TRABAJO ESCRITO CORRESPONDIENTE A LA OPCIÓN DE TITULACIÓN: CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE:

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

TÍTULO DEL TRABAJO:

Estandarización de un Protocolo de Fusarium oxysporum f. sp.

Cubense raza 4 tropical para detección por qPCR

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

INGENIERO BIOTECNOLOGO

PRESENTA:

LUIS MIGUEL VAZQUEZ CASTILLO

México, Ciudad de México a 10 de Junio de 2016

DIRIGIDA POR:

ING. KARINA ARAUJO RUIZ

DR. FRANCISCO ARTURO RAMÍREZ ORTEGA DIRIGIDA POR:

M. en C. JOSE LUIS CRUZ JARAMILLO

Dr. FRANCISCO ARTURO RAMÍREZ ORTEGA

Agradecimientos

Al Instituto Politécnico Nacional, gran institución de enseñanza y en especial a la

Unidad Interdisciplinaria de Biotecnología por ser la cuna de mi desarrollo

profesional. A sus buenos profesores y apreciados compañeros que me

acompañaron a lo largo de mi carrera.

Al Departamento de Desarrollo y Validación de protocolos y Diagnóstico de HLB por

su tutelaje y atención prestada para el desarrollo de este proyecto.

Al Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria por prestar sus instalaciones y

recursos para la realización de este proyecto; y a las personas que trabajan ahí por

su cooperación.

Doy gracias a los camaradas del desayuno por hacer amena mi estancia en el

Centro.

A mis compañeros de SNASS por su fraterno apoyo, compañerismo y complicidad

durante mi estancia en el CNRF

Finalmente un especial y afectuoso agradecimiento a mis Directores, por su apoyo,

dedicación y consejo. Pues sin ellos no hubiera sido posible culminar este trabajo.

Dedicatorias

Con el pasar del tiempo comprendo la bondad de sus corazones y la fuerza de su

carácter. Sin palabras que pueden definir mi amor y admiración, dedico mis

esfuerzos presentes, pasados y futuros así como el fruto de ellos, a las mejores

personas que he conocido y en quienes espero convertirme algún día.

A mis padres, Eladio y Magdalena

A todas aquellas personas que han pasado por mi vida, familiares, amigos,

compañeros, etc. pues sin su intervención no sería la persona que soy ahora, y les

aseguro que las llevo a todas en el corazón.

Pero en especial dedico este trabajo a todos aquellos que me recibieron en su

corazón y me han mantenido allí.

1

Índice

Objetivo General: ................................................................................................................................ 4

Objetivo Particular: ............................................................................................................................. 4

Alcances: ............................................................................................................................................. 4

Justificación ......................................................................................................................................... 5

Introducción ........................................................................................................................................ 6

Descripción de Fusarum oxysporum ......................................................................................... 6

Importancia Histórica del Mal de Panamá ................................................................................ 7

Distribución mundial del Mal de Panamá. ................................................................................ 7

Situación actual en México y potencial epidemiológico ......................................................... 8

Sintomatología .............................................................................................................................. 9

Hospederos ................................................................................................................................. 11

Transmisión ................................................................................................................................. 12

Metodología ...................................................................................................................................... 14

Diseño factorial ........................................................................................................................... 14

Diseño de PCR punto final .................................................................................................... 14

Programa de PCR .................................................................................................................. 16

Cantidad de reacciones ......................................................................................................... 16

Oligonucleótidos empleados ......................................................................................................... 16

Mix de reacción óptimo punto final y tiempo real. ............................................................. 19

Generación de control Positivo ................................................................................................ 19

Programa de Termociclador para PCR punto final ............................................................... 20

Electroforesis en gel de agarosa .............................................................................................. 21

PCR cuantitativa o en tiempo real. .......................................................................................... 21

Resultados y Análisis de resultados ................................................................................................. 22

PCR punto final ........................................................................................................................... 22

PCR cuantitativa ......................................................................................................................... 24

Curva de estandarización ......................................................................................................... 27

Conclusiones ..................................................................................................................................... 31

Sugerencias ....................................................................................................................................... 31

Bibliografia ........................................................................................................................................ 32

2

Anexos ............................................................................................................................................... 33

Índice de figuras

Figura 1.- Descripciones Morfológias de Fusarium oxysporum, A)Macronidias (27-55 um)

B)Micronidias (5-16 um), C) Clamidiosporas (7-11 um) D)FOC TR4 en medio PDA. ......... 6

Figura 2.- Distribución Geográfica de Fusarium oxysporum raza 1,2,3,4. (Fuente:

Senasica, 2015) ................................................................................................................................ 8

Figura 3.- Mapa de zonas potencialmente susceptibles para la infección de FOC TR4.

(SENASICA 2015) ............................................................................................................................ 8

Figura 4 .- Distribución de hospedantes de importancia económica relevante. ..................... 9

Figura 5.- Plátanos infectados de FOC TR4, con las sintomatologías de A) Síndrome

hojas amarillas y B) Síndrome hojas verdes .............................................................................. 10

Figura 6.- Pseudotallo de plátano exhibiendo síntomas necróticos en si tejido. .................. 11

Figura 7.- Hierbas susceptibles a Fusarium oxysporum f.sp. cubense raza 4, en orden A)

Commelina diffusa B) Euphorbia heterophylia C) Tridax procumbens D) Chloris inflata . 12

Figura 8.- Gorgojo taladrador (Cosmopolites sordidus) ........................................................... 13

Figura 9.- Vector de Clonación pGEM-T-easy (3015 pb). Marcador de selección de

colonias transformadas por resistencia a Ampicilina, Marcadores para selección por

colonias blancas/azules LacZ....................................................................................................... 20

Figura 10.- Resultados del Mix D. El cual resultó ser la mejor mezcla de reactivos para

PCR punto final. .............................................................................................................................. 22

Figura 11.- Mix “G”, se observa la amplificación de la banda deseada, ................................ 23

Figura 12.- Comparación de curvas con canales abiertos para A) FAM, B) Texas red y C)

ROX .................................................................................................................................................. 25

Figura 13.- Curva obtenido de PCR tiempo real con relación sonda: oligo 1:1 y MgCl2 a

mitad de concentración. ................................................................................................................ 26

