Marlene Rubí Pérez Martinez

Pruebas bioquímicas

Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos en los cuales es conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no

Se emplean para identificar de forma clara y precisa, la presencia o ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas, o de una vía metabólica completa en uno o más microorganismos. Son empleadas principalmente la identificación y clasificación de bacterias y hongos

Pueden ser…

• Pruebas de identificación rápidas

• Medio de cultivo diferencial

Pruebas de identificación rápidas

Pruebas de la Catalasa

Pruebas de la Oxidasa

Pruebas de la Coagulasa

Pruebas de PYR

Prueba de catalasa

¿Qué es la catalasa?

La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de Hidrogeno (H2O2) en agua y oxigeno.

¿Quiénes tienen catalasa? y ¿Por qué?

El peróxido de Hidrogeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se permite que se acumule resulta letal para la célula bacteriana.

Metabolismo aerobio

bacteria

Catalasa

Fundamento de la prueba

La catalasa es una hemoproteína, cuyo grupo prostético está formado por 4 átomos de hierro trivalente por molécula. Esta prueba sirve para comprobar la presencia de la enzima catalasa en preparaciones de microorganismos. Permite diferenciar géneros: • Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+)• Bacillus (+) de Clostridium (-) y Corynebacterium (+) de

Erysipelothrix (-)

¿Para que nos sirve esta prueba?

Se usa con mucha frecuencia para diferenciar miembros de la familia Micrococaceae de miembros de la familia Streptococcaceae.

micrococcaceae

• Micrococcus• Staphylococcus• Planococcus

Streptococcaceae

• Streptococcus• Pediococcus• Aerococcus• Planococcus

CATALASA +

CATALASA -

¿Qué se necesita para realizar esta prueba?

Peróxido de Hidrogeno al 3% almacenado en frasco ámbar en frío.

Cultivo de 18-24 horas del microorganismo a probar

¿Cómo se realiza esta prueba?

Con un asa o palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia a la superficie de un portaobjetos*

Agregar 1 gota de Peróxido de Hidrógeno al 3% y observar la producción de burbujas

¿Cuáles son los resultados esperados?

La producción rápida y sostenida de burbujas o efervescencia constituye una reacción positiva.

Importante : Los eritrocitos poseen catalasa, por lo cual se debe evitar tomar colonias de agar sangre para evitar falsos positivos.

Prueba de oxidasa

¿Qué es la oxidasa?

Son un grupo de enzimas que pertenecen a la categoría de las oxido-reductasas, llevan a cabo reacciones redox, utilizan al oxigeno como el aceptador de electrones, este es reducido a H2O o H2O2. Su función es conservar energía generando un gradiente de protones para producir ATP

Existen muchos tipos de oxidasa tales como:

Glucosaoxidasa

Monoamina oxidasa

NADPH oxidasa

Citocromo oxidasa

¿Quiénes tienen citocromo? Y ¿Por qué?

El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de Oxidasa es importante para identificar aquellos organismos que carecen de esta enzima (anaerobios obligados).

Fundamento de la prueba

La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxigeno molecular que produce agua o peróxido de hidrogeno según la especie bacteriana. El oxigeno actúa por lo tanto como aceptor final en la cadena de electrones

¿Y para que nos sirve esta prueba? Es muy útil para diferenciar

Pseudomona o Neisserias

Enterobacterias

¿Qué se necesita para realizar esta prueba?

El reactivo de oxidasa es bastante tóxico, manejar con precaución. Se altera por la luz y el oxígeno, por lo que debe ser de preparación extemporánea y protegerse envolviéndolo con papel negro

Papel de filtro cortado

(trozos de  3x 1 cm)

Placas  de Petri nuevas

Cultivo de 18-24 horas del microorganismo a

probar

Reactivo de oxidasa

*dimetil-fenil-diamina *tetrametil-parafenil-

endiamina*Tirillas de Oxidasa

¿Cómo se realiza esta prueba?Poner un trozo de

papel de filtro sobre una de las tapaderas de una placa de Petri.

Añadir una gota del reactivo de oxidasa

Depositar sobre el reactivo masa

bacteriana

¿Cuáles son los resultados esperados?

La reacción positiva la indica un color azul-violeta intenso antes de 10 segundos

Pruebas de la Coagulasa

¿Qué es la coagulasa?

Es una enzima producida por S. aures, permite la conversión del fibrinógeno en fibrina. Es relativamente estable al calor, resiste temperaturas arriba de 60C por 30 minutos.

