PRT-712.02-004 V9 NMP Colif y E.coli

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NMP PARA LA DETERMINACION DECOLIFORMES YESCHERICHIA COLI EN

ALIMENTOS

Fecha emisin:23-08-2002

Revisin: 9

Fecha revisin:

20-01-2012Seccin Microbiologa

de AlimentosPRT-712.02-004

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1.

OBJETIVO

Estimar la densidad de bacterias del grupo coliformes, como indicador sanitario.

2. CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

Aplicar este procedimiento a todas las muestras de alimentos en las cuales se presume que tienen

baja contaminacin microbiana y a las cuales segn reglamento sanitario o a peticin delinteresado se requiere este anlisis.

3. FUNDAMENTO

Los mtodos utilizados en la determinacin deE. coli, coliformes totales y coliformes fecales

como microorganismos indicadores de la calidad sanitaria de agua o como indicador de las

condiciones sanitarias en el procesamiento de alimentos, se basan en la fermentacin de la

lactosa. El mtodo de nmero ms probable NMP, es un mtodo estadstico, compuesto por una

etapa presuntiva y una confirmativa. El ensayo consiste en sembrar diluciones seriadas de la

muestra en medios lquidos, basndose en la combinacin de tubos positivos se puede estimar elnmero de microorganismos presentes por gramo de alimento, con el uso de la tabla estadstica

aportada por la referencia.

4. REFERENCIAS

4.1 Bacteriological Analytical Manual online. September 2002. Captulo 4 puntos C, D, E y F

4.2 Bacteriological Analytical Manual online, apndice 2 Most Probable Number from Serial

Dilutions, Tabla N1, Robert Blodgett,Octubre 2010.

5. TERMINOLOGA

5.1

Grupo coliformes: El grupo coliformes incluye bacilos gram negativos, aerbios yanaerbios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando cido y gas

dentro de 48 hrs. a 35C. Este grupo incluye a los gneros: Escherichia, Citrobacter,KlebsiellayEnterobacter.

5.2

Grupo coliformes fecales: Coliformes fecales se definen como bacilos gram negativosaerbios y anaerbios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formandocido y gas dentro de 24 hrs. a 45,5 0,2C para anlisis de alimentos.

5.3 Escherichia coli:E. colies una bacteria cuyo hbitat es el intestino del hombre y animalesy debido a esto se ha usado como ndice de contaminacin fecal. Dentro del grupo

coliformes, es el microorganismo de mayor significado sanitario. Su recuperacin se hace

de acuerdo a la metodologa establecida para la enumeracin de coliformes.


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6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1 Equipos

Incubadora a 35 1C

Bao de agua termorregulado a 45,5 0,2 C con agitacin y con cubierta

6.2

MaterialesSensor de temperatura calibrado a 35 0,5C

Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL

Placas Petri de 100 mm de dimetro

Botellas de dilucin con capacidad para 100 mL, de vidrio borosilicato con tapas

hermticas

Tubos de fermentacin de 18 x 180 mm y 16 x 160 mm

Asa de 3 mm de dimetro

Propipeta

6.3 Medios de cultivo y reactivos

Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST)

Caldo Bilis Verde Brillante 2% (BVB)

Caldo EC

Agar Rojo Neutro Cristal Violeta (RNCV)

Agar Levine Eosina Azul de Metileno (LEAM)

Caldo Triptona

Caldo RM-VP

Caldo citrato Koser

Agua de Dilucin Buffer Fosfato

Agua Peptonada 0,1%

Reactivo Kovacs

Rectivos solucin de Naftol y solucin KOH al 40 %


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Reactivos Tincin de Gram

Indicador Rojo de Metilo

Agar TSI

Agar LIA

Agar MIO

6.4 Cepas Control

Control positivo: cepa deEscherichia coliATCC 25922

Control negativo: cepa de Staphylococcus aureus. ATCC 6538

Control negativo (coliformes fecales): cepa deEnterobacter aerogenes ATCC 13048

7. DESARROLLO

7.1 TEST PRESUNTIVO PARA COLIFORMES

7.1.1

Preparar la muestra y diluciones, segn PRT-712.02-002 Procedimiento Procesamientode las muestras de alimentos y agua para anlisis microbiolgico, tem 7.4.2.1. Derivar

al laboratorio segn PRT -712.02-001 Procedimiento Recepcin de las muestras para

anlisis microbiolgico.