Figura 14.- Comparación de controles positivos, obtenidos a partir del aumento en MgCl2 y

relación sonda: oligo ...................................................................................................................... 26

Figura 15.- Curva de estandarización realizada por una persona, se observa un threshold

al ciclo 29 ......................................................................................................................................... 27

Figura 16.- Curva correspondiente a diluciones 108 a 102 realizada por el robot QIAgility

........................................................................................................................................................... 28

Figura 17.- Linealización de la curva realizada por el software CFX196. ............................ 29

Figura 18.-Resultados posibles de una muestra dependiendo del ciclo en que levante la

muestra. ........................................................................................................................................... 30

Figura 19.- Resultados mix A ....................................................................................................... 33

Figura20 .- Resultados mix C ....................................................................................................... 33

Figura 21.- Resultados Mix D ....................................................................................................... 33

Figura 22.- Resultados Mix E ....................................................................................................... 33

Figura 24.- Resultados mix G ....................................................................................................... 34

Figura 25.- Resultados mix L ........................................................................................................ 34

3

Figura 26.- Resultados mix M ...................................................................................................... 34

Figura 27.- Resultados mix O ....................................................................................................... 35

Indice de tablas

Tabla 1 .- Volúmenes de reactivos para Mix de PCR .............................................................. 15

Tabla 2.- Secuencia de DNA de oligos y son respectivamente . .............................. 17

Tabla 3.- Conformación secundaria de la sonda FocTR4p, así como datos in sílico .......... 17

Tabla 4.- Listado de Mixes, con sus cantidades empleadas . ................................... 18

Tabla 5.-Volúmenes de reacción ................................................................................................. 19

Tabla 6.- Programa de PCR utilizado para las pruebas de diseño factorial, así como el

gradiente de Temperaturas a las que los mixes fueron sometidos. ....................................... 20

Tabla 7.- Componentes para la preparación de TBE 0.5 X ..................................................... 21

Tabla 8.- Programa de PCR cuantitativa. ................................................................................... 22

Tabla 9.- Resultados obtenidos del diseño factorial para PCR punto final. ......................... 24

Tabla 10.- Resultados correspondientes a la curva realizada por humano. ........................ 27

Tabla 11.- Datos obtenidos de PCR cuantitativa realizada por el robot QIAgility ................ 28

Tabla 12.- Guía de resultados para PCR cuantitativa basada en el Ct ................................. 30

Indice de anexos

Anexo 1. Imágenes de geles para el diseño factorial de PCR punto final ......................................... 33

Anexo 2. Formato de clonación ........................................................................................................ 36

4

Estandarización de un Protocolo de Fusarium oxysporum f. sp.

Cubense raza 4 tropical para detección por qPCR

Objetivo General:

Estandarizar de un protocolo para qPCR que permita el diagnóstico de Fusarium

oxysporum f. sp. cubense raza tropical 4

Objetivo Particular:

Elegir mediante diseño factorial la concentración de DNTP´s, MgCl2 , Oligos y

Temperatura de alineación que mejores resultados

Estandarizar el método de qPCR con las variables óptimas obtenidas en el diseño

experimental.

Establecer los límites de detección del procedimiento de qPCR

Alcances:

Estandarización de un protocolo para detección de Fusarium oxysporum f. sp.

Cubense raza 4 tropical, mejore la vigilancia y prevención de la plaga

cuarentenaria denominada “Mal de Panamá Raza 4” en centros portuarios y

aduanas previo ingreso al país, según la Ley Federal de Sanidad Vegetal.

5

Justificación

Pese a haber sido estudiado anteriormente, Fusarium oxysporum f.sp. cubense, raza 4

tropical, agente causal de la enfermedad de Panamá plantea una diversidad de retos.

Desde la amplia gama de morfologías que puede presentar, hasta su potente capacidad

diseminativa e infectiva.

La enfermedad de panamá ha sido una de las principales amenazantes a la producción

mundial de bananas, habiendo destruido la producción de cultivar Gros Michel en América

Central. (2) La raza tropical 4 de Fusarium oxysporum f.sp. cubense (FOC TR-4) es capaz

de infectar a la mayoría de las variedades del género Musa. El éxito de la propagación se

debe a la resistencia de la clamidiosporas para sobrevivir en el exterior. Utencilios de

labranza, riego agua y suelo son los principales medios por los cuales FOC-TR4 puede

propagar de una planta a otra. Algunos estudios han comprobado que las clamidiosporas

de FOC pueden mantenerse viables en el suelo hasta por 20 años. (1) Aunado a esto, se

ha observado que bananas asintomáticas traídas por efecto de importaciones también

son portadoras de este hongo y pueden infectar a otros plátanos locales por los medios

antes descritos.

Durante el año 2009, México produjo alrededor de 2.2 millones de toneladas de plátano;

siendo los principales estados productores Chiapas, Veracruz y tabasco. De la producción

Nacional, el 91.6% es destinado al mercado nacional y el 8.4% para exportación.

Considerando además que la producción aumenta cada año, no está de más resaltar la

importancia de salvaguardar este sector económico.(3)

Actualmente se estima que un 80% de la producción mundial de bananas es susceptible

a contraer el mal de panamá por la raza tropical 4; por esto y la facilidad de su

propagación, se hace imperativo desarrollar métodos de diagnóstico para prevenir la

entrada de FOC-TR4 al país, y tener un mejor control epidemiológico en caso de que

existiesen brotes nacionales.

Pese a existir métodos de detección de DNA de este hongo, resulta necesario indagar a

técnicas que mejoren el diagnóstico tanto en su rapidez como en la resolución de sus

resultados. La qPCR es una herramienta de diagnóstico por excelencia, esto debido a su

alta resolución, sensibilidad y posibilidad de cuantificar organismos presentes. Es por ello

6

que un protocolo de qPCR adecuado a la detección de FOC TR4 es el siguiente paso

para el combate a este hongo.

Introducción

Descripción de Fusarum oxysporum

Fusarium oxysporum es una compleja serie de especies amorfas, filamentosas e indiferenciadas, y

estás pueden tener relaciones saprofitas, antagonistas o patógenas para las plantas. La interés del

estudio por este género debido a sus diversos patogenicidad da origen a la clasificación de

“formae speciales”, que se asignaron dependiendo del huésped. La forma especial cubense se hizo

aplicable a la patogenicidad en plátanos . Aislado en un periodo desde 1876 a 1913 de diferentes

huéspedes, se hizo el consenso de llamarle Fusarium oxysporum f. sp. Cubense a todo fusarium

patógeno a banano.

