PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO

EN MICROBIOLOGÍA

Raúl Gil OrtsMIR 2 Análisis Clínicos

INDICEINTRODUCCIÓNTINCIONESCULTIVOSTÉCNICAS DIRECTASMÉTODOS MOLECULARESMALDI-TOFTÉCNICAS FUTURAS

INTRODUCCIÓN-Procesos manuales

-Pruebas que se realizan directamente en la muestra y permiten detectar la presencia de microorganismos o de fragmentos de los mismos en las muestras.

- Técnicas aplicadas a procesos habituales que permiten acortar de manera significativa el tiempo necesario para facilitar el resultado - Especialmente útiles cuando el agente causal crece lentamente o no crece en los medios de cultivo.

- Los resultados no se ven alterados por la administración previa de antimicrobianos.

- Inconveniente: no ofrece información sobre la sensibilidad a los antimicrobianos

TINCIÓN-Se realizan sobre la muestra obtenida y procesada adecuadamente

- Morfología microscópica y características tintorialesTinción Aplicación Resultados ComentariosGram Diagnóstico

presuntivo, sobre todo en neumonía y meningitis bacteriana

Deteccíón de leucocitos, reconocimiento de la morfología de bacterias comunes

Requiere experiencia;Puede diferenciar levaduras

Azul de metileno Gránulos metacromáticos de corinebacterias

Morfología general y seleccionada

Corynebacterium diphteriae

Wright-Giemsa LBA, preparaciones de Tzanck, muestras con fondo celular complejo

Morfología general de las estructuras celulares

Permite visualizar bacterias, levaduras, parásitos e inclusiones virales

TinciónTinción Aplicación Resultados ComentariosZiehl-NeelsenKinyoun

Muestras (ESP, LBA, LCR, orina, etc) para identificar BAAR y diferenciar de actinomicetales

BAAR muestran un color rojo granate, sobre fondo azul, permite detectar también parásitos como Cryptosporidium y Ciclospora

Las micobacterias son bacilos rectos, cortos o largos y las nocardias son bacilos arboriformes y ramificados

Microscopía de campo oscuro

Examen directo de lesiones con sospecha de sífilis primaria

Se ven espiroquetas móviles

Requiere experiencia

Tinta china Examen directo de la extensión de LCR, sangre y orina para Crytococcus

Cryptococcus posee una cápsula de polisacáridos que aparece como un halo sobre un fondo oscuro

Tinción inversa, la cápsula no se tiñe; requiere experiencia para diferenciar leucocitos de levaduras

TinciónTinción Aplicación Resultados comentariosKOH 10% Examen directo de

las extensiones de piel, pelos y uñas para ver dermatofitos

Visualiza elementos fúngicos

Digiere las proteínas de las muestras y facilita la visualización

Blanco Calcoflúor Examen LCR, LBA y otros líquidos corporales para detectar estructuras fúngicas y algunos quistes parasitarios

Las levaduras y mohos muestran una fluorescencia blanquecina suave

Tinción fluorescente que se fija a la pared celular de hongos y levaduras, pero no a bacterias o células inflamatorias.Requiere M. Fluoresc.

Auramina-rodamina

Útil para la búsqueda de BAAR en una variedad de muestras clínicas.

Extensiones concentradas de sedimentos de micobacterias

Tinción preferida para BAAR, por su rendimiento en el cribado de gran número de muestrasRequiere M. Fluoresc.

TINCIÓNGRAM

neumococo

TINCIÓNGRAM

LCR: Neisseria meningitidis Exudado uretral:Neisseria gonorrea

TINCIÓNBlanco calcoflúor

Candida albicans

TINCIÓNAuramina

Zhiel-Neelssen

TINCIÓNTinta China

Cryptococcus neoformans

CULTIVOS BACTERIANOSNivel Hemocultivos

- Forma tradicional - Incubación frascos hemocultivos. (8-24 horas) - Tinción de Gram y cultivo en medios sólidos + ATB (24-

48h)- Técnica rápida - Procesar directamente la sangre del frasco hemocultivo

Extraer 10 ml de sangre

Centrifugar 1500 rpm

5 min

Centrifugar3 ml sobrenadante Repartidos 2 tubos

Eppendorf13000 rpm

1 min

IDENTIFICACIÓN - 3-4hANTIBIOGRAMA – 6-12h

- LIQUIDO ASCÍTICO, L. ARTICULAR, L. PLEURAL

SEDIMENTO

TÉCNICAS DIRECTAS-Técnicas diagnósticas que se aplican directamente en una muestra patológica (orina, sangre, frotis nasofaríngeos, heces, LCR)

- mínima manipulación

- reducen el tiempo del proceso analítico

-También denominadas “point-of -care test“

-Beneficio:- Permiten administrar el tratamiento adecuado en el menor

tiempo mejor evolución enfermedad

-técnicas :- Inmunocromatografía- Enzimoinmunoanálisis- Inmunofluoerescencia indirecta

