessitatdequel’scFv‐h3D6jaestrobienlaviaWL(perprèviaincubacióa60°C),ien
presència de DMSO, implica que les fibres WL són cinètica i termodinàmicament més
favorablesquanl’scFv‐h3D6atrapaelsoligòmersd’Aβ.
V‐Capítol1 Discussió
143
Figura1.10.Diagramaenergèticdelaviad’agregaciódelpèptidAβ1‐42,del’scFv‐h3D6,idelcomplex
Aβ1‐42:scFv‐h3D6.A)A37°C(→),elpèptidAβ1‐42segueixlaviaamiloideatravésdelaformaciód’oligòmers
tòxics(O),il’scFv‐h3D6(S)segueixlaviaWLatravésdelaformaciód’oligòmersnotòxics(sO).Ésnecessari
un tractament amb temperatura (⇢) per a convertir els oligòmers d’Aβ en fibres amiloides (AF), i els
oligòmersde l’scFv‐h3D6 (sO) en fibresWL, en aquestúltim cas en absènciadeDMSO.B)El complexAβ1‐
42:scFv‐h3D6directament forma fibresWL, i lasevadisrupcióper temperatura(⇢)generasOpera l’scFv‐
h3D6,mentrequeelpèptidAβ1‐42retornacapalaviaamiloide,formantoligòmers(O)ifibres(AF).
Pertemperaturaelevada,lesfibresWLesdevenendespobladesperdissociaciódel
complexi,llavors,apareixenfibresamiloidesioligòmers.Aixòimplicaquelatemperatura
desplaçaalpèptidAβ1‐42capaforadelaviaWL,retornantcapa laviaamiloide;mentre
que l’scFv‐h3D6 segueix a la viaWL en forma d’oligòmers (Figura 1. 10). Com ha estat
demostrat en aquest treball, la presència de traces deDMSO, inherents al pèptidAβ1‐42,
evitaquel’scFv‐h3D6formifibresWL.
Apartdelsdetallsdelaviad’agregació,laconclusiómésrellevantd’aquesttreball
de tesidoctoralésque,encondicionsnatives, l’scFv‐h3D6 inhibeix la formacióde fibres
amiloidesilacitotoxicitatdelpèptidAβ1‐42mitjançantlaretiradadelsoligòmersd’Aβdela
viaamiloide.Ladescripciódelmecanismepelquall’scFv‐h3D6actuacontralatoxicitatdel
pèptidAβobreunanovaviaperamillorar,enunfutur,elseupotencialterapèutic.
5.4. Efectedel’scFv‐h3D6invivo.
Pelquefaalefectedel’scFv‐h3D6invivo,uncopdemostradal’efectivitatdel’scFv‐
h3D6encultiuscel·lularsilanecessitatd’eliminarlafracciód’LPSsdelamostra,elnostre
grupderecercaencol·laboracióamblaDra.Giménez‐Llort,L.(Gimenez‐Llortetal.2013),
va testarel seupotencial terapèuticenratolins triple‐transgènics3xTg‐AD,modelsd’AD
de5mesosd’edat,quecorresponaestadisinicialsdelamalaltia.Elsresultatsobtinguts,
V‐Capítol1 Discussió
144
detallats en la tesi doctoral en procés de Rivera‐Hernández, G., demostren que el
tractament amb l’scFv‐h3D6 s’ha de considerar una potent estratègia terapèutica en el
futurdel’AD.L’scFv‐h3D6milloralacapacitatcognitiva,reverteixelssímptomesBPSD‐like
(Behavioral and Psychological Symptoms of Dementia) (Gimenez‐Llort et al. 2007), i
eliminaelsoligòmersd’Aβdel còrtex idelbulbolfactoridels ratolins3xTg‐AD, lesdues
àrees cerebrals més sensibles a acumular β‐oligòmers durant els primers estadis de la
demència. Amés a més, l’scFv‐h3D6 restaura els nivells de la xaperona clusterina i de
l’ApoE, augmentats en el còrtex dels ratolins 3xTg‐AD. Cal remarcar que l’augment dels
nivells d’ApoE es troba directament relacionat amb els processos neuroinflamatoris
diagnosticats en pacients d’AD tractats amb l’anticòsmAb sencer (Kim et al. 2011). La
clusterina (o ApoJ), inhibeix la formació de fibres amiloides, unint‐se a ells
hidrofòbicament, i forma complexes estables amb els oligòmers d’Aβ (Humphreys et al.
1999).Amés, recentmenthemdemostratqueel nombredemacroneuronesdel cerebel
delsratolins3xTg‐ADestàmoltreduït,iquel’scFv‐h3D6protegeixaquestesneuronesde
lamort(Esquerda‐Canalsetal.2013,Esquerda‐Canals2013).
Pel que fa als mutants C‐terminals de l’scFv‐h3D6, descrits en el Capítol 2
d’aquesta tesi doctoral, i la seva futura administració en ratolins 3xTg‐AD, s’espera que
l’incrementdel’estabilitatiladisminuciódelatendènciaal’agregacióincrementinlavida
mitjai,conseqüentment,quel’scFv‐h3D6siguiefectiuadosisencaramésbaixesqueladel
WT.
CAPÍTOL 2: Modelatge tridimensional d’un fragment
variablede cadena senzilla (scFv‐h3D6)específic contra
elpèptidAβ1‐42iredissenyracionaldelamolècula.
ARTICLESRELACIONATS:
ElongationoftheC‐terminaldomainofananti‐amyloidAβsingle‐chainvariablefragmentincreasesitsthermodynamicstabilityanddecreasesitsaggregation
tendency
Rivera‐Hernández,G.*,Marin‐Argany,M.*,Blasco‐Moreno,B.,BonetJ.,OlivaB.&Villegas,S.
mAb5:5,678–689(doi:10.4161/mabs.25382)2013
*Firstco‐author
V‐Capítol2 Resum
147
1. RESUM.
Laprimerareferènciaescritasobrel’efectivitatdel’immunoteràpiaAβenratolins
PDAPP va obrir la possibilitat de tractar la malaltia de AD. Els fragments variables
d’anticossosdecadenasenzilla(scFv),formatsperlauniódelsdominisVHiVLd’Ig,també
semblen ser una teràpia efectiva en models animals, amb l’avantatge de no activar la
micròglia.Amés,comparant‐losambl’anticòssencer,mostrenunamillorfarmacocinètica
ipodenserre‐dissenyatsracionalment.
Comalternativainicialal’obtenciódelcristalliperincompatibilitatamblatècnica
deespectroscòpiad’RMNensolució,degutalagrandàriadelamolècula,s’haobtingutun
model de la estructura tridimensional de l’scFv‐h3D6 específic contra el pèptid Aβ, un
treball presentat a la memòria del màster en Bioquímica i Biologia Molecular (Marin‐
Argany 2009). Com a estructura motlle s’ha emprat un scFv humanitzat, d’estructura
cristal·litzada i dipositada al Protein Data Bank, i amb la major homologia seqüencial.
L’scFvcontraelreceptordelcoronavirusSARS(pdb2GHTrp:B)mostraun70%d’identitat
seqüencial, i un94%d’homologia, amb l’scFv‐h3D6.AmbMODELLER s’han obtingut les
coordenadesde5possiblesmodelsi,ambProsa,esvaescollirelmodelòptim.Lapseudo‐
energia és mínima en les regions FR i màxima en les CDRs, en concordança amb la
flexibilitatnecessàriaperaformarelcomplexantigen‐anticòs.
Amblescoordenadesdelmodel,se’nhaderivatinformaciósobrel’accessibilitatal
solvent dels diferents residus, els contactes intramoleculars i un scanning de totes les
mutacions possibles a les diferents posicions. A més, amb la seqüència primària, s’ha
obtingut un perfil de la tendència a l’agregació i un alineament amb altres molècules
d’scFv. Tota aquesta informació ens ha permès proposar una sèrie de mutacions,
dissenyades per augmentar la solubilitat de la molècula i/o per trencar la tendència a
l’agregació,quehandepermetreaconseguirunaltrendimentenl’obtenciód’aquestscFv
depossibleaplicacióterapèuticaenhumans.
V‐Capítol2 Introducció
149
2. INTRODUCCIÓ.
La cristal·lografia de raigs‐X és l’eina més poderosa per a obtenir l’estructura
tridimensionaldeproteïnes.Totiquehamilloratmoltdesdequeesvaobtenirelprimer
cristalldemioglobina (Phillips, Schoenborn1981), l’any1969, l’obtencióde cristalls i la
interpretaciódelsresultatsfandifícilaquestatècnica(Jones,Thirup1986).D’altrabanda,
la tècnica de espectroscòpia d’RMN en solució, molt útil tant per a obtenir l’estructura
tridimensional de proteïnes comper amesurar la seva dinàmica conformacional, té les
limitacionsdelagrandàriailapertorbacióperpartdelsagregats(Wuthrich2001).
En els últims anys, la proteòmica estructural (cristal·lografia de raigs‐X i
l’espectroscòpia d’RMN a gran escala) han permès avançar notablement en el camp de
l’estructuraterciàriadeproteïnes.Actualment,s’handipositatmésde90.000estructures
enelProteinDataBank(PDB),labasededadesinternacionalperacol·lecciód’estructures
proteiquesobtingudesperdifraccióderaigs‐XiperRMN(Bermanetal.2007)(figura2.
1).Totiaixò,elnombredeproteïnescristal·litzadesésdosvegadesinferioralnúmerode
seqüènciestrobadesalesbasesdedadesdeSwiss‐protiTrEMBL(Kopp,Schwede2004).
Davant d’aquest dèficit d’informació, els mètodes computacionals per a la predicció
d’estructuraterciàriahanpermèsferunsaltenl’estudideproteïnes.
Figura2.1.EvoluciódelesestructuresproteiquesdipositadesenelPDB,iquehanestatdeterminades
mitjançantlestècniquesdecristal·lografiaderaig‐X,RMNimicroscòpiaelectrònica(dadesextretesde
http://www.wwpdb.org).
V‐Capítol2 Introducció
150
La semblança estructural entre proteïnes diferents es troba íntimament
relacionadaamblasevafunció.Malgratqueexisteixenmésfamíliesdeproteïnesquetipus
deplegaments,cadaunad’ellesescaracteritzaperadoptarunplegamenttridimensional
adaptat a les funcions que realitzen. Un exemple seria la família d’Igs, els dominis dels
quals es pleguen en conformació barril‐β. També és possible, peròmenys freqüent, que
proteïnessensecaprelacióbiològica,presentinunaconformaciótridimensionalsemblant.
Elplegamentd’unaproteïnavedeterminatperlespropietatsdelaseqüènciad’aminoàcids
que la composen i, per tant, proteïnes amb una seqüència semblant tendeixen a una
estructuratridimensionalsimilar(Chothia,Lesk1986).Percomparaciódeseqüènciesde
diferentsproteïnes,espodenidentificarcombinacionsparticularsd’aminoàcidsquesovint
impliquendeterminatspatronsestructuralsAixòsignificaque,alapràctica,sil’estructura
d’unaproteïnahaestatdeterminadaexperimentalment(percristal·lografiaidifraccióde
raigs‐X), llavors larestademembresde lamateixa famíliapodensermodeladesapartir
d’aquesta.
L’alineamentmúltipleilarecercadeseqüèncieshomòloguesenelPDBéslabase
del modelatge tridimensional de proteïnes, amb el qual es comparen multitud de
seqüènciesd’estructuraconegudais’identificalademajorgraud’identitat,laqualservirà
com amotlle de la proteïna problema. Existeixen diferents tipus d’alineamentmúltiple
però elmés habitual és elmètode heurístic, com ho són els algoritmes BLAST i FASTA
(Altschuletal.1990,Pearson1990).Aquestmètodeesbasaendelimitarelrangderecerca
dedadesmitjançant l’aplicacióde filtresdeselecció,de formaques’optimitza larecerca
d’homologiadinslaimmensitatdeseqüènciesdepositadesenlesbasesdedades,iqueva
enaugment(Leach2001).
La predicció d’estructura per homologia de seqüència resulta molt útil com
alternativa a l’obtenció del cristall de proteïna, o per proteïnes que no poden ser
analitzadesperRMNen soluciódegut a la seva grandària, comés el casdels fragments
variablesd’anticossosdecadenasenzilla(scFv).Laqualitatdelmodelatgetridimensional
ésequiparablealacristal·lografiaderaigs‐Xdebaixaresolucióoalsespectresd’RMNde
resolució mitja. Aproximadament, el 70 % de les seqüències conegudes es poden
comparar, comamínim,ambunade lesproteïnesd’estructuraconegudadepositadesal
PDB.
Unmodelcomparatiuimplicaassignaruntipusdeplegamental’objected’estudia
partir dels ja dipositats en el PDB. Un cop seleccionades les proteïnes d’estructura 3D
coneguda,calrealitzarunalineamentmúltipled’aquestesseqüenciesamblaproblemaper
taldedeterminarlamillorcorrespondènciaentreresidus.Ambl’alineamentil’estructura
motlle,esconstrueixunmodelteòrictridimensionaldelaproteïnaenqüestiófentúsde
V‐Capítol2 Introducció
151
mètodes bioinformàtics, com ara el softwareMODELLER9v2. Finalment, elmodel ha de
ser avaluat, refinat i caracteritzat considerant els criteris estructurals i energètics
necessaris(Sanchezetal.2000,Fenyö2010).
Existeixenunagranquantitatdeprogramescomputacionalsiservidorsd’internet
queautomàticamentprocessenmodelatgetridimensional.Tot isermoltútils,elsmillors
resultatss’obtenenemprantmètodesdeprogramacióbioinformàtica.
En aquest capítol, i en relació amb el capítol anterior, s’ha modelat l’estructura
tridimensionald’unscFvespecíficcontraelpèptidAβ,l’scFv‐h3D6(Marin‐Argany2009).
Els experiments i resultats aquí exposats, han estat realitzats en col·laboració, i durant
l’estadad’unmes,ambelgrupderecercadeBioinformàticaEstructural,dirigitperelDr.
Oliva,B.,delCentredeRecercaBiomèdicdeBarcelona(GRIB‐IMIM‐PRBB).
Peralmodelatgedel’scFv‐h3D6,s’haempratcomamotllel’scFvespecíficcontrael
receptor del coronavirus SARS, d’estructura cristal·litzada i dipositada al Protein Data
Bank (codi PDB2GHTrp:B), ambun 70%d’identitat i un 94%de semblança seqüencial
ambelnostrescFv‐h3D6.Apartirdel’aplicacióbioinformàticaMODELLERs’hanobtingut
lescoordenadesde5possiblesmodels,d’entreelsques’haseleccionatelmodelmésòptim
energèticament.
D’aquesta manera s’ha obtingut un model teòric fiable que ha servit com a
caracteritzacióvisualdelaproteïna,tananivelld’estructurasecundàriaiterciària,comde
residu, així com per a localitzar regions ambmajor tendència a l’agregació. Dadesmolt
útilsperaentendreelcomportamentdelamolècula imillorar‐nel’experimental.Amés,
ha permès al nostre grupde recerca fer undisseny racional demutants del scFv‐h3D6,
augmentant l’estabilitat de la molècula, i disminuint la seva tendència a l’agregació
(Rivera‐Hernandez et al. 2013). Finalment, esperem, enun futur immediat, que aquesta
millora incrementi la vidamitja de l’scFv‐h3D6 i, conseqüentment, aconseguir reduir la
dosiefectivadelamolèculaobtingudaprèviamentenelsratolins3xTg‐AD(Gimenez‐Llort
et al. 2013). Que tot i ja ser baixa (una única injecció intraperitoneal de 85 μg resulta
efectiva als 5 dies), disminuir‐la per disseny racional del plegament i l’estabilitat de la
molècula ha d’ajudar en el pas cap a proves clíniques a d’altres mamífers no murins,
desitjablement,aassajosclínicsenhumans.
V‐Capítol2 MaterialsiMètodes
153
3. MATERIALSIMÈTODES.
L’obtenciódelmodeltridimensionaldel l’scFv‐h3D6esvarealitzarmitjançantun
seguit de tècniques bioinformàtiques descrites a continuació, totes elles emprant el
llenguatge de programació Python (Van Rossum 1991), capaç de llegir i reproduir els
scripts (llistat de comandaments que s’executen amb un ordre determinat i de forma
automàtica)delsdiferentsprogramesutilitzatsenaquesttreball.
3.1. Recercadeproteïnamotlleperhomologiadeseqüència.
El model parteix d’una recerca d’homologia de seqüència per a cada un dels
dominisVHiVLperseparat,emprantl’aplicacióBLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)
(Altschuletal.1990),apartird’estructuresjaresoltesidipositadesalPDB(ProteinData
Bank).Esvan filtrar les regionsdebaixa complexitatde cadaalineamentno redundant,
pertaldedescartatfalsosresultats.Laseqüènciademajorvalordecoincidència,comuna
peralsdosdominis,vaserseleccionadad’entre les24possibles.L’estructuracristal·lina
del fragment d’anticòs scFv‐h3D6 específic contra el domini d’unió del receptor de la
proteïnaSARS(codiPDB:2GHTrp‐B),ambun70%d’identitat(94%desemblança)iun
valord’homologia (E‐score)de2e‐84, va ser seleccionat comamotlleper a construir el
model3Ddel’scFv‐h3D6,mitjançantelprogramaMODELLER9v2(Sali,Blundell1993).
3.2. ModelatgetridimensionaldelscFv‐h3D6.
Inicialment, es van dissenyar cinc possibles conformacions per al scFv‐h3D6.
L’elevadaflexibilitatdelconnector,(Gly4Ser)3,nopermetunpatródedifracciódefinitenel
motlle, per tant, les seves coordenades per al model van ser optimitzades per mínims
energètics (LoopRefining, MODELLER 9v2), obtenint deu possibles estructures del
connector,encaixadesambelscincprimersmodelsseleccionatsdelscFv‐h3D6.
MitjançantelprogramaProSa2003(Wiederstein,Sippl2007),esvatraçarunperfil
de mínims energètics de cada model i connector proposats. Es van analitzar finestres
consecutives de 25 residus, prenent lamitjana de cada una, per assignar un valor d’∆G
teòrica(pseudo‐energia)acadaundelsresidus,deformaqueesvaescollirelmillormodel
demínimaenergia.
LesimatgesdelmodelfinalesvanobtenirambelprogramaPyMol(DeLano2002),
elqualpermetvisualitzarmodelsmolecularsen3D.
V‐Capítol2 MaterialsiMètodes
154
3.3. Numeracióestàndarddel’scFv‐h3D6ilocalitzaciódelesregionsCDR.
Peraseguirlanumeraciócanònicadelsresidusd’Ig,iunacorrectaidentificacióde
les regions CDRs (Complementary determining regions), es va emprar l’esquema de
numeracióKabat(Wu,Kabat1970,Kabat1983,Johnson,Wu2001).Aquestaclassificació
aportaun seguitde reglesquedefineixen cadaundels sisCDRs (tresper cadadomini),
comaral’aminoàcidinicial,elsresidusanteriorsiposteriorsalCDR,ielnombrederesidus
queelformen.
3.4. Caracteritzacióestructuraldelmodeld’scFv‐h3D6perDSSP.
L’algoritme bioinformàtic DSSP (Definition of Secondary Structure of Proteins)
(Kabsch, Sander 1983) resulta molt útil per assignar l’estructura secundària i altres
característiquesgeomètriquesdelmodelapartirdelescoordenadesatòmiquesenformat
PDB,comara:
‐ Exposiciódels residusal solvent. Per a cada residu de la seqüència s’obté un
valor teòricque indica lasuperfíciede l’àreadelresiduquees trobaexposadaal
solvent, en Å. De forma que se’n extrau si el residu es troba encarat cap a la
superfíciedelamolèculaobé,formapartdelnuclihidrofòbicd’aquesta.
‐ Contactesentreresidusdedistànciamenora5.5Å. S’obté,de formageneral,
els valors mínims per a establir interaccions entre residus, definint així les
interaccions secundàries i terciàries intradomini, així com les interaccions
interdomini que conformen la interfície. A l’hora d’estudiar contactes específics
s’ha realitzat, amb el programa Pymol, un anàlisi manual més concret de les
regionsd’interès.
3.5. Predicciódetendènciaal’agregacióperTANGO.
TANGO és un algoritme computacional dissenyat per a predir la tendència a
l’agregacióenfulla‐βdepèptidsiproteïnesdesplegades(Fernandez‐Escamillaetal.2004,
Lindingetal.2004).Esbasaenelsprincipisfisicoquímics(pH,temperatura,forçaiònica,
concentració de TFE, estabilitat proteica, protecció N‐terminal i C‐terminal, etc.) de la
formació de fulla‐β estesa, entenent que les regions internes dels agregats es troben
completamententerrades.TANGOdiferènciaentretendènciaafulla‐βnativail’amiloide.
V‐Capítol2 MaterialsiMètodes
155
3.6. AlineamentMúltipleiResidusConservats.
És necessari establir un alineament múltiple entre l’scFv‐h3D6 modelat i altres
seqüències scFv humanes o humanitzades d’elevada homologia per tal de determinar
aquells aminoàcids conservats evolutivament i que juguen un paper important dins la
molècula, ja sigui per a la seva funció, estabilitat o solubilitat, i que per tant no es
convenientmutar‐losquancoincideixenamblanostraseqüència.
Amb el programa ClustalTrp2 (Thompson, Higgins & Gibson 1994), s’ha fet un
alineament múltiple de les 24 seqüències d’scFv humanitzades obtingudes prèviament
amb el programa BLAST. Aquesta informació és molt important a l’hora de dissenyar
futursmutantsdel’scFv‐h3D6.
3.7. AminoàcidScanning‐Mutation.
Mitjançant l’aplicació ProSa 2003 (Wiederstein, Sippl 2007) s’ha realitzat un
anàlisiAAScanning‐mutationambelqualesmuta,teòricament,cadaundelsresidusdela
seqüènciad’interèsperels20aminoàcidsproteïnogènics.Comaresultats’obtéunvalor
demutació (z‐score)perresidu iaminoàcidsubstituent.Comparantaquestvalorambel
delwild‐type(WT),esclassificacadamutaciócoma:
‐ estabilitzadora(zwt–zmut>0),
‐ desestabilitzadora(zwt–zmut<0),
‐ oneutre(zwt–zmut=0).
El valor z‐score deriva de la distribució d’energies de la proteïna problema
comparadaambunaproteïnapatró,sentσladesviacióestàndard.
Per a determinar els z‐score s’ha tingut en compte la combinació de dos tipus
d’energia:
‐ l’energiasuperficial,associadaalCβdecadaresidu.
‐ l’energiadeparells,associadaal’energiaentreCβ‐Cβdedosresiduspropers.
V‐Capítol2 Resultats
157
4. RESULTATS
4.1. Proteïnamotlle:l’scFvespecíficcontradelvirusSARS.
El model tridimensional de l’scFv‐h3D6 s’ha dissenyat a partir de la seqüència
motlle amb codi PDB 2GHTrp:B, corresponent a un scFv dirigit contra el receptor d’un
coronavirus causantdel Síndromerespiratoriagut sever (SARS,SevereAcuteRespiratori
Syndrome),obtingudaperrecercadeseqüencieshomòloguesaldominiVLiVHmitjançant
elprogramaBLAST.
Comespot veure en la figura2. 2, lesdues seqüències sónmolt semblant entre
elles,comparteixenun70%d’identitati,delsresidusnocoincidents,el81%corresponen
acanvisconservatius,ésadir,entreaminoàcidsdecaracterístiquesmolecularssemblants
i,pertant,noalterensignificativamentl’estructuradonadaperlaseqüènciamotlle.Un2%
(7/246)del’alineamentcorresponagaps,degutaunprocésdeinsercióodeleciód'algun
delsresiduenalgunadelesseqüències.
Figura2.2AlineamentdelaseqüènciascFv‐h3D6(query)amblaseqüènciamotlle2GHTrp:B(subject).
L’alineament,perpBLAST,delaseqüènciadelnostrescFvamblacadenaBdelscFvdirigitcontraelreceptor
delcoronavirusSARS(codiPDB:2GHTrp:B),quetéun70%d’identitat.+:canvisconservatius;gap:posicióen
blancdegutaunainsercióodeleciód’unresidudeterminat.
V‐Capítol2 Resultats
158
En aquest cas, el connector utilitzat en la seqüència motlle és idèntic al nostre
(Gly4Ser)3, el més usat en la bibliografia per al disseny de molècules scFv, però, al no
trobar‐sebenresoltalsmapesdedifracció,noespotusarcomamotlleestructural.
4.2. Possibilitatsdemodels3Dperal’scFv‐h3D6.
Les coordenades atòmiques de la seqüència motlle 2GHTrp:B, dipositades en el
PDB, van ser introduïdes al programa MODELLER 9v2 juntament amb l’alineament de
totesduesseqüències.Així,esvandissenyar5modelsteòricsdel’estructura3Ddel’scFv‐
h3D6,sempretendintaconstruccionsenergèticamentfavorables.
Tal i com es pot observar a figura 2. 3‐A, els 5 models teòrics obtinguts són,
estructuralment, molt semblants entre ells. Tan sols variarà mínimament l’orientació a
l’espai de l’estructura secundària, concretament dels angles Φ (phi) i Ψ (psi),
corresponentsal’enllaçrotacionalNH‐CαiCα‐COrespectivament(resultatsnomostrats).
Alnodisposardelescoordenadestridimensionalsdelconnector,vasernecessari
refinar l’estructura3Dd’aquestaregióde l’scFv‐h3D6 fentúsde l’aplicacióLoopRefining
del programa MODELLER 9v2. Per a cada un dels cinc models, es van obtenir deu
conformacionsespacialsperalconnector(figura2.3‐B).
Figura2.3.Modelsteòricsdel’estructura3Ddel’scFv‐h3D6A)AmbMODELLER9v2esvanobtenirles5
construccionsmésfavorablesenergèticamentapartirdelescoordenadesdelmotlle2GHTrp:B.Totisemblar
iguals, es diferencien per petits canvis d’orientació en les estructures secundàries. B) Per a cada un dels 5
models construïts, es van dissenyar, permínims energètics i dinàmicamolecular, 10models de connector
diferents.Apartirdelperfilenergèticesdescartarenelsmenysfavorablesiesseleccionàelmodelòptim.
V‐Capítol2 Resultats
159
Algunes d’elles, mostren connectors molt desfavorables energèticament,
generadorsd’inestabilitatmolecularpelfetd’unirelsdosdominis,VHiVL,perlainterfície
hidrofòbica,suposantunxocestèricquedónallocalareorientacióderesidusjaestables.
Altresmodelsestrobentallatsenalgunpuntdelaseqüència,jaquelaconformacióglobal
delaproteïnanopermetlapresenciadedeterminatsresidusenunpuntconcret,jasigui
pelseuvolumespacialolasevacarrega,operquèl’angledegirdelsseusenllaçosestroba
foradel’espaiconformacionalpermès.
4.3. Determinaciódelmodeldemínimaenergia.
L’obtenció dels perfils energètics, mitjançant el programa ProSa 2003, de cada
modelambelsdeuconnectorsteòricsvapossibilitarlaselecciódelmodelmésfavorable
energèticament(Figura2.4).
Laconformaciódecadaundelsconnectorsprovocaunareestructuraciódelaresta
delamolècula,modificant,deformaespecífica,l’estructuratridimensionaldelmodel,fent‐
lamésomenysestable.Engeneral,laconformaciódeldominiVHesveumésalteradaque
ladeldominiVL.Comerad’esperar,elspicsdemàximaenergiadelperfilescorresponena
les regions CDR de la proteïna que, igual que el connector, són loops flexibles. Els seus
extrems, però, cauen en pics de mínima energia i formen part de fulles‐β, mostrant la
necessitat dels CDR per aferrar‐se a l’estructura global i estable de la proteïna, i així
compensar l’entropianecessàriaperamantenirels loopsdeCDRexposats.Obtingutsels
perfils,esvandescartarelsconnectorsambuna∆Gteòricagranfinsaconseguirunmillor
perfildemínims.Percomparaciódepics,esvaseleccionarelmodelambméstendènciaa
valorsglobalsmínimsde∆G.
V‐Capítol2 Resultats
160
Figura2.4.Perfils energèticsde cadaundels5models.Amb Prosa2003 es van obtenir els perfils de
mínims energètics de cadamodel amb els 10 connectors. De dalt a baix,model 1‐5; columna dreta, perfils
inicials; columna esquerra, perfils on s’han eliminat els connectorsmenys favorables energèticament. En
vermell,model2seleccionatcomaòptim,ambeltercermodeldeconnector.
4.4. NumeracióKabatdel’scFv‐h3D6ilocalitzaciódelesregionsCDR.
L’esquemadelaseqüènciadel’scFv‐h3D6espotveurerepresentatalafigura2.5.
La primera seqüència representa el domini VH i la segona al domini VL, separades pel
connectorflexible(Gly4Ser)3.ElsresidusCysestrobenmarcatsengroc,elsTrpenvermell,
elsVH‐CDRenverd,ielsVL‐CDRenblau.Tambés’aprecienles9cadenes‐βdecadadomini,
5cadenes‐βd’unafulla‐βi4cadenes‐βdel’altrefulla‐β,queconformenelbarril‐β.
V‐Capítol2 Resultats
161
Figura2.5.Esquemadelaseqüènciadel’scFv‐h3D6inumeracióKabat.EldominiVHestàformatper119
residus,ambsisinsercionsrespectelanumeracióKabat(a,b,c,d…)i,pertant,finalitzaenelresidu113dela
numeracióKabat;itresresidustriptòfan(vermell).EldominiVLconté112residus,ambcincinsercionsi,per
tant, finalitzaenel residu107de lanumeracióKabat; idos residus triptòfan.Totsdos formen9 cadenes‐β
canòniques(VH‐βA,B,C,C’,C’’,D,E,FiG)ipresentenlesduescisteïnesqueformaranelpontdisulfurdecada
domini (groc). Les sis regions CDR (VH, verd i VL, blau) corresponen, principalment, a regions de loops
irregulars.Ennegreelconnectorflexible(Gly4Ser)3queuneixtotsdosdominis.
Per a una correctanumeraciódels residusde la seqüènciade l’scFv‐h3D6, es va
emprarlanumeracióestàndardd’immunoglobulines(Igs)definidaperKabat(Wu,Kabat
1970, Kabat 1983, Johnson, Wu 2001), i desenvolupada a partir d’homologia de
seqüènciesd’Igs.Cadaunadelescadenes,pesadailleugera,téunanumeraciópròpia.La
numeració Kabat és molt rígida per a cada aminoàcid conservat, de forma que les
possibles insercions de seqüència són introduïes mitjançant lletres, conservant la
numeracióestàndard.
Amés amés, gràcies a la definiciódeCDRsperKabat, es vanpoder classificar i
delimitarlessisregionsCDRdel’scFv‐h3D6(tresperacadadomini),aixícomlesregions
entreelles(FRs,oFrameworkRegions).Repespecialatenció,elVH‐CDR3,elmésdifícilde
classificar (Oliva et al. 1998) i el que, a més, potencia les interaccions sinèrgiques
(cooperatives, o avidity) dels anticossos per a reconèixer i unir l’antigen específic
(Manoutcharianetal.2004).Totique,enfunciódel’especificitatperl’antigen,cadaCDR
té una seqüència diferent, determinats paràmetres o patrons són conservats entre les
diferents Igs, com ara l’aminoàcid inicial, els residus anteriors i posteriors al CDR, i el
nombrederesidusqueelformen.
V‐Capítol2 Resultats
162
Comparant informació,hemvistquetanelsVL‐CDR1,VL‐CDR2iVL‐CDR3comels
VH‐CDR3iVH‐CDR2presentenlescaracterístiquestípiquesdelsCDR.TansolselVH‐CDR1
s’allunyadelconsensgeneral,perlasevallargàriailocalitzacióeneldomini;sielsquatre
primersresidusdelaFRanteriorformessinpartdelaregió,elVH‐CDR1jacompliriaamb
elsrequisitsestablerts.
4.5. Caracteritzaciódelmodeltridimensionaldel’scFv‐h3D6.
Adoptant el plegament canònic dels dominis d’Igs, cada un dels dos dominis
variables de l’scFv‐h3D6 conté dues fulles‐β antiparal·leles empaquetades estretament,
unacontral’altre,adoptantunaconformaciócompactaenbarril‐β(Figura2.6).L’extrem
N‐iC‐terminaldecadadominiestrobenoposatsentreellsisituatsalsextremsdelbarril‐
β.Unadelesfullesconté5cadenes‐β(A,B,C,C’iC’’)il’altreenconté4(D,E,FiG).
Figura2.6.Modeltridimensionaldel’estructuradel’scFv‐h3D6.L’scFv‐h3D6contédosdominisvariables
(VHiVL)formats,cadaund’ells,perduesfulles‐βqueadoptenunaconformacióenbarril‐β.Cadadominiconté
tresregionsCDR(verd) iunpontdisulfur (groc).L’scFv‐h3D6contécincresidus triptòfan(vermell), tresal
dominiVHidosaldominiVL.Elconnector(negre),moltexposatalsolvent,uneixtotsdosdominis.
V‐Capítol2 Resultats
163
Els loops de CDR es localitzen entre les cadenes B‐C, C’‐C’’ i F‐G, i es disposen
propers entre ells, encarats cap a lamateixa cara del barril‐β, i exposats a la superfície
globular.Elplegamentdeldominiestrobaestabilitzatper:
‐ pontsd’hidrogenentrelescadenes‐βdecadafulla.
‐ interaccionshidrofòbiquesentreresidusdelesduesfulles‐β.
‐ unpontdisulfurentrelacadenaBd’unafulla‐βilacadenaFdel’altre:
‐ dominiVH:Cys22(B)‐Cys92(F)
‐ dominiVL:Cys23(B)‐Cys88(F)
L’scFv‐h3D6 conté cinc residus de triptòfan molt conservats (figura 2.6, en
vermell),tresendominiVHidoseneldominiVL:
‐ dominiVH:Trp36(C),Trp47(C’)iTrp103(G)
‐ dominiVL:Trp35(C)iTrp89(F,iéselprimerresidudelCDR3)
El VH‐Trp36 i el VL‐Trp35 es localitzen en el nucli hidrofòbic de cada un dels
dominis,mentrequeelsVH‐Trp47,VH‐Trp103,iVL‐Trp89formenpartdelainterfíciedels
dosdominis.Pera teniruna ideade la importànciade les interaccionshidrofòbiquesen
aquestainterfície,ladistànciaentreVH‐Trp103‐CZ2iVL‐Trp89‐CH2ésde3.3Å,ilad’entre
VH‐Trp47‐CD1iVL‐Trp89‐CZ2ésde5.7Å.
4.6. Exposiciódelsresidusalsolvent.
Els valors de DSSP, mostrats a la figura 2. 7, donen informació rellevant per al
disseny de possibles mutants de l’scFv‐h3D6. Aquesta informació representa un dels
primerspassosperadecidirquinresidu,d’unaregiódeterminada,éselmésadientpera
ser mutat. En un principi, és aconsellable no mutar residus enterrats cap a l’interior
proteic.
Estructuralment,elDSSPmostraquelesregionsplegadesenfulla‐βtenencaràcter
amfipàtic, és a dir, alternen residus exposats amb residus enterrats de forma molt
marcada.Encanvi,elsβ‐turnsnosegueixenunpatróamfipàtic.Inicialmentesperàvemque
els residus de les regions CDR tinguessin una elevada exposició al solvent, disposició
òptimaperaunir l’antigen,guanyarestabilitat idisminuïr la∆G,quesense la interacció
ambl’antigenéselevada.
V‐Capítol2 Resultats
164
Tot i això, els resultats obtinguts no ratifiquen aquesta hipòtesi, ja que tant es
trobenorientatscapalasuperfíciecomcapal’interior.Laexplicacióaaquestaobservació
és que el loop de CDR ha d’adoptar una conformació tridimensional que encaixi
específicamentambl’estructura3Ddel’antigencomplementari.
Figura 2. 7. Superfície d’exposició al solvent. La gràfica, obtinguda per DSSP, mostra la superfície
d’exposicióalsolvent(Å)decadaundelsresidusdelaseqüènciadel’scFv‐h3D6.Elsresidusambvalorinferior
a25Åesconsiderenmoltenterrats.
4.7. Predicciódetendènciaal’agregació.
La figura 2. 8, juntament amb la taula, mostra els resultats obtinguts per
l’algoritmeTANGO,elqual identificaquatreregionsambfortatendènciaa l’agregacióen
fulla‐βdinslaseqüènciadel’scFv‐h3D6,iquecorresponenalescadenes‐βFiGdeldomini
VH,iC’iFdeldominiVL.Elspicsambvalorsinferiorsa8s’hanconsideratfalsospositius,i
nos’hantingutencompte(Cerda‐Costaetal.2009).
V‐Capítol2 Resultats
165
Figura2.8.Prediccióde la tendènciaa l’agregacióde l’scFv‐h3D6.Mitjançant l’algoritmeTANGO, s’han
determinatlesregionsambmajortendènciaal’agregaciódel’scFv‐h3D6.Elsresultatsesmostrenenformade
gràfica (dalt) o com a taula de valors específics (baix). Es diferencien clarament quatre regions, dues per
domini,ambfortatendènciaenagregar.Elsvalorsinferiorsa8hanestatdescartats.
Justament,lesduescadenesdecadadominiambtendènciaal’agregacióestroben
empaquetades entre elles per contactes hidrofòbics, contrarestant el possible efecte de
nucleaciódecadaunadelesfulles‐aïllades.L’exposiciód’aquestesregionsalsolvent,pot
desencadenarl’agregaciódelaproteïnailaconseqüentinsolubilitatdel’agregat,apartde
resultarunpuntcríticcapalaviaamiloide.
4.8. AlineamentMúltiple.
L’alineamentmúltipleésunaeinamésperapoderdeterminarresidusmutables.
Comparantentreseqüènciess’hanreconegutelsaminoàcidsmésconservatsi,enprincipi,
nomutables jaque implicariacanvisen laestabilitat, solubilitato funcióde lamolècula.
Residu TANGO Residu TANGO Residu TANGO Residu TANGO
VH‐βF VH‐βG VL‐ βC’ VL‐ βF
A88 36.34 T107 8.08 L47 35.50 V85 24.27
V89 39.80 L108 9.60 I48 36.18 Y86 24.34
Y90 39.80 V109 9.60 Y49 36.18 Y87 24.34
Y91 39.80 T110 9.60 L50 36.18 C88 23.98
C92 39.65 V111 9.60 V51 36.18 W89 23.87
V93 36.89
V‐Capítol2 Resultats
166
Ambl’alineament,esdeterminal’aminoàcidmésabundantenunaposicióamutar isies
corresponambeldelaseqüènciadelnostrescFv(Figura2.9).