FOC no puede ser distinguido de otras formae specialis por su morfología, además no tener una

etap sexual conocida, el hongo produce tanto macronidias, micronidias y clamidiosporas para

reproducción y dispersión. En medio PDA las colonias presentan una morfología variabe, desde

peluda hasta algodonoza, abundantes, aislados o desde tonos blancos a cafecinos.Algnos

científicos describen la producción de pigmentos violeta pálido a rojizos. De cualquier forma FOC

requiere de un gran esfuerzo y conocimiento para poder aislarlo e identificarlo.

Figura 1.- Descripciones Morfológias de Fusarium oxysporum, A)Macronidias (27-55 um) B)Micronidias (5-16 um), C) Clamidiosporas (7-11 um) D)FOC TR4 en medio PDA.

Desde un punto de vista genético, 24 Grupos de Compatibilidad Genética (VCG´s) pueden ser

identificados alrededor del mundo. La raza tropical 4 pertenece a un solo grupo e VCG´s. Estos

estudios se basaron en técnicas multigenéticas como RFLP´S, ALP´S, RAPD´s.

7

Importancia Histórica del Mal de Panamá

El mal de Panamá representa el principal reto del banano para los agricultores desde

hace ya varias décadas. Observado por primera vez en América durante los años 40; se

calcula que la raza 1 hizo desaparecer al menos 50 000 hectáreas de plantaciones de

banano durante esa década(1), posicionándose como una de las principales plagas que

afectan a los agricultores. Países como Costa Rica, vieron diezmada su producción, que

pasó a ser de 11 millones de racimos, a sólo 1.4 millones.

Ambas razas 1 y 2 causaron estragos en la industria bananera hasta pasados los años

sesenta, cuando la raza 1 fue responsable de la casi extinción y desplace comercial del

banano Gros Michel; principal variedad de plátano de importación hasta esa fecha; por

banano Cavendish, que presentaba cierta resistencia al mal de Panamá(2).

Luego de que las plantaciones bananeras de alrededor del mundo sufrieran los efectos de

las razas 1 y 2; apareció en Asia, la raza tropical 4, objeto de estudio de éste proyecto.

Desde su aparición, ha sido un fuente de altas preocupaciones por parte de personas

dedicadas al sector bananero. Para el año 2009 se documentaba más de 8 millones de

plantas y 5000 hectáreas afectadas alrededor de asia, en países como Malasia, Filipinas,

Indonesia, Taiwan. En esta parte del sudeste asiático, las pérdidas monetarias se

reportaron en los 11 millones de dólares.

Actualmente, el mal de panamá por Fusarium oxysporum f.sp. Cubense TR4, se ha

convertido en la principal amenaza para el sector bananero. Esto debido a su alta

virulencia, facilidad de propagación, agresividad y el ser capaz de infectar a los mismos

hospederos que sus razas 1 y 2, inclusive a la variedad de banano Cavendish, situada

como principal plátano de exportación luego de la casi extinción del banano Gros Michel;

Poniendo así, en riesgo al 80% de la producción mundial de plátanos.(2)

Distribución mundial del Mal de Panamá.

Fusarium oxysporum en sus distintas razas se encuentra presenta en todos los

continente; si bien no está delimitado con entera certeza si se trata de raza 1,2, o 3. Por

fuentes de SENASICA y originalmente de la EPPO, se ,muestra a continuación un mapa,

donde se muestran las zonas afectadas por Fusarium oxysporum, sin identificación de la

raza o razas presentes.

8

Figura 2.- Distribución Geográfica de Fusarium oxysporum raza 1,2,3,4. (Fuente: Senasica, 2015)

Situación actual en México y potencial epidemiológico

De manera oficial, México se encuentra libre de FOC TR4, pero cuenta las razas 1 y 2

dentro de su territorio. Debido a esto, se sabe que México cuenta con las características

climatológicas y conjunto de hospederos apropiados para la transmisión de FOC TR4.

Combinando estas características, se hizo un mapa de las zonas con mayor potencial de

susceptibilidad al mal de Panamá.

Figura 3.- Mapa de zonas potencialmente susceptibles para la infección de FOC TR4. (SENASICA 2015)

9

Como en la mayoría de los países, las zonas de mayor riesgo pertenecen a las principales

zonas de producción platanera. Se agrega un diagrama según datos de SENASICA

mostrando las zonas donde existen municipios de importancia comercial bananera.

Figura 4 .- Distribución de hospedantes de importancia económica relevante.

Sintomatología

La sintomatología que presentan los arboles de banano infectados por Fusarium

oxysporum no cambian dependiendo de la raza de hongo que se esté presentando.

Los principales síntomas observables del mal de panamá son tanto el síndrome de hojas

amarillas como el de hojas verdes. En el caso del síndrome de las hojas amarillas, estas

se tornan de un color amarillento que va del exterior al interior de las hojas. En el caso

del síndrome de hojas verdes, el cambio en la coloración antes mencionado no se

presenta.

10

A) B)

Figura 5.- Plátanos infectados de FOC TR4, con las sintomatologías de A) Síndrome hojas amarillas y B) Síndrome hojas verdes

Independientemente de la coloración que presenta en las hojas, en ambos síndromes, los

peciolos de las hojas irán doblándose hasta colgar completamente y dar una apariencia

de muerte por capas al banano. El progreso de esta sintomatología va de las hojas más

viejas a las nuevas; dejando comúnmente sólo a las hojas más jóvenes en una posición

erecta. (1)

El siguiente síntoma importante que FOC ocasiona, es la decoloración o coloración

amarillenta-café que se presenta en los tejidos vasculares del pseudotallo y raíces. Estas

características pueden ser observadas haciendo un corte transversa en el tallos, a través

de manchas que cambian su coloración dependiendo del grado de necrosis

presentado.(1)

11

Figura 6.- Pseudotallo de plátano exhibiendo síntomas necróticos en si tejido.

