Índice

Introducción

I. Indol1. Géneros bacterianos que identifica2. Fundamento bioquímico3. Características generales4. Interpretación5. Controles de calidad

II. Rojo de Metilo1. Géneros bacterianos que identifica2. Fundamento bioquímico3. Características generales4. Interpretación5. Controles de calidad

III. Voges -Proskauer1. Géneros bacterianos que identifica2. Fundamento bioquímico3. Características generales4. Interpretación5. Controles de calidad

IV. Citrato1. Géneros bacterianos que identifica2. Fundamento bioquímico3. Características generales4. Interpretación5. Controles de calidad

V. Conclusión

VI. Bibliografía

Pruebas bioquímicas

Consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Sirven de gran apoyo a la hora de diagnosticar infecciones por bacterias.

IMVIC

El IMVIC se compone de cuatro pruebas:

Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato.

PRUEBA PRINCIPIOI. La prueba del Indol Estudia la capacidad de degradar el

triptófano con producción de Indol y metabolitos indólicos

II. Rojo de MetiloEstudia la fermentación ácido mixta con producción de ácidos estables en el tiempo.

III. Voges ProskauerEstudia la fermentación butanodiólica con formación de un metabolito intermediario neutro.

IV. CitratoEstudia la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de carbono.

I. PRUEBA DE INDOL

PRINCIPIO

Para determinar la capacidad de un microorganismo para separar el indol a partir del triptófano.

OBJETIVO

Ayuda a diferenciación entre géneros

1. Separación de Escherichia coli (+) de los miembros de los géneros Klebsiella (variables, por lo común negativos; V-), Enterobacter (V-), Hafnia (-), Serratia (V-) y una especie de Pantoea, P. agglomerans (-).

Ayuda en la diferenciación de especies junto con otras pruebas bioquímicas.

1. Paenibacillus alvei (+) de otras especies de Bacillus (por lo general -).

2. Escherichia coli (+), E. hermanii (+) y E. fergusonii (+) de E. vulneris (-) y E. blattae (-).

3. Citrobacter freundii (-) de C. koseri (+) y de C. amalonaticus y del biogrupo 1.

4. Klebsiella oxytoca (+) y K. ornithinolytica (+) de otras especies de Klebsiella (V-)

5. Proteous vulgaris (+), P. inconstans (+) de otras especies de Proteus (-)

6. Pasteurella dagmatis (+), P. dagmatis sbesp. Septica (V+) Pasteurella multocida (+), P. multocida subesp. gallicida (+) y P. multocida subesp. multocida (+), P. pneumotropica (+) de P. haemolytica (-) y de Actinobacillus ureae (-)

7. Paenibacillus alvei (+) de las especies aisladas con mayor frecuencia P. macerans (-) y P. polymgxa (-).

8. Peptostreptococcus asaccharolyticus (+) y P. indolicus (+) de otras especies de Peptostreptococcus (-) que pueden causar infecciones humanas.

9. Propionibacterium acnes (+) de las especies de Propionibacterium (-) aisladas con mayor frecuencia.

10.Prueba de indol en mancha

11.Junto con otras pruebas (ureasa y ornitina) subdivide Haemophilus influenzae a Haemophilus parainfluenzae en biotipos.

12.Junto con la sialidasa, alfa- y beta-glucosidasas y alfa-fructosidasa, diferencia entre los aerobios con pigmento negro.

FUNDAMENTO

El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indólicos principales: escatol (metil indol) y ácido indolacético (IAA, indolacetato). Las diversas enzimas intracelulares involucradas se denominan colectivamente “triptofanasa”.

La triptofanasa cataliza la reacción de desaminación atacando la molécula de triptófano sólo en su cadena lateral y dejando el anillo aromático intacto como indo.

La desaminación y la hidrólisis tienen lugar con el agregado de una molécula de agua en presencia de la triptofanasa y de la conenzima fosfato de piridoxal.

II. PRUEBA DE ROJO DE METILO

PRINCIPIO.

Probar la capacidad de un microorganismo para producir y mantener estables los productos finales ácidos a partir de la fermentación de la glucosa y para vencer la capacidad buffer del sistema.

Ésta prueba cuantitativa para la producción de ácido (determinación de pH); algunos microorganismos producen más ácidos que otros.

Los resultados de rojo de metilo son características valiosas para la identificación de especies de bacterias que producen ácidos fuertes a partir de glucosa.

OBJETIVO.

Ayudan a la diferenciación entre géneros o la diferenciación de especies dentro de un género de la familia Enterobacteriaceae.

1. Escherichia coli (MR+) de Enterobacter aerogenes (MR-) y Enterobacter cloacae (MR-).

2. Especies de Yersinia (V, variable, por lo común +) de otros bacilos gramnegativos no entéricos (MR-).

3. Diferenciar Edwardsiella ictaluri (MR-) de E. hoshinae (MR+) y E. tarda del biogrupo 1 (MR+)

4. Diferenciar Leminorella richardii (MR-) de L. grimontii (MR+).

5. Diferenciar Klebsiella oxytoca y K. pneumoniae subesp. Pneumoniae (ambas V, por lo común MR-) y K. terrigena (V) de otras especies o subespecies de Klebsiella. (MR+)

Budvicia aquatica (MR+) de otros miembros de familia Enterobacteriaceae con resultados KIA/TSI Ácido/Ácido, HS2.