Figura 2. 9. Alineamentmúltiple de l’scFv‐h3D6. Alineament de la seqüència de l’scFv‐h3D6 amb 23
seqüènciesscFv.Lesdiferentstonalitatsdeblauressaltenlaconservaciódelresiduencadaposició,desdemés
conservada(blaufort),jasiguielmateixaminoàcidounaltreamblesmateixespropietatsfísico‐químiques,a
menys conservada (blanc). La numeració dels residus no segueix la numeracióKabat emprada per al scFv‐
h3D6.
LesregionsCDRs, tot inoserconservadesentre lesdiferentsseqüènciesdeguta
que cada scFv és específic d’un antigen determinat, no sónmutables. Fer‐ho suposaria
perdreafinitatambl’antigen,enelnostrecaselsoligòmersformatspelpèptidAβ1‐42.Els
mutantsdeCDRsserienpossiblesuncopobtingutelcristalldelcomplexscFv‐h3D6:Aβ1‐42,
treball pensatper a fer enun futur tot i resultardifícil degut a l’agregaciódel complex.
Ambellescaracteritzarienlesinteraccionsrealsenelcomplexiespodrienmutarresidus
específicsperaoptimitzar‐nel’afinitati,així,aconseguirunamenordosiefectivadel’scFv.
V‐Capítol2 Resultats
167
4.9. AminoàcidScanning‐Mutation.
Emprant l’eina Aminoàcid Scanning‐mutation (ProSa 2003), es va realitzar una
predicció teòrica de l’efecte de les mutacions sobre l’estabilitat de la molècula. Es
considera que una posició en elWT no és estable, quanmínim 15 dels 20 aminoàcids
possibles no desestabilitzen l’estructura. L’anàlisi dels resultats obtinguts mostra que
11/113 residus del domini VH (~ 10%) i 13/107 del domini VL (~ 12%)millorarien
l’estabilitatdelamolècula.
Taula2.1.Aminoàcid Scanning‐Mutation.A la taula s’hi representen aquells residus de la seqüència del’scFv‐h3D6que,teòricament,sóninestablesjaquemínim15dels20possiblesaminoàcidsaportenestabilitata lamolècula.Tambéesmostrenaquellscanvisquela inestabilitzenielsqueresultenneutres.Amés,peracada residu, esmostra la regióa laqualpertanyendins lamolècula (FRoCDR), la superfícied’exposicióalsolventobtingudaperDSSP,latendènciaal’agregaciópreditaperTANGOielgraudeconservaciódelresidud’entre les 24 seqüències diferents comparades a l’alineament múltiple. En gris es remarquen aquellesposicionsqueserienadientsperamutar.
Residu
VH
Mutacions
estables
Mutacions inestable
Mutacions neutre
Regió Exposició al
solvent (Å)TANGO
Grau de
conservació E6 19 0 1 FR1 6.3 0 18/24 G10 19 0 1 FR1 44.2 0 21/24
F27 15 4 1 FR1 13.0 0 21/24
R38 16 3 1 FR2 1.1 0 23/24
E46 16 3 1 FR2 17.9 0 22/24
Y59 17 2 1 CDR2 28.8 0 22/24
S60 16 3 1 CDR2 9.3 0 1/24
R71 16 3 1 FR3 11.0 0 23/24
D86 15 4 1 FR3 0.6 0 24/24
D101 16 3 1 CDR3 11.2 0 20/24
G106 17 2 1 FR4 19.8 0.65 24/24
Residu
VL
Mutacions
estables Mutació inestable
Mutació neutre
Regió Exposició al
solvent (Å) TANGO
Grau de
conservació
P18 18 1 1 FR1 50.7 0 1/24
L27c 15 4 1 CDR1 41.7 0 3/24
K30 16 3 1 CDR1 36.9 0 1/24
R46 16 3 1 FR2 1.1 0 1/24
L50 17 2 1 CDR2 37.0 36.06 2/24
V58 17 2 1 FR3 13.7 0 7/24
K74 17 2 1 FR3 44.1 0 1/24
D82 15 4 1 FR3 1.2 0 24/24
Q90 15 4 1 CDR3 0.0 1.06 22/24
F94 16 3 1 CDR3 65.7 0 2/24
P95 19 0 1 CDR3 19.3 0 18/24
R96 17 2 1 CDR3 14.1 0 2/24
K103 16 3 1 FR4 45.5 0 24/24
V‐Capítol2 Resultats
168
Després de mirar la regió (CDR/FR), l’accessibilitat al solvent, la predicció de
TANGO, i el grau de conservació a l’alineament múltiple de cadascun d’aquest residus
(Taula2. 1), teòricamentmillorables, nomésdos eren adientsper a ser realitzats, P18 i
K74 del domini VL. Tanmateix, amb un anàlisi més profund es va veure que la P18 és
necessàriaperquèformapartd’ungir‐β(VLβA‐βB), iquelaK74,amésdeserunresidu
que trenca l’agregació (Pawar et al. 2005), estableix contactes salins que estabilitzen
l’estructurasecundariaalaquepertany(VLβE).
Amés,consideremqueaquestanàlisiéspocfiable,jaque,entred’altres,nodetecta
cap de les regions predites per TANGO com tendents a l’agregació, amb l’excepció del
residuVL‐L50,quepertanyalCDR2ipertantnoésmutable.Labonacorrelacióentreles
prediccions de TANGO i els resultats experimentals s’ha mostrat en diverses ocasions
(Cerda‐Costaetal.2007).
4.10. Redissenydel’scFv‐h3D6apartirdelmodel3D.
4.10.1. Mutacionsenelnuclihidrofòbic.
ApartirdelsresultatsobtingutsperTANGO,esvaproposaridissenyarunabateria
demutantssimplesambl’objectiudedisminuirlatendènciaal’agregaciódel’scFv‐h3D6i,
així,millorarelrendimentdepurificaciódelaproteïnarecombinant.Delesquatreregions
predites amb alta tendència a l’agregació, es van triar les tres amb valors de predicció
superiorsa10:VH‐βF,VL‐βC’,iVL‐βF(figura2.8).
Tot i ser conscients de la gran dificultat que comporta la mutació del nucli
hidrofòbic de qualsevol proteïna, vamdescartarmutacions a la superfície. És important
recordarquelaseqüènciadel’scFv‐h3D6éshumanitzada,jaquelamolèculatéfinalitats
terapèutiques,i,pertant,calanarambcompteal’horad’introduirmutacionsquepodrien
provocar,finalment,unarespostaimmunitàrianodesitjada.
Peraldissenydelsmutantsd’agregaciós’ha tingutencompte,principalment,els
valorsdeDSSP,l’alineamentmúltipleielscanvisderesidusdegutsalahumanitzaciódela
seqüènciadelfragmentd’anticòs(tambérealitzadasobrelesregionsFR).Aldissenyarels
mutants, s’ha tingutmolt en compteque s’estanmodificant regionsquees troben força,
inclús totalment enterrades, fet que comporta una gran dificultat per a triar una
substitucióadequadaperaquestesposicions.
Aixílapropostadesismutantsperadisminuirlatendènciaal’agregaciódel’scFv‐
h3D6vaserlasegüent:
V‐Capítol2 Resultats
169
‐ RegióVH‐A88‐V93(VH‐βF):MutantV89A/V89N
Aquesta regió conté la Cys92, que no és, en principi, mutable. A més, la Val93
precedeixalVH‐CDR3itampocésconvenientmutar‐la.Aixíquenomésensquedalaregió
A88V89Y90Y91,moltenterrada.ElresidumenysenterratéslaVal89,ambunDSSPde15.
Si considerem l’alineament en aquesta posició trobem 23Val i 1Phe, entre les 24
seqüènciesalineades.Amés, la seqüènciade l’anticòsabansde lahumanització erauna
leucina(Trp02006066171).Lafenilalanina,apartdesermassavoluminosa,tendeixmésa
l’agregacióque la leucina (Pawar et al. 2005).Ésper tot aixòque esdevémoltdifícil de
triarunasubstitucióenaquestaposició.L’únicaopcióplausibleenaquestessituacionsera
provar lasubstitucióaalanina, l’aminoàcidquemillors’adaptaenmultituddeposicions
(Weissetal.2000).Detotesmaneres,visualitzantelscontactesdelaV89dinsdelmodel,
també vam considerar la mutació a asparagina, ja que té poca tendència a l’agregació
(Pawaretal.2005).
‐ RegióVL‐L47‐V51(VL‐βC’):MutantY49T/Y49A
AquestaregiócomprènelVL‐FR2ielVL‐CDR2,quecomençaalaposicióLys50.Així
que sols ens queda permutar la regió L47I48Y49, extremadament enterrada. El residu
menysenterratésTyr49,ambunDSSPde8.Siconsidereml’alineamentenaquestaposició
trobem sempre una tirosina, i aquesta posició no ha estat humanitzada
(Trp02006066171). Degut a que aquesta tirosina ésmolt important per a la interacció
entreelsdosdominisdelScFv,consideremques’hademirardemantenirunresiduamb
característiques semblants, especialment la presència del hidroxil, raó per la qual vam
creurequelatreoninaeraunamutacióaprovar.Lamutacióaalaninaesvarealitzarper
defecte.
‐ RegióVL‐V85‐Trp89(VL‐βF):MutantV85T/V85A
AquestaregióprecedeixlaCys88,quenoés,enprincipi,mutable.Amés,elTrp89
ja formapart del VL‐CDR3 i tampoc és potmutar. Així que sols ens quedapermutar la
regióV85Y86Y87,moltenterrada.ElresidumenysenterratésVal85,ambunDSSPde16.
Siconsidereml’alineamentenaquestaposiciótrobem13Val,9Thr,1Alai1Asp,entreles
24seqüènciesalineades.Amés,laseqüènciadel’anticòsabansdelahumanitzacióerauna
leucina(Trp02006066171).Enaquestcasvamconsiderarquelamutacióatreonina,que
trenca la tendència a l’agregaciómillor que l’alanina (Pawar et al. 2005), era una bona
opció.Lamutacióaalaninaesvarealitzarperdefecte.
V‐Capítol2 Resultats
170
4.10.1.1. Resultatsexperimentalsdelsmutantsdissenyats.
Alserconscientsdelriscquesuposamutarresiduscompletamententerratsdinsla
proteïna,ialgunsd’ellsimportantsperalcorrecteempaquetamentglobular,erad’esperar
queel rendimentdepurificacióperalgunsdelsmutants fosbaixa, i aixíhaestatperals
mutantsVH‐V89AiVL‐V85A,onelcanvideresiduhadificultatelseureplegamentdeforma
quenohanpogutserextretsdelafraccióinsoluble.Peraquestaraó,aquestdosmutants
hanestatdirectamentdescartatsaseranalitzats.
Figura2.10.Desnaturalitzaciótèrmicaiquímicadel’scFv‐h3D6ilessevesvariants.A)Desnaturalització
tèrmicaperCDseguintelmínimd’el·lipticitata218nm.B)Desnaturalitzaciótèrmicaseguinteldesplaçament
del màxim de fluorescència a 338 nm. C) Desnaturalització química, per urea, on el màxim de l’espectre
d’emissiódelstriptòfansésrepresentatenfunciódelaconcentraciód’urea.WT(negre),VH‐V89N(blau),VL‐
V85T(vermell),VL‐Y49T(verd),VL‐Y49A(taronja).
V‐Capítol2 Resultats
171
Pelquefaalarestademutacions,tambéharesultatcomplicatextraure’nsuficient
quantitat de proteïna per a la seva posterior caracterització, però tot i així s’ha pogut
seguirendavant.
Lescorbesdedesnaturalitzaciótèrmica,seguidesperCDi fluorescència,mostren
una millora poc significativa o nul·la de la tendència a l’agregació (Figura 2. 10‐A, B).
Concretament,elsdosmutantsdelresiduconservatVL‐Y49T/Acomencenaagregaruns5
grausabansqueelWT,anul·lantdirectamentlahipòtesidedisminuciódelatendènciaa
l’agregació.Encanvi,elsmutantsVH‐V89NiVL‐V85Tsemblaqueretardinl’inicidelprocés
d’agregació,jaqueelsenyala218nmdecreixapartirdels50°C,cincgrausméstardque
elWT, quan s’inicia la reestructuració cap unmajor contingut en fulla‐β. Aquesta dada
seriaconsideradapositivasino fosperquè, tot i començarmés tard,elmutantVH‐V89N
assoleix l’estat agregat ràpidament, abans inclús que elWT. Segons la corba de CD del
mutantVL‐V85T(Figura2.10‐A),podriadir‐seques’hadisminuïtlatendènciaaagregació,
jaquel’intermediaris’assoleixunsdos°CméstardqueelWT,peròperfluorescènciano
s’observendiferènciesrespecteelWT.
Coms’observaalafigura2.10‐C,lescorbesdedesnaturalitzacióquímicaamburea
detotselsmutantssegueixenlamateixatransiciódetresestatsqueladescritaperelWT,
peròcapd’ellssemblamostrarunamilloradel’estabilitat.ElsmutantsVH‐V89NiVL‐V85T
sónpràcticament igualsqueelWTpelque faaldesplegamentdelsdosdominis,mentre
queelsmutantsdelresiduVL‐Try49desestabilitzenclaramenteldominiVLi,encaramés,
semblaquel’estatintermediari,iprecursordelaviaamiloide,estrobaestabilitzat
4.10.2. Re‐dissenydelextremC‐terminaldel’scFv‐h3D6.
Elmodeltridimensionalhapermèsunaexaminaciógràficadel’estructura,aixícom
determinar les distàncies entre cadenes laterals. S’ha vist que l’extremC‐terminal de la
molècula,quecorresponalresiduVL‐K107,segueixformantpartdelacadena‐βG(Figura
2.10). Per tant, les cadenes laterals de VL‐K107 i VL‐E105 es troben orientades cap a la
mateixa cara de la cadena‐β i haurien d’establir una interacció electrostàtica, però la
distanciaentreelles(VL‐K107‐NZiVL‐E105‐OE1),de9.1Å,ésmassagranperaestablir‐la.
Laraód’aquestaexcessivaseparacióésque, lacadenalateraldeVL‐K107estrobaatreta
perOXT107‐O,ladistànciaentrelesqualsésde4.9Å.
V‐Capítol2 Resultats
172
Figura 2. 11. Detall de l’extrem C‐terminal del scFv‐h3D6. A la imatge es marquen les principals
interaccionsentreels residusVL‐E105 iVL‐K107, i l’efectedelàtomd’oxigende la cadena lateralOXT107‐O
sobreaquestainteracció.
Al examinar l’alineament múltiple entre les 24 seqüències de molècules scFv
diferents(Figura2.9)esvaveureque14d’ellescontenienalextremC‐terminalelresidu
VL‐K107,sisVL‐R108iduesVL‐T109.
Amb la intenció d’estabilitzar la cadena‐β G de la molècula (treball de màster
Blasco,B., tesis en redacciódeRivera‐Hernández,G.), es vadecidir elongar enunodos
residus l’extrem C‐terminal, generant les formes mutants VL‐el‐R108 i VL‐el‐R108T109,
respectivament.Amés,peraconfirmarlahipòtesisdel’efectedeOXT107‐Osobrelafalta
d’interaccióentreVL‐K107iVL‐E105,tambéesvaestendrelacadenaprincipalafeginttan
solsunresidudeGly, formantelmutantVL‐el‐R108G.Pera facilitar la lectura,hanestat
anomenatscomaC1(VL‐el‐R108G),C2(VL‐el‐R108),iC3(VL‐el‐R108T109).
V‐Capítol2 Discussió
173
5. DISCUSSIÓ.
S’haobtingutunmodeltridimensionaldel’estructurad’unscFvconstruïtapartir
de la seqüència de l’anticòs h3D6.v2 (AAB‐001, Elan Pharmaceuticals), dirigit contra la
seqüència N‐terminal del pèptid A1‐42 (TrpO2006066171). En la cerca d’estructures
homòloguesenelPDBesvantrobarmésde1000seqüènciesambunahomologiasuperior
al30%(resultatsnomostrats);entreaquestes, l’scFvambcodiPDB2GHTrp:Bmostràel
majorgraud’homologia,ambun70%deidentitati,tansols,2%degaps.Amésdel’alt
graud’identitat,el30%restantcontéun81%demutacionsconservatives,esadir,espot
considerarqueelgrauglobald’homologiaésalvoltantdel94%.Comésd’esperar,el6%
demutacionsnoconservativesestrobaenelsCDRjaquel’anticòsdelqualderival’scFv
motlleestàdirigitcontraunantigendiferent(SARS,Spikeproteinreceptorbindingdomain)
delpèptid‐A.El fetqueelmodelatges’hagirealitzatambunmotlleambungrauglobal
d’homologiatantaltfaqueelmodelresultimoltfiable.
Totiaixò,laregiódelconnectornoestàresoltaencapdelspdbshomòlegsdeguta
lasevaaltaflexibilitat.Aquetaflexibilitatésnecessàriaperapermetrel’empaquetamenta
l’espaidelsdosdominisqueconformenlaquimerarecombinant.Peraixò,vasernecessari
refinarl’estructura3Dd’aquestaregió,fetqueimplicàunareestructuraciódelarestadela
molècula.Concretament, laconformaciódeldominiVHesveumésmodificadaque ladel
dominiVL.Laraód’aquestfetresultadifícild’explicarsenseconèixerlaviadeplegament
delsaltres scFvsde l’alineamentmúltiple.Enprincipi,molts scFvspresentenunaviade
plegamentdedosestats (desplegat i natiu)perquèeldominiVH, queésqui contribueix
més a l’empaquetament d’ambdós dominis per contenir més residus triptòfan a la
interfície,ésmenysestablequeelVL(Worn,Pluckthun1998,Worn,Pluckthun2001).En
elnostrecasperò,eldominiVHéselmésestableis’acumulaunintermediarienequilibri,
elquefaquelaviasiguidetresestats(desplegat,intermediariinatiu)(Rivera‐Hernandez
etal.2013,Rivera‐Hernandez2013).
Una vegada seleccionat el model de mínima energia que modifica menys la
conformaciódelsdominisdesprésdelsrefinaments,s’hapogutclassificarlesregionsCDR
(MacCallumetal.,1996).EncaraqueelVH‐CDR3estàdescritcomelmésvariable(Olivaet
al.,1998),ipertanthauriadeseelmésdifícildeclassificar,enelnostrecastansolselVH‐
CDR1s’allunyadelconsensgeneral,perlasevallargàriailocalitzacióeneldomini.Aquest
fetapuntacapaunamajorimportànciad’aquestCDRenlainteraccióambl’antigen.
Elmodelfinalcontéun51%defulla‐β,un29%degirs‐β, iun20%de loops,en
concordançaambelplegament tot‐quecaracteritzaelplegament tipus Ig(Mattuetal.,
1998).Cadaundelsdominisconténoucadenes‐β,disposadesenduesfulles‐βperadoptar
V‐Capítol2 Discussió
174
laconformacióenbarril‐βcanònicad’Igs.LescadenesβBiβFdecadadominicontenenles
cisteïnesqueconformenelspontsdisulfurcaracterísticsd’aquesttipusdedominis, isón
lescadenesβFlesmésenterradesilesquemostrenunamajortendènciaal’agregació.Els
CDRsd’ambdósdominisestrobenoposatsalconnectoriexposatsalsolvent.Elconnector
uneixtotsdosdominissenseinteraccionaramblamolèculaiambunaaltaflexibilitat,fet
quepotserunadelescauses,encaraquenolaprincipal,delbaixrendimentenl’obtenció
deproteïnarecombinantdurant lasevaexpressióipurificació,tal icomestàdescrita la
bibliografia (Zheng,Baumann&Reymond2003).Lasuperfícied’interaccióentreelsdos
dominisésmoltgran,implicantcontactesterciàrisentreresidusforçaenterrats,comper
exempleelsresidusVH‐Trp47,VH‐Trp103iVL‐Trp89,tresdelscincresidusTrpqueconté
l’scFv‐h3D6iqueestrobensituatsalainterfíciehidrofòbica,desd’onestableixenfinsa5,
7i8interaccionsterciàriesambresidusdeldominioposat,respectivament.
Amb les coordenades del model, s’ha derivat informació sobre l’accessibilitat al
solventdelsdiferentsresidus,ladistànciaentreresidusd’interès,iunrastreigdetotesles
mutacions possibles a les diferents posicions. A més, amb la seqüència primària, s’ha
obtingut un perfil de la tendència a l’agregació i un alineament amb altres fragments
d’anticòs. Tota aquesta informació ens ha permès proposar una sèrie de mutacions,
dissenyades per augmentar l’estabilitat de la molècula i per trencar la tendència a
l’agregació(Rivera‐Hernandez2013).
5.1. Mutacionsalnuclihidrofòbicaugmentenlatendènciaal’agregaciódel’scFv‐
h3D6.
Malauradament, els resultats obtinguts per aquests mutants no han estat els
desitjats,iladisminuciódelatendènciaal’agregaciópermodificacióderesiduspuntuals
nohaestatpossible.D’aquestamanera,esconfirmaladificultatdemutarresidusenterrats
dinslamolècula,comtambélaimportànciadequelesproteïnesadoptinelseuplegament
natiu,pertaldedeixarmenysexposadeslesregionsambméstendènciaal’agregacióiser
menys vulnerables a l’agregació. D’aquests resultats també se’n extrau la necessitat de
dissenyarmutantsmúltiples,jaquealfersubstitucionspuntuals,estrenqueninteraccions
importantsperalplegament iempaquetamentde lamolècula,de formaque laprincipal
parelladelresidumutatquedalliureipotcausarcertarepulsióalinteriordelamolèculao
establirinteraccionsnonativesambaltresresidusdel’entorn,fetqueprovocal’alteració
delesinteraccionsnativesdelaproteïnai,pertant,unamajorexposicióalsolventdeles
regionsambméstendènciaal’agregació.
V‐Capítol2 Discussió
175
5.2. L’elongació del extrem C‐terminal augmenta l’estabilitat termodinàmica i
disminueixlatendènciaal’agregaciódell’scFv‐h3D6.
El model tridimensional de la molècula d’scFv‐h3D6 ha permès observar que
l’extremC‐terminaldelamolècula,quecorresponalresiduVL‐K107,segueixformantpart
delacadena‐βG.LescadeneslateralsdeVL‐K107iVL‐E105estrobenorientadescapala
mateixacaradelacadena‐βperò,laproximitatdelacadenalateraldelresiduOXT107‐O
afebleix la interacció electrostàtica entre VL‐K107‐NZ i VL‐E105‐OE1. La elongació del
extrem C‐terminal hauria de separar l’OXT107‐O de la cadena lateral de VL‐K107, i
propiciarl’estabilitzaciódel’estructurasecundàriadelamolèculaidisminuirlatendència
al’agregaciódel’scFv‐h3D6.
Mitjançant la desnaturalització química per urea i espectroscòpia de FTIR, s’ha
corroboratlahipòtesidel’elongaciódelextremC‐terminal.Elsexperimentscorresponents
hanestatrealitzatspelscompanysdelaboratoriRivera‐Hernández,GiBlasco‐Moreno,B.
Elsresultatsobtingutsestrobendetallatsenlatesidoctoralenredacciódelprimer,ienel
treballdemàsterdelsegon,aixícomenelrecentarticlepublicatalarevistamAb(Blasco‐
Moreno 2011, Rivera‐Hernandez 2013, Rivera‐Hernandez et al. 2013). Resumidament,
l’elongació de l’extremC‐terminal, a través de les formesmutants C1 (VL‐el‐R108G), C2
(VL‐el‐R108), i C3 (VL‐el‐R108T109), ha permès estabilitzar el plegament global de la
molèculafinsaun20%,resultatquehadonatllocaladesestabilitzaciódel’intermediari
tèrmici,conseqüentment,s’hadisminuïtlatendènciaal’agregaciódel’scFv‐h3D6.Amés,
s’ha comprovat que aquesta modificació no afecta la formació del complex Aβ1‐42:scFv‐
h3D6, que segueix formant fibresWL. Per tant, s’ha optimitzat el plegament de l’scFv‐
h3D6 sense afectar la seva capacitat protectora enfront els oligòmers d’Aβ1‐42 (Blasco‐
Moreno2011,Rivera‐Hernandez2013,Rivera‐Hernandezetal.2013).
En conclusió, no ha estat possible mutar les regions amb major tendència a
l’agregaciódegutaqueestrobenenterradesalsnuclishidrofòbicsd’ambdósdominis,però
si s’ha pogut augmentar l’estabilitat i disminuir la tendència a l’agregació mitjançant
l’elongació de l’extrem C‐terminal, completament exposat al solvent. Aquesta elongació
s’ha realitzat amb residus conservats a l’alineament múltiple, de tal manera que no
s’esperenproblemesdeimmunogenicitatal’horaderealitzarassajosinvivo.
CAPÍTOL 3: Estudi inicial, mitjançant tècniques
espectroscòpiques, de les propietats termodinàmiques
d’un domini variable d’Ig implicat en l’Amiloïdosi de
cadenalleugera.Mutacionsrestaurativesiestabilitat.
V‐Capítol3 Resum
179
1. RESUM.
L’amiloïdosi de cadena lleugera (AL) és causada per una aberrant secreció de
cadeneslleugeresd’Igs(LC)lliuresencirculació,queagreguenformantfibresamiloidesal
espaiextracel·lularsd’òrgansvitals.Elsdominisvariables(VL)delesLCs,estansotmesosa
hipermutacionssomàtiquesi,enelcasdepacientsd’AL,aquestesmutacionsprovoquenla
desestabilització de la molècula. Alguns autors relacionen aquesta pèrdua d’estabilitat
amb una major tendència a formar fibres amiloides, causants del dany tissular
diagnosticat en l’AL, tot i això encara cal aprofundir més en els mecanismes
amiloidogènics pels quals es formen aquests agregats, i en el paper dels intermediaris
oligomèricsenlacitotoxicitat.Enl’AL,el85%delpacientspresentendímersdeLCslliures
en el plasma (proteïnes Bence‐Jones), on els dominis VL de dues cadenes LC s’associen
entreellsadoptantlainterfíciecanònicadelsdímersd’VL‐VHd’Ig.Estudisprevisindiquen
una alteració conformacional de la interfície dimèrica formada per cadenes LCs
amiloidogèniques,respectelaproteïnagerminal;uncanviconformacionalquesemblaser
elresponsabledel’amiloïdosid’AL.
Enaquestcapítols’haestudiat,mitjançantl’úsdetècniquesespectroscòpiques(CD,
fluorescència, i FTIR), les propietats termodinàmiques del domini VL de la proteïna
amiloidogènica AL‐12, extreta d’una pacient d’AL, així com també del seus mutants
restauratius cap la seqüència germinal κI O18/O8, amb unamenor tendència a formar
fibresamiloides.Aquestsresultats inicials,handeservirperadeterminar lacontribució
d’unaúnicamutaciósobrel’estabilitatdeldominiVL,iclarificarsiexisteixunacorrelació
directa entre una menor estabilitat i una major tendència a l’agregació amiloide, una
relacióqueencaracomportamoltacontrovèrsiaentreelsdiferentsautors.
V‐Capítol3 Introducció
181
2. INTRODUCCIÓ.
L’amiloïdosi de cadena lleugera (AL) és una de les moltes malalties
amiloidogèniques conegudes en humans, on la proteïna precursora de la formació de
fibres amiloides és una cadena lleugera (LC) d’Ig monoclonal (Ig). Normalment, dues
cadenesLCs’associenambduescadenespesades(HC)peraformarl’heterotetràmerd’Igs,
que serà secretat al plasma sanguini per actuar com a anticòs monoclonal (mAb). Les
cadenesLC tambépodensersecretadescomahomodímers, conegudescomaproteïnes
Bence‐Jones. En el cas d’AL, hi ha una secreció aberrant de dímers d’LC, degut a una
anormal proliferació de cèl·lules plasmàtiques del moll de l’os, les encarregades de la
síntesi de LC. L’excés d’aquestes proteïnes lliures en el plasma esdevé amb la seva
agregacióenformadefibresamiloidesideposicióa l’espaiextracel·lulardemoltòrgans
vitals;aquestadeposicióprogressaràpidamentdonant llocauna insuficiènciaorgànica i
mortdelpacient.
Degut a que existeixen múltiples seqüències germinals codificants per Igs, i la
hipermutabilitat somàtica que aquestes pateixenper tal d’obtenir el gran espectre d’Igs
específiques,l’ALésconsideradaunadelesamiloïdosiméscomplexesdecontrolar.Cada
pacient conté una única seqüència proteica, amb diferent grau amiloidogènic i lloc de
deposició amiloide. En aquest sentit, es considera que certesmutacionsno conservades
desestabilitzenelplegamentnatiuidesencadenenl’AL.Mésqueelnombredemutacions
conservadesonoconservades,serialasevalocalitzaciódinslamolèculalaquetindriaun
efectesignificantsobrel’estabilitatproteica(Blancas‐Mejia,Ramirez‐Alvarado2013).
Les cadenes LCs contenen dos dominis: un domini variable (VL) i un domini
constant(VH).Cadaund’aquestsdominisadoptaunaestructuraglobularenbarril‐β,típic
del plegament d’Igs, format per 9 cadenes‐β (A, B, C, C’, C’’, D, E, F, i G), empaquetades
antiparal·lelament,exceptelescadenesβAiβGqueinteraccionendeformaparal·lela.Dins
del domini VL, els loops entre les cadenes‐β B‐C, C’‐C’’, i F‐G, formen les regions CDR
(ComplementaryDetermining Regions), responsables de l’especificitat i unió a l’antigen;
mentrequelarestadelaproteïnaformenlesregionsFR(FrameworkRegions).
En l’AL, ha estat reportat que la majoria de pacients acumulen fibres amiloides
formadesprincipalmentperdominisVL.Peraquestaraó,granpartdelsestudisdecadenes
LC tan sols inclouen aquest domini que, per la seva variabilitat, és el que pateix més
mutacionssomàtiques.Amés,el85%delpacientsd’ALpresentendímersdeLCslliuresen
elplasma(proteïnesBence‐Jones),onelsdominisVLdeduescadenesLCs’associenentre
ellsadoptant la interfície canònicadelsdímersd’VL‐VHd’Ig.Sovint,però, aquestsdímers
d’VLadoptenunaalteració conformacionalde la interfíciedimèrica, respecte laproteïna
germinal;uncanviconformacionalqueestariamoltrelacionatambl’amiloïdosid’AL.
V‐Capítol3 Introducció
182
En aquest capítol s’ha treballat amb la proteïna AL‐12, un domini variable d’Ig
implicatenl’AL.Lasevaseqüència(codiGenBankAF490912)derivad’unapacientde64
anys amb diagnòstic d’AL cardíaca, després de presentar símptomes de ronquera,
dificultatperempassar,pèrduadepes,fatiga,insuficiènciacardíaca,idolorepigàstric.La
supervivènciadesprésdeldiagnòsticvaserde10anys,ilapresènciadefibresamiloidesal
teixitcardíacvaserconfirmadaenlabiòpsia.ElsnivellsdecadenesLClliuresenelplasma
delapacientnovanserassajatsdurantelprocéspatològic,peròvanserdeterminatsmés
tard,apartirdelreservorideplasmacongelat,obtenintunvalordecadenesк‐LClliuresde
10.1mg/dL,quanelsvalorsnormalsestrobenalvoltantde0.7mg/dL.LaproteïnaAL‐12
té un 87 % d’identitat respecte la seva línia germinal кI O18/O8, una de les més
representadesenpacientsd’AL;iconté8mutacionssomàtiques(Taula3.1),delesquals7
mutacionsnosónconservatives.
Taula 3. 1. Localització de les mutacions somàtiques del domini variable AL‐12. En negreta es ressalten
les mutacions restauratives que han estat dissenyades i caracteritzades en aquest capítol.
Mutació respecte
кI O18/O8 Localització
S30T CDR1 (loop βB‐βC)
Y32H Cadena‐βC/Interfície dimèrica
S65R Cadena‐βD/β‐Hairpin
D70H Cadena‐βE/ β‐Hairpin
E81A Loop entre cadenes‐β E‐F
Q90E Cadena‐βF/Interfície dimèrica
N93Y CDR3 (loop βF‐βG)
/Interfície dimèrica
Y96Q Cadena‐βG/Interfície dimèrica
Lesestructurescristal·logràfiquesdel’AL‐12ilaкIO18/O8hanestatobtingudesi
dipositades prèviament (codi PDB 3DVF i 2Q20, respectivament) (Randles et al. 2009,
Baden et al. 2008b). La figura 3. 1‐Amostra l’estructura de l’AL‐12 amb les respectives
mutacions,ilasevalocalitzaciódinslamolèculaestrobadetalladaalataula3.1.
Tridimensionalment,sisde lesvuitmutacionses trobenproperesentreelles ies
localitzena lamateixacaradelbarril‐β(lamateixaque lesregionsdeCDRs).D’aquestes
mutacions, dues formen part de CDRs, i quatre es localitzen dins la interfície dimèrica,
formadaperlescadenes‐βC,C’,FiG.
V‐Capítol3 Introducció
183
Per solapament amb la proteïna germinal кI O18/O8 (Figura 3. 1‐B), l’AL‐12
adopta el típic plegament dels dominis к‐VL d’Igs. Així, sembla que aquestes proteïnes
tenen una elevada tolerància a les mutacions, en el sentit de mantenir el plegament
canònic.
Figura 3. 1. Estructura cristal·lina de la proteïna AL‐12 i solapament amb la proteïna germinal кI
O18/O8.A) Estructura cristal·lina de l’AL‐12. Les 8mutacions es troben representades en esferes grises i
marcades.B) Superposició de l’AL12 (groc) i la proteïna germinal кIO18/O8 (blau) remarcant que l’AL‐12
manté la interfície dimèrica canònica, mentre que canvia la disposició dels loops CDR3 i βC‐βC’. Figura
adaptadadeRandles,E.G.(2009).
Tot i l’aparent similitud amb la proteïna germinal, l’AL12 presenta dues regions
loopsubtilmentdesviadesdel’estructuracanònica.ElloopentrelescadenesβC‐βC’,ones
localitza la Pro40, i la regiódel CDR3, on es localitza laPro95.Amés, lesmutacions en
l’AL‐12provoquen,directaoindirectament,lapèrduadecertesinteraccionsintra‐domini,
concretament entre les cadenes‐β A‐B‐E, i una orientació diferent de cadenes laterals
localitzades a les cadenes‐β C‐F (Taula 3. 2). Un canvi conformacional que afecta a
l’estabilitatdeldomini.
V‐Capítol3 Introducció
184
Taula3.2.Detallilocalitzaciódelesinteraccionsalteradesoperdudesdegutalesmutacionsqueconté
laproteïnaAL‐12.
Prèviament als resultats exposats en aquest capítol, es va estudiar la correlació
entre l’estabilitatde l’AL‐12i la formaciódefibresamiloides(Sikkink,Ramirez‐Alvarado
2008).Enaquestestudiesconclouquelaforçaiònicanoafectaal’estructurasecundària
deldomini,peròaugmentasignificativamentlasevaestabilitattermodinàmicaiaccelerala
cinèticadeformacióamiloide,escurçantlafasedenucleació.Aixòdemostra,uncopmés,
que l’estabilitat i la tendència a l’agregació no sempre es troben directament
correlacionats(Cerda‐Costaetal.2009).
ElsexperimentsiresultatsexposatsenaquestcapítoldelaTesiDoctoral,hanestat
realitzats en col·laboració i durant l’estada de tres mesos al Laboratori de Protein
Misfolding,dirigitperlaDra.Ramírez‐Alvarado,M.,delaClínicaMayo(Rochester,US).A
partir dels experiments realitzats prèviament per Sikking, L.A., i Randles, E.G., s’ha
continuat l’estudi el domini VL amiloidogènic AL‐12. Mitjançant tècniques
espectroscòpiques, com ara CD i fluorescència, s’ha fet una comparació termodinàmica
entreeldominiVLAL‐12ielsquatremutantsrestauratiusH32Y,R65S,H70DiQ96Y.Per
FTIR, s’ha seguit la via d’agregació del domini AL‐12 i les seves variants, per tal de
extraure’n els principals canvis conformacionals que pateix la proteïna nativa. Aquests
resultatsinicialshandeservirperadeterminarlacontribuciód’unaúnicamutaciósobre
l’estabilitat del domini VL, i clarificar si existeix una correlació directe entre unamenor
estabilitatiunamajortendènciaal’agregacióamiloide.
Interacció perduda Tipus i Localització
T5‐Q24 Pont d’hidrogen. Cadenes‐β A‐B
V19‐I75 Pont d’hidrogen. Cadenes‐β B‐E
I21‐T72 Pont d’hidrogen. Cadenes‐β B‐E
Q24‐D70H Electrostàtica. Cadenes‐β B‐E
V‐Capítol3 MaterialsiMètodes
185
3. MATERIALSIMÈTODES.
3.1. MutagènesiDirigida.
Elsmutantsrestauratiusdel’AL‐12(H32Y,R65S,H70DiQ96Y)hanestatgenerats
emprant el kit de mutagènesi dirigida Quikchange® Multi Site‐Directed Mutagenesi Kit
(Agilent). El gen de la proteïna AL‐12, de 324 pb, ha estat prèviament clonat dins del
vectorpET‐12a (Sikkink,Ramirez‐Alvarado2008).Adiferenciad’altresmètodes, aquest
kitutilitzatansolsunúnicencebadorquecontéelcanvinucleotídic,elqualestraduiràen
elcanvid’aminoàciddesitjat,iquehibridasobreunDNAplasmídicdecadenasenzilla(ss‐
DNA).
Elsencebadorsdissenyatiempratperacadaundelsmutantssónsegüents:
‐ MutantH32Y:
‐ Parental5’GGACATTACCAACCATTTAAACTGGTATCAGCAAAAACC3’
‐ H32Y‐d 5’GGACATTACCAACTATTTAAACTGGTATCAGCAAAAACC3’
‐ MutantR65S:
‐ Parental 5’GGTTCAGTGGGCGTGGATCTGGGACACATTTCAC3’
‐ R65S‐d 5’GGTTCAGTGGGAGTGGATCTGGGACACATTTCAC3’
‐ MutantH70D:
‐ Parental 5’GGATCTGGGACACATTTCACTTTCACCATCAGCAGC3’
‐ H70D‐d 5’GGATCTGGGACAGATTTCACTTTCACCATCAGCAGC3’
‐ MutantQ96Y:
‐ Parental 5’GGACATTACCAACCATTTAAACTGGTATCAGCAAAAACC3’
‐ Q96Y‐d 5’GGACATTACCAACTATTTAAACTGGTATCAGCAAAAACC3’
Tal icomesdetallaa l’apartat2.1deMaterials iMètodesGenerals, lareaccióiel
cicle de PCR, la digestió amb l’endonucleasa DpnI, i la transformació a les cèl·lules
competentsXL‐Gold, s’harealitzat tal i com indicaelprotocoldelkitdemutagènesi.Les
seqüènciesdeDNAmutanthanestatcomprovadespelServeideSeqüenciaciódeDNAde
laClínicaMayo(USA).