Cabe señalar que debido a sus síntomas un tanto genéricos, el mal de panamá puede

confundirse con otros padecimientos, tales como la falta de nutrientes, comúnmente

potasio en el suelo, estrés hídrico y con infecciones bacterianas como el Moko.

La manera más eficaz de poder diferenciar al mal de panamá de otros padecimientos es

haciendo un pequeño corte en el tallo del banano; En caso de que el corte purule,

podemos asumir que se trata de una infección bacteriana, sin embargo si esta no existe y

al aumentar el diámetro de la incisión no se observa decoloración alguna, es más

probable que se trate de una deficiencia de nutrientes o estrés hídrico. (4)

Hospederos

Bajo condiciones de cultivo o silvestres, los principales hospederos de Fusarium

oxysporum f. sp. cubense raza 4 son el género musa (Plantas que conocemos

coloquialmente como plátanos ) y el género Helicondia , que en algunas regiones

presenta valor comercial por la peculiaridad de sus flores.

En los campos silvestres, se han encontrado que diversas malezas y otros arbustos son

susceptibles a contraer el hongo y luego dispersarlo por mayores longitudes de terreno..

En la siguiente Imagen se enlistan algunas de las malezas afectadas por FOC TR4.

12

Figura 7.- Hierbas susceptibles a Fusarium oxysporum f.sp. cubense raza 4, en orden A) Commelina

diffusa B) Euphorbia heterophylia C) Tridax procumbens D) Chloris inflata

Transmisión

Fusarium puede transmitirse por diversos métodos y vehículos. En gran medida esta

capacidad infectiva se debe a la resistencia que tienen sus clamidosporas para

permanecer latentes en sus diversos vehículos. En el caso del suelo, basta con que las

esporas tengan contacto directo con un tejido sano para empezar a germinar a las 6 u 8

horas (5)

El método más común de transmisión de fusarium de manera local e internacional es

debido al movimiento de rizomas asintomáticos y otras partes de infectadas y

asintomáticas del banano; tales como son las hojas y pseudotallos, con los que

comúnmente se envuelven los plátanos para su transporte; y pueden contagiar de este

padecimiento a otros frutos y/ o bananos sanos. Al igual que con los rizomas, otras

estructuras similares son susceptibles para la transmisión de fusarium en otras especies,

tal es el caso de las malezas hospederas Chloris inflata, y Commelina diffusa y plantas

del género Helicondia,(1).

Al permanecer el suelo contaminado, la transmisión puede darse tanto por medios

artificiales como naturales. Entre los métodos naturales se encuentra la erosión y

movimientos debido al paso de animales. Los métodos artificiales son los más variados,

13

pues son generados directamente de la actividad de la agricultura; e incluyen desde

movimientos por maquinaria pesada hasta el arado de la tierra.

El agua es el agente transmisor por el cual este hongo puede transmitirse por mayores

distancias; por arrastre de material vegetal en época de lluvias prolongadas, y el

transporte de esporas a través del subsuelo. También si se utilizara una reserva de agua

contaminada por el hongo, existen altas posibilidades de que sea propagado

rápidamente.(2)

Respecto a la existencia de un vector específico para FOC TR4, científicos en Australia

hallaron por medio de pruebas con PCR rastros de FOC en el caparazón del gorgojo

taladrador (Cosmopolites sordidus), Este animal se encuentra presente en casi cualquier

lugar donde se planten árboles de banano.(1)

Figura 8.- Gorgojo taladrador (Cosmopolites sordidus)

14

Metodología

La metodología general para cumplir con los objetivos del proyecto, puede resumirse en el

siguiente diagrama

Diseño factorial

Antes de poder realizar la curva y estandarizaciones correspondientes al tiempo real;

debemos consolidar un mix apropiado de componentes a concentraciones con las cuales

podamos obtener los mejores resultados posibles. Con esto en mente, partimos a decidir

que variables eran aquéllas que variaríamos en nuestras mezclas de reacción. Debido a

que la parte principal de la reacción en cadena de la polimerasa es la enzima DNA

polimerasa; se decidió utilizar a los elementos que afectan directamente a esta enzima.

Diseño de PCR punto final

Las variables del mix de reacción evaluadas en el presente trabajo, fueron:

Concentraciones de dNTPs, oligonucleótidos y MgCl2. Esto se puede justificar en: la Taq-

Eficiencia del qPCR

Análisis de Resultados

• Curva de No. Copias.

• Escritura Informe

Estandarización de qPCR (clona) Mezcla de qPCR

• Diseño Factorial

• Programa Qiagility

Programa de qPCR

• Diseño Factorial

• Programa en equipo CFX96

Estandarización PCR (Diseño factorial)

Mezcla de Reacción Programa de PCR

Generación Control (+)

FOC TR4 Generación Clona C(+)

•Secuenciación Sanger de clona

15

pol es una enzima alostérica, que requiere la unión de un cofactor (Mg++) para la

activación de la síntesis de DNA. La formación del amplicón [P] está determinado por los

sustratos de la enzima que son el DNA molde [A] y la concentración de dNTPs [B] y el

alineamiento de primers [C], por lo que es una reacción de orden superior de la forma

dP/dt = k [A] [B] [C]. A su vez, la concentración de producto inhibe la velocidad de

reacción de la enzima, por lo que se observa una reacción enzimática con

retroalimentación negativa. En el presente trabajo se eligieron las concentraciones de

MgCl₂, dNTPs y Primers como variables debido a que la velocidad de reacción depende

de la concentración como sustratos y como cofactor de Mg++. (9)

La última variable de Temperatura de alineamiento, es justificada por la temperatura de

disociación del DNA en su forma de primera cadena, que se encuentra en una

temperatura aproximadamente la de Temperatura crítica (la Temperatura a la cual mitad

del DNA está disociado) y que heurísticamente es la variable más modificada en la

optimización de las PCRs. (10)

Existen diversas variables que puede modificarse además de las antes mencionadas, tal

es el caso de la cantidad de DNA por cada reacción, los métodos de extracción y otras

temperaturas y tiempos en el programa de pcr. Si bien tienen impacto en los resultados

finales de la PCR, se optó por empezar por aquellos heurísticamente más optimizados,

con el propósito de disminuir el número de experimentaciones y tiempo empleado; puesto

que el propósito del trabajo es la escala a PCR cuantitativa y no optimización de PCR

punto final.

