Dra. Haydelba D’ Armas, PhD

Mayo de 2014

CROMATOGRAFÍA

2

TECNICAS SEPARATIVAS

Clasificación:

Precipitación.

líquido - líquido

Extracción

en fase sólida

Destilación

Cromatografía

3

CROMATOGRAFÍA

Definición:

“Es una técnica capaz de separar compuestos enbase a diferencias de su afinidad por una faseestacionaria y una móvil”.

Sistema Cromatográfico:

Fase Móvil

Fase Estacionaria

Soluto

4

Proceso físico - químico que rige la separación:

• Adsorción:El soluto se adsorbe en la superficie de las partículassólidas de la fase estacionaria. Es un fenómenosuperficial, aumentado con la formación de puentesde hidrógeno

• Partición o Reparto:

El soluto se equilibra entre el líquido de la faseestacionaria y la fase móvil, por diferencia desolubilidad. Hasta llegar a un equilibrio

Proceso Cromatográfico (1)

5

• Intercambio Iónico:

Los aniones o cationes se separan en base a unacolumna rellena con un intercambiador de iones (resina)

• Exclusión Molecular, Filtración o Permeación en Gel:

No existen interacciones entre la fase estacionariay el soluto. Se separa por tamaño de partícula

Proceso Cromatográfico (2)

6

Fase

estacionaria

Fase

móvil

Proceso

cromatográfico

Capa fina

Columna

Adsorción

I. Iónico

Exc. Molecular

AdsorciónColumna

Papel

Capa fina

Columna

Partición

ParticiónColumna

Líquida

Líquida

Líquida

Sólida

Gas

Gas

Técnica

cromatográfica

7

1. Fundamentos

Fig.1

Tswett (1872-1919)

Fase

móvil

Fase

estacionaria

Pigmentos

vegetales

Chroma: color

Graphein: escribir CROMATOGRAFÍA

1903: usó columnas de adsorción para separar

pigmentos vegetales

8

Según la disposición de la fase estacionaria:

•Cromatografía plana:Cromatografía en capa finaCromatografía en papel

•Cromatografía en columna:Cromatografía de líquidos Cromatografía de gasesCromatografía de fluidos supercríticos

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Fase estacionaria

Papel Cromatografía en papel

Adsorbente sobre soporte Cromatografía

en capa finaGel de sílice, poliamida….

Lámina de vidrio, de plástico o

metálica

CROMATOGRAFÍA PLANA

METODOLOGÍA DE TRABAJO

12 3 4

5

Papel

Tapadera

Fase

móvil

11

Cromatografía en capa fina (CCF)

CCF en solventes de distintas polaridades

12

14

La fase móvil se mueve por capilaridad, gravedado bajo la acción de un campo eléctrico (electro-cromatografía)

x

b

a Rf

ab

a - distancia recorrida por el analito.

b - distancia recorrida por el frente

•La cromatografía en capa fina es una técnica paradeterminar el número de componentes de unamezcla y como una prueba preliminar para realizaruna cromatografía en columna, entre otros•El proceso de cromatografía en columna secontrola por cromatografía en capa fina, de talmanera que se puede separar cada componente dela mezcla•La cromatografía en columna se usa para separargrandes cantidades de material: >100 mg. Elproceso de cromatografía consta de una fase móvil(eluyente) y una fase estacionaria (adsorbente), loscuales dependen de las sustancias

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Fase Móvil

-COOH-OH-NH2

-SH-CHO- CO-COOR-OCH3

Hidrocarburos No SaturadosHidrocarburos Saturados

Ácidos carboxílicosAlcoholesAminasTiolesAldehidosCetonasEsteresÉteres

Alta

Baja

Polaridad

17

H2SO4

I2

Lámpara ultravioletaNo Destructivo

Destructivo

Técnica de Revelado: bañado o pulverizaciónClasificación de reveladores.