V‐Capítol3 MaterialsiMètodes
186
3.2. Expressióheteròlogadel’AL‐12imutantsrestauratius.
Lasocad’E.coliempradaperal’expressióintracel·lulardeldominivariableAL‐12i
els seus mutants restauratius H32Y, R65S, H70D i Q96Y, ha estat la BL21sol(DE3),
mitjançantelvectord’expressiópET‐12aveureapartats3.1 i3.4deMaterialsiMètodes
Generals).
Per a l’expressió del domini variable AL‐12 i els seusmutants restauratius s’ha
seguitelsegüentprotocol:
1. Transformaciódelescèl·lulescompetentssoluBL21(DE3)ambDNAvectorpET‐12a::AL12,
seguintelprotocolexplicatal’apartat2.2.deMaterialsiMètodes.
2. Picarunacolòniaen80mLdemedi2xYTlíquidsuplementatambl’antibiòticAmp(selecció
delvector).
3. Incubarmàxim15henagitacióforta(250rpm)a37°C,perpromoureuncultiusaturat.
4. Inocular, en un volum final d’ 0.5 L, 30mL de cultiu saturat enmedi 2xYT amb Amp, i
incubar a les mateixes condicions anteriors fins arribar a una DO600 de 0.6‐0.8. (Per a
obtenirsuficientquantitatdeproteïna,normalments’hanexpressat2erlenmeyersde2L
amb0.5LdeLBpererlenmeyer).
5. Disminuirlatemperaturadelincubadora30°Ciinduirl’expressióamb0.8mMd’IPTGper
Ldecultiu.Eltempsd’induccióésdemàxim15ha30°C,enagitacióconstantde200rpm.
3.3. Purificacióproteïnaperiplasmàticasoluble.
Del’expressió,s’hapurificatlaproteïnaAL‐12ielsmutantsR65S,H70DiQ96Y
(12.6 kDa) de la fracció periplasmàtica soluble mitjançant cromatografies de bescanvi
iònicid’exclusiómolecular.
Un cop s’ha recuperat l’extracte cel·lular (veure apartat 3.5.2 de Materials i
MètodesGenerals), s’haprosseguit ambel protocol de rentat i recuperacióde la fracció
periplasmàtica,elqualnorequereixllisarlescèl·lulesjaquelesproteïnesdelperiplasma
s’alliberenperxocosmòtic,mantenintlamembranacel·lularpràcticamentintacte.
1. Resuspendreelpelletdecèl·lulesamb200mLdeTampódeResuspensió(Tris/HCl10mM,
pH8.7,prèviamentrefredata4°C)perLdecultiuexpressat,finsasertotalmenthomogeni.
2. Centrifugar a 43700 g durant 40 min a 4 °C, per a separar la fracció cel·lular de la
periplasmàticasoluble.
3. Recuperarelsobrenedantperdecantacióidescartarelpelletdecèl·lules.
4. Concentrarlamostrafinsauns150mL.
5. DialitzarlamostraaTampód’UniódeAEX.(Tris/HCl10mM,pH8.7).
V‐Capítol3 MaterialsiMètodes
187
3.3.1. Cromatografiadebescanvianiònic.
PeralprimerpasdepurificaciódeldominivariableAL12ielsseusmutants,s’ha
empratunacolumnadebescanvianiònic(AEX)ResourceQ‐6mL(GEHealthcare)(veure
apartat 3.6.2 de Materials i Mètodes Generals) Els tampons utilitzats per a la
cromatografiasónelssegüents:
‐ Tampód’UnióideRentat(A):Tris/HCl10mM,pH8.7.
‐ Tampód’Elució(B):Tris/HCl10mM,NaCl1M,pH8.7.
El pI de la proteïna és de 6.7, al utilitzar un tampó a pH 8.7, la mostra estarà
carregadanegativamenti interaccionaràamblareïnapositiva.Peral’eluciódeproteïna,
s’hautilitatungradientlinealambunincrementdelaforçaiònicadeΔ35%B/12VC(o
be,Δ0.5%B/mL).Lacapacitatd’uniódelacolumnaésde480mg(Lisozim,14.5kDa),per
tant,elvolumdemostrainjectatdependràdelaquantitatdeproteïnaenella.
Elprotocolseguitperarealitzarl’AEXéselsegüent:
1. Rentarlacolumnaamb10VCd’aiguaMilli‐Qpertald’eliminarl’etanolempratperalaseva
conservacióa4°C.
2. Equilibrarlacolumnaamb5VCdetampóA.
3. Filtrar la mostra un filtre PVDF de 0.45 μm i injectar‐la, via loop de 50 mL, a un flux
constantde2mL/min.
4. Rentar lacolumnaamb5VCdetampóA,peratald’eliminarcompletament lafraccióde
proteïnanounidaacolumna.
5. Aplicarungradientd’eluciódeΔ35%B/12VC,aunfluxconstantde1mL/min,finsarribar
al100%d’aquesttampó.Recol·lectarfraccionsd’1mL.
6. Rentarlacolumnaa100%detampóBdurantun1VC,aunfluxconstantde2mL/min,per
acabard’eluirtotalafracciódeproteïnaunida.
7. Reequilibrarlacolumnapassantdel0%al100%detampóAamb2VC,aunfluxconstant
de2mL/min.
8. DialitzarlamostraatampódeSEC(tampóPBS,pH7.4).
3.3.2. Cromatografiad’exclusiómolecular.
Enl’últimpasdepurificaciódel’AL‐12ielsseusmutants,s’haempratlacolumna
d’alta resolució HiLoad 26/60 Superdex 75 (GE Healthcare), amb un rang de
fraccionamentde3·103‐7·104Da(veureapartat3.6.3.1deMaterialsiMètodesGenerals).
Per a la SEC, cal que totes les proteïnes parteixin delmateix punt inicial, per evitar un
desfasament de la mostra al iniciar la cromatografia, la capacitat màxima de mostra a
V‐Capítol3 MaterialsiMètodes
188
carregar és de 10mL, volum relatiu al diàmetre de la columna. El tampó usat per a la
cromatografiahaestateltampóPBS,pH7.4.
ElprotocolusatperlaSEC,expressatenvolumsdecolumna(1VC=360mL),ésel
següent:
1. Rentarlacolumnaambmínim1VCd’aiguaMilli‐Qpertald’eliminarl’etanolempratpera
lasevaconservacióa4°C.
2. Equilibrarlacolumnaambmínim1VCdetampóPBS,pH7.4.
3. Filtrar la mostra un filtre PVDF de 0.45 μm i injectar‐la, via loop de 10 mL, a un flux
constantde2mL/min.
4. Eluir lamostraambmínim1VCdetampóPBS,pH7.4, i recol·lectar‐laen fraccionsde2
mL.
5. Rentarlacolumnaambmínim1VCd’aiguaMilli‐Qiconservarlacolumnaa4°Cenetanol
al25%.
6. Dialitzarlamostraatampófinal(Tris/HCl10mM,pH7.4).
7. Concentrar la mostra fins a un mínim de 0.24 mg/mL, necessària per als experiment
posteriors.
8. Aliquotareneppendorfsd’1mL,congelarambN2‐líquidiguardara‐20°C.
3.4. Purificacióproteïnacitoplasmàticainsoluble.
Adiferenciadelesaltresproteïnes,lamajorpartdelaproteïnamutantH32Yes
troba a la fracció citosòlica insoluble, la qual s’ha purificat emprant les mateixes
cromatografiesdescritesanteriorment,desprésd’haverestatsolubilitzada.
3.4.1. LLisiCel·lular.
Per tal de recuperar la fracció citosòlica, s’ha segut el següent protocol de lisis
cel·lular:
1. Resuspendre el pellet de cèl·lules ambTampódeLlisi (Tris/HCl10mM, pH8.7,
prèviament refredata4 °C),aunarelacióde6mLde tampópergramdepellet,
finsasertotalmenthomogeni.
2. Sotmetrelescèl·lulesa3ciclesdecongelacióambN2‐líquididescongelacióa37°C.
3. Sonicarlasoluciómitjançant6ciclesde45seg,apotència9iunafreqüènciadel50
%,mantenintlamostrasempreengelireposant3minentrecicles.
4. Centrifugara43700gdurant40mina4°C,perasepararlafracciótotalsolublede
lainsoluble.
5. Descartarelsobrenedantperdecantacióimantenirelpelletengel.
V‐Capítol3 MaterialsiMètodes
189
3.4.2. Solubilitzaciódelafraccióproteicainsoluble
Totiquepartdelaproteïnaexpressadaestrobaenlafracciócitosòlicasoluble,el
rendiment obtingut de purificar aquesta fracció és baix. Per tant, s’ha optat per a
recuperar tan sols la fracció insoluble.Pera fer‐ho, es resuspènelpellet amb10mLde
TampódeSolubilització(Urea6MenTris/HCl10mM,pH8.7,prèviamentrefredata4°C)
per L de cultiu expressat, fins a ser pràcticament homogeni. El pellet s’acaba de
resuspendreper agitació orbital a 4 °Cdurantmínim2h.A continuació es centrifuga a
43700 g durant 40min a 4 °C, per a separar la fracció solubilitzada de la insoluble, es
recuperaelsobrenedantperdecantació.
3.4.3. Replegamentperdiàlisidelafraccióproteicainsoluble.
A diferència del replegament gota a gota fet en altres purificacions (com per
exemple de l’scFv‐h3D6), en aquest cas el replegament de la proteïna és realitzat
directamentperdiàlisicapaltampóTris/HCl10mM,pH8.7,a4°C.Uncopreplegada,la
proteïna és purificada seguint el mateix protocol descrit anteriorment, mitjançant la
cromatografiaAEXideSEC.
3.5. Determinaciódel’estructurasecundàriaiterciàriadel’AL‐12imutants.
Pelque faals fonamentsde les tècniquesdescritesacontinuació(espectroscòpia
de CD, de fluorescència i de infraroig), es troben detallats a l’apartat 4 de Materials i
MètodesGenerals.
3.5.1. EspectreCDalUV‐llunyà.
Peraobtenirl’espectredeCDd’estructurasecundàriadel’AL12ielseusmutants
s’ha utilitzat l’espectrofotopolarímetre Jasco J‐715, tal i com es va fer per l’scFv‐h3D6
(veure Capítol 1). La concentració experimental de proteïna ha estat de 20 μM (0.24
mg/mL),disposadaenunacubetadequarsde0.2cm.Peramesurarl’espectrede260a
190nm,s’hanenregistrat20acumulacionsaunavelocitatde50nm/min,unarespostade
2seg,unaampladadebandad’1nm,iunaresolucióde0.1nm.L’espectredelplegament
natiudel’scFvhaestatdeterminata25°C;mentrequeperl’AL12imutants,haestata4
°C. A més, s’ha registrat l’espectre de l’estat desplegat (a 90 °C) i de retorn a la
temperaturainicial,pertaldedeterminarsiladesnaturalitzaciótèrmicadelaproteïnaés
reversibleono.
V‐Capítol3 MaterialsiMètodes
190
3.5.2. Espectredefluorescènciadelresidudetriptòfan.
Peraobtenirl’espectredefluorescènciadel’AL12ielseusmutantss’hautilitzatel
fluorímetre Varian Cary Eclypse, tal i com es va fer per l’scFv‐h3D6 (Capítol 1). La
concentracióexperimentaldeproteïnahaestatde20μM(0.24mg/mL),disposadaenuna
cubeta de quars d’1mL. La longitud d’ona d’excitació ha estat de 290 nm, enregistrant
l’espectre d’emissió de 310 a 410 nm, prenent 5 acumulacions a una velocitat de 600
nm/min, amb una obertura d’emissió i d’excitació de 5 nm, i una resolució de 1 nm. A
diferènciade l’espectredelplegamentnatiude l’scFv‐heD6,queva seradquirit a25 °C;
perl’AL12imutantsl’adquisicióhaestata4°C.Tambés’haregistratl’espectredel’estat
desplegat (a 90 °C) i, tornant a la temperatura inicial, s’ha determinat si la
desnaturalitzaciótèrmicadelaproteïnaésreversibleono.Elmàximdefluorescènciade
l’estatnatius’hautilitzatposteriormentperlesdesnaturalitzacionstèrmiquesiquímiques.
3.5.3. DesnaturalitzaciótèrmicaperfluorescènciaiCD.
La desnaturalització tèrmica s’ha seguit per espectroscòpia de CD al UV‐llunyà i
per fluorescència dels residus de triptòfan (fluorímetre Varian Cary Eclypse), a una
concentraciód’AL‐12de20μM,disposadaenunacubetadequarsd’1mL.Elsexperiments
s’hanregistratdesde4°Ca90°C,aunavelocitatde1°C/min,seguintlael·lipticitata218
nm, i la fluorescènciadel triptòfana338nm(longitudd’onad’excitacióa290nm, iuna
oberturadelesfinestresd’excitacióid’emissióde5nm).Durantladesnaturalització,per
CD i fluorescència,esvanenregistrarelsespectresa25°C,90°C i, tornantarefredar la
mostraa25°C.
3.5.4. Desnaturalitzacióquímicaperfluorescència.
Per a la desnaturalització química d’AL12 i els seus mutants, s’han preparat
concentracionscreixentsd’ureaentampóTris/HCl10mM,pH7.4(de0a6M,cada0.15
M). A cada un dels punts s’hi ha afegit 100 μl de proteïna a 22 μM, obtenint una
concentració final de 2 μM en un volum de 1.1 mL. Un cop les mescles han estat
equilibradesa4°Cdurantunes15h,s’haenregistratl’espectred’emissiódefluorescència,
de 310 a 410 nm, de cada una de lesmostres. Els paràmetres de lectura han estat els
mateixosqueelsdescritsal’apartat3.6,augmentantlaresolucióa0.3nm.
3.5.4.1. Obtenciódelsparàmetrestermodinàmics.
Peradeterminarelmàximd’emissióacadaconcentraciód’urea,s’hafetunajust
polinòmicdetresparàmetresutilitzantelprogramaOriginLab.Elsmàximsobtingutss’han
V‐Capítol3 MaterialsiMètodes
191
representatenfunciódelaconcentraciód’ureaacadamostra;laconcentraciófinald’urea
ha estat verificada mitjançant un refractòmetre manual. Els paràmetres d’equilibri de
desnaturalització s’han calculat, per a cada concentraciód’urea, segons l’equaciódedos
estatssegüent:
/ 1
on, ; ; ∆ / ;∆
ionladependènciadelafluorescènciaintrínsecaal’estatnatiu(Fn)ialdesplegat
(Fu),sobrel’augmentdelaconcentraciódedesnaturalitzant(x),éstingudaencompteen
termesdeb·xid·x,respectivament(aproximaciólineal).D’aquestamanera,s’hanobtingut
elsvalorsde[D]50%(concentraciódedesnaturalitzantenlaqualel50%delaproteïnaes
trobadesplegada),de∆GN‐U(energialliuredeplegament),ielvalordemN‐U(diferenciaen
l’accessibilitatalsolvententrel’estatnatiuieldesplegat).
3.6. Estudid’agregaciódel’AL12imutantsperFTIR.
Peral’estudid’agregaciódedominiAL12ielsseusmutants,lesmostreshanestat
dialitzades enfront Tris/HCl 10 mM‐D2O, pD 7.4, a una concentració de 200 μM (2.4
mg/mL). S’han obtingut els espectres d’infraroig a 4, 40, 50, 55 i 60 °C, temperatures
extretesapartirdelescorbesdedesnaturalitzaciótèrmica.Peral’obtenciódelsespectres
s’ha emprat l’espectròmetreVarianResolutionsPro, registrant l’espectrede4000a400
cm‐1, a una velocitat de 95 cm−1/min, una resolucióde2 cm‐1, i fent lamitjanade1000
acumulacions.L’espectrevasercorregitcontraelsorolldefons(obackground),irestant
elsenyaldeltampóidelvapor.
Eltractamentdedadesiladeconvoluciódelabandad’amidaI’s’harealitzatusant
elsoftwareGRAMS(Thermoscientific).Ladeconvolució,sobreunacorbaLorentziana,s’ha
obtingutusantunaampladadebandade17iunfactorKde2.2,enapoditzaciódetipus
Bessel.Elsajustosdelesbandessobrel’espectredeconvolucionats’hanrealitzatsobreuna
corbaGaussiana.Lesdadesfinals,s’hanexpressatentantpercentd’estructurasecundària.
V‐Capítol3 Resultats
193
4. RESULTATS.
4.1. Estructurasecundàriadel’AL‐12.
L’espectredeCDalUV‐llunyàdeldominiAL‐12natiu,a4°C,mostraunmínima
216nmiunmàxima200nm,quecorresponal’estructurasecundàriaenfulla‐βtípicadel
plegament d’Igs (Figura 3. 2‐A). A més, conté un segon mínim, a 235 nm, degut a la
contribució a l’espectre dels residus aromàticsde laproteïna (Sreerama,Venyaminov&
Woody1999).A90°Cesperdelmínima235nm,mentrequeelsenyaldelmínima216
nm augmenta, adoptant l’espectre típic de fulla‐β canònica. Que a l’espectre també
apareguielmínima208nm,faentendrequepartdel’estructuraestrobaenrandom‐coil,
talicomhaestatdescritperaaltresdominisVL(McLaughlinetal.2006).Aquestresultat
indica que esmanté certa estructura secundària a l’estat desnaturalitzat. L’espectre de
renaturalització obtingut al retornar a 4 °C, indica que el desplegament parcial de
l’estructurasecundàriaper temperaturade l’AL‐12ésreversiblepràcticamental100%,
talcoms’hareportatprèviamentperalaproteïnagerminalкIO18/O8ialtresdominisVL
amiloidogènics(Badenetal.2008b).
Figura3.2.EstructurasecundàriaiexposiciódeLW35del’AL‐12adiferentstemperatures.A)Espectre
deCDalUV‐llunyà.L’espectrea4°C(vermell)mostradosmínimsd’el·lipticitat(216nmi237nm),iunmàxim
a200nm.Als90°C(blau)esperdelmínima237nmiapareixunmínima208nm,indicantpartd’estructura
en fulla‐β canònica i part en random‐coil.L’espectre de renaturalització (verd) indica que el desplegament
parcialdel’estructurasecundàriaésreversible.B)EspectredefluorescènciadelresiduW35.A4°C(vermell)
elmàximd’emissiódeltriptòfannatiueslocalitzaa340nm,mentrequea90°C(blau)esdesplaçacapa355
nm,indicantqueelW35estrobacompletamentexposatalsolventi,pertant,quel’estructuraterciàrianativa
s’haperdut.L’espectrederenaturalització(verd)indicaqueeldesplegamentdeldominiésirreversible.
V‐Capítol3 Resultats
194
Per fluorescència de l’únic residu de triptòfan de la seqüència de l’AL‐12 (βC‐
Trp35),s’hanregistratselscanvisanivelld’estructuraterciàriasotapertorbaciótèrmica.
Elfetquetansolshihagiuntriptòfan,permettenirencomptetantelscanvisd’intensitat
de fluorescència com el desplaçament del màxim d’emissió. El màxim d’emissió de
fluorescènciadel’estatnatiu(4°C)eslocalitza340nm(Figura3.2‐B)i,a90°C,aquestes
desplaçacapalvermell,finssituar‐sea355nm,indicantunacompletaexposicióalsolvent
del residu Trp35 (Vivian, Callis 2001). Pel que fa a la renaturalització del domini al
retornara4°C,elsenyalrecuperaelmàximd’emissióa340nmperòlaintensitatésmolt
més alta, més inclús que la de l’estat desnaturalitzat a 90 °C. Per tant, mentre que
l’estructura secundària sembla reversible, l’estructura terciària de l’AL‐12 no retorna a
l’estatnatiu.
4.1.1. Estructurasecundàriadelsmutantsrestauratius.
Delamateixamaneraquel’AL‐12,s’haanalitzatperCDifluorescència,l’estructura
secundàriaiterciàriadelsmutantsrestauratiusH32Y,R65S,H70DiQ96Y.
ElsmutantsH32Y,R65SiH70DmostrenunespectredeCDmoltsemblantal’AL‐
12, tant a 4 °C com a 90 °C. Concretament, el mutant R65S guanya en estructura
secundària(mínima216nm),mentrequeelmutantH70Dmanté lamateixasenyalque
l’AL‐12 (Figura3.3‐A,B).Pelque faalmutantH32Y, semblaqueperd senyalde fulla‐β
nativa(mínima216nm),peròencaramantéelplegamentd’Igs(Figura3.3‐D).Encanvi,
elmutantQ96Yperdelmínima237nmindicantquealaconformaciónativaelTrp35està
col·locatdemaneradiferentalarestademutants,amésdequeesdesplaçaelmínimde
216nm cap a 218nm (Figura 3. 3‐C). Pel que fa a la reversibilitat a nivell d’estructura
secundària, el mutant H70D recupera pràcticament el plegament natiu, mentre que el
Q96Y ho fa però amb menor intensitat de senyal, i els mutants R65S i H32Y són
irreversibles,mantenintl’espectredel’estatdesnaturalitzatambunsenyalinferior.
V‐Capítol3 Resultats
195
Figura3.3.Estructurasecundàriadelsmutantsrestauratiusd’AL‐12.Totsquatremutantsmantenen
l’estructurasecundària típicad’Igs.A)MutantR65S.B)MutantH70D.C)MutantQ96Y.D)MutantH32Y.
Vermell:estatnatiua4°C,blau:estatdesnaturalitzata90°C,verd:estatrenaturalitzatalretornara4°C.
L’emissió de fluorescència dels mutants H32Y, H70D i R65S es comporta de la
mateixa manera que a l’AL‐12 (dades no mostrades), amb el desplaçament del màxim
d’emissióde340a355nm,degutal’exposicióalsolventdelresidutriptòfan,il’augment
dela intensitat.Tal icoms’haobservatperCD, l’estatnatiudelmutantQ96Ydescriuun
espectre de fluorescència diferent al WT i la resta de variants. A 4 °C ja presenta una
elevada intensitat de senyal, major inclús que l’espectre renaturalitzat, i el màxim
d’emissióéstrobadesplaçatcapalvermell,dadaexplicalaposicióalteradaimésexposada
delresiduTrp35delmutantQ96Yrespectealdel’AL‐12ilarestademutants(Figura3.4).
Capdelsmutantstampocrecuperal’estructuraterciàrianativaalreplegara4°C.
V‐Capítol3 Resultats
196
Figura 3. 4.Espectrede fluorescència del residuTrp35 delmutantQ96Y. A 4 °C (vermell) el màxim
d’emissiódeltriptòfanestrobadesplaçatcapalvermellrespecteelmàximtípicdelestatnatiu,a340nm,ila
intensitatdefluorescènciaésmajorquel’AL‐12ilarestademutants,indicantqueelresiduTrp35inicialment
ja téuncertgraud’exposició.A90°C(blau)elmàxims’acabadedesplaçar finsels355nm, indicantqueel
Trp35 es troba completament exposat al solvent i, per tant, que l’estructura terciària nativa s’ha perdut.
L’espectrederenaturalització(verd)indicaqueeldesplegamentdeldominiésirreversible,ipersevalamenor
intensitat,diferental’estatnatiu.
4.2. Desnaturalitzaciótèrmicadel’AL‐12.
Per tal d’aprofundir en la transició conformacional induïda per temperatura de
l’AL‐12,s’hamonitoritzatladesnaturalitzaciótèrmicaperCDifluorescència.L’el·lipticitat
enelmínima216nmcomençaadecréixer apartirdels40 °C, onelplegament guanya
contingutenfulla‐β(figura3.5‐A), ielsenyals’estabilitzaenarribarals55°C.Tal icom
s’ha comentat més amunt, l’estat desnaturalitzat és reversible. La transició tèrmica
obtingudaindicaunprocésd’agregacióenfulla‐βdelaproteïnaAL‐12,dadaqueconcorda
amb la corba de desnaturalització seguida per fluorescència (Figura 3. 5‐B). El màxim
d’emissió a 340nm, augmenta el seu senyal a partir dels 40 °C, lamateixa queper CD,
arribantalmàximd’emissióals55°C, ipartird’aquíelsenyaldecreix,sensearribara la
mateixaquel’estatnatiu.
L’increment de la fluorescència per temperatura, indica una transició
conformacionalanivelld’estructuraterciària,onsemblaqueelplegamentglobulardela
molèculaperdpartdelseuempaquetamentnatiuperassolirunestatintermediari,a55°C,
queseràprecursordel’agregacióenfulla‐βordenadaoamiloide.
V‐Capítol3 Resultats
197
Figura3.5.DesnaturalitzaciótèrmicaAL‐12.A)PerCDs’haseguitelcanvid’el·lipticitatdelmínima216
nm (vermell), el qual, a partirde40 °C començauna transició conformacional guanyant en estructura‐β, el
senyal s’estabilitza als 60 °C. La senyal de renaturalització (blau) mostra la reversibilitat de l’estructura
secundària.B)PerfluorescènciadelresiduTrp35,s’haseguitl’evoluciódelmàxima340nm(vermell),elqual
passaperunatransicióconformacionalals55°C.L’estructuraterciàrianorecuperaelsenyaldelestatnatiual
renaturalitzar(blau).
4.2.1. Desnaturalitzaciótèrmicadelsmutantsrestauratius.
Alcompararelcomportamentdel’AL‐12ambelsseusmutantsrestauratius,veiem
quetotsellsguanyensenyald’el·lipticitata216nmalaugmentarlatemperatura,seguint
elmateixpatród’agregació,enllocdedesplegament,quel’AL‐12(Figura3.6‐A).
ElsmutantsR65SiQ96Y,inicienlatransicióconformacionalméstardquel’AL‐12,
als 45 i 47 °C, respectivament. Pel que fa als mutants H70D i H32Y, inicien la
reestructuració de la fulla‐β nativa a partir dels 38 i 25 °C, indicant que ambdues
mutacionshandesestabilitzatelplegamentnatiu,sobretotpelquefaa l’H32Y,quevaria
fins a15 °C respecte elWT, i que el seu espectredeCD a 4 °C ja donavamenys senyal
inicial(Figura3.3‐D).
LaparticularitatdelplegamentnatiudelmutantQ96Yfadifícillasevacomparació
directe amb el WT, ja que inicialment presenta una estructura secundària i terciària
alterada (Figura3.3‐C i3.4).De lamateixamanera, ladesnaturalització tèrmica també
mostraaquestaalteració,onlaintensitatdelmàxima340nmésmoltmajorquealaresta
deproteïnes,fetquecorroborauncertdesempaquetamentinicialdel’estructuraglobular;
comtambélamajorexposicióalsolventdelW35enelespectrenatiua4°C(Figura3.4).A
més,latransicióquedescriuperdesnaturalitzaciótèrmicamostraunpuntd’inflexióals60
°C, i que ve seguit per una pèrdua de senyal de la nova estructura‐β adquirida, que
V‐Capítol3 Resultats
198
s’estabilitzaapartirdels70°C.Aixòpodriaexplicar‐secomqueelmutantQ96Yparteix
d’unestatdeplegamentdiferentalaresta,quedirectamentcomençaaagregarsensepatir
una obertura de la molècula, però a continuació també reorganitza per donar lloc a
l’agregatfinal,passantperunestatintermediarials60°C.
Figura3.6.Desnaturalització tèrmicadelsmutants restauratiusd’AL‐12.A)Desnaturalització tèrmica
seguidaperCD,seguintelscanvisd’el·lipticitatdelmínima216nm.B)Desnaturalitzaciótèrmicaseguidaper
elcanvideintensitatdefluorescènciaa340nm.
Pel que fa a la transició seguida per fluorescència, tots els mutants despleguen
abansd’agregar,excepteelcasespecialdelmutantQ96Y(Figura3.6‐B),passantperun
estat intermediari precursor de l’agregació. En consonància amb el CD, elmutant R65S
assoleixl’estatintermediariméstardqueelWT(58°Cpelmutanti55°Cperl’AL‐12),per
tant tindria menys tendència a l’agregació; mentre que l’H70D i el H32Y formen
l’intermediarimésaviat,a50i40°C,respectivament,corroborantladesestabilitzaciódel
seuplegament.L’H32Y,apartd’agregarmoltmésràpidque larestademutants,mostra
una transició molt poc cooperativa, tal com indica l’amplada del senyal de la transició
conformacionalperfluorescència.
V‐Capítol3 Resultats
199
4.3. Estabilitattermodinàmicadel’AL‐12.
Així com la desnaturalització tèrmica dels diferents dominis variables de l’AL12
mostra un procés d’agregació passant per un estat intermediari, la desnaturalització
química,mitjançanturea,dónallocaunacorbadedesplegamentdelestatnatiuseguintun
procésdedosestats,sensepoblarcapintermediarialaviadeplegament(Figura3.7‐A),i
queésreversibleperatotselsmutants(dadanomostrada).A3Md’ureal’AL‐12assoleix
un estat deplateau als 355 nm,associat al desplegament de la proteïna on el Trp35 es
troba totalmentexposatalsolvent, iqueindicaquelaestructuraterciàriadeldominiés
perd completament en aquesta concentració d’urea. La desnaturalització química, ha
permèsdeterminarelsparàmetres termodinàmicsdelprocésdeplegamentde l’AL‐12a
partirdelacorbadedesplaçamentdelmàximd’emissióadiferentsconcentracionsd’urea.
L’ajustdelacorbad’ureasobrel’equaciódedosestatsestrobarepresentatalataula3.3.
L’energialliuredeplegamentenaigua(∆GN‐U)deldominiAL‐12ésde‐18.50±0.84KJ·mol‐
1.ElvalordemN‐U,elqualreflexaladiferenciad’accessibilitatalsolvententrel’estatnatiui
eldesplegat,ésde7.95±0.33KJ·mol‐1·M‐1.Laconcentraciód’ureaenlaqualel50%del
dominiestrobadesplegat,[D]50%,ésde2.33M.
Ha estat descrit prèviament, que la proteïna germinal кI O18/O8, menys
amiloidogènicaquelaAL‐12,téunvalorde∆GN‐Ude‐25.60±0.23KJ·mol‐1,iuna[D]50%de
3.98M(elvalordemN‐Unohaestatdetallat)(Badenetal.2008b).Pertant,l’AL‐12mostra
unadesestabilitzaciósignificativadelseuestatnatiu,possiblementdegutales7mutacions
no‐conservatives que conté la seqüència germinal, i que algunes d’elles podrien estar
relacionadesamblamajorcapacitatamiloidogènicadelaproteïna,totiquenoalterenla
interfíciedimèricadeldímerVL.
Taula 3. 3. Ajust, sobre un model d’equilibri de dos estats, de la corba de desnaturalització química de
l’AL‐12 i els seus mutants restauratius. N = estat natiu, U = estat desplegat. *Dades prèviament
reportades per Baden, E.M. (2008).
Proteïna ∆GN‐U
(KJ∙mol‐1) mN‐U
(KJ∙mol‐1∙M‐1) [D]50% (M)
AL‐12 ‐18.50 ± 0.84 7.95 ± 0.33 2.33
R65S ‐17.99 ± 0.91 7.37 ± 0.35 2.44
H70D ‐12.37 ± 0.70 7.83 ± 0.34 1.58
Q96Y ‐11.69 ± 0.85 5.33 ± 0.33 2.19
H32Y ‐7.86 ± 0.36 6.19 ± 0.16 1.27
кI O18/O8* ‐25.60 ± 0.23 ‐ 3.98 ± 0.07
V‐Capítol3 Resultats
200
Figura3.7.Desnaturalitzacióquímicaperureadel’AL‐12ielsseusmutantsrestauratius.Elmàximde
fluorescènciadelresiduTrp35(340nm)ésrepresentatenfunciódelaconcentraciód’urea,itenintencompte
lafracciódeproteïnaplegada.L’ajustsobreunmodeldedosestatsestrobarepresentatperunalíniaacada
gràfica.A)AL‐12,B)R65S,C)H70D,D)Q96Y,E)H32Y,F)ComparaciódelsdiferentsajustosobtingutsperAL‐
12(negre),R65S(vermell),H70D(verd),Q96Y(groc)iH32Y(blau).
V‐Capítol3 Resultats
201
4.3.1. Estabilitattermodinàmicadelsmutantsrestauratius.
Pelquefaal’estabilitatdeldiferentsmutantsrestauratius,elresultatmésnotable
éslarestauraciódelresiduargininacapaserinaR65S(Figura3.7‐B,F/Taula3.3).Amb
aquestamutaciósimple,l’AL‐12augmentaunamicaelvalorde[D]50%(O.11M);totiqueel
valorde∆GN‐Uéspocmésbaixquel’AL‐12(0.5KJ·mol‐1).
Talicomjas’havistperdesnaturalitzaciótèrmica(Figura3.6),elsdosmutantsde
residu histidina (βC‐H32 i βD‐H70) desestabilitzen la molècula. L’H32Y (Figura 3. 7‐E,
F/Taula3.3)desestabilitzatotalment lamolècula(∆GN‐U=‐7.86±0.36KJ·mol‐1), fetque
indica que aquest residu juga un paper important en el plegament i compactació del
domini.Comtambéafectaalasolubilitatdelamolècula,jaqueésl’únicmutantques’ha
purificatdelafracciócitosòlicainsoluble.L’H70D(Figura3.7‐C,F/Taula3.3),enmenor
mesura, també disminueix el valor de ∆GN‐U (‐12.37 ± 0.70 KJ·mol‐1). En consonància,
ambdósmutants són els quepresentenuns valors de [D]50%més baixos (1.58 i 1.27M,
respectivament).
Pel que fa almutant Q96Y (Figura 3. 7‐D, F/Taula 3. 3), i el seu comportament
particular,obtéunvalorde∆GN‐Ude‐11.69±0.85KJ·mol‐1;queelseuvalordemN‐Usigui
el més baix de tots els mutants, 5.33 ± 0.33 KJ·mol‐1·M‐1, indica que ja l’estat natiu no
adoptaunplegamentcompacte,deixantexposadesalsolventcertesregionsquehaurien
detrobar‐seenterrades.Aquest fetexplica lacorbadedesnaturalitzaciótèrmicaseguida
per fluorescència, on directament comença a agregar sense necessitat de desplegar la
molècula.
4.4. Estudidel’agregaciódel’AL‐12perFTIR.
LatècnicadeFTIRéslamésadequadaperestudiarelscanvisconformacionalsque
pateix l’estructura secundària en fulla‐β durant el procés d’agregació, ja que la
deconvolució del espectre de la banda d’amida I’ diferencia entre diferents tipus
d’estructura‐β,jasiguinativa,amiloide,odeltipusWL(Zandomeneghietal.2004).
PeraldominiAL‐12,s’haenregistratl’espectredeFTIRadiferentstemperatures.,
Ladeconvolucióde l’espectredeFTIRa la regióde l’amida I’ es trobarepresentadaa la
figura3.8‐A‐C,idetalladaalataula3.4.Ladeconvoluciódel’amidaI’a4°C,generaquatre
bandesprincipals,centradesa1684,1668,1652,i1634cm‐1(Figura3.8‐A/Taula3.4).
V‐Capítol3 Resultats
202
Figura3.8.Deconvoluciódel’espectredeFTIRdelaregióamidaI’del’AL‐12adiferentstemperatures.
A)4°C,B)40°C,C)55°C,iD)60°C.Labandaverdaindicalacomponenta1634cm‐1,quecorresponalafulla‐
βnativaantiparal·leladebaixafreqüència.Envermell,labandaproperaals1620cm‐1,associadaalsagregats‐
β(WL/Amiloide).
Lesduescomponentsenfulla‐βantiparal·lelanativa,lad’altaibaixafreqüència,es
corresponenamblesbandesa1684i1634cm‐1respectivament,sent lasegona lamajor
bandadelespectrenatiu(48%),enconsonànciaambelplegamentbarril‐βdelsdominis
d’Igs i amb les dades obtingudes prèviament per cristal·lografia de raigs‐X (codi PDB
3DVF)(Randlesetal.2009).Lacomponentenloops/girs‐βeslocalitzaalabandade1668
cm‐1 (Byler,Susi1986,Waltheretal.2010). Inesperadament, labandacorresponenta la
V‐Capítol3 Resultats
203
fraccióenhèlix‐α,situadaa1652cm.1, representael21%delespectredeFTIR,quanel
dominiAL‐12tansolscontéun2%d’hèlix‐αsegonslesdadesdelcristall.
Al escalfar la mostra durant 3 min a 40 °C (Figura 3. 8‐B/Taula 3. 4), la
temperaturaons’inicialatransicióconformacional,disminueixlafracciódefulla‐βnativa
(1634cm‐1)afavordel’incrementdelesbandesa1684,1668i1652cm‐1,corresponentsa
fulla‐βnativa antiparal·lela, loop/girs‐β, i hèlix‐α. I apareix la bandad’agregats‐β (8%),
queesfadifícildediferenciarentreamiloideiWLjaquelesbandesestrobenallímitde
tots dos components (1619‐1620 cm‐1). Als 55 °C, on es pobla l’intermediari tèrmic,
segueixdisminuintlabandadefulla‐βnativa,de1634cm‐1,finsal15%,icreixlabanda
d’agregats‐βfinsal27%deltotaldelespectre,iquecorresponalsagregats‐βdetipusWL
(1627cm‐1).Labandad’hèlix‐αpassaaserun25%delespectreiésmanté(Figura3.8‐
C/Taula3.4).Als60°C,labandaWLs’estabilitzasentel21%deltotaldelespectre,ies
recuperapartdelafracciódefulla‐βquepujafinsel19%(Figura3.8‐D/Taula3.4).
V‐Capítol3 Resultats
204
Taula 3. 4. Deconvolució de l’espectre de FTIR de la regió amida I’ de l’AL‐12 i mutants restauratius a
diferents temperatures.