Las concentraciones base con las cual comenzamos el experimento pueden ser halladas

en el trabajo del Dr. Dita (1) Estas cantidades de cada componente son las siguientes:

Tabla 1 .- Volúmenes de reactivos para Mix de PCR

Componente Cantidad (µL)

Buffer 2.5

MgCL2 0.375

DNTP´s 0.5

Oligo F 1.0

Oligo R 1.0

Taq polimerasa 0.25

16

Agua 18.375

DNA 1

Programa de PCR

El programa de PCR se realizó con base al software “Protocol Autowriter”. Se acordó

variar la temperatura de alineación, como uno de los variables a análisis en el diseño

factorial. Así es como se acuerda utilizar tres temperaturas, de 57.3 °C, 60.5 °C y 63.2°C.

Cantidad de reacciones

Por la naturaleza del experimento, el total de pruebas que se necesitan realizar se calcula

con la siguiente expresión: 43 = 64, dadas las 4 variables a considerar, en tres factores

cada una a altas bajas y concentraciones por defecto. Esto necesitaría bastante tiempo y

material en su realización. Para reducir de ambos recursos, se optó por reducir el número

de experimentaciones, se realizaría al menos 23.5% de ellas, y se cubrirían las

combinaciones más extremas posibles (7). Con estas consideraciones, a continuación se

muestran todas las mezclas evaluadas, con sus respectivos factores al doble de cantidad

normal (2x), igual (1x) o a la mitad (0.5x)

Cada mix se probó por triplicado a cada intervalo de temperatura, con el propósito de

tener una mayor cantidad de datos que se acercasen a la realidad.

Oligonucleótidos empleados

Los oligonucleótidos que se utilizaron en el presente trabajo son diseños inéditos del área

de Desarrollo, Validación de Protocolos y Diagnóstico de HLB. Se tratan de 2 iniciadores

de la PCR y 1 sonda de hidrólisis con fluoróforo en el extremo 5’ y un apagador tipo Black

Hole Quencher (BHQ) en el extremo 3’. El diseño de los oligonucleótidos se solicitó con

un servicio de síntesis externo. La selección de fluoróforo y sonda se entregó fue ROX

con BHQ-2

17

Tabla 2.- Secuencia de DNA de oligos y son respectivamente.

Nombre Tipo Secuencia

FocTR4-qF Forward TGAATCGGAGGACAGGTCTA

FocTR4-qR Reverse GAGAGGCGATTGAAGTTGACTA

FocTR4p Sonda TCTAACCCTCGAAGTGGTCTACCCG

Se utilizó el software Multiple Primer Analyzer para evaluar algunos parámetros in silico

de la sonda. De entre ellas destaca la estructura secundaria de la sonda; esta estructura

confiere a la sonda una mayor resistencia a la temperatura, de tal modo que sólo se abra

cuando sea necesario y permanezca menos tiempo de forma lineal, minimizando así las

probabilidades de degradación.

Tabla 3.- Conformación secundaria de la sonda FocTR4p, así como datos in sílico

FocTR4p # ES Estabilidad

Parámetro Valor 1 /GCTCCCAATCT 5'

| |||

\AAGTGGTCTACCCG 3'

Débil

PM 7578.0

CE 230.3 2 /GCTCCCAATCT 5'

| |||

\AAGTGGTCTACCCG 3'

Débil

µg/DO 32.9

nt 25

Tm 70.7

%GC 56.0

Clamp 4

ES 2

Dim No

18

Los juegos de concentraciones para cada mix se variaron de tal manera que fueran lo

más extremosas posibles, comenzado con todo los valores a mitades o dobles de la

concentración por defecto; se llegó al consenso de utilizar las concentraciones enlistadas

a continuación.

Tabla 4.- Listado de Mixes, con sus cantidades empleadas.

Listado de Mixes

Código Mix MgCl2 DNTP´s Oligos

A 0.5x 0.5x 0.5x

B 2x 2x 2x

C 1x 1x 1x

D 0.5x 1x 1x

E 1x 0.5x 1x

F 1x 1x 0.5x

G 2x 1x 1x

H 1x 2x 1x

I 1x 1x 2x

J 0 2x 2x

K 2x 1x 2x

L 2x 2x 1x

M 1x 0.5x 0.5x

N 0.5x 1x 0.5x

O 0.5x 0.5x 1x

19

Mix de reacción óptimo punto final y tiempo real.

A continuación se enlistan los volúmenes de reacción óptimos empleadas para las

pruebas. La enzima utilizada fue “Taq DNA Polymerase de marca INVITROGEN de

Thermo Scientific con número de catálogo 10342020

Tabla 5.-Volúmenes de reacción

Componente Volumen de Reacción (µL)

Punto Final Cuantitativa

Buffer PCR 10x 2.5 µL 2.5 µL

MgCl2 0.1875 µL 0.75 µL

dNTP´s 0.5 µL 0.5 µL

Oligo Foc TR4 qF 1.0 µL 1.0 µL

Oligo Foc TR4 qR 1.0 µL 1.0 µL

Sonda Foc TR4 p - 2.0 µL

Taq polimerasa 0.25 µL 0.25 µL

Agua 18.5625 µL 15

DNA 1 2

Generación de control Positivo

Debido a que no se tiene una cepa de FOC TR4 en el país, y existen diversas

complicaciones para poder obtener una; se tomó la decisión de utilizar clonas como

controles positivos. Estas clonas fueron construidas por ligación con del vector pGEM-T

Easy (Promega con #catálogo A1360 ), que una vez agregado el amplicón deseado tuvo

un peso molecular total de 3116 pb. Se realizó la solicitud por parte del área de

Desarrollo, Validación de Protocolos y Diagnóstico de HLB (DVD). La generación del

control positivo fue realizada por el servicio de clonación del área de Biología Molecular

(BIM), del mismo centro, con número de folio VAL-07. El código de identificación de la

clona para rastreabilidad interna es FUSO-01 (Área BIM) y QT4A (Área DVD).

20

Figura 9.- Vector de Clonación pGEM-T-easy (3015 pb). Marcador de selección de colonias transformadas por resistencia a Ampicilina, Marcadores para selección por colonias blancas/azules

LacZ.