7.1.2 Una vez recibida la dilucin 1:10 en el laboratorio, agitar en Vortex por 7 segundos,pipetear 10 mL de la dilucin inicial y agregar 90 mL de diluyente y as sucesivamente

para realizar las diluciones 1:100 y 1:1000. Inocular9 tubos de caldo LST (3 dilucionesy 3 tubos por dilucin). Dejar descansar el borde de la pipeta contra el tubo y drenar por 2

a 3 segundos.

3 tubos con 1 mL de la dilucin 1:10, preparada en 7.1.1.

3 tubos con 1 mL de la dilucin 1:100

3 tubos con 1 mL de la dilucin 1:1000

7.1.3 Agitar suavemente la gradilla para mezclar la muestra con el medio de cultivo. El tiempo

entre la preparacin de la muestra y su inoculacin en un medio no debe ser superior a 15

minutos.

7.1.4

Incubar a 35 1C por 24 horas y observar la formacin de gas, si existen tubos que no

presentan formacin de gas, incubar nuevamente hasta completar 48 h. y observar la

formacin de gas, en los tubos de fermentacin. Si se detecta que el equipo no ha

funcionado dentro del rango de temperatura indicado, el anlisis debe ser invalidado y se


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7.2.6 La presencia de gas en los tubos de fermentacin de caldo BVB significa testconfirmativo positivo para coliformes, ausencia de gas constituye un test negativo para

coliformes.

7.2.7 Anotar los resultados del test confirmativo en el registro RG 712.00-072 y de los cultivos

control en el registro RG-712.00-004 y RG-712.00-006.

7.3

METODO CALDO EC PARA COLIFORMES FECALES Y CONFIRMACINPARA Escherichia coli

7.3.1 Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas en el Test Presuntivo se

transfieren a caldo EC para confirmar coliformes fecales. y consecutivamente E. coli.

7.3.2

Mezclar por agitacin el tubo del test presuntivo y transferir un inculo con un asa de 3mm. de dimetro o con aplicador de madera, a tubos de fermentacin conteniendo caldo

EC. Se debe tener la precaucin de enfriar el asa para asegurar que se transfiere un

inculo de cultivo viable.

7.3.3 Los tubos con caldo EC se incuban en un bao de agua con cubierta a 45.5 0,2 C por24 horas +/- 2 horas, examinar si se produce produccin de gas, si la produccin de gas es

negativa incubar nuevamente hasta completar 48 +/- 2 horas. El nivel de agua del baodebe sobrepasar el nivel de caldo dentro de los tubos.

7.3.4 Se deben incluir cultivos control en el bao de agua, se usa como control positivo una

cepa de Escherichia coliy como control negativo una cepa de Enterobacter aerogenes.Se debe inocular siempre el control negativo antes del positivo. Incubar tambin medios

de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad de los medios empleados.

7.3.5 Al trmino del perodo de incubacin se observa la formacin de gas o efervescencia en

los tubos de fermentacin de caldo EC. Si los controles positivo y negativo no secomportasen como tal o si se detecta que el equipo no ha funcionado dentro del rango de

temperatura indicado, repetir el anlisis desde el punto 7.2.2.

7.3.6

La presencia de gas o efervescencia en los tubos de fermentacin de caldo EC significa

un test confirmativo positivo para coliformes fecales; la no formacin de gas significa test

negativo para coliformes fecales.

7.3.7 Anotar los resultados del test confirmativo en el registro RG-712.00-072, de los cultivos

control en el registro RG-712.00-005 y de la esterilidad de los medios en el registro RG-712.00-006.