4 °C AL‐12 R65S H70D Q96Y H32Y
Estructura secundària Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Fulla‐β antiparal∙lela d’alta freqüència
1684 12 1684 12 1684 20 1685 19 1684 18
Loops/girs‐β 1668 15 1668 18 1669 19 1669 18 1669 19
Hèlix‐α 1652 21 1652 18 1652 23 1652 25 1652 24
Fulla‐β antiparal∙lela de baixa freqüència
1634 48 1635 43 1635 28 1636 24 1636 28
WL ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 1621 12
Amiloide 1614 4 1614 10 1619 9 1619 14 ‐ ‐
40 °C AL‐12 R65S H70D Q96Y H32Y
Estructura secundària Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Fulla‐β antiparal∙lela d’alta freqüència
1684 19 1684 16 1684 21 1684 19 1684 14
Loops/girs‐β 1669 19 1669 18 1670 20 1669 19 1669 20
Hèlix‐α 1652 24 1652 23 1652 25 1652 27 1652 27
Fulla‐β antiparal∙lela de baixa freqüència
1635 30 1635 31 1635 25 1636 26 1636 20
WL ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 1623 19
Amiloide 1619 8 1618 12 1619 9 1619 9 ‐ ‐
55 °C AL‐12 R65S H70D Q96Y H32Y
Estructura secundària Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Fulla‐β antiparal∙lela d’alta freqüència
1683 14 1684 17 1684 21 1684 21 1684 22
Loops/girs‐β 1669 19 1669 20 1669 20 1670 20 1670 20
Hèlix‐α 1652 25 1652 26 1652 27 1652 26 1652 26
Fulla‐β antiparal∙lela de baixa freqüència
1637 15 1636 18 1636 19 1636 21 1636 16
WL 1627 27 1623 19 1621 13 1621 12 1620 14
60 °C AL‐12 R65S H70D Q96Y H32Y
Estructura secundària Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Fulla‐β antiparal∙lela d’alta freqüència
1683 15 1684 19 1684 20 1684 20 1684 23
Loops/girs‐β 1669 20 1669 20 1669 21 1669 20 1670 20
Hèlix‐α 1652 26 1652 26 1652 27 1652 27 1652 26
Fulla‐β antiparal∙lela de baixa freqüència
1636 19 1636 18 1636 19 1636 18 1636 16
WL 1625 21 1622 16 1621 13 1622 15 1620 14
V‐Capítol3 Resultats
205
4.4.1. Estudidel’agregaciódelsmutantsrestauratius.
Pelquefaalsmutantsdel’AL‐12,ladeconvoluciódel’espectredeFTIRalaregió
de l’amida I’, dóna lloc a lesmateixesquatrebandesprincipalsqueper l’AL‐12, a1684,
1668, 1652, i 1634 cm‐1 (Figura 3. 9‐A‐D/Taula 3. 4). Sent la fracció de fulla‐β nativa
antiparal·leladebaixafreqüèncialamajoritàriaentotselscasos.
Figura3.9.Evolució,enfunciódelatemperatura,delsprincipalscomponentsdelespectredeFTIRala
regiódel’amidaI’del’AL‐12imutantsrestauratius.A)4°C,B)40°C,C)55°C,iD)60°C.
V‐Capítol3 Resultats
206
Tal i com s’ha vist en el espectre de CD (Figura 3. 3), a 4 °C, elsmutantsH70D,
H32Y i Q96Y tenen menys % de fulla‐β inicial que l’AL‐12, amb un 28 % per als dos
primers,iun24%peralQ96Y(Figura3.9‐A/Taula3.4).Mentrequel’R65Smantéquasi
lamateixaproporcióqueelWT(43%respecteel48%delWT).Ladisminuciódelabanda
enaquestmutantesveucompensadaperunincrementdelabandad’agregats‐βa1619‐
1620 cm‐1. Un cop s’inicia l’increment de temperatura, el mutant R65S és el que es
comportademaneraméssimilaralWT.Als40°C(Figura3.9‐B/Taula3.4),disminueixla
componentdefulla‐βnativa,a1634cm‐1,aexpensesdel’incrementdelesbandesa1684,
1668 i 1652 cm‐1, corresponents a fulla‐β nativa antiparal·lela, loop/girs‐β, i hèlix‐α. La
bandad’agregats‐βapareixenmajorpercentatge(un5%més)queenelWT.A40°C,els
mutantsH70D i Q96Y no varienmassa respecte els 4 °C, indicant que inicialment ja es
trobaven parcialment agregats. Pel que fa a l’H32Y, a 40 °C ja ha assolit la transició
conformacionalqueportaal’agregació,talicoms’havistperladesnaturalitzaciótèrmica
seguidaper fluorescència (Figura3. 6), i a aquesta temperatura la bandadeWL final, a
1627cm‐1, jaestrobabendefinida,aexpensesdeladisminuciódefulla‐βnativa(1687i
1634cm‐1),mentrequeelWTnohofafinsels55°C(Figura3.9‐C/Taula3.4).Encanvi,
elsmutantsR65S,H70DiQ96Y,augmentenprogressivament lafracciód’agregats‐βamb
latemperatura,finsqueals55°CjaqueesdefineixcomagregatsdeltipusWL.Finalment,
als60°C,totselsmutantspresentenunalleugeradisminuciódelabandadeWL,afavorde
lade1687cm‐1,lafulla‐βd’altafreqüència(Figura3.9‐D/Taula3.4).
V‐Capítol3 Discussió
207
5. DISCUSSIÓ.
L’AL pertany a la gran família d’amiloïdosis humanes sistèmiques. La seva
complexitatmolecularvedonadaperl’elevadavariabilitatdeseqüènciaquepresentenles
cadenesLCsd’Igs.Encondicionspatogèniques, lescèl·lulesplasmàtiquesdelmolldel’os
secreten grans quantitats de LCs lliures en el plasma, esdevenint les precursores de la
deposicióamiloideendiferentsteixitsorgànics.EstudiscomparatiusdeseqüènciadeLCs
depacientsd’ALhanaportatquelesmutacionssomàtiquesnoconservadessónlesquees
trobenmésrepresentadesenseqüènciesamiloidogèniques,isovintestrobenlocalitzades
eneldominivariable(VL)de lacadena.El85%delspacientsd’ALpresentendímersde
LCs en el corrent sanguini, on els dominis VL de cada cadena LC s’associen entre ells
adoptant la interfície canònica dels dímers d’VL‐VH d’Ig funcionals. A més, les fibres
amiloides es troben formades principalment per dominis VL (Blancas‐Mejia, Ramirez‐
Alvarado2013).L’alteraciódelainterfíciedimèricaendominisVLamiloidogènics,sembla
tenirunafortacorrelacióambladeposicióamiloideielgraudeseveritatdelamalaltia,tal
icoms’hademostratperaldominiVLAL‐09,undelsmésamiloidogènicsdescritsfinsara,
onlasevainterfíciedimèricaestrobarotada90°CrespectelagerminalкIO18/O8(Baden
etal.2008a).
A diferència de l’AL‐09, la proteïna AL‐12, que conté set mutacions somàtiques
respecte la germinal,manté la interfície canònica d’Igs, tot i això té unmajor potencial
amiloidogènicisegueixunacinèticadeformaciódefibresamiloidesmésràpida(Randles
et al. 2009, Sikkink,Ramirez‐Alvarado2008). Per tant, lesmutacions somàtiquespoden
tenirefectesestructuralsimportantsobéméssubtilsperò,d’algunamaneraoaltre,tenen
unefectealacapacitatamiloidogènicadelaproteïna.
5.1. Estructurasecundària,desplegamentiestabilitatdeldominiAL‐12.
LaproteïnaamiloidogènicaAL‐12presentaunplegamentnatiutípicd’Igs,ambel
mínimd’el·lipticitata216nmielmàxima200nm.Amés,presentaunsegonmínima235
nmques’atribueixalacontribucióalespectredeCDdelsresidusaromàticsdelaproteïna,
especialmentdelresiduconservatTrp35.Pelquefaal’espectredeFTIRdel’estatnatiude
l’AL‐12, la component en fulla‐β antiparal·lela nativa de baixa freqüència (1634 cm‐1)
representa lamajorbandadel espectrenatiu (48%), en consonància ambelplegament
barril‐βdelsdominisd’Igs iamb lesdadesobtingudesprèviamentpercristal·lografiade
raigs‐X (codi PDB 3DVF) (Randles et al. 2009). S’esperava que la segona banda més
representativadelespectredeFTIRfoslacomponentenloopigirs‐β,degutalplegament
tot‐βdeldomini.Enaquestsentit,lacomponentenloops/girs‐β,localitzadaalabandade
V‐Capítol3 Discussió
208
1668 cm‐1, representa el 15 % del total del espectre. Inesperadament, la banda
corresponentalafraccióenhèlix‐α,situadaa1652cm.1,representael21%delespectre
deFTIR,quaneldominiAL‐12tansolscontéun2%d’hèlix‐αsegonslesdadesdelcristall.
Amés,larenaturalitzaciótèrmica,seguidaperCDifluorescènciadelresiduTrp35,indica
que el domini és reversible a nivell d’estructura secundàriamentre que la terciària no
recuperal’estatnatiu.
La desnaturalització química, mitjançant urea, del domini AL‐12 dóna lloc al
desplegament total del domini seguint un procés de dos estats, sense poblar cap
intermediaridereacció.Elsparàmetrestermodinàmicsdelaproteïnamitjançantunmodel
dedosestats,plegatidesplegat,indiquenquel’estabilitatdeldominiAL‐12amiloidogènic,
amb un valor de ∆GN‐U de ‐18.50 ± 0.84 KJ·mol‐1, és inferior a la de la seva proteïna
germinalкIO18/O8(‐25.60±0.23KJ·mol‐1).Anivelldeseveritatdelamalaltia,l’AL‐12té
un potencial patològic entremig de la germinal кI O18/O8 i el domini AL‐09, el més
amiloidogènicreportat finsara, iquetéunvalorde∆GN‐Ude‐14.6KJ·mol‐1(Badenetal.
2008b).
5.2. Viad’agregaciódeldominiAL‐12induïdapertemperatura.
En llocdel desplegamentde lamolècula, la desnaturalització tèrmicadel domini
AL‐12, a 90 °C, dóna lloc a l’agregació de la proteïna, tal i com s’ha vist per CD i
fluorescència del triptòfan. El guany inicial en estructura secundària implica una
reorganització directa de la fulla‐β nativa, i la corba de desnaturalització seguida per
fluorescènciaindicaqueelW35s’exposaalsolventperadesprésenterrar‐sedenou.Això
concorda amb la transició conformacional a partir dels 40 °C, i l’aparició d’un estat
intermediarials55°C,queseràelprecursordel’agregaciódetipus‐β.
L’espectre de FTIR indica que a partir dels 40 °C s’inicia la reorganització
conformacional,deformaquel’estatintermediarijapresentaunaconformaciósimilarala
de l’estat agregat final, el qual ha perdut gran part de la component en fulla‐β
antiparal·lelanativa(19%respecteel48%inicial),a1634cm‐1,afavordel’augmentdela
bandaassociadaalsagregats‐βdetipusWL(21%respecteel0%inicial,a1625cm‐1).
A diferència de l’AL‐12, la desnaturalització tèrmica d’altres dominis VL
amiloidogènicsdescritsprèviament,comaral’AL‐09,haestatdescritacomaunacorbade
desplegament en la qual s’assoleix l’estat totalmentdesplegat, seguintunprocésdedos
estats plegat‐desplegat i completament reversible. Segons aquests resultats, és possible
extraure els valors de Tm (temperatura en la qual el 50 % de la població es troba
desplegada)iΔHN‐Uapartirdel’equaciódeVan’tHoff,comalternativaalsexperimentsde
calorimetria(John,Weeks2000).Degutaque lescorbesdedesnaturalitzaciótèrmicade
V‐Capítol3 Discussió
209
l’AL‐12no corresponen a unprocés de desplegament de dos estats, sinód’agregació en
fulla‐β ordenada, i que no acabade ser reversible al 100%, no s’hanpogut extraure els
valorsdeTmiΔHN‐Udel’AL‐12.
5.3. Efecte de les mutacions restauratives sobre l’agregació i estabilitat del
dominiAL‐12.
Les quatre mutacions restauratives de l’AL‐12 caracteritzades en aquest treball
(H32Y,R65S,H70D, iQ96Y) formenpart de cadenes‐βde l’estructura globular. La seva
caracterització, a nivell d’estructura secundària, mostra que totes elles tendeixen al
plegamentnatiutípicd’Igs,peròperdengranpartdelareversibilitatobservadaenl’AL‐12,
possiblement per estabilització del intermediari d’agregació, i desviament de la via de
plegamentcapalaviadeformaciód’agregats‐βmésestables.Lesduesmutacionssituades
a la interfície dimèrica (βC‐H32Y i βG‐Q96Y) adopten una estructura secundària nativa
relativament alterada. Concretament, la mutació H32Y perd senyal de fulla‐β nativa
(mínim a 216 nm) respecte l’AL‐12, mentre que la mutació Q96Y perd el senyal
corresponent als residus aromàtics (mínim a 237 nm). Per tant, la restauració, en totes
dues posicions, cap al residu altament conservat Tyr35 afecta el plegament natiu de la
proteïnaAL‐12.
Pelquefaalsparàmetrestermodinàmicsobtingutsapartirdeladesnaturalització
química, aquests indiquen que cap de les mutacions puntuals recuperen l’estabilitat
termodinàmicadelaproteïnagerminalкIO18/O8.Sinoalcontrari,toteselleshanestat
desestabilitzadoresrespectel’AL‐12.
Pelquefaal’agregació,elsdosmutantsrestauratiusderesidusd’histidina(H32Yi
H70D)inicienlatransicióconformacionalcapl’agregat‐βabansquel’AL‐12.Encanvi,en
elsmutantR65SiQ96Yl’estatintermediariapareixcapals55°C,pràcticamentigualquea
l’AL‐12.AlanalitzaraquestestransicionsperFTIR,totselsmutantspresenteninicialment
menyscomponentenfulla‐βnativa,aexpensesdelapresènciainiciald’agregatsdetipus‐
β,peraquestaraó,latransicióconformacionals’observapitjorqueenelcasdel’AL‐12.En
totselscasosperò,a60°C,labandade1620cm‐1,ésinferioraladel’AL‐12,afavord’un
augment de la banda de 1683 cm‐1, que es correspon a la fulla‐β antiparal·lela d’alta
freqüència.
Per tant,semblaaserqueenelcasde l’AL‐12, ladesestabilitzaciódeldominiva
relacionada amb unamajor tendència a l’agregació, tal i com s’observa a les corbes de
desnaturalització tèrmica, seguides per CD i fluorescència de triptòfan. Actualment al
laboratori, s’està treballant amb cinètiques de formació de fibres amiloides, assajades
mitjançant l’emissió de fluorescència del fluoròfor ThT i en funció del pH, per tal de
V‐Capítol3 Discussió
210
corroborarodescartaraquestapossiblerelació,aixícomperestudiarl’efectedelpHenel
procésdefibril·lació.Peraltrabanda,tambés’estàrealitzantlapreparaciódemostresper
microscòpia. Mitjançant TEM, s’espera completar els resultats del procés d’agregació
obtingutsperFTIRgràciesa l’obtenciód’imatgesdelsagregatsadiferentstemperatures.
TambéperTEM,esvolestudiarl’efectedelpHsobrelaviad’agregacióilamorfologiadels
agregats‐βdel’AL12idelsseusmutantsrestauratius.
5.4. Expectativesdefuturenelestudidel’agregaciódel’AL‐12.
Recopilantlesdadesobtingudes,podemafirmarquelarestauracióderesiduscap
alalíniagerminal,noimplica,excepteenalguncasexcepcional,coméselmutantH87Yde
la AL‐09 (Baden et al. 2008b), el retorn de les propietats conformacionals i
termodinàmiques germinals al domini amiloidogènic. Per tant, és improbable que una
únicamutaciósiguilacausadequeundominiVLesdevinguiamiloidogènicicausimalaltia.
Calmésinformacióexperimentalperapoderdescriuremésdetalladamentl’efecte
delesmutacionssomàtiquesdel’AL‐12enelcontextdelseupotencialamiloidogènic.Per
aquestaraó,actualments’estàtreballantenlescinètiquesdeformaciódefibresamiloides,
mitjançantfluorescènciadeThTienfunciódelpH,aixícoml’obtenciód’imatgesdeTEM,
del’AL‐12idelsseusmutantsrestauratius.Aquestspropersresultatshandeservirpera
tancarl’estudiinicialdeldominivariableAL‐12,implicatenl’AL.
Peraltrabanda, resulta indispensable,decaraaun futur,obtenir lesestructures
cristal·logràfiques dels diferents mutants restauratius, per entendre millor quin efecte
tenenaquestscanvisal’estructurai,també,alainterfíciedimèricaqueformenentreells,i
entendred’aquestamaneraelroldelsdímersVLenl’AL.
Qin et al. afirmen que els dímers VL‐VL de la proteïna amiloidogènica SMA,
estabilitzenl’estatnatiu,disminuintlaquantitatd’intermediaridesplegati,pertant,tenen
unefecteprotectorinhibintlaformaciódefibresamiloides(Qinetal.2007).Enelcasdela
proteïna amiloidogènica TTR, implicada en la malaltia d’amiloïdosi familiar, mutacions
puntualsenlasevaseqüènciapodencausarladissociaciódeltetràmernatiudonantlloca
unmonòmermolt inestable i precursor amiloide (Shnyrov et al. 2000). Aquest cas ens
porta a relacionar la pèrdua de l’estructura tetramèrica d’Ig, degut a un excés de LCs
lliuressecretadesenpacientsd’AL,ambladesestabilitzaciódeldominiilasevadeposició
amiloide.Pertant,totapuntacapunacombinaciódefactorsdesestabilitzants,iniciantper
lapèrduadeltetràmernaturald’Igilesmutacionssomàtiquesnoconservades,quepoden
implicardesdepetitscanvisd’interaccióintraiinterdomini,finsaprovocargranscanvis
conformacionals. Depenent del grau de desestabilització, la proteïna adquirirà un
V‐Capítol3 Discussió
211
potencial amiloide diferent, possiblement correlacionat amb una major cinètica de
fibril·lació.
QueelsdominisVLformindímerspotentendre’scomunefecteprotectorevitantla
lliure acumulació del intermediari amiloidogènic. Tanmateix, certes mutacions
localitzadesenresidusdelainterfíciedonenllocadímersnocanònics,ambunaestructura
globulardiferentdepenentdel canvi d’interaccions global queprovoquena lamolècula.
Per tant, a nivell de potencial amiloidogènic tan es pot considerar un fort precursor
fibril·larelmonòmerinestablesolublecomlasevaformadimeritzadaalterada;imésque
ladesestabilitzaciódelestatnatiu,serial’augmentdelatendènciaal’agregacióo,ditd’una
altra manera, l’increment d’estabilitat de les espècies intermediàries precursores de
l’agregacióeldetonantdel’amiloïdosi.
CAPÍTOL 4: Estudi per FTIR de la via d’agregació del
domini PSD95‐PDZ3: Reorganització estructural en
fibres‐βde tipusworm‐like icitotoxicitat, i implicacióde
l’hèlix‐α3enl’estabilitatiagregaciódeldominiPDZ3.
ARTICLESRELACIONATS:
Theinterconversionbetweenaflexibleβ‐sheetandafibrilβ‐arrangementconstitutesthemainconformationaleventduringmisfoldingofPSD95‐PDZ3
domain
Marín‐Argany,M.*,Candel,MA.*,Murciano‐Calles,J.,Martinez,JC.&Villegas,S.
BiophysicalJournal103,738‐47(doi:10.1016/j.bpj.2012.07.029)2012
*Firstco‐author
AthermodynamicstudyofthethirdPDZdomainofMAGUKneuronalproteinPSD‐95revealsacomplexthree‐statefoldingbehavior
Murciano‐Calles,J.,Martinez,JC.,Marín‐Argany,M.,Villegas,S.&Cobos,ES.
BiophysicalChemistry,SubmittedonSeptember,2013
Theimpactofextra‐domainstructuresandpost‐translationalmodificationsinthefolding/misfoldingbehaviourofthethirdPDZdomainofMAGUKneuronalprotein
PSD‐95
Marín‐Argany,M.*,Murciano‐Calles,J.*,Cobos,ES.,Villegas,S.&Martinez,JC.
*Firstco‐author
Articleenredacció
V‐Capítol4 Resum
215
1. RESUM.
Laviademisfolding,induïdapertemperatura,deldominiPDZ3,eltercerdominide
laproteïnaneuronalPSD95, éspobladaperun intermediari trimèric ric enestructura‐β
que dóna lloc a la formació reversible d’estructures fibril·lars altament ordenades.
Mitjançant la tècnica de FTIR, s’ha determinat que la via demisfolding és deguda a la
interconversió d’una fulla‐β flexible del domini cap a un intermediari que porta a la
formaciódefibresworm‐like(WL),sensepassarperunafasedenucleació.L’apariciódela
bandadeFTIR corresponent a les fibresWLva acompanyada, amésde la pèrduade la
fulla‐βflexible,d’unalleudisminuciódelacomponentdeloopsdel’estatnatiu,mentreque
la resta d’elements d’estructura secundària de la molècula es mantenen pràcticament
inalterats. Per microscòpia electrònica de transmissió, s’ha confirmat la presència de
fibres WL a partir dels 60 °C, temperatura on la població del intermediari trimèric és
màxima.Assajos de toxicitat emprant la línia cel·lular deneuroblastomahumà SH‐SY5Y
mostrenque aquesta citotoxicitat augmenta amesuraque el procésd’agregació avança.
L’anàlisi d’RMNper desplaçament químic en funció de la temperatura ha revelat que la
reorganitzaciódelafulla‐βalvoltantdelacadena‐β3promouelcanviconformacionalque
dónallocal’agregaciódeldominiPDZ3.
Amb l’objectiu de definir els determinants conformacionals implicats en la
regulacióde la funciódeldominiPDZ3, s’ha realitzatunacaracterització termodinàmica
delprocésdeplegamentid’agregaciódeldominiPDZ3,aixícomdelavariantmancadade
la tercera hèlix‐α, l’∆10ct‐PDZ3, i d’una sèrie de mutants específics de la interacció
d’aquesta hèlix‐α amb el domini PDZ3, els mutants E401R, D332G/P i E334L/Q. Els
experiments de FTIR i DSC, demostren la forta implicació de l’hèlix‐α3 en el plegament
globaldeldomini,lasevaestabilitatitendènciaal’agregació.
V‐Capítol4 Introducció
217
2. INTRODUCCIÓ.
Tal i com s’ha descrit a la introducció general, els dominis PDZ són un dels
principalsmòdulsdelesproteïnesmultidominihub,constituintl’elementestructuralmés
abundant enmamífers. Reconeixen els extrems C‐terminal de diferents pèptids lligands
amb una elevada especificitat, de forma que actuen com a suport estructural demoltes
proteïnes funcionals (Ivarsson 2012). La proteïna PSD‐95 és un exemple de sistema
multimodularhub i formapartde la famíliadeproteïnesMAGUK(MembraneAssociated
GuanylateKinase).Estrobalocalitzadaalaregiódedensitatpost‐sinàptica, iorganitzala
transducció de senyals i coordina el tràfic molecular de la sinapsis neuronal. Aquesta
proteïnaestàorganitzadaentresdominisPDZ,undominiSH3,iundominiGK,elsquals
estan connectats per loops flexibles que juguen un rolmolt important en la plasticitat i
funcionalitatdelaproteïnaglobal(Zhangetal.2013).
Enaquestcapítols’exposal’estudisobreeldominiPDZ3delaproteïnaPSD‐95,un
treballrealitzatdurantlatesidoctoral,iques’hadutatermeencol·laboracióambelgrup
derecercadelDr.JoséC.Martínez,delDepartamentdeQuímicaFísicadelaUniversitatde
Granada.Elsresultatsaquípresentatsparteixend’estudisprèviamentrealitzatsperaquest
grupiquepodenserconsultatsextensamentalaTesiDoctoraldelDr.Murciano‐Calles,J.
Aquesta, així com les publicacions del grup, seran citades al llarg del capítol per tal de
posarencontextelresultatsaexposar.
EldominiPDZ3delaPSD‐95repespecialimportànciadegutaquecontéunahèlix‐
αaddicionalalextremC‐terminal,queconnectaambelsegüentdominiSH3delaPSD‐95,i
quenoéspresent a la restadedominisPDZ.Anivell funcional, aquesta extensió regula
al·lostèricament l’afinitat del domini per unir‐se als lligands (Petit et al. 2009, Camara‐
Artigasetal.2010,Zhangetal.2011,Mostarda,Gfeller&Rao2012).
Desdelpuntdevista termodinàmic,elsprimersestudisd’equilibrideplegament
que es van realitzar sobre els dominis PDZ mitjançant tècniques espectroscòpiques,
mostravenunaúnicatransicióconformacionaldedosestats,plegatidesplegat.Unmodel
quenoacabavad’encaixarambl’elevadaplasticitatifuncionalitatd’aquestsdominis.Més
recentment, els estudisde calorimetriaduts a termeper elDr.Murciano‐Calles, J., i que
precedeixenelsresultatsseguidamentexposats,posenenevidènciaaquestmodelsimplei
proposenunnouplegamentdetresestatsdeldominiPDZ3,enelqualespoblaunestat
intermediari trimèric ric en estructura‐β, que es troba fora de la via de plegament del
domini(off‐pathway)idónallocalaformaciódefibresreversibles.Unmodelqueestroba
en consonància amb l’elevada plasticitat dels dominis PDZ (Murciano‐Calles et al. 2010,
Murciano‐Callesetal.2011).ResultamoltinteressantelfetdequeeldominiPDZ3ésun
dels pocs casos descrits on es segueix una via de plegament no natiu (d’ara endavant
V‐Capítol4 Introducció
218
anomenada de misfolding) que dóna lloc a agregats reversibles. A més, l’anàlisi de
l’equilibrid’altresdominisPDZdonaràpistessobresiaquestcomportamentdetresestats
ésgeneraldinslafamíliadedominisPDZ.
LatècnicadeDSC(DifferentialScanningCalorimetry)ésconegudaperserl’òptima
per a detectar qualsevol conformació en el equilibri que es pugui poblar durant el
desplegament. Segons la corba de desplegament tèrmic del domini PDZ3, a pH neutre i
sota incubació a 60‐70 °C, apareixen dues transicions endotèrmiques que indiquen
l’existènciade3estatsconformacionalsdiferents:l’estatnatiu,N;l’estatdesnaturalitzat,D,
iunestatintermediari,I.Amés,lesduesendotermesesdistancienentresiamesuraque
augmenta la concentració de proteïna, suggerint un cert grau d’associació
(oligomerització) del estat intermediari. D’aquesta manera es va establir que el
desplegamentdeldominiPDZ3‐PSD95segueixl’esquemasegüent:
Per DLS (Dynamic Light Scattering), es va caracteritzar l’equilibri d’associació‐
dissociaciódelestat intermediari. Inicialment,a20ºC, l’estatmonomèric(de11kDaiun
radide1.8nm)representael100%delapoblaciód’espèciesconformacionals.Mentreque
després d’incubar a 60ºC, desapareix l’estat monomèric a favor d’estructures
oligomèriquesde33kDai2.6nm.Aquestadadaapuntaqueelsmonòmerss’associenamb
unaestequiometriaden=3,formantunestatintermediaritrimèric,elqualaugmentade
grandària amesuraque s’allargael tempsd’incubació (fins a12nm, corresponenauns
100monòmers).
Energèticament,elprocésdeformaciódefibresapartirdelintermediaritrimèric
delPDZ3ésunexempleinusualperlesraonsdescritesseguidament:
‐ L’associació dels oligòmers no implica cap altre canvi conformacional de l’estat
intermediari,perquèlasegonatransiciódelacorbadeDSCjaésladedissociació
delintermediari.
‐ La fibril·lació,visualitzadaperTEMiseguidaper fluorescènciade l’ANS i laThT,
segueixuncomportamentnocooperatiu,nodepenentdenucleació.
‐ L’energialliuredeGibbsdel’estatnatiua25ºC(∆GN‐D=‐40kJ/mol)ésmajorque
lad’associaciódel’estatintermediaria60ºC(∆GD‐In=‐25kJ//mol).Raóperlaqual
lesfibresamiloidesformadessónreversibles.
nN⇄In⇄nD
V‐Capítol4 Introducció
219
‐ I per últim, la poca variació del valor d’entalpia entre l’intermediari i l’estat
desnaturalitzat (entalpia de dissociació) (∆HD‐In = ‐130 kJ/mol) indiquen que la
formaciódefibressegueixunmecanismebàsicamententròpic.
A condicions àcides, el domini PDZ desplega seguint un procés de dos estats.
Aquestcomportaments’atribueixalaprotonaciódelsresidusglutàmiciaspàrtic(pKa3‐4)
situatsal’hèlix‐α3(Glu401)ialloopβ2iβ3(Glu334iAsp332).ApHneutre,existeixuna
repulsió electrostàtica entre aquests residus carregats negativament, i que suposa
l’aperturadelahèlix-α3delarestadeldomini,l’exposicióalsolventderegionsambmés
tendènciaa l’agregació i,així, la formaciód’oligòmers trimèrics.Encanvi,apHsàcids, la
protonació evita aquesta repulsió i l’intermediari restaria com amonòmer inestable en
solució,fentqueelprocésd’agregaciósiguiméslent,depenentdenucleació,idonantlloca
fibresmésestablesiirreversibles(Murciano‐Callesetal.2011).
Elconjuntde lescaracterístiquesd’equilibriconformacionaldeldominiPDZ3fan
d’ell unmodel d’estudi de la formació d’oligòmers i fibres amiloides, i la seva possible
relacióambdeterminadespatologieshumanes.Anivelldefuncionalitatfisiològica,espot
concloure que l’entorn intracel·lular modula l’electrostàtica del domini PDZ3 i, com a
conseqüència, controla la seva afinitat espai‐temporal per a unir lligands, a través de
canvisconformacionalsenlahèlix-α3.
Amb l’objectiu d’aprofundir en els detalls moleculars de la via d’agregació del
dominiPDZ3,enaquestcapítols’exposenelsresultatsobtingutsmitjançantlestècniques
deFTIR,TEM,experimentsdecitotoxicitat,id’RMN.S’hadeterminatqueunadelesdues
fulles‐βdeldomini,concretamentlamésflexible,éslaprecursoradelareestructuracióde
l’estatnatiucapalaformaciódel’intermediariqueportaalaformaciódefibres‐βdeltipus
worm‐like (WL), mentre que la resta d’estructures secundàries resten pràcticament
inalterades. Gràcies a l’anàlisi d’RMN, en funció de la temperatura, realitzat per la Dra.
Candel, A.M., s’ha reportat tal interconversió a nivell de residu. En particular, s’ha
identificatlacadena‐β3comlaprincipalresponsabledelcanviconformacionalquepateix
laproteïnaiquel’arrossegacapalaviad’agregació.L’adquisiciód’aquesttipusdefibres
WL i el seu caràcter citotòxic ha estat confirmat per TEM i assajos de citotoxicitat,
respectivament.
Degut a l’absència d’informació sobre l’energètica i l’origen estructural d’aquest
canviconformacional,hemanalitzatperDSC,FTIR,ialtrestècniquesespectroscòpiques,el
comportamentdeplegament/agregaciódeldominiPDZ3enabsènciadelatercerahèlix‐α
addicional (residus 302‐492 de la PSD‐95), anomenat a partir d’ara ∆10ct‐PDZ3, on els
V‐Capítol4 Introducció
220
deuresidusdelextremC‐terminalqueformenl’hèlix‐α3hanestatdelecionats.Apriori,la
variant∆10ct‐PDZ3,adoptaeltípicplegamentdelsdominisPDZ,peròrealmentésmenys
estable que el PDZ3 original. I, mentre que el PDZ3 sencer segueix un procés de
desplegamentdetresestats,haestatnecessaridefinirunnoumodeldequatreestatspera
descriurecorrectamentlaviadedesplegamentdel’∆10ct‐PDZ3.
A part de la variant ∆10ct‐PDZ3, s’ha realitzat un anàlisis mutacional sobre els
residusimplicatsenlesinteraccionsentreeldominiil’hèlix‐α3.S’havistquelainteracció
entrelaLys355ielGlu401resultadeterminantenelscanvisobservatsdurantl’agregació
deldomini,mésquelainteraccióGlu334iArg399descritaanteriorment(Camara‐Artigas
etal.2010).Aquestaúltimaéscrucialpelquefaalaregulaciódel’afinitatperalspèptids,
perònotansiparlemanivelldereestructuracióconformacional.Finalment,s’haanalitzat
larellevànciadelacircularització,enformad’anelldesuccinimidina,delresiduAsp332a
través de les mutacions D332G i D332P, aquest últim emularia l’efecte de l’aspàrtic
circularitzat.
V‐Capítol4 MaterialsiMètodes
221
3. MATERIALSIMÈTODES.
3.1. ExpressióipurificaciódeldominiPDZ3imutants.
Les mostres de PDZ3 i les seves variants (∆10ct‐PDZ3, E401R, D332G, D332P,
E334L i E334Q) han estat purificades per el Dr. Murciano‐Calles, J., seguint el protocol
descrit a (Camara‐Artigas et al. 2010, Murciano‐Calles et al. 2010). Resumidament, les
seqüències del domini PDZ3 i els seusmutants (residus 302‐402de la PSD‐95), i la del
∆10ct‐PDZ3 (residus 302‐492) van ser subclonades dins el vector pBAT4 (EMBL Core
PurificationFacility, Heidelberg, Germany) i expressades en la soca d’E. coliBL21(DE3)
(Novagen,Madison,WI).Lescèl·lulesvanserllisadesiultracentrifugadespertald’obtenir
lafracciósoluble.Després,laproteïnavaserpurificadaperprecipitacióensulfatd’amoni
al 75 %, seguit d’una cromatografia d’exclusió molecular Superdex‐75 (GE‐Healthcare,
Fairfield,CT)entampóTris/HCl50mM,KCl400mM,pH7.5.Elrendimentdepurificació
obtingutvaser,d’aproximadament,15mgdeproteïnaPDZ3ielsseusmutantssimples,i
de8mgdeproteïna∆10ct‐PDZ3,perLdecultiud’LBexpressat.
LesmostresexperimentalsvanserdialitzadescontraeltampóKH2PO450mM,pH
7.5ieltampóPBS,pH7.4,a4°C.
Elcoeficientd’extinciómolar(ε278)empratperalaquantificaciódelesmostresva
serde2985u.Abs.·cm‐1·M‐1,peraldominiPDZ3imutants,ide1425u.Abs.cm‐1·M‐1,pera
la variant ∆10ct‐PDZ3. La massa molecular, confirmada per MALDI‐TOF (Centro de
InstrumentaciónCientífica(CIC)delaUniversidaddeGranada),vaserde11004Dai9898
Da,respectivament.
3.2. AgregaciódeldominiPDZ3imutants.
Abans d’induir la fibril·lació del domini PSD95‐PDZ3 per incubació a 60 °C, les
mostres,aunaconcentracióde8mg/mLientampóKH2PO450mM,pH7.5,tampóPBS,
pH 7.4, o en tampó KH2PO4 50 mM, 150 mM d’NaCl, pH 7.5, van ser liofilitzades i
resuspesesen200μldeD2O,icentrifugadesa10.000gdurant5min.
Els diferentsmutants van ser tractats de lamateixamanera però tan sols es va
prepararlamostraentampóKH2PO450mM,pH7.5.
Peralafibril·lació,lesmostresvanserincubadesa60°C,durant0,4,8i16dies.
3.3. Espectroscòpiad’infraroigambtransformadadeFourier.
Pelquefaalsfonamentsdelatècnicad’infraroigdescritaacontinuació,estroben
detallatsal’apartat4.5deMaterialsiMètodesGenerals.
V‐Capítol4 MaterialsiMètodes
222
Mitjançant l’espectròmetre Varian Resolutions Pro, es van obtenir els espectres
d’infraroig de les diferents mostres prèviament fibril·lades. Primer, la mostra inicial
(temps 0 dies), a 25 i 60°C, i posteriorment les de diferents temps d’incubació a 60 °C,
sempre deixant temperar la mostra 5 min abans de la lectura. Els espectres es van
registrarde4000a400cm‐1,aunavelocitatde95cm−1/min,unaresolucióde2cm‐1,ifent
la mitjana de 1000 acumulacions. L’espectre va ser corregit contra el soroll de fons
(background),irestantlasenyaldeltampóidelvapor.
Eltractamentdedadesiladeconvoluciódelabandad’amidaI’s’harealitzatusant
elsoftwareGRAMS(Thermoscientific).Ladeconvolució,sobreunacorbaLorentziana,s’ha
obtingutusantunaampladadebandade17iunfactorKde2.2,enapoditzaciódetipus
Bessel.Elsajustosdelesbandessobrel’espectredeconvolucionats’hanrealitzatsobreuna
corbaGaussiana.Lesdadesfinals,s’hanexpressatentantpercentd’estructurasecundària.
3.4. Microscòpiaelectrònicadetransmissió(TEM).
Les mateixes mostres del domini PDZ3 induïdes a fibril·lació i analitzades per
FTIR,vanservisualitzadesperelmicroscopielectrònicdetransmissióHitachiH‐7000,del
serveidemicroscòpiadelaUAB,ianalitzadesambelsoftwareDigitalMicrograph(Gatan).
Per a fer‐ho, lesmostres van ser absorbides en reixetes de coure recobertes de
carboni, i tenyides negativament amb acetat d’uranil al 1 % (veure apartat 4.6.1 de
MaterialsiMètodesGenerals).
3.5. AssajosdecitotoxicitatdeldominiPDZ3.
ElsassajosdecitotoxicitatdelsagregatsdePDZ3esvanrealitzarmitjançantlalínia
cel·lular de neuroblastoma humà SH‐SY5Y (veure apartat 5.5 de Materials i Mètodes
Generals).
Prèviament,esvainduirlafibril·laciódeldomini,talicoms’haexplicatal’apartat
3.2, però aquest cop a una concentració de 44 mg/mL en tampó PBS, pH 7.4. Un cop
agregades,esvaafegir10μldemostraperpoudecultius,obtenintunaconcentraciófinal
de4.4mg/mLperpoude100μl,iesvadeixarincubantdurant24ha37°C.
Seguidament es va mesurar el % de viabilitat del cultiu cel·lular mitjançant el
mètode d’MTT (veure apartat 5.5.1 de Materials i Mètodes Generals). Cada condició
consistiaen6rèpliquesperexperiment,i2experimentsindependentsvanseranalitzats
estadísticament per nivell de significança (test de rangs signats de Wilcoxon, SPSS),
desprésdenormalitzar lesdadesusant la concentracióde la condició tampóPBScoma
referència.Elsresultatsrepresentenl’errorSEM(StandardErroroftheMean).
V‐Capítol4 MaterialsiMètodes
223
3.6. ExperimentsdeDSC,DLSiCDdelesdiferentsvariantsdeldominiPDZ3.
Els experiments de calorimetria (DSC, Differential Scanning Calorimetry), DLS
(DinamycLightScattering)iCD(CircularDichroism)hanestatrealitzatspelDr.Murciano‐
Calles,J.delaUniversitatdeGranada.
Resumidament,lesmostresaestatanalitzadesentampóKH2PO450mM,pH7.5ia
4 °C. Els experiments de DSC han estat registrats a una velocitat de 1.5 K/min, i a
concentracionsde0.4a7.2mg/mL,mitjançantelcalorímetreVP‐DSC(MicrocalINC.),tali
com s’ha descrit prèviament (Viguera et al. 1994). Els experiments de DLS i CD també
s’hanrealitzatsegonss’hadescritanteriorment(Cobosetal.2004,Cobosetal.2009).El
pesmolecular de les espècies ha estat calculat a partir del respectiu radi hidrodinàmic,
emprant el model de “proteïna globular” inclòs en el software de l’instrument de DLS
(DynaPro,DYNAMICSV6,WyattTechnologyCorporation).
3.7. Espectroscòpiad’RMN.
Els experiments d’espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (RMN) han
estatrealitzatsperlaDra.Candel,A.M.,delaUniversitatdeGranada.