Durante la experimentación de tiempo real se usaron productos de PCR como controles

positivos. Los resultados de estos experimentos se discutirán posteriormente.

Programa de Termociclador para PCR punto final

Para la primera parte de la experimentación, se realizó una secuencia de PCR´s puntos

finales con los primers FOC TR4 qF y FOC TR4 qR. El programa de PCR se muestra a

continuación. Las distintas concentraciones de las reacciones de PCR pueden ser

halladas en la parte de anexos.

Tabla 6.- Programa de PCR utilizado para las pruebas de diseño factorial, así como el gradiente de Temperaturas a las que los mixes fueron sometidos.

Fase Temperatura (°C) Duración

Desnatiralización inicial 95 3 min

Desnaturalización 95 20 s

Alineamiento 57.3,60.5,63.2 20 s

Elongación 72 15 s

Rellenado 72 3 min

Conservación 4 Inf

21

Todas las PCR fueron hechas en el equipo Biorad T-100, utilizando para todas, el mismo

control positivo, y así eliminar variables referentes a la concentración de DNA.

Electroforesis en gel de agarosa

Para el análisis fundamental de los productos de pcr anteriores; las muestras fueron

corridas en un gel de electroforesis al 1%. Los geles fueron elaborados y corridos en TBE

(Tris, EDTA, ác. Borico. Para mejor referencia ver tabla X) al 0.5% a 70 volts por 2 horas,

y utilizados marcadores moleculares de 1 Kb y 25 bp. En los anexos se comparten el

compendio de imágenes resultados de este proceso.

Tabla 7.- Componentes para la preparación de TBE 0.5 X

TBE 0.5X Cf(0.5X) 1 L

Tris 44.5 mM 54 g

Ac Bórico 44.5 mM 27.5 g

0.5 M EDTA ph 8 2 mM 20 mL

H20 - Cbp 1 L

PCR cuantitativa o en tiempo real.

Las PCR fueron realizadas con las concentraciones del mix D. Lo tiempos de cada una

de las fases de las PCR´s punto final se mantuvieron sin modificaciones; y la temperatura

de alineación utilizada fue de 57°C, dado que a esta temperatura se observaron los

mejores resultados en las PCR punto final.

Para mejorar los resultados de la PCR cuantitativa, se varió el elemento más extremo del

Mix D. Los MCl2 se argumentaron hasta el doble de la concentración por defecto y

posteriormente se probó diferentes relaciones sonda: oligos y se eligió por la relación 2: 1

Todas las pruebas de PCR fueron realizadas en el equipo Bio-Rad C-1000 Touch System,

con un cabezal CFX96. El programa de tiempo real fue el siguiente

22

Tabla 8.- Programa de PCR cuantitativa.

Fase Temperatura (°C) Duración Ciclos

Desnaturalización

inicial

95 3 min

Desnaturalización 95 20 s 40

Alineamiento 57 20 s

Elongación (captura) 72 15 s

Conservación 4 Hold

Resultados y Análisis de resultados

PCR punto final

El método más práctico de evaluar los resultados de la primera fase del experimento fue

el observar las características asociadas a la calidad de las bandas. Para ejemplificar

mejor este proceso, se muestran dos geles (Figuras 10 y 11), y se realiza un análisis para

finalmente otorgar una calificación arbitraria con base a la apreciación de intensidad de

bandas producidas por el mix de reacción y la temperatura.

Figura 10.- Resultados del Mix D. El cual resultó ser la mejor mezcla de reactivos para PCR punto final.

Si se analiza la imagen del mix D, podemos observar bandas consistentes, sin un barrido

de dímeros que dificulte la lectura o indique inespecificidad en la amplificación. Una buena

57.3 °C 60.5 °C 63.2 °C

101 pb

23

intensidad de banda que muestra una buena amplificación. Por estas razones es que la

imagen anterior es considerado el gel con mejores resultados. Las calificaciones

asignadas a cada triplicado fueron 10, 9.5 y 9 respectivamente, pues todas las reacciones

fueron obtenidas buenos resultados; y sólo disminuyendo el valor de la calificación por

una menor intensidad en el gel.

Figura 11.- Mix “G”, se observa la amplificación de la banda deseada,

Otros geles dieron resultados positivos, tal es el caso del gel correspondiente al mix “G”,

sin embargo, las bandas resultantes no son tan definidas, dando la apariencia de tener

“fantasmas” alrededor; fenómeno comúnmente asociados a una amplificación inespecífica

por parte de la enzima; ocasionando dímeros

Los mixes de PCR B, H, I, J, N se observó la ausencia de una banda de 101 pb. Esto sólo

puede indicar que a estas concentraciones específicadas, no es posible utilizarlas para la

amplificación de la secuencia deseada. Por esta razón fueron calificadas con un 0, para

futuras referencias.

En la siguiente tabla, se hace un compendio de los resultados obtenidos de cada mix de

reacción; con un promedio de la calificación de las tres temperaturas y la desviación

estándar de cada una. El cálculo de la desviación estándar tiene por objetivo observar

que mixes tienen una mayor susceptibilidad a la temperatura.

100 pb

57.3 °C 60.5 °C 63.2 °C

24

Tabla 9.- Resultados obtenidos del diseño factorial para PCR punto final.

Composicion Mix Temperaturas Promedio Desv. Estandar

Código MgCl2 DNTP´s Oligos 57°C 60°C 63°C

A -2 -2 -2 9 8 7 8.0 0.7

B 2 2 2 0 0 0 0.0 0.0

C 0 0 0 8.5 0 0 2.8 16.1

D -2 0 0 10 9.5 9 9.5 0.2

E 0 -2 0 6 6 6 6.0 0.0

F 0 0 -2 0 0 0 0.0 0.0

G 2 0 0 8 7 6.5 7.2 0.4

H 0 2 0 0 0 0 0.0 0.0

I 0 0 2 0 0 0 0.0 0.0

J 0 2 2 0 0 0 0.0 0.0

K 2 0 2 7 7.5 6.5 7.0 0.2

L 2 2 0 8.5 8.5 8.5 8.5 0.0

M 0 -2 -2 6 5 4 5.0 0.7

N -2 0 -2 0 0 0 0.0 0.0

O -2 -2 0 8.5 8 7.5 8.0 0.2

Luego de deliberar las diversas calificaciones de cada mix, se optó por usar el mix “D”,

marcado en la tabla anterior. La decisión se tomó por sus altas calificaciones y poca

variabilidad a la temperatura (Desviación estándar).