Otros microorganismos que son rojo de metilo positivos.

Aerococcus urinae

Todas las especies Shigella

Ewingella americana

Especies Kluyvera

Lecrercia adecarboxylata

Especies Citrobacter, Buttiauxella agrestis

Las pruebas de rojo de metilo y Voges-Proskauer identifican:

o Aeromonas hydrophila

o Aeromonas salmonicida

subesp.masoucida

o Aeromonas veronni

o Especies de Listeria

o Vibrio metschnikovii

FUNDAMENTO.

La prueba de rojo de metilo (MR) es una prueba cuantitativa basada en el uso de un indicado de pH, el rojo de metilo, para determinar la concentración del ion Hidrógeno, cuando un microorganismo fermenta glucosa. La concentración del ion Hidrógeno depende de la relación de gases (CO2 y H2), lo que a su vez es un índice de las diferentes vías metabólicas de la glucosa exhibidas por los diversos microorganismos. Los diferentes patrones de fermentación se deben a las variaciones en las enzimas relacionadas con el metabolismo del ácido piruvico en el organismo.

Reacción global del metabolismo de:

E.coli

2Glucosa + H2O 2 Ácido láctico + ácido acético + etanol + 2 CO2 + 2 H2

(Ácido fórmico H2 + CO2)

Klebsiella-Enterobacter

Glucosa + ½ O 2,3-butanodiol + H2O + 2 CO2

(Acetoìna 2,3-butanodiol)

La validez de la prueba de RM depende de un tiempo de incubación suficiente como para permitir que se produzca la diferencia en el metabolismo de

la glucosa. Los organismos en estudio se incubarán por lo menos 2 días a 35-37°C, lo que permite que todos los organismos con baja proporción gaseosa(MR+) muestren su limite en la concentración de iones H limitante, mientras que todos los que tienen relaciones altas de gas (MR-) mostraran una concentración del ion H más baja.

MEDIO DE CULTIVO UTILIZADO.

Medio de Clark y Lubs

Fórmula

Polipeptona o peptona de carne tamponada

O digerido pancreático de caseína

Y digerido péptico de tejidos animales

Glucosa (dextrosa)

Buffer fosfato dipotásico (K2HPO4)

Agua desionizada

MÈTODO DE PREPARACIÒN.

1) Pesar la cantidad exacta como indica el rótulo. Los productos de las diferentes compañías pueden presentar leves variaciones.2) Rehidratar con agua destilada o desmineralizada.3) Calentar con suavidad la solución.4) Fraccionar alrededor de 5ml por tubo(26x125mm)

Método de esterilización: autoclave, 121°C, 15lb, 15min.

Enfriar antes de usar y refrigerar para la conservación (4-10°C); vencimiento, a las 6-8 semanas.

Inoculación.

Incubación.

• MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD

A. MR-positivo (+)/VP negativo(-): Escherichia coli ATCC 25922

B. MR-negativo (-)/VP positivo(+): Enterobacter aerogenes ATCC 13048

III. PRUEBA DE VOGES- PROSKAUER

La prueba de Voges-Proskauer (VP) se basa en la detección de acetoína, un producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. La glucosa es metabolizada a ácido pirúvico, las bacterias pueden seguir muchos caminos metabólicos; la producción de acetoína es una de las vías metabólicas de la degradación de la glucosa en las bacterias. La prueba de Voges-Proskauer para la acetoína se utiliza sobre todo para separa Escherichia coli de los grupos KlebsiellaEnterobacter,aunque otros miembros de la familia Enterobacteriaceae pueden producir un resultado positivo de VP.

En esta prueba se determina la vía de fermentación del butanodiol descrita anteriormente en la prueba rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol o acetoína es un

producto intermediario en la producción de butanodiol esta se forma por la descarboxilación de dos moléculas de ácido purúvico, tanto la acetoína como el 2,3-butanodiol son productos neutros en la fermentación de la glucosa. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo este se revela en presencia de α-naftol dando un color rojo-fucsia.

Reactivos empleados:

Reactivos VP de Barrit

Añadir 0.6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio.

Reactivos VP de Coblentz

Añadir 0.2ml de alfa naftolal 5% en etanol al 95%, creatina al 0.3% en KOH al 40%.

VP positivo (+) color rosado-rojo en la superficie del medio (acetoína presente)

Enterobacter cloacae ATCC 13047

VP negativo (-) color amarillo en la superficie del medio, puede formarse un color cobrizo pero es un resultado negativo.

Escherichia coli ATCC 11775

CONCLUSIÓN

Las pruebas IMViC son suma importancia dentro de la búsqueda de un agente patógeno causal, es decir

y comparten una característica importante, éstas identifican enterobacterias en su mayoría. De acuerdo a sus vías metabólicas, las cuales pueden ser aerobias o anaerobias.

Cada una denota su fundamento.

La prueba de Indol

Degradación de Triptófano con producción de Indol.

Rojo de Metilo.

Acidificación del medio.

Voges Proskauer

Fermentación butanodiólica con formación de un metabolito intermediario neutro.

Citrato

Como única fuente de carbono

BIBLIOGRAFÍA