Resumidament,laproteïnamarcadaamb15Nvaserpurificadad’uncultiucel·lular
crescut en medi mínimM9 amb 15NH4Cl com a única font de nitrogen, d’acord amb el
mètodedescritanteriorment(Marley,Lu&Bracken2001).
Lesmostresperalsexperimentsd’RMNvanserpreparadesa8mg/mLen90%
H2O/10%D2OientampóKH2PO450mM,pH7.5.
L’espectredecorrelació1H‐15Nvaserregistratdesde25a60°C,aintervalsde2.5
°C,mitjançant l’espectròmetreVarianNMRDirect‐DriveSystem600MHz(freqüènciade
l’1Hde600.25MHz)equipatambcryoprobe.Lesdadesd’RMNvanserprocessadesusant
NMRpipe i analitzades usant SPARKY. L’assignació del domini PDZ3 va ser obtingut
emprant els mètodes estàndards. Les intensitats dels pics a l’espectre 2D van ser
determinadesusantlarutinadepeak‐pikingenSPARKY.
V‐Capítol4 Resultats
225
4. RESULTATS.
4.1. EspectredeFTIRdeldominiPDZ3natiu.
Ladeconvoluciódel’espectredelabandad’amidaI’deldominiPDZ3a25°C,en
tampóKH2PO450mM,pH7.5,generasisbandesprincipalscentradesa1680,1669,1659,
1650,1640, i1631cm‐1, i tresbandesminoritàries centradesa1692,1620, i1606cm‐1
(Figura4.1‐A/Taula4.1).
Figura4.1.Descomposicióenbandesdel’espectredeconvolucionatdeFTIRdeldominiPDZ3adquirit
entampóKH2PO450mM,pH7.5.A)25°C,B)desprésde5mina60°C,C)desprésde4diesa60°C, iD)
després de 8 dies a 60 °C. La banda de 1640 cm‐1 és representada en verd, i la banda de 1620 cm‐1 és
representadaenvermell.Larestadebandessónrepresentadesengris.
V‐Capítol4 Resultats
226
Labandamésrepresentativa,ambun28%del’àreatotaldelespectre,éslocalitza
a1640cm‐1,ideprimerespodriaserassignadacomacomponentenrandom‐coil(Byler,
Susi1986).Totiaixò,aquestvalorestrobaallímitentreelrangatribuïtalacontribució
enrandom‐coil(1645‐1640cm‐1)il’atribuïtalacomponentenfulla‐βantiparal·lelanativa
de baixa freqüència (1630‐1640 cm‐1) (Byler, Susi 1986, Zandomeneghi et al. 2004).
L’espectre de CD del domini PDZ3, obtingut prèviament (Murciano‐Calles et al. 2010),
mostraunperfilcanònicdefulla‐β,ambelmínima218nm(Figura4.2),pertant,quela
majorbandadel’espectredeFTIRsiguiunacomponentenfulla‐βantiparal·lelanativade
baixafreqüènciaprenméssentit.
Figura4.2.EspectredeCDdeldominiPDZ3en tampóKH2PO450mM,pH7.5. Enverdes representa
l’espectre de la proteïna nativa a 2 °C y en vermell l’espectre a 98 °C. Per a comprovar la reversibilitat, la
mostraesvareplegardenoubaixantlatemperaturafinsa2°Ciesvaregistrarl’espectredesprésde5min
d’incubació.FiguraadaptadadeMurciano‐Calles,J.(tesisdoctoral,2011).
Apart,esgeneraunaaltrabanda,a1631cm‐1,queestrobaenelrangassignatper
a la component en fulla‐β antiparal·lela nativa de baixa freqüència, però tan sols
contribueixenun14%delespectre(Taula4.1),encontradel34%obtingutapartirde
l’estructuracristal·logràficadelPDZ3,resoltaprèviament(Camara‐Artigasetal.2010).Per
tant, lanostrahipòtesi inicialvaserque labandaa1640cm‐1corresponiaauna fracció
moltflexibledelafulla‐β,iquefàcilmentesdesorganitzaensolució;fetqueconcordaamb
la flexibilitat conformacional que requereix el domini PDZ3 per tal d’assolir l’elevada
capacitat d’unió que té cap als pèptids lligands (Saro et al. 2007). Per altra banda, la
componentenfulla‐βantiparal·lelanativad’altafreqüència,eslocalitzaa1681cm‐1,itan
solscontribueixenun8%del’àreadel’espectre.
V‐Capítol4 Resultats
227
Lacomponentengirs‐βestrobaa1669i1659cm‐1(Byler,Susi1986),enaquesta
últimabandatambéhicontribueixenelsloops(Heredia,DeLasRivas2003),irepresenta
el16%del’àreatotal.Lacomponentenhèlix‐α,centradaa1650cm‐1,contribueixnomés
enun16%de l’espectre,menysdel24%donatper lesdadescristal·logràfiques(veure
apartat5.2deDiscussió)(Taula4.1)(Camara‐Artigasetal.2010).
Taula4.1.Descomposicióenbandesdel’espectredeconvolucionatdeFTIRdeldominiPDZ3adquirit
entampóKH2PO450mM,pH7.5.
25 °C
60 °C, 0 dies
60 °C, 4 dies
60 °C, 8 dies
60 °C, 16 dies
Estructura secundària Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Girs‐ 1694 1 1695 1 1692 2 1692 2 1694 1
Fulla‐β antiparal∙lela d’alta freqüència
1680 8 1684 2 1679 12 1679 12 1680 10
‐ 1676 9 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
Girs‐ 1669 9 1669 7 1668 8 1668 8 1668 11
Loops / Girs‐ 1659 16 1659 15 1658 13 1658 13 1659 12
Hèlix‐α 1650 16 1649 16 1648 13 1648 13 1649 16
Fulla‐β flexible / Random coil
1640 28 1640 19 1640 13 1640 13 1640 11
Fulla‐β antiparal∙lela de baixa freqüència
1631 14 1631 16 1631 13 1631 13 1630 18
WL /Amiloide 1620 4 1620 12 1620 22 1620 22 1621 19
Cadenes laterals 1606 4 1606 3 1606 4 1606 4 1607 3
Pelquefaalesbandesminoritàries,labandaa1620cm‐1corresponalsagregats‐β
(Zandomeneghietal.2004),ilade1606cm‐1alescadeneslaterals(Arrondoetal.1993);
la banda a 1692 cm‐1 és pot considerar negligible (Taula 4. 1). A l’estat natiu, la banda
assignada als agregats‐β, a 1620 cm‐1, tan sols representa el 4% del espectre, però ja
reflexa la tendència del domini PDZ3 a l’agregació, tot i ser trobar‐se a temperatura
ambient.Aquestabandaestrobaentrelesduescomponentsd’agregatsfibril·larsordenats,
lesfibresWL(de1630a1620cm‐1)ilesfibresamiloides(de1620a1615cm‐1).
4.1.1. EspectredeFTIRdel’agregaciódeldominiPDZ3.
L’espectrea60°Cs’haadquiritdesprésd’incubarlesmostresdesdeminutsfinsa
varisdies, jaques’haviavistqueaaquestatemperaturaes formal’intermediaritrimèric
precursor de fibres amiloides reversibles (Murciano‐Calles et al. 2010). Un cop dins la
cel·la de FTIR, lesmostres van ser equilibrades durant 5min a 60 °C abans d’adquirir
l’espectre.
V‐Capítol4 Resultats
228
Elprincipalcanvienl’espectredesprésdelaprimeraincubacióa5min(Figura4.
1‐B/Taula4.1),ésunaapreciabledisminuciódelabandaa1640cm‐1,corresponentala
fulla‐β flexible, a favor de l’increment de banda a 1620 cm‐1, la dels agregats WL o
amiloide. Aquesta reorganització conformacional entre fulles‐β fa que augmenti el grau
d’empaquetament entre cadenes‐β, i per tant el nombre d’ona baixa, tal i com ha estat
descrit en altres processos de fibril·lació (Zandomeneghi et al. 2004, Cerda‐Costa et al.
2009).Pelquefaalabandaatribuïdaalafulla‐βantiparal·lelanativadebaixafreqüència,
a 1631 cm‐1, i la de l’hèlix‐α, a 1650 cm‐1, resten quasi inalterades. Degut a les seva
complexitat i les discrepàncies d’assignació entre autors, resulta difícil d’interpretar els
canvisa laregióde1700‐1660cm‐1,aixícomladivisióendosdelabandade1680cm‐1
(Olingeretal.1986,Arrondoetal.1993).
Quan lamostra és incubada durant 4 dies a 60 °C (Figura 4. 1‐C/Taula 4. 1), la
reorganització conformacional entre fulles‐β continua, decreixent la fracció flexible de
fulla‐βnativafinsal13%(desdel28%a25°C),iaugmentantlabandaWL/amiloidefins
al22%(desdel4%a25°C).Amés,semblaque labandadegirs‐β/loops,a1650cm‐1,
tambétendeixadisminuir.
Finalment, després d’incubar lamostra durant 8 i 16 dies a 60 °C (Figura 4. 1‐
D/Taula4.1), l’espectredeFTIResmantépràcticament igualqueals4diesd’incubació.
Aixòimplicaquelareorganitzacióquegeneral’estatintermediaritrimèrics’assoleixals4
diesd’incubació.
4.1.2. Influenciadelaforçaiònicasobrel’agregaciódeldominiPDZ3.
Pertaldecomprovarl’efectedelaforçaiònicasobrelaviad’agregaciódeldomini
PDZ,s’hacomparatelsresultatsdeFTIRobtingutsentampóKH2PO450mM,pH7.5,amb
elsespectresentampóPBS,pH7.4.Talicoms’observaalafigura4.3‐A,B,l’agregaciódel
domini es comporta de manera similar en totes dues condicions, però el canvi
conformacionalcapafibresWL/amiloidesentampóPBS,s’assoleixals5primersminuts
d’incubacióa60°C,indicantquelaforçaiònicaacceleraelprocésdereorganitzaciódeles
fulles‐β,perònocanviaeltipusdeviad’agregació.
V‐Capítol4 Resultats
229
Figura 4. 3. Evolució de les principals components del espectre de FTIR, sota diferents condicions,
durant la incubacióa60 °C.A)En tampóKH2PO450mM,pH7.5.B)En tampóPBS,pH7.4. C)En tampó
KH2PO450mM,pH7.5,més150mMd’NaCl.Lacomponentde1659‐1658cm‐1haestatdesignadacoma1660
cm‐1 per tal de facilitar la gràfica (resolució del espectre inicial 2 cm‐1). La mostra 0 dies a 60 °C va ser
temperadadurant5minabansderegistrarl’espectredeFTIR.
Taula4.2.Descomposicióenbandesdel’espectredeconvolucionatdeFTIRdeldominiPDZ3adquirit
entampóPBS,pH7.4.
25 °C
60 °C, 0 dies
60 °C, 4 dies
60 °C, 8 dies
60 °C, 16 dies
Estructura secundària Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Girs‐ 1694 1 1694 1 1695 2 1695 2 1695 2
Fulla‐β antiparal∙lela d’alta freqüència
1683 2 1684 4 1684 5 1684 8 1685 4
1679 6 1676 2 1676 7 1677 4 1677 9
Girs‐ 1669 9 1670 17 1668 9 1668 13 1667 9
Loops / Girs‐ 1659 16 1658 11 1659 13 1658 9 1658 10
Hèlix‐α 1649 18 1648 16 1649 13 1648 14 1648 14
Fulla‐β flexible / Random coil
1640 24 1640 13 1640 15 1640 12 1640 11
Fulla‐β antiparal∙lela de baixa freqüència
1630 16 1631 15 1631 12 1631 13 1631 12
WL /Amiloide 1621 4 1620 17 1619 22 1619 22 1620 25
Cadenes laterals 1605 2 1606 2 1606 2 1606 3 1605 4
Peraconfirmarl’efectedelaforçaiònicasobrelaformaciódefibres‐β,tambéesva
dissenyar l’agregació en tampó KH2PO4 50 mM, pH 7.5. més 150 mM d’NaCl (una
concentraciódesalsimilaraladeltampóPBS).Lafigura4.3‐Cconfirmaquelatransició
conformacionalésassolidaals5mina60°Cdegutalapresènciadeforçaiònica,talicom
jahaestatreportatenaltresproteïnesambtendènciaaformarfibres,comaraelsdominis
VLd’immunoglobulines(Sikkink,Ramirez‐Alvarado2008).
V‐Capítol4 Resultats
230
Taula4.3.Descomposicióenbandesdel’espectredeconvolucionatdeFTIRdeldominiPDZ3adquirit
entampóKH2PO450mM,pH7.5,més150mMd’NaCl.
25 °C
60 °C, 0 dies
60 °C, 4 dies
60 °C, 8 dies
60 °C, 16 dies
Estructura secundària Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Girs‐ 1694 2 1694 2 1694 1 1693 3 1694 1
Fulla‐β antiparal∙lela d’alta freqüència
1680 7 1683 6 1683 6 1684 7 1685 5
1676 2 1677 5 1676 5 1677 6
Girs‐ 1669 8 1669 14 1669 11 1670 12 1669 12
Loops / Girs‐ 1659 15 1658 10 1658 11 1658 9 1658 9
Hèlix‐α 1650 18 1648 15 1649 15 1649 14 1649 15
Fulla‐β flexible / Random coil
1640 27 1640 12 1640 14 1640 12 1640 11
Fulla‐β antiparal∙lela de baixa freqüència
1630 16 1631 14 1631 13 1631 13 1631 12
WL /Amiloide 1620 5 1620 22 1620 21 1620 23 1620 24
Cadenes laterals 1606 2 1606 3 1605 3 1606 2 1606 5
Lestaules4.2i4.3mostrenelscanvisquepateixeldominiPDZ3incubata60°C
en presència de sal. Resumidament, la component en de fulla‐β flexible decreix
dràsticament,acostad’incrementarlabandadeWL/amiloideidisminuir,també,lafracció
degirs‐β/loops.Lapartmésestructuradade lamolècula, la fulla‐βantiparal·lelanativa i
l’hèlix‐α,tambédisminueixlleugerament,totiqueesconsiderapocrepresentatiu.
4.1.3. CitotoxicitatdelsagregatsdePDZ3.
Per als assajos de citotoxicitat, mostres del domini PDZ3, a 44 mg/mL, van ser
incubadesa60°Cdurantdiferentsperíodesde temps(0,4,8 i16dies),per tald’induir
l’agregació(veureapartat3.5deMaterials iMètodesdelcapítol).Laconcentració finala
cultius,de4.4mg/mL,éslameitatdel’empradaperalsespectresdeFTIR,jaqueamajors
concentracions la mostra es troba massa agregada per a realitzar assajos de viabilitat
obtenint resultats reals i reproduïbles. S’ha de tenir en compte, a més, que la via
d’agregaciódeldominiespotveurerevertidapelcanvidetemperaturaacultius,passant
de60a37°C,onesmantédurant24hores.Pertant,apartdecomprovarperTEMaquesta
possible reversibilitat dels agregats, no és pot fer una comparació directe entre els
resultatsdeFTIRicitotoxicitat,degutaladiferenciadeconcentracióidetemperaturadels
experiments.
V‐Capítol4 Resultats
231
Figura 4. 4.Assaig de viabilitat perMTT de la línia cel·lular de neuroblastoma humà SH‐SY5Y. Les
cèl·lulesvansertractadesdurant24hambtampóPBS,pH7.4, iambPDZ3incubata60°Cdurantdiferents
dies (0,4,8 i16).Laconcentracióde lamostradurant la incubació ienelcultiucel·lularvaserde44 i4.4
mg/mL,respectivament.
Els assajos de toxicitat en la línia cel·lular de neuroblastoma humà SH‐SY5Y,
mostren que la citotoxicitat augmenta a mesura que la via d’agregació es troba més
avançada(Figura4.4).Aquestresultats indiquenque l’agregacióhauriadeser, tansols,
parcialmentreversibleiqueaquestareversibilitatdecreixamesuraquelareaccióéstroba
mésdesplaçadacapalaformaciód’agregatsmadurs.
4.1.4. MicroscòpiaelectrònicadelsagregatscitotòxicsdePDZ3.
Pertaldedeterminareltipusdeviad’agregació(WL/amiloide)quesegueixenels
agregats citotòxics del domini PDZ3, assignada a la banda de FTIR 1620 cm‐1, s’han
obtingut imatges de TEM de les mostres emprades per als espectres de FTIR, a
concentració8mg/mL,ientampóPBS,pH7.4(veureapartat3.4deMaterialsiMètodes
del capítol).Améss’hacomprovatelgraudereversibilitatdelsagregatsen funcióde la
temperatura, iverificaraixí,sialdisminuir la temperaturaa37°Cdurant24h,condició
necessàriaperalsassajosdecitotoxicitat,elsagregatsesmanteneni,pertant,sisónels
responsablesdeladisminuciódelaviabilitatcel·lular.
Tal icoms’observaa la figura4.5‐A,alsestadis inicialsde l’agregacióhi trobem
petitesestructuresglobulars,sensepresènciad’agregatsfibril·lars.Segonselsresultatsde
citotoxicitat, aquestaconformacióno seria tòxicaencultius.Desprésde la incubacióper
varisdiesa60°C,apareixenfibresdeltipusWL,queescaracteritzenpersercorbades,no
massallarguesiambundiàmetrede8‐9nm.AquestesfibresWLésmantenendurantels
V‐Capítol4 Resultats
232
4,8i16diesd’incubació.SegonsFTIR,aquestesfibresesformenràpidamentals5mina
60°C,iesmantenendurantlarestadediesd’incubació.
Pelquefaalareversibilitat,lesimatgesdelafigura4.5‐B,mostrenqueelcanvide
temperatura a 37 °C, no afecta al grau d’agregació, i per tant, la citotoxicitat en cultius
cel·lularsespotatribuir,talicoms’esperava,alsagregatsdeltipusWLdeldominiPDZ3.A
més,podemcorroborarquel’agregaciódeldominiPDZ3ésparcialmentreversible.
Figura4.5.ImatgesdeTEMdeldominiPDZ3incubata60°C,entampóPBS,pH7.4.A)Incubacióa60°C
durant0,4i8dies.B)Incubacióa60°Cdurant0,4i8dies,més24ha37°C,quemostraquelescondicionsde
cultiu cel·lular no reverteixen els agregatsWL del domini PDZ3. En totes dues condicions, a temps 0 dies
s’observenestructuresglobulars.Als4diesd’incubació,apareixenfibresdeltipusWL,queesfanmésevidents
als8diesd’incubació(lesimatgesadquiridesals16diesd’incubaciósónmoltsimilarsals8diesa60°C).
4.1.5. Anàlisis per RMN‐HSQC dels aspectes moleculars de l’agregació del
PDZ3.
Per tal d’aprofundir en el mecanisme molecular d’agregació del domini PDZ3, i
corroborarelpasperun intermediari trimèricquedonaria lloca laviaWL, tal icomha
estat descrit anteriorment pel Dr. Murciano‐Calles (Murciano‐Calles et al. 2010), s’ha
analitzat, per espectroscòpia d’RMN, les regions responsables del canvi conformacional
observatperFTIR.Aquestsexperimentsil’anàlisideresultatshanestatdesenvolupatsper
laDra.Candel,A.M.,delaUniversitatdeGranada.
V‐Capítol4 Resultats
233
L’espectre de correlació 1H‐15N HSQC‐NMR (Heteronuclear Single Quantum
Coherence‐Nuclear Margnetic Resonance) correlaciona els desplaçaments químics (o
chemical shifts) dinsdels grupsNHde la cadenapolipeptídica. L’espectrebidimensional
del domini PDZ3 en tampó KH2PO4 50mM, pH 7.5, va ser registrat des de 25 a 60 °C
(Figura4.6‐A).
Figura4.6.Espectredecorrelació1H‐15NHSQC‐RMNdeldominiPDZ3entampóKH2PO450mM,pH7.5,
desde25a60°C.A)Efectede la temperaturasobre les intensitatsdelspicsobtingutpercomparaciódels
espectres de correlació 1H‐15N adquirits a intervals de temperatura de 2.5 °C. Per simplificar‐ho, la figura
mostra espectres adquirits cada 5 °C. Tots els pics esmouen cap a freqüènciesmajors (o cap a l’esquerra,
downfield)enl’espectredeprotóamesuraqueaugmentalatemperatura.B)Representaciódel’estructuradel
domini PDZ3 (codi PDB3K82). En colors, esmostra el graudepertorbaciódeHSQC.Magenta: residusque
mantenenelsseuspicsenposició i intensitatsimilar.Cian:residusque, tot i canviar les intensitats/volums,
mantenenlasevaposicióals60°C.Blau:residusquemodifiquenlasevaposicióinicialjaqueelpicdesapareix
ocanviadelocalitzacióals60°C.C)EstructurasecundàriaipertorbaciódeHSQCanivellderesidu,usantel
mateixcodidecolorquealafiguraB.Lesregionsambtendènciaal’agregació(perTANGO)sónmarcadesen
negreta.
L’anàlisid’aquestespectreaportainformaciódelesintensitats/volumsdelspicsde
cada residu en funció de la temperatura, i ha permès classificar‐los en funció de si
mantenenonoladisposicióconformacionaldel’estatnatiudesprésd’incubara60°C.
V‐Capítol4 Resultats
234
D’aquestamaneras’hanidentificattrestipusderesidusdinsl’estructuraglobular
deldominiPDZ3(Figura4.6‐B,C):elsquemantenenlaconformaciódel’estatnatiujaque
lesintensitats/volumsdelsseuspicsnodecreixensignificativament;elsresidusque,toti
atenuar les intensitats/volums, mantenen la seva posició nativa; i els residus que
modifiquenlasevaposicióinicial,jasiguiperquèelpicdesapareixocanviadelocalització
als60°C.
Aquesta classificació dins l’estructura globular del domini (Figura 4. 6‐B, C),
mostra que els residus localitzats a les cadenes β1 i β5, les quals s’organitzen en un β‐
hairpin antiparal·lel, són aquells que mantenen la seva disposició. En contra, la fulla‐β
formada per les cadenes β2, β3 i β4, sembla pateix un cert grau de desorganització o
readaptació, juntamentambelsresidusde l’hèlix‐α1, laqual tambéestrobaparcialment
inclosa com a regió amb tendència a l’agregació, tal i com s’ha predit per l’algoritme
TANGO.
Lapermanènciadelasenyaldecorrelaciódelaβ1ilaβ5concordaperfectament
ambelsresultatsdeFTIR,onpartdelacomponentenfulla‐βnativaésmantéals60°C.Per
altrabanda,lafeblesaodesapariciódelasenyaldelaβ2,β3iβ4estariarelacionatambla
fracciódefulla‐βnativaiflexible,responsabledel’apariciódelabandad’agregatsWL.
4.2. Efectedeladeleciódel’hèlix‐α3sobreelplegamentdeldominiPDZ3.
Laimportànciadel’hèlix‐α3haestatcorroboradaambelpaperreguladorsobreles
propietats d’unió del domini PDZ3 (Petit et al. 2009). Aquest domini presenta una
regulacióal·lostèricaatravésdel’hèlixaddicional,quenointeraccionadirectamentambel
lligand.Alestudiarlespropietatsd’uniódeldominisensel’α3,esvaobservarquel’afinitat
varianotablement,depenentdelpèptidlligand,finsa20vegadesmenys.Aquestavariació
de l’afinitat no sembla que estigui acompanyada d’un canvi conformacional, sinó a
fenòmensdinàmicsdecaràcterentròpic.
Vista l’evident importància d’aquesta hèlix‐α3, es va decidir estudiar les
conseqüències de la seva eliminació en el procés de plegament. Per això es va clonar i
purificar la construcció del tercer domini PDZ de la proteïna PSD‐95, amb deleció dels
últims 10 residus del extrem C‐terminal, la variant ∆10ct‐PDZ3. Els experiments de
clonatge, expressió, i l’estudi del plegament del domini ∆10ct‐PDZ3, han estat realitzats
perelDr.Murciano‐Calles, J.,de laUniversitatdeGranada, iestrobendetallatsa laseva
Tesi Doctoral, i al article en col·laboració en espera d’acceptació i publicació(Murciano‐
Calles2011,Murciano‐Callesetal.2013).
V‐Capítol4 Resultats
235
Uncopcomprovatquel’afinitatdeldominiPDZ3peral lligandKKETAVésmajor
(Kd = 1 μM) que la del domini ∆10ct‐PDZ3 (Kd = 3.6 μM) (Murciano‐Calles 2011), es va
estudiar,mitjançantDSC,l’efectedel’eliminaciódel’hèlix‐α3enelplegamentdeldomini.
La figura 4. 7 mostra les traces calorimètriques obtingudes prèviament amb el
dominiPDZ3(Murciano‐Callesetal.2010) i lesdel l’∆10ct‐PDZ3(Murciano‐Calles2011,
Murciano‐Callesetal.2013).Lesduestransicionsendotèrmiquesindiquenlapresènciade
tresestatsmacroscòpicsenequilibri,reversibles,iindependentsalavelocitatdecanvide
temperatura (dada no mostrada). Al augmentar la concentració de proteïna, les dues
endotermes es separen, indicant un fenomen d’associació del estat intermediari. La
primeraendoterma(quecorresponalequilibriN⇄In)reflexaelprocésd’associaciódel
estat intermediari durant el desplegament, i és resultat de dos processos oposats: a) la
contribuciópositivadelprocésdedesplegamentdel’estatnatiu, ib)elprocésexotèrmic
de l’associaciódel intermediari. La segonaendoterma (corresponent al equilibri In⇄D)
indica, únicament, la pèrdua de l’estat d’associació (o dissociació) donant lloc al estat
desplegat. Qualitativament, les dues construccions difereixen en que les transicions de
l’∆10ct‐PDZ3sónmésagudes.Però,ladiferenciamésimportantéselgraudereversibilitat
del’∆10ct‐PDZ3(un10%),forçainferioraldeldominiPDZ3sencer(un60%).
Figura 4. 7. Corbes del desplegament tèrmic del domini PDZ i ∆10ct‐PDZ3 obtingudes per DSC. A
diferentconcentraciódeproteïna,ientampóKH2PO450mM,pH7.5,s’hanobtingutelsvalorsexperimentals
(cerclesgrisos).L’anàlisiglobals’harealitzatapartirdelmodeldetresestats(PDZ)odequatreestats(∆10ct‐
PDZ3)iésrepresentatambunalínianegra.ImatgesextretesdeMurciano‐Calles2011.
V‐Capítol4 Resultats
236
MalgratqueelperfildeDSCversuslaconcentracióésmoltsemblantentretotsdos
constructes,elmodel3tresestats(nN⇄In⇄nD)empratperal’anàlisideDSCdeldomini
PDZ3nos’ajustaalatraçacalorimètricadel’∆10ct‐PDZ3,pertanthacalgutdefinirunnou
modeldequatreestatsperadescriureladesnaturalitzaciótèrmicadel’∆10ct‐PDZ3,ique
éselsegüent:
Pertant,eldesplegamentdeldomini∆10ct‐PDZ3contétresprocessosenequilibri,
1)elpasdelestatnatiualintermediari(N⇄I),alquesegueix,2)eldesplegamentcomplet
del domini (I ⇄ D), i per altra banda, i off‐pathway, 3) l’equilibri d’associació del
intermediari(I⇄(1/3)I3).Així,seguintaquestmodel,existeixunintermediarimonomèric
en equilibri previ al procés d’associació, el qual s’associarà donant lloc a un oligòmer
trimèric,lamateixaestequiometriafinalqueperaldominiPDZ3sencer.
Apartirdelsparàmetrestermodinàmicsobtingutsdelmodeldequatreestats,s’ha
fetunanàlisidepoblacionsdelsdiferentsestatsenequilibri(Murciano‐Calles2011).Ala
figura4.8espotobservarquel’intermediaritrimèricespoblapràcticamental100%enel
intervaldetemperaturad’entre50i85°C,iqueaconcentracionsbaixestambéesforma
de manera majoritària (fins a un 90 %). Això reflexa una diferencia important amb el
dominiPDZ3sencer,queabaixaconcentraciól’intermediaritansolsarribaaserel50%,i
dinsd’unrangdetemperaturamenor,de65a85°C.Pelquefal’estatmonomèric,totiser
indispensable, no supera el 10% de població a cap temperatura, concloent que l’estat
oligomèricésmésestablequeelmonomèric.
nN⇄In⇄nD
⇅
(1/n)In
V‐Capítol4 Resultats
237
Figura4.8.DistribuciódepoblacionsdelsdiferentsestatseneldesplegamenttèrmicdeldominiPDZ3i
deldomini∆10ct‐PDZ3.Peracadadominiesmostraladistribuciódepoblacions,obtingudesapartirdeles
traces de DSC, a concentració de 85 μM (línia continua) i 480 μM (línia discontinua). Imatges extretes de
Murciano‐Calles2011.
Per tant, gràcies a l’excel·lent ajust a un model de quatre estats de les dades
calorimètriques, realitzat per el Dr. Murciano‐Calles, i els espectres de FTIR
deconvolucionats que es presenten a continuació, es pot concloure que al delecionar la
tercera hèlix‐α del domini PDZ3, s’estabilitza l’intermediari, ja que apareix a
concentracionsmenorsiespoblaenmajorproporciórespectel’estatnatiuidesplegat.
4.2.1. Efectedeladeleciódel’hèlix‐α3sobrel’agregaciódeldominiPDZ3.
Un cop caracteritzat el mecanisme de plegament del domini ∆10ct‐PDZ3, s’ha
determinat l’efecte de la deleció de l’hèlix‐α3 addicional sobre la via d’agregació del
domini PDZ3. Per a fer‐ho, s’han adquirit els espectres de FTIR del domini ∆10ct‐PDZ3
natiuiadiferentstempsd’incubacióa60°C.
V‐Capítol4 Resultats
238
4.2.1.1. EspectredeFTIRdeldomini∆10ct‐PDZ3natiu.
L’espectre de FTIR natiu (25 °C), de l’∆10ct‐PDZ3, genera sis bandes principals
centradesalvoltantdels1680,1670,1660,1650,1640,i1630cm‐1;aixícomtresbandes
minoritàriesals1690,1620,i1605cm‐1(Figura4.9‐A).Aquestesbandessónlesmateixes
quelesobtingudeseneldominiPDZ3,pertant,podemconfirmarquel’∆10ct‐PDZ3manté
eltípicplegamentdelsdominisPDZ.
Totiaixò,existeixencertscanvisrespecteelPDZ3.Sorprenentment,ladeleciódel
l’hèlix‐α3 tan sols implica una disminució del 2 % de la banda d’hèlix‐α, a 1650 cm‐1,
constituintun14%de l’àreatotalde l’espectre(Figura4.9‐A/Taula4.4).Apartqueel
FTIRésunatècnicadebaixaresolució,unapossibleexplicacióseriaqueaquestahèlixes
troba empaquetada contra la fulla‐β flexible (cadenes β2, β3 i β4), que a al seu torn es
troba empaquetada contra l’hèlix‐α1. La deleció de l’α3 resultaria en una millor
acomodacióde la fulla‐β flexible i l’estabilitzacióde l’hèlix‐α1, compensant lapèrduade
component‐α.
Figura 4. 9. Descomposició en bandes de l’espectre deconvolucionat de FTIR del domini ∆10ct‐PDZ3
adquirit en tampó KH2PO4 50 mM, pH 7.5. A) 25 °C, B) després de 5 min a 60 °C. La banda de 1640 cm‐1
és representada en verd, i la banda de 1620 cm‐1 és representada en vermell. La resta de bandes són
representades en gris.
Per altra banda, tot i haver estat descrit que la deleció de l’α3 incrementa la
flexibilitat del loop β1‐β3 (Mostarda, Gfeller & Rao 2012), per FTIR no es pot detectar
aquesta diferencia. De fet, la component en fulla‐β flexible, centrada a 1640 cm‐1,
disminueixenl’∆10ct‐PDZ3respecteelPDZ3sencer(del28al21%).
V‐Capítol4 Resultats
239
Taula 4. 4. Descomposició en bandes de l’espectre deconvolucionat de FTIR del domini ∆10ct‐PDZ3
adquirit en tampó KH2PO4 50 mM, pH 7.5, i comparació amb els valors del domini PDZ3.
PDZ3 25 °C
60 °C, 0 dies
60 °C, 4 dies
60 °C, 8 dies
60 °C, 16 dies
Estructura secundària Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Girs‐ 1694 1 1694 1 1695 2 1695 2 1695 2
Fulla‐β antiparal∙lela d’alta freqüència
1683 2 1684 4 1684 5 1684 8 1685 4
1679 6 1676 2 1676 7 1677 4 1677 9
Girs‐ 1669 9 1670 17 1668 9 1668 13 1667 9
Loops / Girs‐ 1659 16 1658 11 1659 13 1658 9 1658 10
Hèlix‐α 1649 18 1648 16 1649 13 1648 14 1648 14
Fulla‐β flexible / Random coil
1640 24 1640 13 1640 15 1640 12 1640 11
Fulla‐β antiparal∙lela de baixa freqüència
1630 16 1631 15 1631 12 1631 13 1631 12
WL /Amiloide 1621 4 1620 17 1619 22 1619 22 1620 25
Cadenes laterals 1605 2 1606 2 1606 2 1606 3 1605 4
∆10ct‐PDZ3 25 °C
60 °C, 0 dies
60 °C, 4 dies
60 °C, 8 dies
60 °C, 16 dies
Estructura secundària Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Centre (cm‐1)
Àrea (%)
Girs‐ 1692 2 1691 4 1694 2 1695 3 1694 4
Fulla‐β antiparal∙lela d’alta freqüència
1677 9 1683 12 1684 13 1684 16
1669 7 1679 10 1670 17 1676 7 1670 24
Girs‐ 1659 15 1668 8 1659 10 1667 15 1659 8
Loops / Girs‐ 1649 14 1659 13 1650 10 1659 7 1650 11
Hèlix‐α 1641 21 1649 10 1640 14 1651 13 1641 11
Fulla‐β flexible / Random coil
1631 22 1641 13 1631 8 1641 11 1631 8
Fulla‐β antiparal∙lela de baixa freqüència
1621 6 1631 11 1618 25 1631 12 1621 17
WL /Amiloide 1607 4 1619 29 1606 3 1618 16 1605 2
Cadenes laterals 1692 2 1606 3 1694 2 1606 3 1694 4
Alcontraripassaamblafulla‐βestable(atribuïdaalescadenesβ1iβ5),localitzada
a labandade1630 cm‐1, que incrementa clarament en la variant∆10ct‐PDZ3 (22%per
l’10ct‐PDZ3versusel14%enelPDZ3)(Figura4.9‐A/Taula4.4).Pertant,l’incrementde
labandade1630cm‐1ésdegudaal’estabilització,ipertant,disminuciódelacomponent
enfulla‐βflexible,a1640cm‐1.Aquestaestabilitzaciógeneraldelesfulles‐βpodriaserla
raó de que, malgrat la baixada de reversibilitat del desplegament de l’∆10ct‐PDZ3
(aproximadament del 10 %), l’estabilitat del domini 10ct‐PDZ3 no decreixi
dramàticamentrespecteelPDZ3sencer(ΔGN‐DPDZ3=‐39±6kJ·mol‐1,ΔGN‐D10ct‐PDZ3
=‐28±10kJ·mol‐1).
En el cas de l’∆10ct‐PDZ3, l’estat natiu conté un tant per cent de fulla‐β
WL/Amiloide, atribuïda a la banda de 1620 cm‐1, lleugerament superior que el domini
V‐Capítol4 Resultats
240
PDZ3 (Taula 4. 4), una característica que podria indicar unamajor tendència inicial del
domini∆10ct‐PDZ3perentraralaviaamiloide.Siguicomsigui,aquestvalornoésmassa
acurat, i la informació sobre el procés d’agregació a 60 °C hauria de clarificar aquesta
consideracióinicial.
4.2.1.2. EspectredeFTIRdelintermediarid’agregaciódel’∆10ct‐PDZ3.
Elscanvisconformacionalsdelavariant∆10ct‐PDZ3uncopincubadaa60°C,han
estatestudiatsdesprésdeserequilibradadurant5min,idesprésdeserincubadadurant
4,8,i16dies.
Després de 5 min a 60 °C, l’∆10ct‐PDZ3 mostra un increment de la regió que
correspon als loops/girs‐β, i aquest increment és progressivament major durant la
incubació(Figura4.9‐B/Taula4.4);perexemple,a25°Caquestabandarepresentael33
%de l’àrea total del espectre,mentreque als 16dies el valor ja arribar a serdel 52%
(Taula4.4).Pelquefaalacomponentenhèlix‐α,disminueixun4%desprésdelaprimera
incubacióperò s’incrementadesprésdels8dies sense recuperar el14% inicial.Aquest
patró de canvi conformacional de les hèlix‐α també es dóna en el domini PDZ3 però a
partirdels4diesd’incubació,irecuperanttotalmenteltantpercentals16dies(Taula4.
4).
Pelquefaalpercentatgedecomponent‐β,desprésd’incubardurant5min,canvia
deformadràstica.Totesduesfulles‐βnatives,laflexibleil’estable,esperdenafavordela
component en agregats‐β, la bandade1620 cm‐1, que creixdel 6 al 29%.En el domini
PDZ3sencer, la fulla‐βestableesmantémésomenysconstantal llargde totsels temps
d’incubació, i la component‐β flexible també decreix, però, de nou, ho fa a partir dels
quatredies.
Totil’importantaugmentdelabandaa1620cm‐1als5mind’incubació,assolintel
29%del’àreatotal,apartird’aquídisminueixprogressivamentafavordel’incrementen
loops i girs‐β, tal i com s’hamencionat anteriorment.Després de 16dies d’incubació, la
bandad’agregats‐βrepresentael17%del’espectre.
Aquestaràpidareorganitzaciófapensarque,l’estatintermediarimonomèricjaes
troba en conformació de fulla‐β compacta (banda a 1620 cm‐1), fent possible les
interaccionsintermolecularsquedonenllocalasevaassociacióioligomerització.
V‐Capítol4 Resultats
241
4.3. Interaccióhèlix‐α3i loopβ2‐β3ielseuefectesobre l’agregaciódeldomini
PDZ3.
A part de la variant ∆10ct‐PDZ3, s’ha realitzat un anàlisis mutacional sobre els
residus implicats en les interaccions entre el domini i l’hèlix‐α3, concretament les
interaccionsentre laLys355(β4) ielGlu401(α3),mutacióE401R, i l’establertaentreel
Glu334 (loop β2‐β3) i l’Arg399 (α3), mutació E334L/Q. També s’ha indagat sobre la
rellevància de la circularització, en forma d’anell de succinimida, del residu Asp332 a
travésdelesmutacionsD332G/P,aquestúltimemularial’efectedel’aspàrticcircularitzat.