PCR cuantitativa

El paso siguiente fue la realización de PCR cuantitativas. El programa de PCR cuantitativa

fue el mismo que para punto final y se inició trabajando una relación de sonda: oligos de

1:1.

Al momento de realizar las primeras pruebas, se obtuvieron resultados bastante

insatisfactorios.

25

A) B)

D)

Figura 12.- Comparación de curvas con canales abiertos para A) FAM, B) Texas red y C) ROX

De estos primeros resultados, donde ninguno de los controles positivos alzó por encima

del umbral. Luego de repetir la prueba y obtener resultados similares, se corrieron las

muestras en un gel, donde se comprobó la amplificación; se llegó a la conclusión de que

había algo incorrecto en la sonda. Para la siguiente prueba se repitió el mismo proceso,

esta vez abriendo todos los canales que le es posible leer al equipo. Así se obtuvo la

siguiente curva:

Al notar que el equipo detectaba a algunas muestras levantar en el Fluoróforo Texas red,

se eligió por probar con los fluoróforos que se encuentran en el mismo canal que Texas

red, para así hallar al fluoróforo que probablemente se encuentra ligado a nuestra sonda.

Finalmente, con la última ronda de experimentaciones, donde se halló mejor respuesta

leyendo fluorescencia con ROX, podemos concluir que en vez de ponerle FAM a la sonda,

le agregaron ROX. A partir de aquí todas las PCR cuantitativas se hicieron leyendo ROX.

Se realizaron más ensayos de PCR cuantitativa, en busca de curvas más claras para

poder hacer una curva de calibración. Luego de observar que los resultados arrojados

seguían siendo poco fiables, tal como se muestra en la siguiente curva:

26

Figura 13.- Curva obtenido de PCR tiempo real con relación sonda: oligo 1:1 y MgCl2 a mitad de concentración.

Luego de algunas repeticiones y de observar resultados similares; se comenzó a cambiar

las relaciones de sonda: oligos y elevar la concentración de MgCl2, en un esfuerzo por

obtener resultados más altos de fluorescencia y resultados consistentes. Esta meta se

cumplió, y luego de incrementar la relación de sonda: oligo a 2:1, y la concentración de

MgCl2 al doble del valor por defecto. A partir de estos mejores resultados, se procedió a

realizar una prueba para determinar la mejor fuente de controles positivos; comparando

productos de PCR contra clonas del amplicón.

Figura 14.- Comparación de controles positivos, obtenidos a partir del aumento en MgCl2 y relación

sonda: oligo

Los resultados fueron bastantes contundentes, y se puede concluir que los controles

positivos de clonas son los apropiados para realizar una estandarización, pues se observa

claramente un intervalo de separación entre una dilución y otra, mientras que en los

productos de PCR, existe alguna variable o subproducto que genera una lectura

incorrecta por parte del equipo y arroja fluorescencias negativas.

Productos PCR

Clonas

106 105 104

27

Curva de estandarización

Finalmente, con las concentraciones y controles positivos adecuados, se procedió a

realizar la curva estándar.

Figura 15.- Curva de estandarización realizada por una persona, se observa un threshold al ciclo 29

La curva anterior fue hecha por mano humana, por lo que conlleva un cierto error. Esta

fue construida con los siguientes puntos:

Tabla 10.- Resultados correspondientes a la curva realizada por humano.

N° Copias 100000

0

100000 10000 1000 100 10 0

Ct

Promedio

21.92 25.643333

3

28.425 29.205 29.365 29.415 -

Eficiencia 111.81181

2

83.533533

5

23.423423

4

4.804804

8

1.501501

5

-

Aparentemente, la curva anterior parecería satisfactoria, incluso podríamos aseverar que

el threshold se encuentra a los 29 ciclos. Lamentablemente al observar las eficiencias de

cada dilución, observamos que caen dramáticamente a partir de mil copias lo cual resulta

bastante insatisfactorio estandarizar un protocolo. Para eliminar el error humano, del cual

podrían provenir estos comportamientos atípicos.

28

El robot utilizado fue el QIAgility, que es capaz de realizar los mixes y diluciones, para así

minimizar el error humano al momento de pipetear. La curva realizada con el robot se ve

mucho mejor que la realizada por humano, ésta fue realizada en diluciones que van desde

108 a 103.

Figura 16.- Curva correspondiente a diluciones 108 a 102 realizada por el robot QIAgility

A continuación se muestran los datos de la curva, para un mejor análisis.

Tabla 11.- Datos obtenidos de PCR cuantitativa realizada por el robot QIAgility

N° Copias 1.0E+08 1.0E+07 1.0E+06 1.0E+05 1.0E+04 1.0E+03 1.0E+02 NTC

Promedio 15.2433 18.453 19.276 22.32 25.57 29.326 31.666 32.096

Dev E 0.0382 0.0016 0.0021 0.0216 0.154 0.028 0.011 0.030

Eficiencia 97.272 24.949 92.222 98.484 113.83 70.909 13.03

De la tabla anterior podemos discernir que la curva realizada por QIAgility, mantiene una

mejor eficiencia a lo largo del proceso, Por esta razón y la consistencia de los datos, se

optó por utilizar esta curva para la estandarización del proceso. Se observa además que

el protocolo es fiable hasta las 1000 copias/µL, debido a que 100 copias/µL y el Control

negativo o NTC levantaron muy cerca el uno del otro; no podemos aseverar que las 100

copias alzadas a 31.6 ciclos sean confiables.

Una vez establecido esto, se linealita la recta, y se obtiene la ecuación que permitirá

cuantificar el número de copias en una muestra analizada.

29

Figura 17.- Linealización de la curva realizada por el software CFX196.

La ecuación para cuantificar el logaritmo (base 10) del número de copias, en un intervalo

confiable hasta el ciclo 29, o hasta 1000 copias /µL es la siguiente:

log10 𝐶 =𝐶𝑞 − 36.927

−2.761

El número de copias, por lo tanto es:

𝐶 = 10𝐶𝑞−36.927

−2.761 , 0 < 𝐶 ≤ 29.326

Otro uso de la estandarización desde un punto de vista más práctico si no se requiere

cuantificar el número de copias, es el poder realizar un diagnóstico rápido de si la muestra

esta infectada o no. Es por eso que se realizó el siguiente gráfico que muestra las

siguientes regiones donde puede levantar una muestra y su correspondiente resultado,

positivo, negativo o dudoso (requiere repetir PCR).