¿Quiénes tienen coagulasa? Y ¿Por qué?

Los Staphylococcus aureus, representa un importante factor de virulencia. La coagulasa puede unirse al fibrinógeno y convertirlo en fibrina insoluble, la cual tiende a formar depósitos donde pueden agregarse

Fundamento de la prueba

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. El objetivo es buscar un factor de aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del género Staphylococcus.

¿Para que sirve esta prueba?

La prueba de la coagulasa es usada específicamente para diferenciar las especies del genero staphylococccus

Nota: también es producida por Yersinia pestis.

¿Qué se necesita para realizar esta prueba?

plasma de conejo

Cultivo de 18-24 horas del

microorganismo a probar

¿Cómo se realiza esta prueba?

En un tubo pequeño Mezcle un asa cargada con el

microorganismo Con 0,5 mL de plasma de conejo

Incube en baño de agua a 37°C y examine

periódicamente.

¿Cuáles son los resultados esperados?Los Staphylococcus aureus siempre da positivo, las demás especies no.

Para obviar esta posible fuente de error, se recomienda utilizar plasma en el cual se ha utilizado EDTA como anticoagulante

Pruebas de PYR

¿En qué consiste?

Detecta la enzima pirrolidonil arilamidasa se utiliza como sustrato el reactivo L-pirrolidonil- beta-naftilamida (PYR), para la identificación rápida de enterococos

Solución fisiológica en tubo

Disco de PYR

¿Qué se necesita para realizar esta prueba?

Cultivo de 18-24 horas del microorganismo a probar

¿Cómo se realiza esta prueba?

Realizar un alto inóculo en solución

fisiológica

Introducir un disco de PYR.

incubar 30 minutos a 35º

¿Cuáles son los resultados esperados?

Consideraciones: Algunas especies de Staphylococcus y los estreptococos del grupo A dan, también, una prueba positiva

Pueden ser…

• Pruebas de identificación rápidas

• Medio de cultivo diferencial

Medio de cultivo diferencial

TSI

LIA

MIO

SIM

KIA

Citrato de Simmons

Caldo urea

TSI (Triple Sugar Iron)• Color rojo ladrillo• Inhibidores: no tiene• Indicador: rojo de fenol• Sustratos principales: lactosa, sacarosa y glucosa (la proporción en el medio de lactosa y sacarosa es de 10: 1 con la glucosa)• Sustratos secundarios: tiosulfato sódico, peptona, citrato férrico amoniacal y extractos.

Se siembra por picadura profunda con aguja y luego se siembra por estrías en el pico

Resultados• Fuente de carbono utilizada (produce un

viraje del rojo al amarillo)– Lactosa ocurre en la parte superior– sacarosa en la parte intermedia – glucosa en la parte profunda

• El tiosulfato es reducido a H2S quien reacciona con el citrato férrico amoniacal para dar formación al sulfuro de fierro que es de color negro.

• La presencia de gas se debe al CO2 producto de la fermentación.

En este medio se busca determinar la capacidad de la bacteria para degradar los azúcares, la formación de gas y de H2S.

Tubo Control 1 2 3 4 5

Fermentan glucosa - - + + - -

Fermentan sacarosa - - - - - -

Fermentan lactosa - - - - + -

Formación de H2S - - - - + +

gas - - - + - -

LIA (Lysine Iron Agar)• Color: lila

• Inhibidores: no tiene

• Indicador: púrpura de bromocresol

• Sustratos principales: lisina y glucosa

• Sustratos secundarios: peptona, tiosulfato de sodio, extracto de levaduras.

Se siembra por picadura profunda con aguja y luego por estrías en el pico

Resultados• Descarboxilación de lisina en la diamina cadaverina y

desaminación de la lisina en un alfa cetoácido. (viraje del indicador púrpura de bromocresol)

• La formación de H2S se pone de manifiesto por la presencia del tiosulfato sódico, que dará formación al sulfato férrico.

• También puede verificarse la formación de gas a partir de la degradación de la glucosa.

En este medio se permite evidenciar la descarboxilación del aminoácido lisina en la diamina cadaverina, como también la desaminación de la lisina en un alfa cetoácido

Tubo Control 1 2 3

Lisina descarboxilasa - + + -

H2S - - - +

Formación de gas - - + +

MIO (Motilidad-Indol-Ornitina)

• Color: lila• Inhibidor: no tiene• Indicador: púrpura de bromocresol• Sustratos principales: ornitina y glucosa.• Sustratos secundarios: peptona, triptona y extractos.

