PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA ENTEROBACTERIAS

1. TSI.- AGAR CON AZUCAR TRIPLE Y HIERROa. Objetivo

Determinar la capacidad de un microorganismo fermentar la glucosa, lactosa y sacarosa, con producción de gas o sin ella y la producción de acido sulfihidrico (H2S).

b. Indicador

Rojo Fenol:

Alcalino: Rojo Acido: Amarillo Medio sin sembrar: naranja-rojizo

c. Fundamento

En este medio, el extracto de carne y pluripeptona aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano. Los hidratos de carbono fermentables son: glucosa (0.1%), lactosa (1%) y sacarosa (1%). El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de H2S y el sulfato de hierro y amonio es el indicador de H2S.

El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan dos cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada expuesta en toda su superficial oxigeno es aerobia y la porción inferior está protegida del aire es la anaerobia.

La fermentación tiene lugar tanto en anaerobiosis como en anaerobiosis. En el pico de flauta, el monosacáridos glucosa es catabolizado por la vía metabólica Embed-Meyerhof-Parnas para producir es acido piruvico. El acido piruvico es degradado luego a través del ciclo de Krebs, para rendir C02, H2O y energía. En el fondo existen condiciones anaerobias de forma que la glucosa se metaboliza por la vía de Embed-Meyerhof-Parnas a ATP y acido piruvico que luego se convierte en acido láctico y otros ácidos orgánicos.

Fermentación solo de glucosa: El pico de flauta es rojo (alcalino) porque al principio se degrada aerobicamente la glucosa pero debido a su baja concentración se agota y el microorganismo empieza a usar las peptonas liberando Amoniaco y alcalinizando el medio. Sin embargo, el fondo es amarillo debido a la fermentación de la glucosa por la vía metabólica Embed-Meyerhof-Parnas que da productos finales ácidos, esta reacción acida se mantienen en el fondo debido a la baja concentración de O2.

Fermentación Lactosa, Sacarosa: la sacarosa y lactosa se degradan aerobicamente, lo que produce un medio acido (amarillo) en el pico, esta reacción se mantiene por la alta concentración de lactosa y sacarosa. La lactosa es degradadada a glucosa por la enzima “β- galactosidasa”. La sacarosa mediante la enzima “sacarosa sintasa o invertasa” da lugar a la glucosa.

Ausencia de fermentación: los microorganismo incapaces de fermentar la glucosa, lactosa ni sacarosa, degradan aerobia y anaeróbicamente la peptona lo que alcaliniza el medio.

Formación de H2S: el tiosulfato de sodio es el sustrato que en medio acido forma H2S, el cual se combina con los iones férricos (Fe+3) y da lugar al sulfuro de hierro (negro).

Formación de gas: Se debe a la degradación aerobia y anaerobia de la glucosa por vía metabólica Embed-Meyerhof-Parnas dando lugar al acido piruvico, el cual por el ciclo de Krebs va a rendir C02.

d. Reacciones

Fermentación de Glucosa

Pico

Fondo

Fermentación de Lactosa, sacarosa y glucosa

Pico

Fondo

Ausencia Fermentación

Pico/fondo

Formación H2S

e. Lectura

Pico Alcalino (rojo) /Fondo Acido (amarillo) GLU (+), LAC (-), SAC (-)

Peptonas

Aerobico NH3

(Alcalino)

Glucosa Ac. Orgánicos (Acido)

E-M-P / Aerobio

Lactosa

Sacarosa

Β-galactosidasa /

Sacarosa invertasa

Acidos

Acidos

Glucosa Ac. Orgánicos (Acido)E-M-P Aerobico

Peptona

Sulfuro Ferroso (Precipitado)

H2S + Fe+3Tiosulfato de sodio

NH3Aerobio/anaerobio

Medio Acido

Pico Acido (amarillo) / Fondo Acido (amarillo) GLU (+), LAC (+), SAC (+) Pico Alcalino (rojo) / Fondo Alcalino (rojo) GLU (-), LAC (-), SAC (-) Ennegrecimiento H2S (+) Burbuja GAS (+)

2. LIA ( AGAR CON LISINA Y HIERRO)

a. Objetivo

Determinar la capacidad enzimática de un microorganismo de descarboxilizar/desaminar la lisina y la capacidad de producir H2S.

b. Indicador

Purpura de Bromocresol

Acido: Amarillo Alcalino: Purpura Medio sin sembrar: purpura

c. Fundamento

En este medio, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo de la bacteria. La glucosa es el único hidrato de carbono fermentable. La lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de la enzima descarboxilasa o desaminasa. El tiosulfato es el sustrato para la producción de H2S y el citrato de hierro y amonio es el revelador.

La descarboxilacion de la lisina tiene lugar en medio acido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada acidificando el medio; el aminoácido lisina es descarboxilado por la acción de la enzima “lisina descarboxilasa” para formar una diamina denominada Cadaverina y CO2, que alcaliniza el medio (purpura).

