1Pruebas diagnsticas basadas en la respuesta inmunitaria

2 El diagnstico clnico no suele ser definitivo.

Las lesiones histolgicas pueden ser indicativas pero pocas veces

son patognomnicas

A veces, el diagnstico microbiolgico es lento, complicado o

imposible

Por qu utilizamos el diagnstico inmunolgico?

Principales motivos de utilizacin del diagnstico inmunolgico

3Inte

nsid

ad d

e la

res

pues

ta

Tiempo

Respuesta primaria

Respuesta secundaria

Periodo de induccin(0-14 das)

IgM>>IgG

IgG>>IgM

Esquema de la respuesta inmune primaria y secundaria

4Seroconversin: Aumento del ttulo de anticuerpos x4 o paso de negativo a positivo

Ttulo: Mxima dilucin a la cual un suero contina siendo positivo en una prueba serolgica determinada

Inte

nsid

ad d

e la

res

pues

ta

Tiempo

Seroconversin

Conceptos de ttulo de anticuerpos y seroconversin

5 Las IgM normalmente reflejan una infeccin reciente

El aumento del ttulo de anticuerpos indica una infeccin

reciente

A veces, simplemente con determinar un ttulo elevado

podemos suponer que se ha producido una infeccin reciente

Los ttulos de IgG por s solos suelen indicar uan infeccin

pasada

Conceptos bsicos

Conceptos bsicos de interpretacin de resultados

61. Pruebas basadas en la deteccin de anticuerpos

7Pruebas de aglutinacin

Se utilizan con antgenos particulados tales como una suspensin bacteriana.Detectan preferentemente IgM

+

Rosa de Bengala (brucelosis)

Este tipo de pruebas suele ser extremadamente sensible pero, al mismo tiempo suele padecer de falta de especificidad por el hecho de ser mayoritariamente IgMs lo que se detecta

Pruebas de aglutinacin: Se basan en la unin de antgenos particulados a los anticuerpos, preferentemente de clase IgM. Suele tratarse de pruebas muysensibles pero con poca especificidad. Ejemplos de este tipo de pruebas es la aglutinacin con rosa de Bengala empleada en el diagnstico de la brucelosis.

8Pruebas de precipitacin

Se utilizan con antgenos solubles a los que se permite difundir en una matriz semislida

Lnea de precipitacin

Se trata de pruebas relativamente sensibles y especficas pero con un elevadocomponente subjetivo y muy engorrosas

Inmunodifusin en gel de agar

Pruebas de precipitacin: En este caso se utilizacin antgenos solubles que se difunden frente a los anticuerpos. La unin antgeno-anticuerpo precipita de forma visible y permite establecer la presencia de anticuerpos especficos. Un ejemplo clsico de este tipo de pruebas es la inmunodifusin en gel de agarutilizada histricamente en el diagnstico de la leucosis bovina.

9Fijacin del complemento

positivo negativo

La fijacin del complemento se basa en la capacidad del complemento paraunirse a los complejos antgeno-anticuerpo. La prueba incluye la adicin de eritrocitos sensibilizados con una hemolisina. Si el suero posee anticuerpos especficos, se fija el complemento y no puede unirse a la hemolisina para lisar los eritrocitos. Se trata de una prueba muy especfica.

+ CC

C

C

CC

C

Suero Antgeno

positivo

negativo

CC

C

C

C

C

C

positivo

negativo

Fijacin del complemento: Como hemos visto en captulos anteriores, el complemento posee la capacidad de unirse a los complejos antgeno anticuerpo(fijacin). Esta capacidad es aprovechada en la prueba de fijacin del complemento. Metodolgicamente, la prueba se desarrolla en dos fases, una primera que es una reaccin antgeno anticuerpo en un medio lquido y una segunda consistente en la adicin de complemento, una hemolisina dependientede complemento y eritrocitos. Si se ha producido reaccin antgeno-anticuerpo, es decir, si el suero analizado contena anticuerpos frente al antgeno, el complemento queda fijado y no puede activar la hemlisis de los glbulos rojos. Un ejemplo clsico de utilizacin de esta prueba es la perineumona bovina o la pleuroneumona porcina.

