PRUEBAS DX DE MICOLOGIAMEDICINA V NICOLE BEJARANO VILLEGAS PAULA ANDREA VALDES MAYOR

REQUISITOS PARA UN LABORATORIO

DE MICOLOGÍA• 1. Sala adecuada.• 2. Poseer los

instrumentos • 3. técnicas de

búsqueda de anticuerpos

• 4. laboratorio de biología molecular

• 5. bioseguridad.

TÉCNICAS Y MÉTODOS

• 1. Poner de manifiesto el parásito

• 2. Permitir el aislamiento del hongo

• 3. Identificación del hongo.

• 4. Investigación de las reacciones inmunitarias

ESTUDIO CON LUZ DE WOOD

• ÚTIL EN ALGUNAS MICOSIS SUPERFICIALES

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS• Pinzas de depilar y

tijeras, Aguja de disección. Cajas de Petri o portaobjetos, Asa de aluminio o platino, Matraces Erlenmeyer, Tubos de ensayo, espátulas, torundas, Cepillos, Solución salina, formol , Medios de cultivo.

OBTENCIÓN DE MUESTRAS

RECHAZO DE MUESTRAS

• 1. esputo mas no la saliva.

• 2. Las muestras de las zonas enfermas pero no ser tomadas al azar.

• 3 Muestras insuficientes.

• 4. no se usen muestras con mucho tiempo de almacenamiento

MUESTRA

ESCAMAS

PELO

EXUDADO MUCOSAS

PUS Y LIQUIDOS

PATOLOGICOSEXPECTORACI

ON

HECES

SANGRE

FROSTIS• tinción de Gram• azul de metileno• Giemsa• PAS • Papanicolaou

BIOPSIA DE TEJIDOS U ÓRGANOS

• valorar el tipo de reacción en los tejidos, que puede ser: congestiva con vasodilatación, edema, exudados y depósitos de fibrina; purulenta, con cúmulos de polimorfonucleares, o más a menudo granulomatosa con histiocitos, células gigantes de tipo cuerpo extraño o de Langhans, rodeadas por linfocitos y plasmocitos.

• Los hongos se presentan en forma de filamentos, levaduras y esporangios

• fenómeno de Splendore-Hoeppli

ANÁLISIS DIRECTO • Sencillo, rápido y

barato.• Se efectúa a partir de

escamas, pelos y exudados. (Dificiles de observar sin sustancias aclarantes)

• Se encuentran abundantes hongos oportunistas.

• Se utiliza solución de lugol.

ANÁLISIS DIRECTO CON FLUORESCENCIA

• Se utiliza blanco de calcoflúor bajo el microscopio fluorescencia.

• Se observan hifas, seudohifas y levaduras.

• Imposible ver endosporas de C. immitis.

CULTIVO• Las muestras se

recolectan con un hisopo estéril.

• Especímenes en el centro del cultivo, a temperatura ambiente (en caso de micosis profundas de 30 a 37 C°)

• Las levaduras se siembran en zigzag y se desarrollan en 24 a 48 horas.

• Los hongos patógenos se desarrollan en una a dos semanas.

Técnica de resiembra: Recolección de la colonia en tubo pasa la conservación de la cepa.

Cultivo en lámina o microcultivo: Se coloca un fragmento del cultivo en un porta objetos con laminilla.

Esta técnica tiene dos variedades: • Lamina desecada• Cuadrado de gelosa

Cultivo sobre pelo o método del anzuelo: Se depositan en tierra húmeda pelos o cabellos para aislar dermatofitos del suelo.

Ataque del pelo in vitro: En agua estéril se depositan cabellos rubios o de niño junto con el extracto de levadura, permite la observación de dermatofitos.

AUXONOGRAMA Y ZIMOGRAMAImportante para definir especies de levaduras.

Auxonograma: Asimilación de alimentos con carbono o nitrógeno.

Medio de lodder modificado:• Asimilación de azucares.• Asimilación de nitrógeno.

Zimograma: Fermentación de azucares, cultivo de levadura en medio liquido con glucido.

Medio de Marcelou-Kinti: Agar en 900ml de agua por 24 horas.

Se añade peptona y se calienta a 110°C durante 10 minutos.