- PCR a tiempo real

TÉCNICAS DIRECTASTest/Microorganismo

Muestra Técnica S E

Antígeno neumococo Orina, LCR, LPL ICT 66-70 90-100Antígeno legionella Orina ICT 76 99Plasmodium Sangre ICT 87-

10052-100

S. pyogenes Frotis faríngeo EIA 53-99 62-100Antígeno VRS Frotis nasofaríngeo ICT 59-97 75-100Antígeno rotavirus Heces ICT 75-99 95S. aureus (MRSA)S. agalactiaeEnterovirus

Frotis nasalFrotis vaginalLCR

PCR t.r. 86-9494-9797

93-9596-100100

VIH Sangre ICT 99-100

99-100

TÉCNICAS DIRECTAS

Microorganismo Muestra TécnicaHaemophilus influenzae Muestra respiratoria

Líquido pleuralLA

Virus gripe A y B Moco nasofaríngeoExudados nasal y faríngeo

IFI, ICT, EIA

Metaneumovirus Moco nasofaríngeo IFIVirus parainfluenza 1, 2, 3

Moco nasofaríngeo IFI

Adenovirus Moco nasofaríngeoExudados nasal y faríngeo

IFI, ICT

TÉCNICAS DIRECTASAntígeno neumococo Antígeno legionella Plasmodium

Antígeno VRS

TÉCNICAS DIRECTASS. pyogenes Rotavirus Toxina C. difficile

Entamoeba hystolitica

EIA

MÉTODOS MOLECULARES

PNA-FISH - peptide nucleic acid fluorescent in-situ hybridization

- Se emplean cebadores fluorescentes que hibridan con los pares de bases de nucleótidos contenidos en el ARN ribosomal de los microorganismos.

- Útil para detectar bacteriemias por S. aureus, E. coli,Enterococcus spp, Ps. Aruginosa o fungemias por Candida spp. En aproximadamente 3 horas

Métodos molecularesPNA-FISH

S. aureus

Ps. aeruginosa

MÉTODOS MOLECULARESPCR en tiempo real

- Modificación de PCR convencional- Mejora la rapidez en la detección- Mejora en Sensibilidad y Especificidad

- Detecta a la vez que amplifica - Sistema cerrado: evita contaminaciones y pérdida de tiempo con

el empleo de geles agarosa

- Sensibilidad y especificidad igual o superior al 95% - Tiempo de ejecución 1.5 horas

MÉTODOS MOLECULARES-PCR a tiempo real

- Test comercializados:

- Detección MRSA en frotis nasales

- Detección Enterococcus spp. resistentes a glucopéptidos en frotis rectales

- Clostridium difficile en heces

- S. agalactiae en frotis vaginal y rectal en embarazadas

- Enterovirus en LCR

- Cuantificación de citomegalovius, VIH o hepatitis C

MÉTODOS MOLECULARESPCR t.r.

Detección: - S. aureus resistente a meticilina - Clostridium difficile - Enterovirus en LCR - S. agalactiae

MALDI-TOF- Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight- Se describió hace 30 años-Se diseñó para analizar biomoléculas- uso reciente para la identificación de microorganismos-Técnica:

- Se emplea un emisor de rayos láser que se aplica a una mezcla del microorganismo y una matriz que absorbe la mayoría de la energía emitida

- las proteínas del microorganismo quedan ionizadas y son sometidas a una aceleración en un campo eléctrico

- son separadas según masa y carga hasta que llegan a un detector

- el perfil de proteínas generado se compara con una base de datos y en menos de 10 min. se dispone de la identificación

MALDI-TOFVentajas:

- Rapidez- más barato que sistemas habituales- puede identificar la mayoría de microorganismos habituales

Uso:-para identificar bacterias y levaduras a partir de colonias- puede utilizarse en frascos de hemocultivos positivos- puede detectar proteínas concretas

- proteína fijadora de penicilina PBP2a identificando así staphylcoccus resistentes a oxacilina.

Técnicas futurasMultiplex PCR tiempo real

Técnica Septifast de Roche. Desarrollada para identificar a partir de sangre del paciente con sospecha de bacteriemia o candidemia hasta 25 microorganismos frecuentes.Aún no comercializado

Secuencición del ADN: pirosecuenciación

Método rápido que se fundamenta en la detección del pirofosfato liberado durante la síntesis de ADNPermite detectar el polimorfismo de un solo nucleótido se ha empleado:

- genotipado de bacerias y virus- reconocer mutaciones de resistencia a antivíricos en VIH- caracterizar bacterias resistentes a antibióticos

Técnicas futurasSistema StaphPlex

Diseñado para detectar y amplificar 18 genes de forma simultánea que permiten identificar :

-a nivel de especie diferentes estafilococos

- identificar resistencia a antibióticos más utilizados

GRACIAS