4.3.1. EstructurasecundàriadelestatnatiudelsmutantsdePDZ3.
A25°Clesestructuressecundàriesirregulars,loopsigirs‐β,queessituenlaregió
de 1690‐1660 cm‐1, creixen clarament en els mutants localitzats al loop β2‐β3 (D332 i
E334), però no per aquells on s’hanmutat residus de l’hèlix‐α3 (E401R i10ct‐PDZ3)
(Figura 4. 10/Taula 4. 5). Això implica un cert grau de descompactació de l’estat natiu
degutal’alteraciódelaregiódelloopβ1‐β2.Pelquefaalabandadefulla‐βflexible(1640
cm‐1), disminueix en tots els mutants, mentre que la estable (1630 cm‐1), incrementa
lleugerament,totinoseruncanvitanobvicomenelcasdel’10ct‐PDZ3.Peraltrabanda,
lacomponentenagregats‐βdelsdiferentsmutantsésmoltsimilaraladelPDZ3(un3‐4%
del’àreaentotselscasos).
Figura 4. 10. Comparació dels principals components de l’espectre natiu de FTIR delsmutants del
dominiPDZ3,adquiritsentampóKH2PO450mM,pH7.5ia25°C.
V‐Capítol4 Resultats
242
‐ MutacióE401R(hèlix‐α3).
ElresiduGlu401éslocalitzaal’extremC‐terminaldel’hèlix‐α3;elfetdemutar‐lo
per un residu d’arginina implica la introducció de càrrega positiva, que permet la
interacció d’aquest amb l’últim grup carboxil de l’hèlix, disminuint el dipol elèctric del
motiu estructural i, com a conseqüència, aquest és estabilitzat. Per altra banda, aquesta
mutació trenca la interaccióentreelGlu334(de l’α3) i laLys355(de lacadena‐β4),que
desestabilitzaria lahèlix‐α.Elsdosefectesoposats resultenenunanul·la alteracióde la
componentenhèlix‐α,centradaa1650cm‐1(Figura4.10/Taula4.5).Encanvi,respectea
lafraccióenfulla‐β,lamutaciócausalasevaestabilització,incrementantlabandade1630
cm‐1aexpensesdelade1640cm‐1,deformasimilaralcasdel’10ct‐PDZ3.
‐ MutacióE334L/Q(loopβ2‐β3).
Les mutacions en el residu Glu334 causen un major contingut en estructures
secundàriesirregulars(1690‐1660cm‐1;39%i40%perE334LiE334Q,respectivament,
respecteel34%perPDZ3),aexpensesdelafraccióenfulla‐βflexible,quedisminueixmés
d’un20%(Figura4.10/Taula4.5).Aquestaugments’explicaperquèelGlu334estableix
unió amb l’Arg399 (hèlix‐α3), imutar‐lo implica lapèrduade la interacció i conseqüent
desestabilització del loop β2‐β3 (Camara‐Artigas et al. 2010). Les fraccions d’hèlix‐α i
d’agregats‐βesmantenenpràcticamentinalteradesrespecteelPDZ3.
‐ MutacióD332G/P(loopβ2‐β3).
LesmutacionsalresiduAsp332,situadaalloopβ2‐β3,causenelmajorincrement
enestructurasecundàriairregulard’entretotselsconstructesdePDZ3,sentun45%i42
%perD332GiD332P,respectivament,respecteel34%delPDZ3(Figura4.10/Taula4.
5).Especialment,augmenta la flexibilitatdel loopquans’introdueixunresidudeglicina.
L’anelldesuccinimida formatperaquestresiduenelPDZ3,quesemblaquedisminueixi
aquesta flexibilitat (Camara‐Artigas et al. 2010), no pot formar‐se espontàniament en
aquestsdosmutants,peròl’efecteésmimetitzatpelresidudeprolina.
Mutar l’Asp332 implica una lleugera reducció de la fracció en hèlix‐α (13 %
respecteel16%perPDZ3),perunapossibledesestabilitzaciódel’α3.
Labandadefulla‐βflexibledecreixperatotsdosmutants,un20%iun23%per
D332G i D332P, respectivament, respecte el 28% per PDZ3. Tot i això, la β‐estable es
mantéinalterada,sentl’estructurairregular(1690‐1660cm‐1)laqueesveuincrementada
(Figura4.10/Taula4.5).
V‐Capítol4 Resultats
243
Taula4.5.Descomposicióenbandesde l’espectredeconvolucionatdeFTIRdelsmutantsdeldomini
PDZ3adquiritentampóKH2PO450mM,pH7.5,icomparacióambelsvalorsdeldominiPDZ3.
PDZ3 E401R D332G D332P E334L E334Q
25 °C, 0 dies Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Girs‐β 1694 1 1692 3 1691 9 1691 7 1691 5 1691 6Fulla‐β anti. d’alta freqüència
1680 8 1680 8 1679 10 1679 10 1679 9 1679 9
Girs‐β 1669 9 1669 8 1668 9 1668 9 1668 9 1668 9Loops/Girs‐β 1659 16 1659 16 1659 16 1659 17 1659 17 1659 17Hèlix‐α 1650 16 1649 17 1649 13 1649 13 1649 15 1649 15Fulla‐β flexible/ Random coil
1640 28 1640 24 1641 20 1641 23 1641 24 1640 22
Fulla‐β anti. de baixa freqüència
1630 14 1631 16 1630 14 1630 14 1630 15 1630 15
WL/Amiloide 1620 4 1621 3 1621 4 1621 3 1621 3 1621 3Cadenes laterals 1606 4 1605 5 1605 5 1605 4 1605 4 1605 4
60 °C, 5 min Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Girs‐β 1695 1 1691 4 1691 8 1691 8 1691 6 1691 7Fulla‐β anti. d’alta freqüència
1684 2
1676 9 1679 10 1678 11 1678 11 1679 10 1678 10Girs‐β 1669 7 1669 8 1668 9 1668 9 1668 9 1668 9Loops/Girs‐β 1659 15 1659 13 1659 14 1659 14 1659 13 1659 14Hèlix‐α 1649 16 1649 10 1648 10 1648 10 1649 10 1649 11Fulla‐β flexible/ Random coil
1640 19 1641 14 1641 14 1641 14 1641 14 1641 15
Fulla‐β anti. de baixa freqüència
1631 16 1631 11 1630 11 1630 12 1630 11 1630 12
WL/Amiloide 1620 12 1619 26 1620 19 1620 17 1619 23 1620 19Cadenes laterals 1606 3 1606 4 1608 4 1609 4 1608 4 1608 2
60 °C, 4 dies Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Girs‐β 1692 2 1694 1 1695 1 1695 1 1695 1 1695 1Fulla‐β anti. d’alta freqüència
1679 12 1681 11 1683 6 1683 7 1682 11 1683 5
Girs‐β 1668 8 1668 12 1672 12 1669 15 1668 12 1671 13Loops/Girs‐β 1658 13 1658 10 1658 18 1659 8 1659 10 1659 12Hèlix‐α 1648 13 1649 12 1647 9 1649 14 1649 13 1648 16Fulla‐β flexible/ Random coil
1640 13 1640 12 1640 10 1640 10 1640 13 1640 6
Fulla‐β anti. de baixa freqüència
1631 13 1631 10 1631 11 1631 11 1630 11 1632 15
WL/Amiloide 1620 22 1619 28 1619 30 1619 30 1619 25 1619 27Cadenes laterals 1606 4 1606 4 1606 4 1606 4 1606 4 1606 3
60 °C, 8 dies Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Girs‐β 1692 2 1694 3 1694 2 1694 2 1695 1 1694 2Fulla‐β anti. d’alta freqüència
1683 12 1683 10 1683 11 1682 13 1683 10
1679 12 Girs‐β 1668 8 1670 19 1669 19 1670 20 1670 9 1669 16Loops/Girs‐β 1658 13 1659 10 1659 9 1659 9 1659 15 1659 10Hèlix‐α 1648 13 1650 8 1650 9 1650 8 1649 8 1650 10Fulla‐β flexible/ Random coil
1640 13 1641 15 1641 14 1641 15 1641 15 1641 14
Fulla‐β anti. de baixa freqüència
1631 13 1631 7 1631 8 1631 7 1631 9 1631 9
WL/Amiloide 1620 22 1619 23 1619 25 1619 24 1619 25 1619 25Cadenes laterals 1606 4 1606 4 1606 4 1606 4 1606 4 1606 5
V‐Capítol4 Resultats
244
PDZ3 E401R D332G D332P E334L E334Q
60 °C, 16 dies Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Centre (cm
‐1)
Àrea (%)
Girs‐β 1694 1 1694 3 1694 2 1694 2 1695 1 1695 1Fulla‐β anti. d’alta freqüència
1680 10 1683 14 1683 13 1683 11 1682 10 1681 10
Girs‐β 1668 11 1669 23 1669 20 1669 20 1670 9 1670 7Loops/Girs‐β 1659 12 1658 8 1658 9 1658 9 1659 15 1659 18Hèlix‐α 1649 16 1649 10 1650 9 1650 9 1648 13 1648 14Fulla‐β flexible/ Random coil
1640 11 1640 14 1641 15 1640 15 1640 10 1640 8
Fulla‐β anti. de baixa freqüència
1630 18 1630 7 1631 6 1631 7 1631 14 1631 16
WL/Amiloide 1621 19 1619 18 1619 22 1619 23 1619 25 1620 24Cadenes laterals 1607 3 1607 4 1606 4 1606 4 1606 3 1606 3
4.3.2. Estructura secundària del intermediari d’agregació delsmutants de
PDZ3.
Els canvis conformacionals dels diferents mutants del domini PDZ3, un cop
incubatsa60°C,hanestatestudiatsdesprésdeserequilibratsdurant5min,idesprésde
serincubatsdurant4,8,i16dies.
‐ MutacióE401R(hèlix‐α3).
A la mutació E401R, la regió corresponent a loops/girs‐β (1690‐1660 cm‐1) es
manté invariable fins als 8 dies d’incubació, quan es dóna un clar increment de la
component,iqueésmajorals16dies(Figura4.11/Taula4.5).
Figura4.11Evolució,enfunciódeltempsd’incubacióa60ºC,delsprincipalscomponentsdel’espectre
natiudeFTIRdelmutantPDZ3‐E401R,adquiritsentampóKH2PO450mM,pH7.5.
Labandade leshèlix‐α(1650cm‐1) ide fulles‐β(tan flexiblecomestable,1640 i
1630 cm‐1), disminueixen progressivament durant la incubació, a favor de la banda
V‐Capítol4 Resultats
245
d’agregats‐β.Aquestabanda,però,disminueixlleugeramentaperíodesd’incubacióllargs
(8i16dies),queésquanaugmentenlesestructuresirregularsjacomentades.
En aquest mutant, que a priori estabilitza la hèlix‐α3, sorprenentment la
disminueixdesprésdels5mina60°C(Figura4.11/Taula4.5).S’hadetenirencompte
quelamutacióevitalainteraccióentreelGlu401ilaLys355(alaβ4),pelqueesdedueix
que l’energia d’aquesta interacció ésmajor que l’energia que es guanya en disminuir el
dipolelèctricdel’hèlix‐α.Siguicomsigui,segueixelmateixcomportamentquelavariant
Δ10ct‐PDZ3,talicoms’haexplicatenapartatsanteriors.
‐ MutacióE334L/Q(loopβ2‐β3).
Els dos mutants de la posició Glu334, els E334L/Q (Figura 4. 12/Taula 4. 5),
segueixenuncomportamentsimilar.Laregióde loops/girs‐βdecreixenprogressivament
durantlaincubació,mentrequelabandad’hèlix‐αfluctuaalvoltantdelvalorobtinguta25
°C. Les bandes de fulla‐β flexible i estable, a 1640 i 1630 cm‐1, respectivament,
disminueixen durant la incubació, en concordança amb l’increment de la banda de
agregats‐β, a 1620 cm‐1. Tot i això, als 16 d’incubació, la fulla‐β estable tendeix a
recuperar‐secapalsvalorsinicials,especialmentenelcasdelmutantE334Q.
Figura 4. 12. Evolució, en funció del temps d’incubació a 60ºC, dels principals components de
l’espectre natiu de FTIR dels mutant PDZ3‐E334L/Q, adquirits en tampó KH2PO4 50 mM, pH 7.5.
‐ MutacióD332G/P(loopβ2‐β3).
V‐Capítol4 Resultats
246
Pel que fa al mutant D332G, és comporta de manera semblant als del residu
Glu334. La regió dels loops/girs‐β decreix progressivament durant la incubació,mentre
quelabandad’hèlix‐αfluctuaalvoltantdelvalorobtinguta25°C.Lesbandesdefulla‐β
flexible i estable, a 1640 i 1630 cm‐1, respectivament, disminueixen progressivament
durant la incubació.Labandadelsagregats‐β,a1620cm‐1, incrementasignificativament
als5mina60°C.ElmutantD332Ptambésegueixaquestatendència,malgratquelaregió
de loops/girs‐β tan sols varia als quatre dies d’incubació; que es mantinguin les
estructures irregulars pot ser degut a les restriccions conformacionals del residu de
prolina.Capdelsdosmutants,adiferènciadelsdelGlu334,recuperenpartdel’estructura
enfulla‐β,nilaestablenilaflexible(Figura4.13/Taula4.5).
Figura 4. 13. Evolució, en funció del temps d’incubació a 60 °C, dels principals components de
l’espectre natiu de FTIR dels mutants PDZ3‐D334G/P, adquirits en tampó KH2PO4 50 mM, pH 7.5.
4.4. Anàlisiscalorimètric(DSC)delmutantsdeldominiPDZ3.
Talicoms’hafetambeldominiPDZ3senceriel10ct‐PDZ3,peracadaundels
mutants s’han realitzat experiments deDSC.Aquests experiments i l’anàlisi de resultats
han estat desenvolupats pel Dr. Murciano‐Calles, J., de la Universitat de Granada
(Murciano‐Calles 2011).
ComparantelperfildeDSCdelsdiferentsmutants(Figura4.14),totsellsmostren
una major similitud amb el perfil del domini PDZ3 ja publicat (Murciano‐Calles et al.
2010), que no amb la variant 10ct‐PDZ3. Conseqüentment, les traces calorimètriques
delsmutantshanestatajustatsalmodeldetresestats(nN⇄In⇄nD)empratperalPDZ3
sencer, enlloc del model de quatre estats de l’10ct‐PDZ3. Amb excepció del mutant
E401R, l’ajust ha estat assolit amb una bona convergència, obtenint així els paràmetres
V‐Capítol4 Resultats
247
termodinàmics de l’equilibri d’associació, de l’estat natiu, i del desplegat, de lamateixa
maneraquepeldominiPDZ3(Murciano‐Callesetal.2010).
Figura4.14.Comparacióde lescorbesdeldesplegamenttèrmicdeldominiPDZ3ilessevesvariants
obtingudesperDSC.ImatgesextretesdeMurciano‐Calles2011.
EnelcasdelmutantE401R,noesvaobtenircapconvergènciaraonablemitjançant
elmodeldetresestats,pertant,esvaoptarperajustar‐losobreelnoumodeldequatre
estatsdescritperalavariant10ct‐PDZ3.
El conjunt de paràmetres termodinàmics obtinguts de les diferents variants del
dominiPDZ3,apartirdelesdadesdeDSCienfunciódesisegueixenunmodeldetreso
quatreestats,estrobenrecollitsalataulasegüent:
Taula4.6.ParàmetrestermodinàmicsdeldesplegamenttèrmicdeldominiPDZ3ilessevesvariants.
Lesdadeshanestatobtingudesapartirdel’anàlisideDSCambelmodeldetresoquatreestats,depenentdela
variant.DadesobtingudesperMurciano‐Calles,J..
Model de tres estats TU‐N
(ºC) ΔHU‐N(TU‐N) kJ∙mol‐1
ΔGU‐N(298) kJ∙mol‐1
TIn‐U (ºC)
ΔHIn‐U(TIn‐U) kJ∙mol‐1
ΔGIn‐U(343) kJ∙mol‐1
PDZ3 70.4 ± 0.5 335 ± 20 39 ± 6 79.2 ± 1.2 ‐130 ± 20 ‐25 ±5 D332G 70.1 ± 1.5 360 ± 40 33 ± 8 88.6 ± 2.0 ‐145 ± 40 ‐24 ± 7 D332P 71.6 ± 2.0 360 ± 25 33 ± 7 89.9 ± 2.0 ‐160 ± 30 ‐25 ± 5 E334L 67.4 ± 1.3 300 ± 10 (1‐3) 25 ± 4 96.0 ± 1.5 ‐145 ± 20 ‐24 ± 3 E334Q 70.1 ± 1.5 370 ± 25 32 ± 6 89.0 ± 1.5 ‐145 ± 20 ‐41 ± 10
V‐Capítol4 Resultats
248
Model de quatre estats
TI‐N (ºC)
ΔHI‐N
(TI‐N) kJ∙mol
‐1
ΔGI‐N
(298) kJ∙mol
‐1
TU‐I (ºC)
ΔHU‐I
(TU‐I) kJ∙mol
‐1
ΔGU‐I
(298) kJ∙mol
‐1
TIn‐I (ºC)
ΔHIn‐I
(TIn‐I) kJ∙mol
‐1
ΔGIn‐I
(343) kJ∙mol
‐1
ΔGU‐N
(298) kJ∙mol
‐1
Δ10ct‐PDZ3 51.6 ± 3 250 ± 20 28 ± 8 78.5 ± 3 215 ± 10 17 ± 6 124.6 ± 4 ‐135 ± 15 ‐27 ± 5 28 ± 10E401R 64.4 ± 3.5 315 ± 30 57 ± 10 87.5 ± 7 300 ± 25 35 ± 12 127.7 ± 4 ‐115 ± 20 ‐24 ± 6 81 ± 20
Al comparar els valorsdeΔG, sembla serque elsmutants a lesposicionsE332 i
D334 presenten estabilitats similars al domini PDZ3 però tenen unamajor tendència a
l’agregació, tal i com s’ha observat per FTIR. Pel que fa a lamutació E401R, clarament
presenta una estabilitatmolt superior al PDZ3 i resta de variants, però no sembla que
tinguiunamajortendènciaal’agregació,segonss’extraudelanàlisiperFTIR.
V‐Capítol4 Discussió
249
5. DISCUSSIÓ.
5.1. Lafulla‐βflexibledónallocal’agregaciódelPDZ3.
Labandad’amidaI’del’espectredeFTIR,eslocalitzaentreels1700i1600cm‐1i,
bàsicament,sorgeixdelavibraciódelenllaçC=Odel’esqueletpeptídic.L’assignaciódeles
diferents estructures secundàries dins la regió d’amida I’ resulta complicada degut a
l’elevada sensibilitat de la radiació infraroja davant de factors estructurals i ambientals
(Arrondoetal.2003).L’assignacióméscompromesaésladelsgirs‐β,ondiferentsbandes
es localitzendins laregiód’entre1700 i1660cm‐1.Elspicscentratsa1670 i1660cm‐1
són, generalment, assignats a elements d’estructura secundària irregulars, com ara els
girs‐β (Byler, Susi 1986), tot i que els loops estables també contribueixen a la bandade
1660cm‐1(Heredia,DeLasRivas2003).Permésdificultat,labandaproperaals1680cm‐1
és assignada a la component en fulla‐β antiparal·lela d’alta freqüència, la qual no és
detecta en estructures en fulla‐β paral·lela ((Chirgadze, Nevskaya 1976, Goormaghtigh,
Cabiaux&Ruysschaert1994,Zandomeneghietal.2004).Amés,tambédinsaquestaregió
de1700‐1660cm‐1,labandade1690cm‐1,quasinegligible,haestatatribuïdaalafulla‐β
paral·lela(Chirgadze,Nevskaya1976),totiquealgunsautorslaidentifiquencomagirs‐β
(Olingeretal.1986).
Pelquefaalaregióde1655‐1630cm‐1,elpicalvoltantde1650cm‐1ésindicatiu
de contingut en hèlix‐α, mentre que els pics a 1645‐1640 cm‐1 i 1640‐1630 cm‐1,
corresponentarandomcoilifulla‐β,respectivament(Arrondo,Goni1999).
Com a regla general, un increment en interaccions d’hidrogen resulta en un
desplaçament cap números d’onamés baixos, el qual explicaria perquè els agregats de
tipusWLcontenenpicsde fulla‐βcentradesa1630‐1620cm.1, ielsagregatsamiloidesa
1620‐1615cm‐1(Zandomeneghietal.2004).L’espectredel’estatintermediarideldomini
PDZ3,a60°C,mostraunaugmentdel18%delabandade1620cm‐1,allímitentrelaregió
WL i l’amiloide (Figura 4. 1/Taula 4. 1). Aquests dos tipus d’agregats‐β segueixen vies
d’agregació diferents, les fibres amiloides segueixen una cinètica depenent de nucleació
(sigmoïdal,cooperativa),mentrequelesfibresWLnoensóndependents,sinóquecreixen
exponencialmentideformanocooperativa(Gosaletal.2005).Prèviament,s’hareportat
queeldominiPDZ3uneixelfluoròforsThTiANSdurantlacinèticad’agregació,iquehofa
de manera exponencial (Murciano‐Calles et al. 2010). Conseqüentment, el procés no
requereixd’unnucliprèviamentformat,estable i jaorganitzatenestructura‐βordenada.
PeracabardediscernirsilacomponentdeFTIRenfulla‐βa1620cm‐1corresponafibres
WL o amiloides, s’han obtingut imatges per TEM (Figura 4. 4). La presència de fibres
V‐Capítol4 Discussió
250
corbadesirelativamentcurtesdefinitivamentconfirmaqueelsagregatsdeldominiPDZ3
sónfibresWL.
Desafortunadament,laconcentraciódeproteïnailatemperaturaempradaperals
assajosdecitotoxicitathandeserdiferentsdelsusatsperal’estudid’agregacióperFTIR.
Tenint en compte que el procés d’agregació del domini PDZ3 ha estat descrit com a
reversible (Murciano‐Calles et al. 2010), és important anar en compte a l’hora
d’interpretarelsresultatsdecultiuscel·lulars(Figura4.5).Alescondicionsassajades,la
via d’agregació pot haver‐se desplaçat cap a estadis inicials de l’agregació, com per
exemplel’oligòmertrimèric,quaneldominiagregata60°Césdiluït10vegadesalscultius
i incubat durant 24 h a 37 °C. Tot i això, és important determinar si els precursors de
l’agregacióWLdeldominiPDZ3sóncitotòxicsono,pelfetdequealtresestatsoligomèrics
hanestatdescritscomaespèciescitotòxiquesendeterminadesproteïnesambtendènciaa
l’agregació(Chiti,Dobson2006),comtambénotòxiquesperaaltres(Marin‐Arganyetal.
2011).Amés,lacitotoxicitatdelsagregatsdePDZ3incrementaamesuraqueaugmentael
temps d’incubació a 60 °C previ als cultius. Per tant, sembla que la via d’agregació del
dominiés, tansols,parcialment reversible, iqueaquesta reversibilitatdecreixamesura
queavançaelprocésd’agregaciócapaestadis finals.De fet, s’hademostratprèviament,
queelsagregatsformatsdurantmésde16dies,esmantenenensoluciótotidisminuirla
temperaturaals25°C(Murciano‐Callesetal.2010).
5.2. Importànciadelacadena‐β3enlareorganitzaciódelafulla‐βflexible.
ElsexperimentsdeFTIRa25°C(Figura4.1/Taula4.1)revelenuncontinguten
hèlix‐α inferior a aquell determinat a partir de les dades cristal·logràfiques (codi PDB
3K82)(Camara‐Artigasetal.2010).L’explicaciómésplausibleaaquestadiferenciaseria
que l’hèlix‐α1, empaquetada contra la fulla‐β flexible, pateix una desorganització en
solució. Així, la disminució de la fracció d’hèlix‐α després de la incubació a 60 °C seria
degudaalapèrduadel’hèlix‐α1,mentrequel’α2il’α3esmantindrienintactesenl’estat
intermediari. Aquest fet també s’explica amb l’espectre de correlació de 1H‐15N, el qual
mostra que part dels residus que es mantenen intactes en funció de la temperatura,
estableixencontactesdirectesambl’hèlix‐α2(Figura4.6).
Talicoms’hadescritmésamunt,labandad’infraroigde1660cm‐1corresponala
fracciódegirs‐βiloops,idecreixalincubara60°C(Figura4.1).EldominiPDZ3conté4
regionsloopmajorsde4residus,elloopβ1‐β2,elβ2‐β3,l’α1‐β4,ielloopβ4‐α2.Elsloops
β2‐β3iα1‐β4podrienserelsresponsablesdeladisminucióde labandadeFTIRa1660
cm‐1, ja que es troben localitzats dins la regió de la molècula que és flexible i que es
desorganitzadurantl’agregació,d’acordambelsexperimentsdeHSQC‐RMN(Figura4.6).
V‐Capítol4 Discussió
251
El loopβ1‐β2estrobapropera la fulla‐β formadaper lescadenesestablesβ1 iβ5,però
comquelacadena‐β2pateixcertgraudedesorganització,esfadifícildiscernirsiaquest
looptambéparticipaadisminuirlabandade1660cm‐1ono.Apart,elloopβ4‐α2estroba
empaquetat contra l’α2, i conté aquells residusqueesmantenenconformacionalment, a
part dels de les cadenes β1 i β5, i que interaccionen amb l’α2, per tant, és evident que
aquestloopmantélasevaconformaciónativa.
Pelquefaal’algoritmeTANGO,empratperadeterminarlesregionsambtendència
a l’agregació (Fernandez‐Escamilla et al. 2004), el domini PDZ3 mostra una tendència
pràcticamentnul·laentoteldominiambexcepciódelsresidus335‐344(queformenpart
delmotiusestructuralsβ3‐α1),idelsresidus384‐392(localitzatsalacadenaβ5)(Figura
4.14‐A).
Figura4.15.AnàlisisperTANGOdelesregionspropensesal’agregaciódeldominiPDZ3.A)Estructura
secundària i regions amb tendència a l’agregació. La regió dels residus 335‐344 (β3‐α1) és marcada en
vermell,mentreque la regiódels residus384‐392 (β5) ésmarcada en taronja. B)Representaciódelmodel
tridimensional de l’estructura del domini PDZ3 (codi PDB 3K82), on es mostren les dues interfícies amb
tendència a l’agregació. Adopten una estructura en fulla‐β i es localitzen en cares oposades de l’estructura
globular.Esrepresententrespuntsdevistadiferentsdelamolècula,rotats90°C.
Ladisposiciótridimensionald’aquestsresidusdinsl’estructuraresoltaapartirde
la difracció de raigs‐X (Camara‐Artigas et al. 2010),mostren dues superfícies principals
localitzadesencaresoposadesal’estructuraglobular(Figura4.14‐B),facilitantquecada
monòmerinteractuïambaltresdosaddicionals,formanteltrímeroligomèricprecursorde
l’agregació(Murciano‐Callesetal.2010).Justament,laregióβ3iα1,queéslaquepresenta
V‐Capítol4 Discussió
252
més tendència a agregar, forma part de la fulla‐β flexible que es reorganitza durant la
fibril·lació, tal i com s’ha resolt anteriorment. Però pel que fa a la regió de la cadena
superficialβ5,totiserpreditaperTANGO,mantélaconformaciónativadurantl’agregació.
Aquesta contradicció s’explicapel fetdeque agregacióno implicadirectament formació
amiloide (Rousseau, Schymkowitz & Serrano 2006), i TANGO reconeix patrons amb
tendència a l’agregació amorfa, no amiloide ni fibril·lar. En canvi, l’algoritme PASTA
(Trovato et al. 2006), que prediu estructures involucrades en la formació d’agregats
ordenatsenfulla‐βcreuada,tansolsreconeixlaregiódefulla‐βflexiblecomaprecursora
del’agregació,d’acordambelsnostresresultatsobtinguts.
Un altre dada que corrobora que la fulla‐β flexible es la que pateix una
reorganització estructural que dóna lloc al intermediari ric en estructura‐β, és que la
presènciadel pèptid lligandKKETAV, el demajor afinitat pel dominiPDZ3 (Kd=1μM),
afectal’estabilitatdelestatnatiu,perònoladelintermediarid’agregació(Murciano‐Calles
et al. 2010). Fet que s’explica perquè la butxaca d’unió a lligands, que es localitza a la
cavitatentrelacadena‐β2il’hèlix‐α2,esveupertorbadadurantlaviad’agregació.Amés,
el loop β2‐β3 juga un paper important en la unió de pèptids (Mostarda, Gfeller & Rao
2012),itambéesveualteratdegutaladesorganitzaciódelescadenesβ2iβ3.
5.3. Roldel’hèlix‐α3enelplegamentil’agregaciódeldominiPDZ3.
Una comprensiva interpretació dels resultats obtinguts d’estudiar la via de
plegament i d’agregació de la variant10ct‐PDZ3, emprant com a referència el domini
PDZ3 sencer, on s’inclou l’hèlix‐α3 al extrem C‐terminal, ens permet confirmar que
aquestahèlixésunelementreguladordelplegamentdeldominiPDZ3.
Ladeleciódel’hèlix‐α3noevita lareorganitzacióquegenera l’estat intermediari,
prèviament detectat en el PDZ3 (Murciano‐Calles et al. 2010). Però, tot i que l’anàlisi
calorimètric (DSC) mostra una estequiometria trimèrica en els estadis inicials de
l’associació,talicomhofaelPDZ3,enelcasdel’10ct‐PDZ3aquestaassociaciótrimèrica
no s’ha pogut detectar ni per cromatografia d’exclusió molecular, ni per DLS, on es
detectenpartículesdegrandàriasuperior(Murciano‐Calles2011).Aquestacaracterística
podriaserconseqüènciadelanoreversibilitatdelsagregatsdel’10ct‐PDZ3,mentreque
la presencia de l’α3 genera un cert grau de reversibilitat dels estats oligomèrics
(Murciano‐Callesetal.2010).Així,laràpidainter‐associaciódelespartículestrimèriques
del10ct‐PDZ3podriaserlaraódelasevairreversibilitat.
En tot cas, totes les evidències que indiquen que la supressió de l’hèlix‐α3
estabilitza l’intermediari a l’equilibri, han estat confirmades per la major tendència a
V‐Capítol4 Discussió
253
formaragregats fibril·larsperpartde l’10ct‐PDZ3, en comparació ambelPDZ3 sencer
(Taula4.4).Lahèlix‐α3 interactuaambresidusde la regióβ2‐β3 (Camara‐Artigaset al.
2010),laqualhaestatpreditaperTANGOiPastacomapropensaal’agregacióenfulla‐β
ordenada (Figura 4. 15). Per tant, l’absència de l’α3 incrementa l’exposició al solvent
d’aquesta regió, el qual facilita el desplegament i l’auto‐associació dels dominis.
L’estabilitatdelesespèciesintermediàries,però,esveudisminuïdaavalorsdepHpersota
de 3.0, fet que dóna importància a les regions involucrades en la formació d’oligòmers
(Murciano‐Callesetal.2011).Enaquestsentit,laprotonaciódelsresidusGlu/Aspsemblen
serelsresponsablesd’aquestadesestabilització.
ElsespectresdeFTIRestrobenenplenaconsonànciaamblaràpidaagregaciódel
domini10ct‐PDZ3,itambémostrenqueésdegutalescomponentsenfulla‐βnativadel
domini, tant la flexible com l’estable, les quals es perden a favor de la component en
agregats‐β (Taula 4. 4). Fet que es confirma amb els resultats de l’algoritme TANGO, el
qualrevelaqueelsresidus335‐344(regió3)i384‐392(regió5)sónelsméspropensos
aagregar.EnelcasdelPDZ3sencer,lahèlix‐α3protegeix,encertamanera,latendènciaa
l’agregaciódeldomini,mantenintlaintegritatdelafulla‐βnativaformadaperlescadenes
β1 i β5. En el cas de 10ct‐PDZ3, la cadena β5 passa a ser l’extrem C‐terminal de la
molècula, empitjorant l’empaquetament global del domini, i llavors, les cadenes β1 i β5
tambéesdevenenprecursoresdel’agregació.
5.4. Residusimplicatsenlesinteraccionsentrel’hèlix‐α3ieldominiPDZ3.
Apartdelpaperreguladorde l’hèlix‐αaddicionalsobreelplegamentdeldomini,
també és un element regulador al·lostèric d’unió a pèptids lligands, tal i com ha estat
descritprèviament (Camara‐Artigas et al. 2010,Mostarda,Gfeller&Rao2012).Aquesta
regulacióadistànciaéspossiblegràciesalfortempaquetamentdel’hèlix‐α3amblaregió
β2‐β3,moltproperaalabutxacad’unióapèptidsiqueinteraccionaambellsdirectament.
Lesinteraccionsentrel’Arg399(α3)ielGlu334(loop2‐3),ielGlu401(α3)ilaLys355
(β4), empaqueten l’hèlix‐α3 contra el domini, i és la primera interacció la que està
directamentimplicadaenlaregulaciódel’afinitat.Amés,l’anelldesuccinimidaformatpel
residuAsp332(loopβ2‐β3), jugaunpaper importantsobre la flexibilitatd’aquest loop, i
indirectamentsobrel’empaquetamentdelesduesregions.
LamutaciódelresiduGlu334(E334L/Q)trencalainteraccióambl’Arg399,i,tali
coms’havistperFTIR,esveuenincrementadeslescomponentsenestructurasecundària
irregular(1690‐1660cm‐1)aexpensesde ladesestabilitzacióde la fulla‐β flexible(1640
cm‐1)(Figura4.10/Taula4.5).DelamateixamanerapassaamblesmutacionsD332G/P,
V‐Capítol4 Discussió
254
queevitenlaformaciódel’anelldesuccinimida.Peraltrabanda,almutarelresiduGlu401
(E401R) les fulles‐βnoesveuenalterades.Això remarca la importànciade la interacció
entrel’hèlix‐α3ilescadenesβ2iβ3,tantanivelld’afinitatcomd’estabilitzacióglobaldela
molècula, disminuint la tendència a l’agregació. Per tant, trencar les interaccions entre
aquestesduesregionsdeldominidonariallocaunadesestabilitzaciódelaregiódelPDZ3
ambtendènciaal’agregació,lescadenesβ2,β3iβ4.
Pelque faa la formacióde l’estat intermediariapartirdemonòmersmutants,el
canviprincipalentotselsmutantsrespecteelPDZ3,éselpromiscuisignificantincrement
de la banda a 1620 cm‐1 just després dels 5 min a 60 °C (Figura 4. 16/Taula 4. 5),
corresponentalsagregats‐βordenats,principalmentenelcasdel’E401R,quasisemblant
al’10ct‐PDZ3(un26%i29%,respectivament,versusel12%delPDZ3).
Figura 4. 16.Evolució, en funció del temps d’incubació a 60 °C,de la banda de 1620 cm.1 de FTIR,
corresponentalsagregats‐β,deldominiPDZ3ilessevesvariants.
En concordança, aquest increment es troba relacionat amb la reorganització
conformacional que pateix la fulla‐β nativa del domini durant la via d’agregació. En
general,elsmutantslocalitzatsal’hèlix‐α3(l’10ct‐PDZ3ielE401R)sónméspropensosa
l’agregació,totiqueals16diesd’incubacióeltantpercentdelabandaa1620cm‐1ésla
mateixaquealdominiPDZ3,un18%(Taula4.5).Elsmutants,D332G/PiE334L/Q,tots
quatre situats dins la regió del domini amb tendència a l’agregació,mostren unamajor
tendènciaqueelPDZ3justdesprésdelaincubacióinicial,ilamantenenalllargdetemps
representantel25%del’àrea,aproximadament.Endefinitiva,delsresultatsdeFTIRse’n
extreuquetotselsmutantsdonenllocaproteïnesambméstendènciaal’agregacióqueel
dominiPDZ3.
VI. CONCLUSIONSGENERALS.
VI‐ConclusionsGenerals Capítol1
257
Aquest treball demostra la importància dels estats intermediaris a l’espai
conformacionaldelesproteïnes,lasevarelacióamblesmalaltiesconformacionalsi
l’aplicabilitatdelseuconeixementeneldesenvolupamentdeteràpiesefectives.
‐ Capítol1:
S’ha optimitzat l’obtenció d’un fragment d’anticòs recombinant específic contra
oligòmers d’Aβ1‐42, l’scFv‐h3D6, a partir del replegament de la fracció insoluble
obtinguda dins del sistema d’expressió d’E. coliOrigami2(DE3) i la proteïna de
fusiótrx,posteriormenteliminadaperlaproteasaespecíficaTEV.
L’scFv‐h3D6conté4residuscisteïna,dosperdomini,elsqualspodenformarfinsa
8 combinacions de ponts disulfur diferents, a banda de la nativa. Les formes
scrambledmodifiqueninteraccionsintra‐domini,alterendràsticamentl’estabilitat
globaldelamolècula,iaugmentenlatendènciaal’agregaciódel’scFv‐h3D6.
Percromatografiadebescanvicatiònic,s’hapogutseparar la formanativade les
scrambled.
Les estructures secundària i terciària de l’scFv‐h3D6, estudiades per CD,
fluorescènciadetriptòfaniFTIR,segonselcas,mostraeltípicplegamenttot‐βd’Ig,
i on els residus triptòfan conservats dels nuclis hidrofòbics contribueixen en ell
donantllocalsespectresparticularsdelsscFv.
Sota pertorbació tèrmica, l’scFv‐h3D6 entra a la via d’agregació en fulla‐β
ordenada,independentdeconcentracióiirreversible,laqualestàpobladaperun
intermediariricenestructura‐β.
Per FTIR i TEM, s’ha comprovat que l’agregació per temperatura de l’scFv‐h3D6
esdevé en la formació de fibres WL, mentre que el pèptid Aβ1‐42 causant de
l’Alzheimerdónallocafibresamiloides.
Els assajos per MTT, mostren que els oligòmers del pèptid Aβ1‐42, induïts per
temperatura,redueixenlaviabilitatdelcultiucel·lulardeneuroblastomahumàSH‐
SY5Yfinsaun60%.
Lacoincubaciódel’scFv‐h3D6ambelpèptidAβ1‐42anul·laelseuefectetòxicsobre
lescèl·lulesSH‐SY5Yd’unamaneradepenentdeconcentració.
En condicions natives, l’scFv‐h3D6 inhibeix la formació de fibres amiloides i la
citotoxicitat del pèptidAβ1‐42mitjançant la retiradadels oligòmers d’Aβ1‐42 de la
viaamiloidecapalaviaWL.
VI‐ConclusionsGenerals Capítol1
258
Les fibres WL formades pel complex Aβ1‐42:scFv‐h3D6 són cinètica i
termodinàmicamentmés favorablesque lesdel l’scFv‐h3D6sol, jaqueapareixen
sensenecessitatdetractamentambtemperatura,ienpresènciadeDMSO.
La descripció del mecanisme pel qual l’scFv‐h3D6 actua contra la toxicitat del
pèptid Aβ1‐42 obre una nova via per a millorar, en un futur, el seu potencial
terapèutic.