10

Pruebas de hemaglutinacin e inhibicin de la hemaglutinacin

Estas pruebas se basan en la capacidad de algunos patgenos (p.ej. el virus de la influenza) para causar la aglutinacin de los eritrocitos. Pueden utilizarse para detectar el patgeno (pruebas de hemaglutinacin) o los anticuerpos dirigidos contra las hemaglutininas del microorganismo (inhibicin de la hemaglutinacin). Suelen ser pruebas especficas de serotipo o subtipo y bastante sensibles.

+

Suero

positivo

negativo Inhibicin de la hemaglutinacin

Las pruebas de hemaglutinacin se utilizan con patgenos que poseen esta capacidad, generalmente virus. El ejemplo ms clsico es el diagnstico de la influenza.

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ELISA

Placa de ELISA tapizada con el antgeno

Aadir suero

Aadir anti-inmunoglobulinaconjugada a enzima (peroxidasa)

Aadir sustratoy leer

Las pruebas inmunoenzimticas se basan en una reaccin antgeno anticuerpo que tiene lugar sobre un soporte slido (normalmente una microplaca de plstico) a la que se ha adsorbido un antgeno o un anticuerpo.

La prueba puede desarrollarse en diferentes modalidades pero en todas ellas la reaccin final se revela mediante un enzima que modifica un substrato que adquiere color. Se trata de pruebas muy sensibles y especficas

a) ELISA indirecto

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b) ELISA de competicin

Placa de ELISA tapizada con el antgeno

Aadir suero

Aadir anticuerpo frente al antgenoconjugado al enzima

Aadir sustratoy leer

Suero positivo

Suero negativo

b) ELISA de capturaAadir muestra Aadir anticuerpo deteccin

Revelar y leerPlaca de ELISA tapizada

con un anticuerpo frente al patgeno

13

Pruebas de inmunofluorescencia

Las pruebas de inmunofluorescencia pueden utilzarse para detectar anticuerpos o para detectar la presencia de un patgeno. En ambos casos la reaccin finaliza mediante la adicin de un anticuerpo conjugado a una sustancia fluorescente, habitualmente fluorescena. Estas pruebas son muy sensibles pero su interpretacin tiene un alto grado de subjetividad

Inmunofluorescencia indirecta

Portaobjetos en el que se ha fijado el microorganismo

suero

1:10 1:20 1:40 1:80 1:160

Conjugadofluorescente

Las pruebas de inmunofluorescencia, en sus dos variantes, directa e indirecta, han sido muy utilizadas durante el siglo pasado aunque hoy en da han cadobastante en desuso debido al desarrollo de otros sistemas diagnsticos como el ELISA o las tcnicas de biologa molecular. La tcnica se basa en una reaccinantgeno-anticuerpo que se revela con la ayuda de un anticuerpo marcado con una sustancia fluorescente. Ejemplos de este tipo de pruebas los encontramosen el diagnstico directo de la mayora de virus del sndrome respiratorio bovino.

14

Pruebas de neutralizacin

Las pruebas de neutralizacin van dirigidas a la deteccin de anticuerpos capaces de bloquear los eptopos crticos del patgeno. Normalmente suelen tener una interpretacin biolgica correlacionada con la proteccin. Sin embargo, no suelen ser tiles para diferenciar respuestas entre animales infectados y vacunados ya que la matyora de vacunas inducen anticuerpos neutralizantes

+

Suero

+Cultivo celularo inoculacin

Cultivo celular sin alteraciones

Las pruebas de neutralizacin y en particular las de neutralizacin vrica, son unode los estndares habituales para medir los niveles de inmunidad protectivafrente a un patgeno. Normalmente la prueba se realiza en dos pasos, unoprimero de incubacin del patgeno con el suero del animal a analizar y un segundo consistente en la inoculacin del patgeno en un cultivo celular o en un animal. Si el suero contena anticuerpos neutralizantes, se bloquea la capacidadinfectiva del patgeno y; por lo tanto, no produce la infeccin del animal o del cultivo. Este mismo sistema puede utilizarse con toxinas o bacterias. A pesar de su utulidad, este mtodo ha cado en desuso fuera de la investigacin debido al tiempo quew requiere y a la dificultad de trabajar con animales experimentales o cultivos celulares.