Se siembra por picadura profunda

Resultados• La ornitina es descarboxilada por la enzima ornitina

descraboxilasa para producir la diamina putrescina y CO2– Positivo purpura– Negativo amarillo

• La motilidad – Positiva se demuestra por un (enturbamiento del medio)– Negativa (crecen a lo largo de la línea de inoculación)

• La prueba del indol se basa en la reacción que se produce con el rvo de Kovacs. (produce un color rojo)

Este medio se usa para la identificación de enterobacterias en base a su movilidad, producción de indol y actividad de ornitina descarboxilasa.

Tubo control 1 2 3 4 5 6

La ornitina + - - + + + +

La motilidad - + + - - - -

La prueba del indol - - + - - - +

SIM (Sulfuro-Indol-Motilidad)• Color: crema• Inhibidores: no tiene• Indicador: no tiene• Sustrato principal: peptona• Sustrato secundario: tiosulfato sódico, hierro y amonio

Este medio se utiliza para comprobar la motilidad, la formación de H2S y la producción de indol por parte de la bacteria. Se siembra por picadura

Resultados

• La motilidad – Positiva (turbidez difusa) – Negativa (crecimiento a lo largo de la línea de inoculación)

• La producción de H2S (ennegrecimiento de la zona de crecimiento o del medio)

• La prueba del indol se basa en la reacción que se produce con el rvo de Kovacs. (produce un color rojo)

Tubo Control 1 2 3 4 5

motilidad - + - - + +

H2S - - - + - +

Indol - + - - - +

KIA (Kligler Iron Agar)• Color: rojo• Inhibidor: no tiene• Indicador: rojo de fenol• Sustratos principales: lactosa y glucosa• Sustratos secundarios: peptona, extractos y tiosulfato sódico.

Se siembra por picadura profunda con aguja y luego se siembra por estrías en el pico

Resultados

• Fuente de carbono

• La formación de H2S se demostrará por el ennegrecimiento del medio.

Este medio se emplea para la identificación de bacilos gram – basada en la fermentación de la lactosa y la glucosa y en la producción de H2S.

tubo control 1 2 3 4

Fermenta glucosa - - - + +

Fermenta lactosa - + + - -

Formación de H2S - - - - +

Citrato de Simmons• Color: verde• Inhibidor: no tiene• Indicador: azul de bromotimol• Sustrato principal: citrato de sodio• Sustratos secundarios: fosfato dipotásico, cloruro de sodio, sulfato de magnesio y fosfato monoamónico.

Se siembra por picadura profunda con aguja y luego por estrías en el pico.

Resultados

• La degradación del citrato con lleva a la alcalinización del medio – Positivo (azul)– Negativo (verde)

Este medio nos permite comprobar la capacidad de la bacteria de utilizar el citrato como fuente exclusiva de carbono

Caldo Urea

• Color: rosado• Inhibidor: no tiene• Indicador: rojo de fenol• Sustrato principal: úrea• Sustrato secundario: extracto de levaduras, fosfato monopotásico y fosfato disódico.

Este medio no se autoclava

Resultados

• La degradación de urea por medio de ureasa a amoniaco y carbonato de amonio, alcalinizan el medio (el rojo de fenol vira a un rojo cereza)– Bacterias úrea + (rosa mexicano o rojo cereza)– Bacterias úrea - (Amarillo)

En este medio se observa la capacidad de la bacteria de degradar la urea por medio de la enzima ureasa formando amoniaco y carbonato de amonio.

Bibliografía1. Jean F. MacFaddin, 2003 Pruebas bioquímicas para la identificación de

bacterias de importancia clínica 3ª Edición, Ed. Medica panamericana, Buenos Aires Argentina

2. http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U3c_PruebasBioquimicas_17461.PDF

3. Whinn H., Allen, Janda, Koneman, Procop, Schreckenberger. 2008 Microbiological diagnosis,6ª Edición, Ed. Medica panamericana, Buenos Aires, Argentina

4. https://www.studyblue.com/notes/note/n/microbio-practicum-review-5-catabolism/deck/11103074

5. Álvaro Gonzales Hernández, 2014, Principios de bioquímica clínica y patología molecular , 2ª Edición, ELSEVIER, México

6. Imágenes de: http://microbeonline.com7. Geo. F. Brooks, Karen C. Carroll, Janet S. Butel, Stephen A. Morse, Timothy

A. Mienzaner., 2014 Microbiologia medica, 26ª Edición, McGraw-Hill, Mexico