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7.4 CONFIRMATIVO PARAE.coli

7.4.1 De cada tubo de caldo E.C. que presente formacin de gas, transferir un inculo a una

placa de agar LEAM para obtener colonias aisladas.

7.4.2 Incubar las placas invertidas 18 a 24 horas a 35C.

7.4.3 Al trmino del perodo de incubacin observar las colonias sospechosas, con centrooscuro con o sin brillo metlico en el caso de usar Agar LEAM.

7.4.4 Anotar los resultados en el registro RG-712.00-072.

7.4.5 De cada placa de agar transferir 5 colonias aisladas a un tubo de agar nutritivo o agar

standard, incubar por 18 a 24 horas a 35C para realizar pruebas: morfolgicas medianteTincin de Gram segn IT-712.00-066 y bioqumica utilizando las reacciones IMViC(Indol, Rojo Metilo, Vogues Prokauer y Citrato). Repetir la inoculacin en caldo LST

para confirmar la produccin de gas. Alternativamente se puede realizar un API 20 E o

VITEK. Agregar TSI, LIA y MIO. Si una de las 5 colonias es identificada como positiva

paraE. coli, se considera el tubo EC como positivo y no es necesario realizar pruebas a ladems colonias.

7.5

INTERPRETACIN

Todos los cultivos que fermenten la lactosa con produccin de gas dentro de 48 hrs. a

35C, aparezcan como bacilos Gram negativos no esporulados y cuyo test IMVIC sea + +- - (biotipo 1) o - + - - (biotipo 2), son considerados E. coli.

7.6 CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS COLIFORMES TOTALES

7.6.1 La combinacin de tubos positivos y/o negativos en los tests confirmativos de caldo

BVB, es referida a la Tabla N 2 (BAM on line, apndice 2, tabla N1) y se expresa

como: NMP de coliformes/g o ml. De muestra

7.6.2. Si en vez de las porciones de muestra 0,1-0,01-0,001, se utiliza 0,01-0,001-0,0001, se lee

el resultado de la tabla y se multiplica por 10.


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7.6.3. Cuando se utilizan ms de 3 series de diluciones decimales, se considera el resultado de 3series, eligiendo la dilucin ms alta que da resultados positivos en los 3 tubos ensayados

y las dos diluciones siguientes. Utilizando el resultado de estas 3 series, leer en la Tabla

de N.M.P. y multiplicar por 10, 100, 1000, etc. Segn las porciones de muestra

consideradas.

7.7

CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOSEscherichia coli

7.7.1 Calcular el NMP de E. coli, basndose en el nmero de tubos de caldo EC, en que se

confirm la presencia de E. coli en 3 diluciones sucesivas y anotar los resultados en el

registro RG-712.00-072.

Tabla N 1: Ejemplos de determinacin de NMP en series de 3 tubos

Ejemplo Cantidad muestra (g. o mL. ) Lectura NMP

0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001

a 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3 2 0 930

b 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3 2 0 9300

c 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0 1 0 30d 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3 2 2 2100

e 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3 3 3 >110000

Nmero de tubos positivos / Nmero de tubos inoculados


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Tabla N 2. Para serie de 3 tubos con 0.1, 0.01, y 0.001 g. NMP por gramo con un95% de confianza. ((BAM on line, apndice 2, tabla N1)TubosPositivos

NMP/g Lim. Conf. Tubos Positivos NMP/g Lim. Conf.

0.10 0.01 0.001 Bajo Alto 0.10 0.01 0.001 Bajo Alto0 0 0 1100 420 --

8. REGISTROS8.1

Registro cepas control de incubadora8.2

Registro cepas control baos de agua para anlisis de coliformes fecales8.3

Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el anlisis de

coliformes, coliformes fecales yE. coli.8.4 Registro control de ambiente8.5 Registro de resultados de anlisis de coliformes, E. coliy Salmonella en muestras de

alimento.

9. ANEXOS

No Aplica

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