Si hay fermentación, el medio se decolora.

ESTUDIO DE LAS NECESIDADES VITAMINÍCAS

En tubos se incuba un fragmento de cultivo o suspensión de esporas o levaduras. No se observa crecimiento en el tubo donde falta una vitamina indispensable.

SINTESIS DE UREASASe utiliza medio urea-

indol a 37°C. Rojo fenol, de color amarillo, vira a rojo-violeta en tres a seis horas. (cryptococcus)

En tubos solidificados en posición inclinada se siembra un pequeño inoculo de la colonia y se incuba a 25 grados centígrados.

INOCULACIÓN EXPERIMENTAL

Se emplea en la investigación, pero también tiene utilidad diagnostica.

Se usan conejos, ratas, ratones, cobayos y hámsteres.

Los hongos pueden ser inoculados por vía subcutanea, intravenosa, intraperitoneal, intratesticular e intracraneal.

REACCIONES INMUNOLÓGICASPRUEBAS DE

SENSIBILIDAD CUTÁNEA

• intradermorreacciones

SERODIAGNÓSTICO Y DETECCIÓN DE ANTÍGENOS

• doble difusión en agar• técnica de Ouchterlony• técnicas de electrodifusión

pueden ser inmunoelectroforesis y electrosinéresis

• anticuerpos fijadores de complemento

• inmunofluorescencia indirecta • técnicas inmunoenzimáticas• anticuerpos monoclonales

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A FARMACOS Se utilizan métodos como: tubos germinativos,

consumo de metabolitos, citometría de flujo, métodos basados en agar y dilución de caldos de cultivo.

Las técnicas de agar son fáciles y de bajo costo. Los métodos de dilución son ampliamente usados pero reservados para Candida y Cryptococcus.

Prueba Colorimétrica

Se usa azul de alamar para producir cambio de azul a rojo, cuando se reduce en presencia de un crecimiento microbiano. Las sales de tetrazoilo pueden cambiar de color cuando se reducen, y para detectarlo se usa el espectrofotómetro.

AISLAMIENTO DEL HONGO • se pueden agregar dos

gotas de una mezcla de penicilina estreptomicina o emplear medios que contengan cloranfenicol

Técnicas de aislamiento para líquidos, sólidos y ambiente• técnica de dilución y

vaciado en placa

IDENTIFICACIÓNDE LOS HONGOSmedio de cultivo, la naturaleza de los azúcares, la pureza de la peptona, el pH, el grado de humedad y la temperatura

MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA

1. Forma y tamaño.2. Color en la superficie o en el reverso.3. Difusión del pigmento.4. Coloración5. Textura6. Superficie7. Aspecto8. Consistencia9. Rapidez de crecimiento

MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA

1. Análisis a través del tubo. 2. Análisis de un fragmento del cultivo. 3. Método de la cinta adhesiva transparente 4. Cultivo en lámina

PRESERVACIÓN Y CONSERVACIÓN DE CULTIVOS

Preservar su viabilidad, sin degeneración, variación ni mutación. mantener en agarmétodo de agua

destilada Congelado en

nitrógeno líquido

OTROS TIPOS DE MICROSCOPIA• Contraste de fase • Campo oscuro• Microscopia

electrónica

BIOLOGIA MOLECULAR EN MICOLOGIA MEDICAPermite estudiar cualidades estables e

inmodificables por el ambiente.

• Hibridación.• Reacción en cadena polimerasa.• Polimorfismo en la longitud de los

fragmentos de restricción.

• Análisis de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción de regiones amplificadas por PCR.

• Análisis del polimorfismo en la conformación de las cadenas sencillas de ADN de regiones amplificadas por reacción de PCR.

• Análisis del polimorfismo del ADN amplificado con cebadores arbitrarios.

RIESGO BIOLÓGICOLas vías más frecuentes de exposición son:• accidentes con objetos

punzocortantes• picaduras• mordeduras de

animales • la inhalación de

aerosoles• ingestión accidental • contacto de

membranas mucosas

MEDIDAS DE SEGURIDAD• En un laboratorio de micología, se debe actuar

con responsabilidad y observar las más elementales normas de seguridad para evitar accidentes de trabajo.