VI‐ConclusionsGenerals Capítol2
259
‐ Capítol2:
S’haobtingutunmodeltridimensionaldelfragmentd’anticòsscFv‐h3D6específic
contra el pèptid Aβ1‐42. El pdb motlle utilitzat, l’scFv 2GHW, té un grau global
d’homologiaalvoltantdel94%amblanostraseqüència,característicaquefaque
elmodelsiguimoltfiable.
El 6% de les mutacions no conservatives es troben en els CDR, les regions de
reconeixementdelantigen.
La manca de resolució estructural del connector, degut a la seva elevada
flexibilitat, ha fet necessari refinar la seva estructura 3D. Aquest fet implica una
reestructuraciódelarestadelamolècula,principalmentdeldominiVH,elmenys
estableenlamajoriadelesseqüènciesdel’alineament,perònoenl’scFv‐h3D6.
Pel que fa a la classificació dels CDRs, tan sols el VH‐CDR1 s’allunyadel consens
general,perlasevallargàriailocalitzacióeneldomini,iguanyaimportànciaenla
funciód’interaccióambl’antigen.
Elmodelfinalcontéun51%defulla‐β,un29%degirs‐β,iun20%deloops.Cada
domini adopta un plegament de tipus barril‐β amb un pont disulfur, en
concordançaambelplegamentdetipusimmunoglobulina.
ElsCDRsd’ambdósdominiseslocalitzenalamateixacaradel’estructuraglobular,
oposats al connector, i exposats al solvent; una disposició òptima per a unir
l’antigeniassolirlamàximaestabilitatdelamolècula.
L’obtenciódelsvalorsdel’exposiciódelresidusalsolvent,laprediccióderegions
amb tendència a l’agregació, i l’alineament múltiple de seqüències, ha permès
extreurelainformaciónecessàriaperaunredissenyracionaldelamolècula,iaixí
millorar‐nel’estabilitatidisminuirlatendènciaal’agregació.
S’hanidentificat4regionsdel’scFv‐h3D6ambfortatendènciaal’agregació,totes
elles molt enterrades al nucli hidrofòbic de la molècula, de les quals s’han
dissenyat6mutantspuntualsperadisminuir latendènciaa l’agregaciódelscFv‐
h3D6.
Lesmutacionsalnuclihidrofòbicaugmenten la tendènciaa l’agregacióde l’scFv‐
h3D6,confirmantladificultatdemutarresidusenterratsdinslamolècula.
L’extremC‐terminaldelamolècula,elresiduVL‐K107,segueixformantpartdela
cadena‐β G i estableix interaccions que desestabilitzen la cadena, de forma que
s’han dissenyat 3 mutants per tal d’elongar aquest extrem i augmentar‐ne
l’estabilitat.
VI‐ConclusionsGenerals Capítol2
260
L’elongació de l’extrem C‐terminal, mutants VL‐el‐R108G VL‐el‐R108 i VL‐el‐
R108T109, augmenta l’estabilitat termodinàmica i disminueix la tendència a
l’agregaciódel’scFv‐h3D6.
L’obtenció d’un model tridimensional de l’scFv‐h3D6, per homologia de
seqüències,hapermèsferunredissenyracionaldelamolèculapertaldemillorar‐
ne la seva estabilitat, disminuir la tendència a l’agregació, augmentar la seva
producció, i disminuir la dosi efectiva ja demostrada en ratolins model
d’Alzheimer.
VI‐ConclusionsGenerals Capítol3
261
‐ Capítol3:
L’AL‐12, un domini variable d’Ig procedent d’una pacient amb Amiloïdosi de
cadenalleugera,aixícom4mutantsrestauratius,hanestatobtingutsipurificatsde
lafraccióperiplasmàticad’E.coli,excepteelmutantH32Yquehaestatpurificatde
lafraccióinsoluble,degutalasevamajortendènciaal’agregació.
EldominiAL‐12adoptaunplegamentenbarril‐β típicd’immunoglobulina,onel
residuTrp35altamentconservatcontribueixenelespectredeCDambunmínim
d’el·lipticitataddicional.
Elplegamentnatiudel’AL‐12ésreversibleanivelld’estructurasecundàriamentre
quelaterciàrianorecuperal’estatnatiu.
Ladesnaturalitzaciótèrmica,seguidaperCDifluorescènciadelresiduTrp35,dóna
llocal’agregaciódelaproteïna,laqualpateixunatransicióconformacionalones
formaunestatintermediariprecursordel’agregaciódetipus‐β.PerFTIRs’observa
queaquestintermediarijapresentaunaconformaciósimilaraladel’estatagregat
final.
Ladesnaturalitzacióquímica,mitjançanturea,dónallocaldesplegamenttotaldel
dominiseguintunprocésdedosestats,sensepoblarcapintermediaridereacció.
Les mutacions restauratives, cap a la línia germinal i menys amiloidogènica кI
O18/O8, perden gran part de la reversibilitat observada en l’AL‐12, estabilitzen
l’intermediarid’agregació, idesvien laviadeplegament capa laviade formació
d’agregats‐βmésestables.
Capdelesmutacionspuntualsrecuperal’estabilitattermodinàmicadelaproteïna
germinal кI O18/O8, si no al contrari, totes elles han estat desestabilitzadores
respectel’AL‐12.
LadesestabilitzaciódeldominiAL‐12varelacionadaambunamajor tendènciaa
l’agregació,talicoms’observaalescorbesdedesnaturalitzaciótèrmica,seguides
perCDifluorescènciadetriptòfan.
Larestauracióderesiduspuntualsdel’AL‐12capalalíniagerminalкIO18/O8,no
implicaelretornde lespropietatsconformacionals i termodinàmiquesgerminals
aldominiamiloidogènic i,pertant,és improbablequeunaúnicamutaciósigui la
causadequeundominiVLesdevinguiamiloidogènicicausantdelamalaltia.
VI‐ConclusionsGenerals Capítol4
263
‐ Capítol4:
LacorbadedesnaturalitzaciótèrmicadeldominiPSD95‐PDZ3segueixunareacció
dedosestatsonespoblaunestatintermediaritrimèricricenestructura‐β,quees
trobaforadelaviadeplegamentdeldominiiquedónallocalaformaciódefibres
reversiblesinodependentsdeconcentració.
PerTEMiFTIR,s’hademostratqueelsagregats‐βdeldominiPDZ3sónde tipus
WL; i lesmicrografiesmostrenque lasevareversibilitatdecreixamesuraque la
reaccióéstrobamésdesplaçadacapalaformaciód’agregatsmadurs.
Lainfluènciadelaforçaiònicasobreelprocésd’agregaciódeldominiPDZaccelera
lareorganitzaciódelesfulles‐β,perònocanviaeltipusdeviad’agregació.
Els assajos de toxicitat en la línia cel·lular de neuroblastoma humà SH‐SY5Y,
mostren que els agregats WL del domini PDZ3 són citotòxics, i que aquesta
augmentaamesuraquelaviad’agregacióestrobamésavançada.
Lesduesregionsamb tendènciaa l’agregació, les cadenesβ3 iβ5,es trobena la
superfície i en cares oposades de l’estructura globular, facilitant la formació de
l’oligòmertrimèricprecursordel’agregació.
PerFTIR,s’hadeterminatqueunadelesduesfulles‐βdeldomini,concretamentla
mésflexible,éslaprecursoradelareestructuraciódel’estatnatiucapalaformació
de l’intermediari que porta a la formació de fibres‐β ordenades, mentre que la
restad’estructuressecundàriesrestenpràcticamentinalterades.
Per RMN, s’ha identificat la cadena β3 com la principal responsable del canvi
conformacional que pateix la proteïna i que l’arrossega cap a la via d’agregació.
D’aquestamanera, la fullaβ formadaper lescadenesβ2,β3 iβ4ésmolt flexible,
mentrequelaformadaperlescadenesβ1iβ5ésmésestable.
Elfetquelabutxacad’unióalligands,queeslocalitzaalacavitatentrelacadena‐
β2i l’hèlix‐α2,esvegipertorbadadurant laviad’agregacióexplicaperquè l’estat
intermediarinoésfuncional.
La deleció de l’hèlix‐α3, reguladora al·lostèrica de l’afinitat del domini, afecta el
procés de plegament del domini PDZ3, de forma que apareix un intermediari
monomèric a l’equilibri previ a la seva associació, seguint un procés de quatre
estats.
L’absència de l’hèlix‐α3 estabilitza l’estat l’intermediari a l’equilibri i incrementa
l’exposicióalsolventdelesduesregionsambtendènciaal’agregació.Aixòfacilita
eldesplegamentil’auto‐associaciódelsdominis,i,pertant,augmentalatendència
aformaragregatsfibril·larsperpartdeldomini.
VI‐ConclusionsGenerals Capítol4
264
Lapèrduad’interaccióentrel’hèlix‐α3ielloopβ2iβ3,importantperalaregulació
de l’afinitat i l’empaquetamentdeldomini,dóna llocaunadesestabilitzacióde la
regió del PDZ3 amb tendència a l’agregació. Per tant, els mutants d’aquesta
interacciógenerenproteïnesambméstendènciaal’agregacióqueeldominiPDZ3.
ElmutantE401R, situata lahèlix‐α3, segueixunprocésdeplegamentdequatre
estats,igualquelavariantΔ10ct‐PDZ3,sensel’hèlix‐α3.Encanvi,elsmutantsdela
regiódelloopβ2‐β3mantenenelmecanismedetresestatsdeldominiPDZ3.
L’eliminaciódelahèlix‐α3.obédelsseuscontactesamblarestadeldomini,regula
negativamentlacapacitatd’uniódelesproteïneslligand.
L’anàlisi de l’equilibri i l’agregació del domini PDZ3 aportarà pistes sobre si el
plegament de tres estats i l’agregació de tipusWL parcialment reversible és un
comportamentgeneraldinslagranfamíliadedominisPDZ.
VII. BIBLIOGRAFIA.
VII‐Bibliografia
267
Abraham,R.S.,Geyer,S.M.,Price‐Troska,T.L.,Allmer,C.,Kyle,R.A.,Gertz,M.A.&Fonseca,R.2003, "Immunoglobulin light chain variable (V) region genes influence clinicalpresentationandoutcomeinlightchain‐associatedamyloidosis(AL)",Blood,vol.101,no.10,pp.3801‐3808.
Ahmed,M.,Davis,J.,Aucoin,D.,Sato,T.,Ahuja,S.,Aimoto,S.,Elliott,J.I.,VanNostrand,W.E.& Smith, S.O. 2010, "Structural conversion of neurotoxic amyloid‐beta(1‐42)oligomerstofibrils",Naturestructural&molecularbiology,vol.17,no.5,pp.561‐567.
Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman,D.J.1990,"Basiclocalalignmentsearchtool",JournalofMolecularBiology,vol.215,no.3,pp.403‐410.
Anfinsen, C.B., Harber, E., Sela, M. & White, F.H.,Jr 1961, "The kinetics of formation ofnativeribonucleaseduringoxidationofthereducedpolypeptidechain",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.47,pp.1309‐1314.
Arbel, M. & Solomon, B. 2007, "Immunotherapy for Alzheimer's disease: attackingamyloid‐betafromtheinside",Trendsinimmunology,vol.28,no.12,pp.511‐513.
Arndt,K.M.,Muller,K.M.&Pluckthun,A.1998,"Factorsinfluencingthedimertomonomertransitionofanantibodysingle‐chainFvfragment",Biochemistry,vol.37,no.37,pp.12918‐12926.
Arrondo, J.L., Echabe, I., Iloro, I., Hernando, M.A., de la Cruz, F. & Goni, F.M. 2003, "Abacterial TrwC relaxase domain contains a thermally stable alpha‐helical core",JournalofBacteriology,vol.185,no.14,pp.4226‐4232.
Arrondo,J.L.&Goni,F.M.1999,"Structureanddynamicsofmembraneproteinsasstudiedbyinfraredspectroscopy",Progressinbiophysicsandmolecularbiology,vol.72,no.4,pp.367‐405.
Arrondo, J.L., Muga, A., Castresana, J. & Goni, F.M. 1993, "Quantitative studies of thestructure of proteins in solution by Fourier‐transform infrared spectroscopy",Progressinbiophysicsandmolecularbiology,vol.59,no.1,pp.23‐56.
Bacskai,B.J.,Kajdasz,S.T.,McLellan,M.E.,Games,D.,Seubert,P.,Schenk,D.&Hyman,B.T.2002, "Non‐Fc‐mediated mechanisms are involved in clearance of amyloid‐beta invivo by immunotherapy", The Journal of neuroscience : the official journal of theSocietyforNeuroscience,vol.22,no.18,pp.7873‐7878.
Baden,E.M.,Owen,B.A.,Peterson,F.C.,Volkman,B.F.,Ramirez‐Alvarado,M.&Thompson,J.R.2008a,"Altereddimerinterfacedecreasesstabilityinanamyloidogenicprotein",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.283,no.23,pp.15853‐15860.
Baden,E.M.,Randles,E.G.,Aboagye,A.K.,Thompson, J.R.&Ramirez‐Alvarado,M. 2008b,"Structural insights into the role of mutations in amyloidogenesis", The Journal ofbiologicalchemistry,vol.283,no.45,pp.30950‐30956.
Baldwin,R.L.1989,"Howdoesproteinfoldinggetstarted?",Trendsinbiochemicalsciences,vol.14,no.7,pp.291‐294.
VII‐Bibliografia
268
Bard,F.,Cannon,C.,Barbour,R.,Burke,R.L.,Games,D.,Grajeda,H.,Guido,T.,Hu,K.,Huang,J., Johnson‐Wood, K., Khan, K., Kholodenko, D., Lee, M., Lieberburg, I., Motter, R.,Nguyen, M., Soriano, F., Vasquez, N., Weiss, K.,Welch, B., Seubert, P., Schenk, D. &Yednock, T. 2000, "Peripherally administered antibodies against amyloid beta‐peptideenterthecentralnervoussystemandreducepathologyinamousemodelofAlzheimerdisease",Naturemedicine,vol.6,no.8,pp.916‐919.
Beel, A.J., Mobley, C.K., Kim, H.J., Tian, F., Hadziselimovic, A., Jap, B., Prestegard, J.H. &Sanders, C.R. 2008, "Structural studies of the transmembraneC‐terminal domainofthe amyloid precursor protein (APP): does APP function as a cholesterol sensor?",Biochemistry,vol.47,no.36,pp.9428‐9446.
Bennion, B.J. & Daggett, V. 2003, "Themolecular basis for the chemical denaturation ofproteinsbyurea",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.100,no.9,pp.5142‐5147.
Berman,H.,Henrick,K.,Nakamura,H.&Markley,J.L.2007,"TheworldwideProteinDataBank (wwPDB): ensuring a single, uniform archive of PDB data", Nucleic acidsresearch,vol.35,no.Databaseissue,pp.D301‐3.
Birnboim, H.C. & Doly, J. 1979, "A rapid alkaline extraction procedure for screeningrecombinantplasmidDNA",Nucleicacidsresearch,vol.7,no.6,pp.1513‐1523.
Blancas‐Mejia,L.M.&Ramirez‐Alvarado,M.2013,"SystemicAmyloidoses",AnnualReviewofBiochemistry,.
Blancas‐Mejia, L.M., Tellez, L.A., del Pozo‐Yauner, L., Becerril, B., Sanchez‐Ruiz, J.M. &Fernandez‐Velasco, D.A. 2009, "Thermodynamic and kinetic characterization of agerm line human lambda6 light‐chain protein: the relation between unfolding andfibrillogenesis",JournalofMolecularBiology,vol.386,no.4,pp.1153‐1166.
Blanco, F.J., Serrano, L. & Forman‐Kay, J.D. 1998, "High populations of non‐nativestructures in the denatured state are compatible with the formation of the nativefoldedstate",JournalofMolecularBiology,vol.284,no.4,pp.1153‐1164.
Blasco‐Moreno, B. 2011, Estabilització de l'extrem C‐terminal d'un fragment variable decadena senzilla (scFv) específic per al pèptid Aβ, Treball de Màster, UniversitatAutònomadeBarcelona.
Blommel, P.G. & Fox, B.G. 2007, "A combined approach to improving large‐scaleproduction of tobacco etch virus protease",Protein expressionandpurification, vol.55,no.1,pp.53‐68.
Bramucci, E., Paiardini, A., Bossa, F. & Pascarella, S. 2012, "PyMod: sequence similaritysearches, multiple sequence‐structure alignments, and homology modeling withinPyMOL",BMCbioinformatics,vol.13Suppl4,pp.S2‐2105‐13‐S4‐S2.
Brenner,D.A., Jain,M.,Pimentel,D.R.,Wang,B.,Connors,L.H.,Skinner,M.,Apstein,C.S.&Liao, R. 2004, "Human amyloidogenic light chains directly impair cardiomyocytefunctionthroughanincreaseincellularoxidantstress",Circulationresearch,vol.94,no.8,pp.1008‐1010.
VII‐Bibliografia
269
Brockwell, D.J., Smith, D.A. & Radford, S.E. 2000, "Protein folding mechanisms: newmethodsandemergingideas",Currentopinioninstructuralbiology,vol.10,no.1,pp.16‐25.
Bryngelson, J.D.,Onuchic, J.N., Socci,N.D.&Wolynes,P.G.1995, "Funnels,pathways, andtheenergylandscapeofproteinfolding:asynthesis",Proteins,vol.21,no.3,pp.167‐195.
Bucciantini,M.,Giannoni,E.,Chiti,F.,Baroni,F.,Formigli,L.,Zurdo,J.,Taddei,N.,Ramponi,G.,Dobson,C.M.&Stefani,M.2002,"Inherenttoxicityofaggregatesimpliesacommonmechanismforproteinmisfoldingdiseases",Nature,vol.416,no.6880,pp.507‐511.
Byler, D.M. & Susi, H. 1986, "Examination of the secondary structure of proteins bydeconvolvedFTIRspectra",Biopolymers,vol.25,no.3,pp.469‐487.
Camara‐Artigas,A.,Murciano‐Calles,J.,Gavira,J.A.,Cobos,E.S.&Martinez,J.C.2010,"Novelconformational aspects of the third PDZ domain of the neuronal post‐synapticdensity‐95 protein revealed from two 1.4A X‐ray structures", Journal of structuralbiology,vol.170,no.3,pp.565‐569.
Cascella,R.,Conti, S.,Tatini, F., Evangelisti, E., Scartabelli,T., Casamenti, F.,Wilson,M.R.,Chiti, F. & Cecchi, C. 2013, "Extracellular chaperones prevent Abeta42‐inducedtoxicityinratbrains",Biochimicaetbiophysicaacta,vol.1832,no.8,pp.1217‐1226.
Cerda‐Costa,N.,DelaArada,I.,Aviles,F.X.,Arrondo,J.L.&Villegas,S.2009,"InfluenceofaggregationpropensityandstabilityonamyloidfibrilformationasstudiedbyFouriertransform infrared spectroscopy and two‐dimensional COS analysis", Biochemistry,vol.48,no.44,pp.10582‐10590.
Cerda‐Costa, N., Esteras‐Chopo, A., Aviles, F.X., Serrano, L. & Villegas, V. 2007, "Earlykinetics of amyloid fibril formation reveals conformational reorganisation of initialaggregates",JournalofMolecularBiology,vol.366,no.4,pp.1351‐1363.
Chan, H.S., Bromberg, S. & Dill, K.A. 1995, "Models of cooperativity in protein folding",Philosophical transactionsof theRoyalSocietyofLondon.SeriesB,Biologicalsciences,vol.348,no.1323,pp.61‐70.
Cheng, I.H.,Scearce‐Levie,K.,Legleiter, J.,Palop, J.J.,Gerstein,H.,Bien‐Ly,N.,Puolivali, J.,Lesne, S., Ashe, K.H.,Muchowski, P.J. &Mucke, L. 2007, "Accelerating amyloid‐betafibrillization reduces oligomer levels and functional deficits in Alzheimer diseasemousemodels",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.282,no.33,pp.23818‐23828.
Chirgadze, Y.N. & Nevskaya, N.A. 1976, "Infrared spectra and resonance interaction ofamide‐Ivibrationoftheantiparallel‐chainpleatedsheet",Biopolymers,vol.15,no.4,pp.607‐625.
Chiti, F. & Dobson, C.M. 2009, "Amyloid formation by globular proteins under nativeconditions",Naturechemicalbiology,vol.5,no.1,pp.15‐22.
Chiti,F.&Dobson,C.M.2006,"Proteinmisfolding,functionalamyloid,andhumandisease",AnnualReviewofBiochemistry,vol.75,pp.333‐366.
VII‐Bibliografia
270
Chothia, C. & Lesk, A.M. 1986, "The relation between the divergence of sequence andstructureinproteins",TheEMBOjournal,vol.5,no.4,pp.823‐826.
Cobos, E.S., Iglesias‐Bexiga,M., Ruiz‐Sanz, J.,Mateo, P.L., Luque, I. &Martinez, J.C. 2009,"Thermodynamic characterization of the folding equilibrium of the human Nedd4‐WW4domain:atthefrontiersofcooperativefolding",Biochemistry,vol.48,no.36,pp.8712‐8720.
Cobos,E.S.,Pisabarro,M.T.,Vega,M.C.,Lacroix,E.,Serrano,L.,Ruiz‐Sanz,J.&Martinez,J.C.2004, "A miniprotein scaffold used to assemble the polyproline II binding epitoperecognized by SH3 domains", JournalofMolecularBiology,vol. 342, no. 1, pp. 355‐365.
Comenzo, R.L., Zhang, Y., Martinez, C., Osman, K. & Herrera, G.A. 2001, "The tropism oforgan involvement in primary systemic amyloidosis: contributions of Ig V(L) germlinegeneuseandclonalplasmacellburden",Blood,vol.98,no.3,pp.714‐720.
Creighton,T.E.1992,ProteinFolding,W.H.Freeman&Co.,NewYork.
Daggett, V. & Fersht, A.R. 2003, "Is there a unifying mechanism for protein folding?",Trendsinbiochemicalsciences,vol.28,no.1,pp.18‐25.
Dahlgren, K.N., Manelli, A.M., Stine, W.B.,Jr, Baker, L.K., Krafft, G.A. & LaDu, M.J. 2002,"Oligomeric and fibrillar species of amyloid‐beta peptides differentially affectneuronal viability",The Journal ofbiological chemistry, vol. 277, no. 35, pp. 32046‐32053.
Das, A. & Mukhopadhyay, C. 2009, "Urea‐mediated protein denaturation: a consensusview",Thejournalofphysicalchemistry.B,vol.113,no.38,pp.12816‐12824.
del Pozo Yauner, L., Ortiz, E., Sanchez, R., Sanchez‐Lopez, R., Guereca, L., Murphy, C.L.,Allen,A.,Wall,J.S.,Fernandez‐Velasco,D.A.,Solomon,A.&Becerril,B.2008,"Influenceof the germline sequence on the thermodynamic stability and fibrillogenicity ofhumanlambda6lightchains",Proteins,vol.72,no.2,pp.684‐692.
DeLano,W.L.2002,ThePyMOLMolecularGraphicsSystem,DeLanoScientific,SanCarlos,CA.
Deshpande,A.,Mina,E.,Glabe,C.&Busciglio,J.2006,"Differentconformationsofamyloidbeta induce neurotoxicity by distinctmechanisms in human cortical neurons",TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience,vol.26,no.22,pp.6011‐6018.
Dill, K.A. & Chan,H.S. 1997, "From Levinthal to pathways to funnels",Nature structuralbiology,vol.4,no.1,pp.10‐19.
Dineley, K.T., Xia, X., Bui, D., Sweatt, J.D. & Zheng, H. 2002, "Accelerated plaqueaccumulation, associative learning deficits, and up‐regulation of alpha 7 nicotinicreceptor protein in transgenic mice co‐expressingmutant human presenilin 1 andamyloidprecursorproteins",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.277,no.25,pp.22768‐22780.
VII‐Bibliografia
271
Dobson, C.M., Evans, P.A. & Radford, S.E. 1994, "Understanding how proteins fold: thelysozymestorysofar",Trendsinbiochemicalsciences,vol.19,no.1,pp.31‐37.
Dodart, J.C.,Bales,K.R.,Gannon,K.S.,Greene,S.J.,DeMattos,R.B.,Mathis,C.,DeLong,C.A.,Wu, S.,Wu, X., Holtzman, D.M. & Paul, S.M. 2002, "Immunization reversesmemorydeficitswithoutreducingbrainAbetaburden inAlzheimer'sdiseasemodel",Natureneuroscience,vol.5,no.5,pp.452‐457.
Doyle,D.A.,Lee,A.,Lewis,J.,Kim,E.,Sheng,M.&MacKinnon,R.1996,"Crystalstructuresofacomplexedandpeptide‐freemembraneprotein‐bindingdomain:molecularbasisofpeptiderecognitionbyPDZ",Cell,vol.85,no.7,pp.1067‐1076.
Dunker, A.K., Silman, I., Uversky, V.N. & Sussman, J.L. 2008, "Function and structure ofinherentlydisorderedproteins",Currentopinion in structuralbiology,vol. 18,no.6,pp.756‐764.
Eaton,W.A.1999, "Searching for "downhill scenarios" inprotein folding",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesof theUnitedStatesofAmerica,vol.96,no.11,pp.5897‐5899.
Elias, G.M. & Nicoll, R.A. 2007, "Synaptic trafficking of glutamate receptors by MAGUKscaffoldingproteins",Trendsincellbiology,vol.17,no.7,pp.343‐352.
Esquerda‐Canals,G.2013,Neuronalvulnerability inthe3xTg‐ADmouseand itsprotectionby the anti‐amyloid β antibody fragment scFv‐h3D6, Treball de Màster, UniversitatAutònomadeBarcelona.
Esquerda‐Canals,G.,Marti, J.,Rivera‐Hernandez,G.,Gimenez‐Llort,L.&Villegas,S.2013,"Loss of deep cerebellar nuclei neurons in the 3xTg‐ADmice and protection by ananti‐amyloidbetaantibodyfragment",mAbs,vol.5,no.5,pp.660‐664.
Facciuto, F., Cavatorta, A.L., Valdano, M.B., Marziali, F. & Gardiol, D. 2012, "DifferentialexpressionofPDZdomain‐containingproteinsinhumandiseases‐challengingtopicsandnovelissues",TheFEBSjournal,vol.279,no.19,pp.3538‐3548.
Fandrich, M. 2012, "Oligomeric intermediates in amyloid formation: structuredeterminationandmechanismsoftoxicity",JournalofMolecularBiology,vol.421,no.4‐5,pp.427‐440.
Fenyö,D.2010,ComputationalBiology,SpringerProtocols,US.
Fernandez‐Escamilla,A.M.,Rousseau,F.,Schymkowitz,J.&Serrano,L.2004,"Predictionofsequence‐dependent and mutational effects on the aggregation of peptides andproteins",Naturebiotechnology,vol.22,no.10,pp.1302‐1306.
Fersht, A.R. 1997, "Nucleation mechanisms in protein folding", Current opinion instructuralbiology,vol.7,no.1,pp.3‐9.
Fersht,A.R.1993, "ThesixthDattaLecture.Protein foldingandstability: thepathwayoffoldingofbarnase",FEBSletters,vol.325,no.1‐2,pp.5‐16.
Fitzpatrick, A.W., Debelouchina, G.T., Bayro, M.J., Clare, D.K., Caporini, M.A., Bajaj, V.S.,Jaroniec, C.P., Wang, L., Ladizhansky, V., Muller, S.A., MacPhee, C.E., Waudby, C.A.,
VII‐Bibliografia
272
Mott, H.R., De Simone, A., Knowles, T.P., Saibil, H.R., Vendruscolo, M., Orlova, E.V.,Griffin, R.G.&Dobson, C.M. 2013, "Atomic structure andhierarchical assembly of across‐beta amyloid fibril", Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnitedStatesofAmerica,vol.110,no.14,pp.5468‐5473.
Focant, M.C. & Hermans, E. 2013, "Protein interacting with C kinase and neurologicaldisorders",Synapse(NewYork,N.Y.),.
Fukuchi,K.,Accavitti‐Loper,M.A.,Kim,H.D.,Tahara,K.,Cao,Y.,Lewis,T.L.,Caughey,R.C.,Kim,H.&Lalonde,R.2006,"Ameliorationofamyloidloadbyanti‐Abetasingle‐chainantibody in Alzheimer mouse model", Biochemical and biophysical researchcommunications,vol.344,no.1,pp.79‐86.
Gimenez‐Llort,L.,Blazquez,G.,Canete,T.,Johansson,B.,Oddo,S.,Tobena,A.,LaFerla,F.M.& Fernandez‐Teruel, A. 2007, "Modeling behavioral and neuronal symptoms ofAlzheimer's disease in mice: a role for intraneuronal amyloid", Neuroscience andbiobehavioralreviews,vol.31,no.1,pp.125‐147.
Gimenez‐Llort, L., Rivera‐Hernandez, G., Marin‐Argany, M., Sanchez‐Quesada, J.L. &Villegas, S. 2013, "Early intervention in the 3xTg‐AD mice with an amyloid beta‐antibodyfragmentamelioratesfirsthallmarksofAlzheimerdisease",mAbs,vol.5,no.5,pp.665‐677.
Goh,K.I.&Choi,I.G.2012,"Exploringthehumandiseasome:thehumandiseasenetwork",Briefingsinfunctionalgenomics,vol.11,no.6,pp.533‐542.
Gomez, S.B. & Di Mauro, P.P. 2012, Polymeric nanoparticles for drug delivery<br />,WO/2012/153286edn,PCT/IB2012/052320,ES.
Good,M.C.,Zalatan,J.G.&Lim,W.A.2011,"Scaffoldproteins:hubsforcontrollingtheflowofcellularinformation",Science(NewYork,N.Y.),vol.332,no.6030,pp.680‐686.
Goormaghtigh, E., Cabiaux, V. & Ruysschaert, J.M. 1994, "Determination of soluble andmembrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy. I.Assignmentsandmodelcompounds",Sub‐cellularbiochemistry,vol.23,pp.329‐362.
Gosal, W.S., Morten, I.J., Hewitt, E.W., Smith, D.A., Thomson, N.H. & Radford, S.E. 2005,"Competing pathways determine fibril morphology in the self‐assembly of beta2‐microglobulinintoamyloid",JournalofMolecularBiology,vol.351,no.4,pp.850‐864.
Haass, C. & Selkoe, D.J. 2007, "Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessonsfrom the Alzheimer's amyloid beta‐peptide", Nature reviews.Molecular cell biology,vol.8,no.2,pp.101‐112.
Hanahan,D.1983,"StudiesontransformationofEscherichiacoliwithplasmids",JournalofMolecularBiology,vol.166,no.4,pp.557‐580.
Heredia, P. & De Las Rivas, J. 2003, "Calcium‐dependent conformational change andthermal stability of the isolated PsbO protein detected by FTIR spectroscopy",Biochemistry,vol.42,no.40,pp.11831‐11838.
VII‐Bibliografia
273
Herrup,K.2010,"ReimaginingAlzheimer'sdisease‐‐anage‐basedhypothesis",TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience,vol.30,no.50,pp.16755‐16762.
Hock,C.,Konietzko,U.,Streffer,J.R.,Tracy,J.,Signorell,A.,Muller‐Tillmanns,B.,Lemke,U.,Henke, K., Moritz, E., Garcia, E., Wollmer, M.A., Umbricht, D., de Quervain, D.J.,Hofmann,M.,Maddalena,A., Papassotiropoulos,A.&Nitsch,R.M.2003, "Antibodiesagainstbeta‐amyloidslowcognitivedeclineinAlzheimer'sdisease",Neuron,vol.38,no.4,pp.547‐554.
Hou, X., Richardson, S.J., Aguilar, M.I. & Small, D.H. 2005, "Binding of amyloidogenictransthyretin to the plasma membrane alters membrane fluidity and inducesneurotoxicity",Biochemistry,vol.44,no.34,pp.11618‐11627.
Humphreys,D.T.,Carver,J.A.,Easterbrook‐Smith,S.B.&Wilson,M.R.1999,"Clusterinhaschaperone‐like activity similar to that of small heat shock proteins",The Journalofbiologicalchemistry,vol.274,no.11,pp.6875‐6881.
Hurle,M.R.,Helms,L.R.,Li,L.,Chan,W.&Wetzel,R.1994,"Arolefordestabilizingaminoacidreplacementsinlight‐chainamyloidosis",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.91,no.12,pp.5446‐5450.
Huse,M.&Kuriyan, J. 2002, "The conformationalplasticityofproteinkinases",Cell,vol.109,no.3,pp.275‐282.
Hust,M.,Jostock,T.,Menzel,C.,Voedisch,B.,Mohr,A.,Brenneis,M.,Kirsch,M.I.,Meier,D.&Dubel,S.2007,"SinglechainFab(scFab)fragment",BMCbiotechnology,vol.7,pp.14.
Itzhaki, L.S., Otzen, D.E. & Fersht, A.R. 1995, "The structure of the transition state forfolding of chymotrypsin inhibitor 2 analysed by protein engineering methods:evidence for a nucleation‐condensation mechanism for protein folding", Journal ofMolecularBiology,vol.254,no.2,pp.260‐288.
Ivarsson, Y. 2012, "Plasticity of PDZ domains in ligand recognition and signaling",FEBSletters,vol.586,no.17,pp.2638‐2647.
Jackson,S.E.&Fersht,A.R.1991, "Foldingof chymotrypsin inhibitor2.1.Evidence foratwo‐statetransition",Biochemistry,vol.30,no.43,pp.10428‐10435.
Jacobsen, J.S. 2006, Antibodies specific for epitopes within amyloid β (Aβ), for use inimprovingcognition.,WO/2006/066171edn,PCT/US2005/045860,US.
Jahn,T.R.&Radford,S.E.2008,"Foldingversusaggregation:polypeptideconformationsoncompetingpathways",ArchivesofBiochemistryandBiophysics,vol.469,no.1,pp.100‐117.
Jahn,T.R.&Radford,S.E.2005, "TheYinandYangofprotein folding",TheFEBS journal,vol.272,no.23,pp.5962‐5970.
Jahn, T.R., Tennent, G.A. & Radford, S.E. 2008, "A common beta‐sheet architectureunderlies in vitro and in vivo beta2‐microglobulin amyloid fibrils", The Journal ofbiologicalchemistry,vol.283,no.25,pp.17279‐17286.
VII‐Bibliografia
274
Jemth,P.&Gianni,S.2007,"PDZdomains:foldingandbinding",Biochemistry,vol.46,no.30,pp.8701‐8708.
John,D.M.&Weeks,K.M.2000,"van'tHoffenthalpieswithoutbaselines",Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety,vol.9,no.7,pp.1416‐1419.
Johnson, G. & Wu, T.T. 2001, "Kabat Database and its applications: future directions",Nucleicacidsresearch,vol.29,no.1,pp.205‐206.
Johnson, W.C.,Jr 1988, "Secondary structure of proteins through circular dichroismspectroscopy", Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry, vol. 17, pp.145‐166.
Jones,T.A.&Thirup,S.1986,"Usingknownsubstructuresinproteinmodelbuildingandcrystallography",TheEMBOjournal,vol.5,no.4,pp.819‐822.
Jurado,P.,deLorenzo,V.&Fernandez,L.A.2006,"Thioredoxinfusionsincreasefoldingofsingle chain Fv antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli: evidence thatchaperone activity is the prime effect of thioredoxin", JournalofMolecularBiology,vol.357,no.1,pp.49‐61.
Kabat,E.A.1983,Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,U.S.
Kabsch, W. & Sander, C. 1983, "Dictionary of protein secondary structure: patternrecognitionofhydrogen‐bondedandgeometrical features",Biopolymers,vol.22,no.12,pp.2577‐2637.
Kad, N.M., Myers, S.L., Smith, D.P., Smith, D.A., Radford, S.E. & Thomson, N.H. 2003,"Hierarchical assembly of beta2‐microglobulin amyloid in vitro revealed by atomicforcemicroscopy",JournalofMolecularBiology,vol.330,no.4,pp.785‐797.
Khurana,R.,Gillespie, J.R.,Talapatra,A.,Minert,L.J., Ionescu‐Zanetti,C.,Millett, I.&Fink,A.L.2001,"Partiallyfoldedintermediatesascriticalprecursorsoflightchainamyloidfibrilsandamorphousaggregates",Biochemistry,vol.40,no.12,pp.3525‐3535.
Kim, J., Jiang, H., Park, S., Eltorai, A.E., Stewart, F.R., Yoon, H., Basak, J.M., Finn, M.B. &Holtzman,D.M.2011,"HaploinsufficiencyofhumanAPOEreducesamyloiddepositionin a mouse model of amyloid‐beta amyloidosis", The Journal of neuroscience : theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience,vol.31,no.49,pp.18007‐18012.
Kim,P.S.&Baldwin,R.L.1990,"Intermediatesinthefoldingreactionsofsmallproteins",AnnualReviewofBiochemistry,vol.59,pp.631‐660.
Kim, P.S. & Baldwin, R.L. 1982, "Specific intermediates in the folding reactions of smallproteinsand themechanismofprotein folding",AnnualReviewofBiochemistry,vol.51,pp.459‐489.
Klein‐Seetharaman,J.,Oikawa,M.,Grimshaw,S.B.,Wirmer,J.,Duchardt,E.,Ueda,T.,Imoto,T., Smith, L.J., Dobson, C.M.& Schwalbe,H. 2002, "Long‐range interactionswithin anonnativeprotein",Science(NewYork,N.Y.),vol.295,no.5560,pp.1719‐1722.
VII‐Bibliografia
275
Koehl, P. & Levitt, M. 2002, "Protein topology and stability define the space of allowedsequences",Proceedingsof theNationalAcademy of Sciencesof theUnited States ofAmerica,vol.99,no.3,pp.1280‐1285.
Kopp, J. & Schwede, T. 2004, "The SWISS‐MODEL Repository of annotated three‐dimensionalproteinstructurehomologymodels",Nucleicacidsresearch,vol.32,no.Databaseissue,pp.D230‐4.
Kumar,S.&Walter,J.2011,"Phosphorylationofamyloidbeta(Abeta)peptides‐atriggerforformationoftoxicaggregatesinAlzheimer'sdisease",Aging,vol.3,no.8,pp.803‐812.
LaDu,M.J.,Falduto,M.T.,Manelli,A.M.,Reardon,C.A.,Getz,G.S.&Frail,D.E.1994,"Isoform‐specific binding of apolipoprotein E to beta‐amyloid", The Journal of biologicalchemistry,vol.269,no.38,pp.23403‐23406.
Laganowsky, A., Liu, C., Sawaya, M.R., Whitelegge, J.P., Park, J., Zhao, M., Pensalfini, A.,Soriaga,A.B.,Landau,M.,Teng,P.K.,Cascio,D.,Glabe,C.&Eisenberg,D.2012,"Atomicviewofatoxicamyloidsmalloligomer",Science(NewYork,N.Y.),vol.335,no.6073,pp.1228‐1231.