En cambio la desaminacion de la lisina produce un acido –ceto-carbonico, el cual con la sal de hierro y bajo la influencia del oxigeno forma un color rojo en la superficie.

Para la formación de H2S, el tiosulfato de sodio en medio acido produce H2S, el cual se combina con los iones férricos (Fe+3) del citrato de hierro y amonio para producir u n precipitado negro de sulfuro de hierro.

Los microorganismo que no producen “lisina descarboxilasa”, pero que son fermentadores de la glucosa producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hrs. de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de peptonas, y el fondo amarillo.

d. Reacciones

Descarboxilacion

1. GlucosaE-M-P Medio Acido

2. Lisina Lisina Descarboxilasa / Cadaverina (Alcalino)

Desaminacion

Producción H2S

e. Lectura Descarboxilacion lisina

o Positivo Pico Alcalino (purpura) / Fondo Alcalino (purpura)o Negativo Pico Alcalino (purpura) / Fondo Acido (Amarillo)

Desaminacion lisina Pico Rojizo / Fondo Amarillo Producción H2S Ennegrecimiento

3. CITRATO

a. Objetivo

Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono y energía, como alcalinidad resultante.

b. Indicador

Azul de Bromotimol

Acido: amarillo (no observado) Alcalino: Azul de Prusia oscuro Medio no Inoculado: verde

c. Fundamento

En el medio, el fosfato de amonio es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono/ el magnesio es el co-factor enzimático.

El metabolismo del citrato se realiza en presencia de la enzima “citrasa o citrato permeasa” a través de la vía metabólica del acido tricarboxilico, la citrasa para actuar necesita un catión divalente (Mg2+). El desdoblamiento del citrato da lugar, progresivamente, oxalacetato y piruvato. El piruvato en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos carbónicos que al ser utilizados como fuente de carbono producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos.

El microorganismo que puede utilizar el citrato como única fuente de carbono, también utiliza las sales de amonio como única fuente de nitrógeno. El fosfato de amonio es degradado a amoniaco lo que alcaliniza más el medio al producir hidróxido de amonio.

1. Glucosa E-M-P Medio Acido

2. Lisina Lisina Desaminasa / H+ Acido ceto-carbonico

Tiosulfato de sodio

H+ H2S + Fe+3 Sulfuro Ferroso (Precipitado negro)

d. Reacciones1.

2.

e. Lectura Positivo Crecimiento y azul Negativo El medio permanece verde

4. UREAa. Objetivo

Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar la urea por la acción de la enzima ureasa.

b. Indicador

Rojo Fenol

Acido: Amarillo Alcalino: Rojo Medio sin siembra: Naranja-rojizo

c. Fundamento

En este medio, el extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y aporta los nutrientes especiales para el desarrollo bacteriano, las sales de fosfato constituyen el sistema buffer y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.

El sustrato urea es una diamida del acido carbónico. Aquellas bacterias que poseen la enzima “ureasa” pueden utilizar el nitrógeno proveniente de la urea, la hidrolizan liberando dos moléculas de amoniaco y CO2. Estos productos alcalinizan el medio.

d. Reacciones

e. Lectura Positivo Rosado Negativo Amarillo

Urea + 2 H2O Ureasa CO2 + 2 NH3

Citrato Citrasa /Mg+2 Oxacelato

Piruvato OH- Ac. Carbonico (energia)

Piruvato + CO2

Ac. Carbonicos

Acetato + format (Alcalino)

Fosfato de amonio NH3+ NH4OH (Aumenta

alcalinidad)

5. SIMa. Objetivo

En el agar SIM, se determina la capacidad de un microorganismo de moverse, producir indol y H2S.

b. Revelador

Reactivo de Kovacs (para indol)

c. Fundamento

El triptófano es un aminoácido que puede ser hidrolizado por las bacterias que poseen un sistema de enzimas denominada “Triptofanasa” para formar indol, acido piruvico y amoniaco.

El indol producido se combina con el p-dimetilamina-benzaldehido del reactivo de Kovacs para originar un compuesto de color rojo.

El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de H2S, el cual se combina con los iones ferricos (Fe+3) y da lugar a un precipitado negro de sulfuro ferroso.

d. Reacciones

Formación H2 S

e. Lectura Movilidad Turbidez más allá de la siembra. Inmovilidad Crecimiento solo en la línea de siembra H2S (+) Ennegrecimiento H2S (-) Sin cambio de color Indol (+) Anillo Rojo (al agregar Reactivo Kovacs) Indol (-) Sin anillo (al agregar Reactivo Kovacs)

Triptofano

Triptofanasa Indol + Acido Piruvico + NH3

Indol + P- dimetilamina benzaldehido

Compuesto Color Rojo

Tiosulfato de H+ H2S + Fe+3

H+ Sulfuro Ferroso (Precipitado Negro)