Química Biológica

Seminario Espectrofotometría

Algunos conceptos previos ….

• Una radiación electromagnética tiene una naturaleza dual

Las moléculas tienen un estado energético que puede ser alterado por una radiación electromagnética

Cada molécula tiene estados excitados que la distingue del resto de moléculas

Espectrofotometría

Es un conjunto de técnicas analíticas cuali y cuantitativas

Se basa en la interacción de las moléculas y las

radiaciones electromagnéticas.

La cantidad de luz absorbida por una sustancia a distintas es como una huella digital y se llama espectro de absorción

Espectrofotometría

Cualitativa Cuantitativa

Espectro de absorción

La cantidad de radiación absorbida depende de la concentración

Espectro de Absorción

Absorbancia

Longitud de onda (nm)

A A

B

Transmitancia y absorbancia

Io = Ia + It

Puedo cuantificar la luz transmitida (transmitancia) o la absorbida (absorbancia)

Transmitancia y absorbancia

T = ( It / Io) x 100 Transmitancia

A= - Log T

Absorbancia A= log ( 100 / %T)

…. empleamos la absorbancia

AbsorbanciaLey de Lambert y Beer

• A= abc• A: absorbancia• a: absortividad específica de cada soluto• b: distancia recorrida por el haz de luz en cm• c: concentración de la solución

• A= abc

Conc. Prob = (A Prob/A Patrón)(Conc. Patrón)

Espectrofotómetro

Parte práctica

Objetivos:• Aprender el uso del espectrofotómetro.

• Realizar espectro de absorción de sustancias puras: soluciones de azul de metileno.

• Realizar una curva de calibración para determinar la concentración de una muestra problema de azul de metileno

Pasos para determinar la concentración de una muestra problema

Calibración del equipo

Espectro de absorción

No cumple con la ley de LB

Curva de calibración

Calibración del espectrofotómetro

• Prender el equipo y esperar 15 minutos para que los circuitos alcancen temperatura.

• Elegir la longitud de onda deseada con el selector.

• Verificar 0% de T. Se realiza en modo transmitancia y colocando un cuerpo negro

Espectro de absorción de solución de azul de metileno

Se emplea para identificar una sustancia y para

determinar la a la cual la absorbancia es máxima

• Utilizar la solución de 5mg/l.

• Llevar a cero de absorbancia con agua destilada.

• Medir las absorbancias a distintas

Espectro de Absorción

Absorbancia

Longitud de onda (nm)

A

25 mM

5 mM

Max

Curva de calibracionCurva de calibración

• A partir de la solución patrón de 5 mg/l realizar cinco diluciones: 1/2; 1/4; 1/5; 1/6; 1/8; 1/10; 1/15.

• Medir sus absorbancias y la de la muestra problema a la longitud de onda seleccionada

• Graficar absorbancia versus concentración.

• Determinar con la gráfica anterior la concentración de la muestra problema.

Curva de calibración