Lansbury, P.T. & Lashuel, H.A. 2006, "A century‐old debate on protein aggregation andneurodegenerationenterstheclinic",Nature,vol.443,no.7113,pp.774‐779.
Leach,A.R.2001,Mollecularmodelling.Principlesandapplications.2ndEditionedn,.
Lee,H.J.&Zheng,J.J.2010,"PDZdomainsandtheirbindingpartners:structure,specificity,andmodification",Cellcommunicationandsignaling:CCS,vol.8,pp.8‐811X‐8‐8.
Levinthal,C.1968,"Aretherepathwaysforproteinfolding?", JournaldeChimiePhysique,vol.65,no.1,pp.44‐45.
Linding, R., Schymkowitz, J., Rousseau, F., Diella, F. & Serrano, L. 2004, "A comparativestudyoftherelationshipbetweenproteinstructureandbeta‐aggregationinglobularandintrinsicallydisorderedproteins",JournalofMolecularBiology,vol.342,no.1,pp.345‐353.
Lockless, S.W.&Ranganathan,R.1999, "Evolutionarily conservedpathwaysof energeticconnectivityinproteinfamilies",Science(NewYork,N.Y.),vol.286,no.5438,pp.295‐299.
Long, J.F., Tochio,H.,Wang, P., Fan, J.S., Sala, C.,Niethammer,M., Sheng,M.& Zhang,M.2003, "Supramodular structure and synergistic target binding of the N‐terminaltandemPDZdomainsofPSD‐95",JournalofMolecularBiology,vol.327,no.1,pp.203‐214.
Lorenzo, A. & Yankner, B.A. 1994, "Beta‐amyloid neurotoxicity requires fibril formationandisinhibitedbycongored",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.91,no.25,pp.12243‐12247.
Maezawa,I.,Hong,H.S.,Liu,R.,Wu,C.Y.,Cheng,R.H.,Kung,M.P.,Kung,H.F.,Lam,K.S.,Oddo,S., Laferla, F.M. & Jin, L.W. 2008, "Congo red and thioflavin‐T analogs detect Abetaoligomers",Journalofneurochemistry,vol.104,no.2,pp.457‐468.
VII‐Bibliografia
276
Manoutcharian,K.,Acero,G.,Munguia,M.E.,Becerril,B.,Massieu,L.,Govezensky,T.,Ortiz,E., Marks, J.D., Cao, C., Ugen, K. & Gevorkian, G. 2004, "Human single chain Fvantibodies and a complementarity determining region‐derived peptide binding toamyloid‐beta1‐42",Neurobiologyofdisease,vol.17,no.1,pp.114‐121.
Marin‐Argany,M.2009,Modelatgetridimensionald'unfragmentvariabledecadenasenzilla(scFv) específic contra el pèptidAbeta, Treball deMàster, Universitat Autònoma deBarcelona.
Marin‐Argany, M., Rivera‐Hernandez, G., Marti, J. & Villegas, S. 2011, "An anti‐Abeta(amyloidbeta)single‐chainvariablefragmentpreventsamyloidfibril formationandcytotoxicity by withdrawing Abeta oligomers from the amyloid pathway", TheBiochemicaljournal,vol.437,no.1,pp.25‐34.
Marley, J., Lu, M. & Bracken, C. 2001, "A method for efficient isotopic labeling ofrecombinantproteins",JournalofBiomolecularNMR,vol.20,no.1,pp.71‐75.
McGee,A.W.&Bredt,D.S.2003,"Assemblyandplasticityoftheglutamatergicpostsynapticspecialization",Currentopinioninneurobiology,vol.13,no.1,pp.111‐118.
McGee,A.W.,Dakoji,S.R.,Olsen,O.,Bredt,D.S.,Lim,W.A.&Prehoda,K.E.2001,"StructureoftheSH3‐guanylatekinasemodulefromPSD‐95suggestsamechanismforregulatedassemblyofMAGUKscaffoldingproteins",Molecularcell,vol.8,no.6,pp.1291‐1301.
McLaughlin,R.W.,DeStigter,J.K.,Sikkink,L.A.,Baden,E.M.&Ramirez‐Alvarado,M.2006,"Theeffectsofsodiumsulfate,glycosaminoglycans,andCongoredon thestructure,stability, and amyloid formation of an immunoglobulin light‐chain protein",Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety,vol.15,no.7,pp.1710‐1722.
McLean,C.A.,Cherny,R.A.,Fraser,F.W.,Fuller,S.J.,Smith,M.J.,Beyreuther,K.,Bush,A.I.&Masters, C.L. 1999, "Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity ofneurodegeneration in Alzheimer's disease",Annals ofNeurology, vol. 46, no. 6, pp.860‐866.
McParland,V.J.,Kad,N.M.,Kalverda,A.P.,Brown,A.,Kirwin‐Jones,P.,Hunter,M.G.,Sunde,M. & Radford, S.E. 2000, "Partially unfolded states of beta(2)‐microglobulin andamyloidformationinvitro",Biochemistry,vol.39,no.30,pp.8735‐8746.
Mohajeri,M.H.,Saini,K.,Schultz,J.G.,Wollmer,M.A.,Hock,C.&Nitsch,R.M.2002,"Passiveimmunization against beta‐amyloid peptide protects central nervous system (CNS)neuronsfromincreasedvulnerabilityassociatedwithanAlzheimer'sdisease‐causingmutation",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.277,no.36,pp.33012‐33017.
Mok,Y.K.,Kay,C.M.,Kay,L.E.&Forman‐Kay,J.1999,"NOEdatademonstratingacompactunfolded state for an SH3 domain under non‐denaturing conditions", Journal ofMolecularBiology,vol.289,no.3,pp.619‐638.
Montoliu‐Gaia, L. 2013, Anàlisi de les conseqüències termodinàmiques i conformacionalsd'eliminarelpontdisulfurdeldominiVLd'unfragmentd'anticòsanti‐Aβ(scFv‐h3D6),TreballdeMàster,UniversitatAutònomadeBarcelona.
VII‐Bibliografia
277
Mostarda,S.,Gfeller,D.&Rao,F.2012,"Beyondthebindingsite:theroleofthebeta(2)‐beta(3) loop and extra‐domain structures in PDZ domains", PLoS computationalbiology,vol.8,no.3,pp.e1002429.
Muller, B.M., Kistner, U., Veh, R.W., Cases‐Langhoff, C., Becker, B., Gundelfinger, E.D. &Garner, C.C. 1995, "Molecular characterization and spatial distribution of SAP97, anovel presynaptic protein homologous to SAP90 and the Drosophila discs‐largetumor suppressor protein", The Journal of neuroscience : the official journal of theSocietyforNeuroscience,vol.15,no.3Pt2,pp.2354‐2366.
Mullis, K.B. & Faloona, F.A. 1987, "Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase‐catalyzedchainreaction",Methodsinenzymology,vol.155,pp.335‐350.
Murciano‐Calles, J. 2011, Caracterización termodinámico‐estructural de la estabilidad dedominiosPDZyanálisisdesuespecificidaddeuniónmediantelibreríasdeexpresiónenfagos,TesisDoctoral,UniversidaddeGranada.
Murciano‐Calles, J., Cobos, E.S., Mateo, P.L., Camara‐Artigas, A. &Martinez, J.C. 2011, "AcomparativeanalysisofthefoldingandmisfoldingpathwaysofthethirdPDZdomainofPSD95investigatedunderdifferentpHconditions",Biophysicalchemistry,vol.158,no.2‐3,pp.104‐110.
Murciano‐Calles, J., Cobos,E.S.,Mateo,P.L.,Camara‐Artigas,A.&Martinez, J.C.2010, "Anoligomeric equilibrium intermediate as the precursory nucleus of globular andfibrillarsupramacromolecularassemblies inaPDZdomain",Biophysical journal,vol.99,no.1,pp.263‐272.
Murciano‐Calles, J., Martinez, J.C., Marin‐Argany, M., Villegas, S. & Cobos, E.S. 2013, "Athermodynamic studyof the thirdPDZdomainofMAGUKneuronalproteinPSD‐95revealsacomplexthree‐statefoldingbehavior",BiophysicalChemistry,Submitted.
Naiki, H., Higuchi, K., Hosokawa, M. & Takeda, T. 1989, "Fluorometric determination ofamyloid fibrils in vitro using the fluorescent dye, thioflavin T1", AnalyticalBiochemistry,vol.177,no.2,pp.244‐249.
Nallamsetty,S.,Kapust,R.B.,Tozser,J.,Cherry,S.,Tropea,J.E.,Copeland,T.D.&Waugh,D.S.2004, "Efficient site‐specific processing of fusion proteins by tobacco veinmottlingvirusproteaseinvivoandinvitro",Proteinexpressionandpurification,vol.38,no.1,pp.108‐115.
Neudecker,P.,Robustelli,P.,Cavalli,A.,Walsh,P.,Lundstrom,P.,Zarrine‐Afsar,A.,Sharpe,S., Vendruscolo,M.&Kay, L.E. 2012, "Structure of an intermediate state in proteinfoldingandaggregation",Science(NewYork,N.Y.),vol.336,no.6079,pp.362‐366.
Nicoll, J.A., Wilkinson, D., Holmes, C., Steart, P., Markham, H. & Weller, R.O. 2003,"NeuropathologyofhumanAlzheimerdiseaseafterimmunizationwithamyloid‐betapeptide:acasereport",Naturemedicine,vol.9,no.4,pp.448‐452.
Nitsch, R.M. & Hock, C. 2008, "Targeting beta‐amyloid pathology in Alzheimer's diseasewithAbetaimmunotherapy",Neurotherapeutics :the journaloftheAmericanSocietyforExperimentalNeuroTherapeutics,vol.5,no.3,pp.415‐420.
VII‐Bibliografia
278
Nix, S.L., Chishti, A.H., Anderson, J.M. &Walther, Z. 2000, "hCASK and hDlg associate inepithelia,andtheirsrchomology3andguanylatekinasedomainsparticipateinbothintramolecular and intermolecular interactions",The Journalofbiologicalchemistry,vol.275,no.52,pp.41192‐41200.
Novotny, J. & Haber, E. 1985, "Structural invariants of antigen binding: comparison ofimmunoglobulin VL‐VH and VL‐VL domain dimers", Proceedings of the NationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.82,no.14,pp.4592‐4596.
Olinger, J.M., Hill, D.M., Jakobsen, R.J. & Brody, R.S. 1986, "Fourier transform infraredstudies of ribonuclease inH2O and 2H2O solutions",Biochimica etbiophysicaacta,vol.869,no.1,pp.89‐98.
Oliva, B., Bates, P.A., Querol, E., Aviles, F.X. & Sternberg, M.J. 1998, "Automatedclassificationof antibody complementaritydetermining region3of theheavy chain(H3) loops intocanonical formsand itsapplicationtoproteinstructureprediction",JournalofMolecularBiology,vol.279,no.5,pp.1193‐1210.
O'Nuallain,B.,Allen,A.,Kennel,S.J.,Weiss,D.T.,Solomon,A.&Wall,J.S.2007,"Localizationofaconformationalepitopecommontonon‐nativeandfibrillarimmunoglobulinlightchains",Biochemistry,vol.46,no.5,pp.1240‐1247.
Passafaro,M.,Sala,C.,Niethammer,M.&Sheng,M.1999,"MicrotubulebindingbyCRIPTanditspotentialroleinthesynapticclusteringofPSD‐95",Natureneuroscience,vol.2,no.12,pp.1063‐1069.
Pawar, A.P., Dubay, K.F., Zurdo, J., Chiti, F., Vendruscolo, M. & Dobson, C.M. 2005,"Predictionof"aggregation‐prone"and"aggregation‐susceptible"regionsinproteinsassociatedwithneurodegenerative diseases", JournalofMolecularBiology,vol. 350,no.2,pp.379‐392.
Pearson,W.R.1990,"RapidandsensitivesequencecomparisonwithFASTPandFASTA",Methodsinenzymology,vol.183,pp.63‐98.
Pedroso,I.,Irun,M.P.,Machicado,C.&Sancho,J.2002,"Four‐stateequilibriumunfoldingofanscFvantibodyfragment",Biochemistry,vol.41,no.31,pp.9873‐9884.
Peterson, F.C., Baden, E.M., Owen, B.A., Volkman, B.F. & Ramirez‐Alvarado, M. 2010, "Asingle mutation promotes amyloidogenicity through a highly promiscuous dimerinterface",Structure(London,England:1993),vol.18,no.5,pp.563‐570.
Petit,C.M.,Zhang,J.,Sapienza,P.J.,Fuentes,E.J.&Lee,A.L.2009,"HiddendynamicallosteryinaPDZdomain",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.106,no.43,pp.18249‐18254.
Pfeifer, M., Boncristiano, S., Bondolfi, L., Stalder, A., Deller, T., Staufenbiel, M., Mathews,P.M. & Jucker, M. 2002, "Cerebral hemorrhage after passive anti‐Abetaimmunotherapy",Science(NewYork,N.Y.),vol.298,no.5597,pp.1379.
Phillips, S.E. & Schoenborn, B.P. 1981, "Neutron diffraction reveals oxygen‐histidinehydrogenbondinoxymyoglobin",Nature,vol.292,no.5818,pp.81‐82.
VII‐Bibliografia
279
Pim,D.,Bergant,M.,Boon,S.S.,Ganti,K.,Kranjec,C.,Massimi,P.,Subbaiah,V.K.,Thomas,M.,Tomaic,V.&Banks,L.2012,"HumanpapillomavirusesandthespecificityofPDZdomaintargeting",TheFEBSjournal,vol.279,no.19,pp.3530‐3537.
Pokkuluri, P.R., Huang, D.B., Raffen, R., Cai, X., Johnson, G., Stevens, P.W., Stevens, F.J. &Schiffer, M. 1998, "A domain flip as a result of a single amino‐acid substitution",Structure(London,England:1993),vol.6,no.8,pp.1067‐1073.
Poshusta,T.L., Sikkink, L.A., Leung,N., Clark,R.J.,Dispenzieri,A.&Ramirez‐Alvarado,M.2009, "Mutations in specific structural regions of immunoglobulin light chains areassociatedwithfreelightchainlevelsinpatientswithALamyloidosis",PloSone,vol.4,no.4,pp.e5169.
Preissmann, D., Leuba, G., Savary, C., Vernay, A., Kraftsik, R., Riederer, I.M., Schenk, F.,Riederer, B.M. & Savioz, A. 2012, "Increased postsynaptic density protein‐95expression in the frontal cortex of aged cognitively impaired rats", Experimentalbiologyandmedicine(Maywood,N.J.),vol.237,no.11,pp.1331‐1340.
Prince,M.,Bryce,R.&Ferri,C.2011,"Thebenefitsofearlydiagnosisandintervention.", ,ed.WorldAlzheimerReport,Alzheimer’sDiseaseInternational(ADI),.
Qin,Z.,Hu,D.,Zhu,M.&Fink,A.L.2007,"Structuralcharacterizationofthepartiallyfoldedintermediates of an immunoglobulin light chain leading to amyloid fibrillation andamorphousaggregation",Biochemistry,vol.46,no.11,pp.3521‐3531.
Radford, S.E. 2000, "Protein folding: progress made and promises ahead", Trends inbiochemicalsciences,vol.25,no.12,pp.611‐618.
Rain, J.C., Selig, L.,DeReuse,H., Battaglia, V.,Reverdy, C., Simon, S., Lenzen,G., Petel, F.,Wojcik, J., Schachter, V., Chemama, Y., Labigne,A.& Legrain, P. 2001, "Theprotein‐protein interactionmapofHelicobacterpylori",Nature,vol.409,no.6817,pp.211‐215.
Ramirez‐Alvarado,M.2012,"Amyloidformationinlightchainamyloidosis",Currenttopicsinmedicinalchemistry,vol.12,no.22,pp.2523‐2533.
Ramírez‐Alvarado,M.,Kelly,J.W.&Dobson,C.M.2010,Proteinmisfoldingdiseases:currentand emergingprinciplesand therapies.VladimirN. Uversky, Series Editor edn, JohnWiley&Sons,NewYork.
Randles, E.G., Thompson, J.R., Martin, D.J. & Ramirez‐Alvarado, M. 2009, "Structuralalterations within native amyloidogenic immunoglobulin light chains", Journal ofMolecularBiology,vol.389,no.1,pp.199‐210.
Ray, S.S., Singh, S.K.&Balaram, P. 2001, "An electrospray ionizationmass spectrometryinvestigationof1‐anilino‐8‐naphthalene‐sulfonate(ANS)bindingtoproteins",JournaloftheAmericanSocietyforMassSpectrometry,vol.12,no.4,pp.428‐438.
Rezaei‐Ghaleh, N., Blackledge, M. & Zweckstetter, M. 2012, "Intrinsically disorderedproteins: from sequence and conformational properties toward drug discovery",Chembiochem:aEuropeanjournalofchemicalbiology,vol.13,no.7,pp.930‐950.
VII‐Bibliografia
280
Rinne, J.O., Brooks, D.J., Rossor, M.N., Fox, N.C., Bullock, R., Klunk, W.E., Mathis, C.A.,Blennow,K.,Barakos, J.,Okello,A.A.,RodriguezMartinezdeLiano,S.,Liu,E.,Koller,M.,Gregg,K.M.,Schenk,D.,Black,R.&Grundman,M.2010,"11C‐PiBPETassessmentofchange in fibrillaramyloid‐beta load inpatientswithAlzheimer'sdisease treatedwith bapineuzumab: a phase 2, double‐blind, placebo‐controlled, ascending‐dosestudy",Lancetneurology,vol.9,no.4,pp.363‐372.
Rivera‐Hernandez,G.2013,TesiDoctoralenredacció,UniversitatAutònomadeBarcelona.
Rivera‐Hernandez,G.2009,Expresión recombinante,purificaciónycaracterización inicialdeun fragmentovariabledecandenasencilla (scFv)específicoparaelpéptidoAbeta,TreballdeMàster,UniversitatAutònomadeBarcelona.
Rivera‐Hernandez,G.,Marin‐Argany,M.,Blasco‐Moreno,B.,Bonet,J.,Oliva,B.&Villegas,S.2013, "Elongation of the C‐terminal domain of an anti‐amyloid beta single‐chainvariable fragment increases its thermodynamic stability and decreases itsaggregationtendency",mAbs,vol.5,no.5,pp.678‐689.
Robert,R.,Dolezal,O.,Waddington,L.,Hattarki,M.K.,Cappai,R.,Masters,C.L.,Hudson,P.J.& Wark, K.L. 2009, "Engineered antibody intervention strategies for Alzheimer'sdisease and related dementias by targeting amyloid and toxic oligomers", Proteinengineering,design&selection:PEDS,vol.22,no.3,pp.199‐208.
Rousseau, F., Schymkowitz, J.& Serrano, L. 2006, "Protein aggregation and amyloidosis:confusionofthekinds?",Currentopinioninstructuralbiology,vol.16,no.1,pp.118‐126.
Royer,C.A.1995,"Fluorescencespectroscopy",Methodsinmolecularbiology(Clifton,N.J.),vol.40,pp.65‐89.
Sadqi, M., Fushman, D. & Munoz, V. 2006, "Atom‐by‐atom analysis of global downhillproteinfolding",Nature,vol.442,no.7100,pp.317‐321.
Sali, A. & Blundell, T.L. 1993, "Comparative proteinmodelling by satisfaction of spatialrestraints",JournalofMolecularBiology,vol.234,no.3,pp.779‐815.
Sanchez, R., Pieper, U., Melo, F., Eswar, N., Marti‐Renom, M.A., Madhusudhan, M.S.,Mirkovic, N. & Sali, A. 2000, "Protein structure modeling for structural genomics",Naturestructuralbiology,vol.7Suppl,pp.986‐990.
Sanger, F.&Coulson,A.R. 1975, "A rapidmethod for determining sequences inDNAbyprimedsynthesiswithDNApolymerase", JournalofMolecularBiology,vol.94,no.3,pp.441‐448.
Saraceno, C., Musardo, S., Marcello, E., Pelucchi, S. & Luca, M.D. 2013, "ModelingAlzheimer'sdisease:frompasttofuture",Frontiersinpharmacology,vol.4,pp.77.
Saro, D., Li, T., Rupasinghe, C., Paredes, A., Caspers, N. & Spaller, M.R. 2007, "Athermodynamic ligand binding study of the third PDZ domain (PDZ3) from themammalianneuronalproteinPSD‐95",Biochemistry,vol.46,no.21,pp.6340‐6352.
Schenk, D. 2002, "Amyloid‐beta immunotherapy for Alzheimer's disease: the end of thebeginning",Naturereviews.Neuroscience,vol.3,no.10,pp.824‐828.
VII‐Bibliografia
281
Schenk, D., Barbour, R., Dunn, W., Gordon, G., Grajeda, H., Guido, T., Hu, K., Huang, J.,Johnson‐Wood,K.,Khan,K.,Kholodenko,D.,Lee,M.,Liao,Z.,Lieberburg,I.,Motter,R.,Mutter, L., Soriano, F., Shopp,G., Vasquez,N., Vandevert, C.,Walker, S.,Wogulis,M.,Yednock, T., Games, D. & Seubert, P. 1999, "Immunization with amyloid‐betaattenuatesAlzheimer‐disease‐likepathology in thePDAPPmouse",Nature,vol.400,no.6740,pp.173‐177.
Serio,T.R.,Cashikar,A.G.,Kowal,A.S.,Sawicki,G.J.,Moslehi,J.J.,Serpell,L.,Arnsdorf,M.F.&Lindquist, S.L. 2000, "Nucleated conformational conversion and the replication ofconformational information by a prion determinant", Science (New York,N.Y.), vol.289,no.5483,pp.1317‐1321.
Serpell,L.C.,Sunde,M.,Benson,M.D.,Tennent,G.A.,Pepys,M.B.&Fraser,P.E.2000,"Theprotofilamentsubstructureofamyloidfibrils",JournalofMolecularBiology,vol.300,no.5,pp.1033‐1039.
Serrano,L.,Matouschek,A.&Fersht,A.R.1992,"Thefoldingofanenzyme.III.Structureofthe transition state for unfolding of barnase analysed by a protein engineeringprocedure",JournalofMolecularBiology,vol.224,no.3,pp.805‐818.
Shapiro,A.L.,Vinuela,E.&Maizel,J.V.,Jr1967,"Molecularweightestimationofpolypeptidechains by electrophoresis in SDS‐polyacrylamide gels",Biochemical and biophysicalresearchcommunications,vol.28,no.5,pp.815‐820.
Sheng, M. & Sala, C. 2001, "PDZ domains and the organization of supramolecularcomplexes",AnnualReviewofNeuroscience,vol.24,pp.1‐29.
Shi,J.,Guan,J.,Jiang,B.,Brenner,D.A.,DelMonte,F.,Ward,J.E.,Connors,L.H.,Sawyer,D.B.,Semigran,M.J.,Macgillivray,T.E.,Seldin,D.C.,Falk,R.&Liao,R.2010,"Amyloidogeniclight chains induce cardiomyocyte contractile dysfunction and apoptosis via a non‐canonicalp38alphaMAPKpathway",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.107,no.9,pp.4188‐4193.
Shnyrov,V.L.,Villar,E.,Zhadan,G.G.,Sanchez‐Ruiz, J.M.,Quintas,A.,Saraiva,M.J.&Brito,R.M.2000,"Comparativecalorimetricstudyofnon‐amyloidogenicandamyloidogenicvariantsofthehomotetramericproteintransthyretin",Biophysicalchemistry,vol.88,no.1‐3,pp.61‐67.
Sierralta,J.&Mendoza,C.2004,"PDZ‐containingproteins:alternativesplicingasasourceof functional diversity", Brain research.Brain research reviews, vol. 47, no. 1‐3, pp.105‐115.
Sikkink, L.A. & Ramirez‐Alvarado, M. 2010, "Cytotoxicity of amyloidogenicimmunoglobulinlightchainsincellculture",Celldeath&disease,vol.1,pp.e98.
Sikkink, L.A. & Ramirez‐Alvarado, M. 2008, "Salts enhance both protein stability andamyloidformationofanimmunoglobulinlightchain",Biophysicalchemistry,vol.135,no.1‐3,pp.25‐31.
Solomon, A., Weiss, D.T. & Wall, J.S. 2003, "Immunotherapy in systemic primary (AL)amyloidosis using amyloid‐reactive monoclonal antibodies", Cancer biotherapy &radiopharmaceuticals,vol.18,no.6,pp.853‐860.
VII‐Bibliografia
282
Solomon, B. 2009, "Immunotherapeutic strategies for Alzheimer's disease treatment",TheScientificWorldJournal,vol.9,pp.909‐919.
Solomon, B. 2006, "Alzheimer's disease immunotherapy: from in vitro amyloidimmunomodulationtoinvivovaccination",JournalofAlzheimer'sdisease:JAD,vol.9,no.3Suppl,pp.433‐438.
Solomon, B., Koppel, R., Frankel, D. & Hanan‐Aharon, E. 1997, "Disaggregation ofAlzheimerbeta‐amyloidbysite‐directedmAb",ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.94,no.8,pp.4109‐4112.
Songyang, Z., Fanning,A.S., Fu,C., Xu, J.,Marfatia, S.M., Chishti,A.H., Crompton,A., Chan,A.C., Anderson, J.M. & Cantley, L.C. 1997, "Recognition of unique carboxyl‐terminalmotifsbydistinctPDZdomains",Science(NewYork,N.Y.),vol.275,no.5296,pp.73‐77.
Sreerama, N., Manning, M.C., Powers, M.E., Zhang, J.X., Goldenberg, D.P. &Woody, R.W.1999,"Tyrosine,phenylalanine,anddisulfidecontributionstothecirculardichroismof proteins: circular dichroism spectra of wild‐type and mutant bovine pancreatictrypsininhibitor",Biochemistry,vol.38,no.33,pp.10814‐10822.
Sreerama,N.,Venyaminov,S.Y.&Woody,R.W.1999,"Estimationofthenumberofalpha‐helicalandbeta‐strandsegmentsinproteinsusingcirculardichroismspectroscopy",Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety,vol.8,no.2,pp.370‐380.
Stefani,M.2012,"Structural featuresandcytotoxicityofamyloidoligomers: implicationsin Alzheimer's disease and other diseases with amyloid deposits", Progress inneurobiology,vol.99,no.3,pp.226‐245.
Stevens, F.J. 2000, "Four structural risk factors identify most fibril‐forming kappa lightchains",Amyloid:theinternationaljournalofexperimentalandclinicalinvestigation:theofficialjournaloftheInternationalSocietyofAmyloidosis,vol.7,no.3,pp.200‐211.
Stevens,P.W.,Raffen,R.,Hanson,D.K.,Deng,Y.L., Berrios‐Hammond,M.,Westholm,F.A.,Murphy,C.,Eulitz,M.,Wetzel,R.&Solomon,A.1995,"Recombinantimmunoglobulinvariable domains generated from synthetic genes provide a system for in vitrocharacterizationoflight‐chainamyloidproteins",Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety,vol.4,no.3,pp.421‐432.
Thomas, K. 2012, Trials for Alzheimer’s drug halted after poor results., The New YorkTimes.,US.
Thompson,J.D.,Higgins,D.G.&Gibson,T.J.1994,"CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position‐specific gappenalties andweightmatrix choice",Nucleicacids research,vol. 22, no.22,pp.4673‐4680.
Trinkaus‐Randall,V.,Walsh,M.T.,Steeves,S.,Monis,G.,Connors,L.H.&Skinner,M.2005,"Cellularresponseofcardiacfibroblaststoamyloidogeniclightchains",TheAmericanjournalofpathology,vol.166,no.1,pp.197‐208.
VII‐Bibliografia
283
Trovato, A., Chiti, F.,Maritan, A. & Seno, F. 2006, "Insight into the structure of amyloidfibrilsfromtheanalysisofglobularproteins",PLoScomputationalbiology,vol.2,no.12,pp.e170.
Tsai,N.P.,Wilkerson,J.R.,Guo,W.,Maksimova,M.A.,DeMartino,G.N.,Cowan,C.W.&Huber,K.M. 2012, "Multiple autism‐linked genes mediate synapse elimination viaproteasomaldegradationofasynapticscaffoldPSD‐95",Cell,vol.151,no.7,pp.1581‐1594.
Tsytlonok,M.&Itzhaki,L.S.2013,"Thehow'sandwhy'sofproteinfoldingintermediates",ArchivesofBiochemistryandBiophysics,vol.531,no.1‐2,pp.14‐23.
Umeda,K.,Ikenouchi,J.,Katahira‐Tayama,S.,Furuse,K.,Sasaki,H.,Nakayama,M.,Matsui,T.,Tsukita,S.,Furuse,M.&Tsukita,S.2006,"ZO‐1andZO‐2independentlydeterminewhereclaudinsarepolymerizedintight‐junctionstrandformation",Cell,vol.126,no.4,pp.741‐754.
Uversky,V.N.2013,"Adecadeandahalfofprotein intrinsicdisorder:Biologystillwaitsforphysics",Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety,.
Uversky,V.N.&Fink,A.L.2004, "Conformational constraints foramyloid fibrillation: theimportanceofbeingunfolded",Biochimicaetbiophysicaacta,vol.1698,no.2,pp.131‐153.
Vallabhajosyula, R.R., Chakravarti, D., Lutfeali, S., Ray, A. & Raval, A. 2009, "Identifyinghubsinproteininteractionnetworks",PloSone,vol.4,no.4,pp.e5344.
vanAnken, E.&Braakman, I. 2005, "Endoplasmic reticulum stress and themaking of aprofessionalsecretorycell",Criticalreviewsinbiochemistryandmolecularbiology,vol.40,no.5,pp.269‐283.
vandenBerg,S.,Lofdahl,P.A.,Hard,T.&Berglund,H.2006,"ImprovedsolubilityofTEVproteasebydirectedevolution",JournalofBiotechnology,vol.121,no.3,pp.291‐298.
VanRossum,G.1991,Python(programminglanguage),PythonSoftwareFoundation.
Viguera, A.R., Martinez, J.C., Filimonov, V.V., Mateo, P.L. & Serrano, L. 1994,"Thermodynamic and kinetic analysis of the SH3 domain of spectrin shows a two‐statefoldingtransition",Biochemistry,vol.33,no.8,pp.2142‐2150.
Villegas,V.,Azuaga,A.,Catasus,L.,Reverter,D.,Mateo,P.L.,Aviles,F.X.&Serrano,L.1995,"Evidenceforatwo‐statetransitioninthefoldingprocessoftheactivationdomainofhumanprocarboxypeptidaseA2",Biochemistry,vol.34,no.46,pp.15105‐15110.
Villegas,V.,Martinez,J.C.,Aviles,F.X.&Serrano,L.1998,"StructureofthetransitionstateinthefoldingprocessofhumanprocarboxypeptidaseA2activationdomain",JournalofMolecularBiology,vol.283,no.5,pp.1027‐1036.
Vivian,J.T.&Callis,P.R.2001,"Mechanismsoftryptophanfluorescenceshiftsinproteins",Biophysicaljournal,vol.80,no.5,pp.2093‐2109.
VII‐Bibliografia
284
Wall,J.,Schell,M.,Murphy,C.,Hrncic,R.,Stevens,F.J.&Solomon,A.1999,"Thermodynamicinstability of human lambda 6 light chains: correlation with fibrillogenicity",Biochemistry,vol.38,no.42,pp.14101‐14108.
Wall, J.G. & Pluckthun, A. 1999, "The hierarchy of mutations influencing the folding ofantibodydomainsinEscherichiacoli",Proteinengineering,vol.12,no.7,pp.605‐611.
Walther,F.J.,Waring,A.J.,Hernandez‐Juviel,J.M.,Gordon,L.M.,Wang,Z.,Jung,C.L.,Ruchala,P., Clark, A.P., Smith,W.M., Sharma, S. & Notter, R.H. 2010, "Critical structural andfunctional roles for the N‐terminal insertion sequence in surfactant protein Banalogs",PloSone,vol.5,no.1,pp.e8672.
Weiss,G.A.,Watanabe,C.K.,Zhong,A.,Goddard,A.&Sidhu,S.S.2000,"Rapidmappingofprotein functional epitopes by combinatorial alanine scanning", Proceedings of theNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,vol.97,no.16,pp.8950‐8954.
Wiederstein,M.&Sippl,M.J.2007,"ProSA‐web:interactivewebservicefortherecognitionoferrorsinthree‐dimensionalstructuresofproteins",Nucleicacidsresearch,vol.35,no.WebServerissue,pp.W407‐10.
Wimo,A.&Prince,M.2010,WorldAlzheimerReport2010,TheGlobalEconomicImpactofDementia,Alzheimer’sDiseaseInternational,London,2010.
Wisniewski, T. & Konietzko, U. 2008, "Amyloid‐beta immunisation for Alzheimer'sdisease",Lancetneurology,vol.7,no.9,pp.805‐811.
Wolynes,P.G.,Onuchic,J.N.&Thirumalai,D.1995,"Navigatingthefoldingroutes",Science(NewYork,N.Y.),vol.267,no.5204,pp.1619‐1620.
Worn, A. & Pluckthun, A. 2001, "Stability engineering of antibody single‐chain Fvfragments",JournalofMolecularBiology,vol.305,no.5,pp.989‐1010.
Worn,A.&Pluckthun,A.1999,"DifferentequilibriumstabilitybehaviorofScFvfragments:identification,classification,andimprovementbyproteinengineering",Biochemistry,vol.38,no.27,pp.8739‐8750.
Worn,A.&Pluckthun,A.1998,"MutualstabilizationofVLandVHinsingle‐chainantibodyfragments, investigatedwithmutantsengineeredforstability",Biochemistry,vol.37,no.38,pp.13120‐13127.
Wu,J.,Yang,Y.,Zhang,J.,Ji,P.,Du,W.,Jiang,P.,Xie,D.,Huang,H.,Wu,M.,Zhang,G.,Wu,J.&Shi,Y.2007,"Domain‐swappeddimerizationof thesecondPDZdomainofZO2mayprovideastructuralbasisforthepolymerizationofclaudins",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.282,no.49,pp.35988‐35999.
Wu,J.W.,Breydo,L.,Isas,J.M.,Lee,J.,Kuznetsov,Y.G.,Langen,R.&Glabe,C.2010,"Fibrillaroligomersnucleate theoligomerizationofmonomericamyloidbetabutdonotseedfibrilformation",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.285,no.9,pp.6071‐6079.
Wu,T.T.&Kabat,E.A.1970,"AnanalysisofthesequencesofthevariableregionsofBenceJones proteins and myeloma light chains and their implications for antibodycomplementarity",TheJournalofexperimentalmedicine,vol.132,no.2,pp.211‐250.
VII‐Bibliografia
285
Wuthrich,K.2001,"ThewaytoNMRstructuresofproteins",Naturestructuralbiology,vol.8,no.11,pp.923‐925.
Yankner, B.A., Dawes, L.R., Fisher, S., Villa‐Komaroff, L., Oster‐Granite,M.L. & Neve, R.L.1989, "Neurotoxicity of a fragment of the amyloid precursor associated withAlzheimer'sdisease",Science(NewYork,N.Y.),vol.245,no.4916,pp.417‐420.
Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S.V. & Sierks, M.R. 2008, "Anti‐oligomeric Abeta single‐chain variable domain antibody blocks Abeta‐inducedtoxicity against human neuroblastoma cells", JournalofMolecularBiology,vol. 384,no.4,pp.917‐928.
Zandomeneghi, G., Krebs, M.R., McCammon, M.G. & Fandrich, M. 2004, "FTIR revealsstructural differences between native beta‐sheet proteins and amyloid fibrils",Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety,vol.13,no.12,pp.3314‐3321.
Zhang,J.,Lewis,S.M.,Kuhlman,B.&Lee,A.L.2013,"SupertertiaryStructureoftheMAGUKCorefromPSD‐95",Structure(London,England:1993),vol.21,no.3,pp.402‐413.
Zhang, J., Petit, C.M., King, D.S. & Lee, A.L. 2011, "Phosphorylation of a PDZ domainextension modulates binding affinity and interdomain interactions in postsynapticdensity‐95 (PSD‐95) protein, a membrane‐associated guanylate kinase (MAGUK)",TheJournalofbiologicalchemistry,vol.286,no.48,pp.41776‐41785.
Zhang,X.,Xu,J.&Xiao,W.X.2013,"Anewmethodforthediscoveryofessentialproteins",PloSone,vol.8,no.3,pp.e58763.
Zheng,L.,Baumann,U.&Reymond,J.L.2003,"ProductionofafunctionalcatalyticantibodyScFv‐NusA fusion protein in bacterial cytoplasm", Journal ofBiochemistry, vol. 133,no.5,pp.577‐581.
APÈNDIXD’ARTICLES.
An anti‐Aβ (amyloid β) single‐chain variable fragment prevents amyloid fibrilformationandcytotoxicitybywithdrawingAβoligomersfromtheamyloidpathwayMarin‐Argany,M.*,Rivera‐Hernández,G.*,Martí‐Clua,J.&Villegas,S.BiochemicalJournal437,25–34(doi:10.1042/BJ20101712)2011*Firstco‐authorEarly intervention in the 3xTg‐AD mice with an amyloid β‐antibody fragmentamelioratesfirsthallmarksofAlzheimerdisease.Giménez‐Llort,L.,Rivera‐Hernández,G.,Marin‐Argany,M.,Sánchez‐Quesada,JL.&Villegas,S.mAb5:5,665–677(doi:10.4161/mabs.25424)2013Elongation of the C‐terminal domain of an anti‐amyloid Aβ single‐chain variablefragment increases its thermodynamic stability and decreases its aggregationtendencyRivera‐Hernández,G.*,Marin‐Argany,M.*,Blasco‐Moreno,B.,BonetJ.,OlivaB.&Villegas,S.mAb5:5,678–689(doi:10.4161/mabs.25382)2013*Firstco‐authorThe interconversion between a flexible β‐sheet and a fibril β‐arrangementconstitutes the main conformational event during misfolding of PSD95‐PDZ3domainMarín‐Argany,M.*,Candel,MA.*,Murciano‐Calles,J.,Martinez,JC.&Villegas,S.BiophysicalJournal103,738‐47(doi:10.1016/j.bpj.2012.07.029)2012*Firstco‐authorAthermodynamicstudyofthethirdPDZdomainofMAGUKneuronalproteinPSD‐95revealsacomplexthree‐statefoldingbehaviorMurciano‐Calles,J.,Martinez,JC.,Marín‐Argany,M.,Villegas,S.&Cobos,ES.BiophysicalChemistry,SubmittedonSeptember,2013The impactofextra‐domainstructuresandpost‐translationalmodifications in thefolding/misfoldingbehaviourofthethirdPDZdomainofMAGUKneuronalproteinPSD‐95Marín‐Argany,M.*,Murciano‐Calles,J.*,Cobos,ES.,Villegas,S.&Martinez,JC.*Firstco‐authorArticleenredacció
Top Related