30

Figura 18.-Resultados posibles de una muestra dependiendo del ciclo en que levante la muestra.

Resumimos los posibles resultados para agilizar la lectura en los siguiente tabla

Tabla 12.- Guía de resultados para PCR cuantitativa basada en el Ct

Resultado Intervalo de ciclos

Positivo para FOC TR4 1 – 29

Negativo para FOC TR4 31 en adelante

Dudoso / Repetir prueba 29-32

0.9

1

1.1

1.2

1.3

- 5 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0

REG

ION

ES

CT

Positiva Negativa DUDA

31

Conclusiones

El protocolo estandarizado es sensible hasta un número de 1000 copias/ uL

Para escalamientos a PCR Cuantitativa, el uso de clonas es una herramienta

fundamental para lograr resultados concisos.

La interacción a concentraciones específicas de los componentes en el Mix de

reacción, pueden variar en escalamientos debido a la introducción de nuevos

componentes como una sonda.

Sugerencias

Se deberá realizar una prueba de especificidad, utilizando el método para

diferenciar una muestra de FOC TR4 de un grupo de Fusariums diversos.

Las concentraciones de reacción para PCR cuantitativa pueden mejorarse, por lo

que una optimización por diseño factorial podría conllevar a menor uso de

reactivos.

Deben realizarse cambios en las concentraciones y programas de PCR para

aumentar la sensibilidad del proceso, hasta el máximo posible.

32

Bibliografia

1.- Dr Miguel A. Dita, Dr Luis Pérez Vicente (2014), Technical Manual. Prevention and

diagnostic of fusarium Wilt (Panama disease) of banana, caused by Fusarium Oxysporum

sp cubense tropical race 4 , Food and Agricultural organization

2.- Dr Miguel Dita, Detecting Fusarium oxysporum f.sp. cubense in soil and symtompless

banana tissue.

3.-Monografía del sector Plátano en México Situación actual y Oportunidades de Mercado,

Secretaría de Economía, Dirección General de Industrias Básicas, Febrero 2012

4.- Panama disease Fact sheet , Plant Health Australia. Queensland government

5.- Luis Pérez-Vicente, Fusarium wilt (Panama disease) of bananas: an updating review

of the current knowledge an its causal agent, Instituto de investigaciones de sanidad

vegetal, Ciudad Habana , cuba

6.- Ficha técnica Mal de panamá (Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 4), Dirección

general de sanidad vegetal, Centro Nacional de referencia fitosanitaria, Area de vigilancia

epidemiológica fitosanitaria

7.- Luciano Martínez Bolaños, (revisado por SENASICA 2015),Ficha técnica N° 2,

fusaium oxysporum f. sp. cubense, SENASICA, Laboratorio nacional de referencia

fitosanitaria.

8.- Cruz-Jaramillo JL, Ramirez-Ortega FA. Datos para optimización de experimentos

basados en PCR (Sin publicar)

9.- Preparación de buffer Tris, ac. Bórico, EDT,(TAE) y Tris, Ac. Bórico, EDTA (TBE),

Laboratorio de genómica viral y humana, Universidad de San Luis Potosí, Nov 2008

10.- Tamay de Dios, L., Ibarra, C. y Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en

Discapacidad. 2: 70-78.

33

Anexos

Anexo 1. Imágenes de geles para el diseño factorial de PCR punto final

Figura 19.- Resultados mix A

Figura20 .- Resultados mix C

Figura 21.- Resultados Mix D

Figura 22.- Resultados Mix E

34

Figura 23.- Resultados mix G

Figura 24.- Resultados mix L

Figura 25.- Resultados mix M

35

Figura 26.- Resultados mix O

36

Anexo 2. Formato de clonación

Folio ____________

Fecha de Entrega: _____15/03/2016______________

Área interesada: _____Área de Desarrollo, Validación y Diagnostico de HLB

CONDICIONES PARA LA RECEPCIÓN DEL MATERIAL A CLONAR:

1. Producto de PCR reciente (máximo 3 días), sin presencia de fragmentos inespecíficos,

previamente secuenciado, sin dímeros y sin buffer con colorante.

2. Enviar 15 µL de producto de PCR por muestra, en frío (4°C).

3. Enviar 50 µL de cada primer.

4. Anexarel programa de termociclaje.

5. La recepción de muestras es lunes y martes antes de las 13:00

1. La entrega de resultados (clonas y secuencia) será dos semanas y media después de la recepción del

material. Solo clonas

Indicar los siguientes datos:

Incluir imagen de la secuencia del material a clonar (Descripción, cobertura, error, % de

identidad).

Se solicita secuenciación para corroborar

No. De orden

(Si aplica) Clave de

identidad (4 caracteres)

Nombre del

patógeno

Tamaño del

fragmento a

clonar (pb)

Oligos (Para verificación de

clona)

Observaciones

N/A QT4A Fusarium

oxysporum

f.sp.

cubense

Raza 4

Tropical

101 FOC-qF FOC-qR Foc A

QT4B Fusarium

oxysporum

f.sp.

cubense

Raza 4

Tropical

101 FOC-qF FOC-qR Foc B

QT4B Fusarium

oxysporum

f.sp.

cubense

Raza 4

Tropical

101 FOC-qF FOC-qR Foc C

37

Incluir programa de PCR

93° 3 min

95° 20 s 40 ciclos

57° 20s |

72° 15s |

72° 3 min

4° hold

Incluir imagen del Gel de Electroforesis del material a clonar.

Indicar el objetivo del material que se envía para clonar:

INVESTIGACIÓN DIAGNÓSTICO MATERIAL DE

REFERENCIA

PROTOCOLO CAPACITACIÓN OTRO (Especificar)________

Laboratorio o Interesado (a) Ing. Mario Espinosa Mendoza

Procedencia del Material Coordinador de Biología Molecular Subdirector de Diagnóstico

Fitosanitario

Entregó Revisa Autoriza