H2SO4 (o con molibdato de amonio o vainilina)

Lámpara ultravioleta

I2

Ftalato de anilina (azúcares)

Ninhidrina (Amino-ácidos) Resorcina (Cetosas)Difenilamina + UV 254 (I. Clorados)

Generales

Selectivo

Específico

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

LECHO CROMATOGRÁFICOf. estacionaria

EMPAQUETADO

COLUMNA

COLUMNA

llave

MUESTRA

APLICACIÓN

MUESTRA

RESERVORIOf. móvil

ELUCIÓN Y RECOGIDA DE FRACCIONES

FLUJOgravedad

DIFUSIÓN

SEPARACIÓN O FRACCIONAMIENTO

Fase

estacionaria

Fase

móvil

Muestra

(A+B)

A

B

A B

B

B

Según el tipo de fase móvil:

•Cromatografía de líquidos (LC)

•Cromatografía de gases (GC)

•Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC)

En columna o en superficie plana

En columna

Método Técnica Fase estacionaria Tipo de equilibrio

LC Reparto Líquido adsorbido sobre un

sólido

Distribución entre líquidos

inmiscibles

Adsorción Sólido Adsorción

Intercambio

iónico

Resina de Intercambio Iónico Intercambio iónico

Exclusión por

tamaños

Líquido en intersticios de un

sólido polimérico

Distribución/Exclusión

GC Gas-líquido Líquido adsorbido sobre un

sólido

Distribución entre gas y

líquido

Gas-sólido Sólido Adsorción

SFC Especies orgánicas enlazadas a

superficie sólida

Distribución entre fluido

supercrítico y superficie

enlazada

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN COLUMNA

El proceso cromatográfico

Detector ● ● ● ●

Faseestacionaria

Fasemóvil

Muestra(A+B)

●

A

B

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6

●●

Señ

al a

nal

ític

a

Tiempo, min t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6

A B

B

B

AB

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Parámetros fundamentales

Res

pu

esta

del

det

ecto

r

TiempoInyección

CH4 Octano Noidentificado

Nonano

tr´ = tr - tm

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tr =tiempo de retención o el que transcurre desde el momentode la inyección de la muestra hasta la aparición de la máximaconcentración del compuesto eluido en el detector

tm= tiempo muerto o cuando un compuesto no sufre ninguna interacción con la faseestacionaria. tr´ = tiempo de retención corregido o la interacción del soluto con la faseestacionaria

Aplicaciones de la cromatografía ANÁLISIS CUALITATIVOSe

ñal

an

alít

ica

Tiempo

CH4 Octano Nonano Decano

Disolución estándar

Señ

al a

nal

ític

a

Tiempo

CH4 Octano ¿Nonano? ¿Decano?

Muestra

La muestra no contienemetano ni octano.Si los contiene será aconcentraciones inferioresa los correspondienteslímites de detección

Identificación positiva: - Comparación de datos de retención- Uso de detectores en línea

26

27

Se

ña

l a

na

lítica

Tiempotrtm

Altura, h

Área

Concentración, ng ml-1

0 5 10 15 20 25 30

Áre

a d

e p

ico, s

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Preparación de disoluciones patrón

Obtención de sus cromatogramas

MÉTODOS DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO CUANTITATIVO

A. Calibración con patrones:

ANÁLISIS CUANTITATIVO •La cromatografía cuantitativa encolumna se basa en lacomparación de la altura, o delárea, del pico del analito con lade uno o más estándares•Equipos modernos: integracióndel área

Método consiste en introducir en cada disolución estándar, así como en lamuestra, una cantidad exactamente medida de una sustancia estándar, a la quese llama patrón interno. La relación entre las áreas (o alturas) del analito y delestándar interno, es el parámetro que representado frente a la concentración deanalito, origina una línea recta, cuya ecuación permite calcular la concentraciónde analito en la muestra.

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Cromatografía de gases

32

Cromatógrafo de Gases

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☯Gas de acarreo

☯Controladores de flujo

☯Inyectores

☯Columnas

☯Detectores

☯Sistema de datos

Principales componentes

Gas de acarreo

Portador o fase móvil, es el que transporta a loscompuestos a través de la columna.

Químicamente inerte, puro (>99%), seco

Se aconseja colocar un filtro de carbón activo y unatrampa para humedad antes de la entrada del gas alinstrumento.

El tipo de gas acarreador depende de la velocidadrequerida para el análisis y el tipo de detector a emplear.

Los más utilizados son helio, nitrógeno, hidrógeno o unamezcla argón con 5 % de metano.

Inyectores

En el puerto de inyección se lleva acabo la introducción de la muestra

☛Es donde ocurre la separación y es el “corazón” de uncromatógrafo.

☛Columnas empacadas de: cobre, aluminio, acero inoxidable,vidrio ó teflón.

☛Columnas capilares de sílice fundida recubiertas conpoliimida.

☛El empaque puede ser un sólido, un líquido o un sólidorecubierto por un líquido.

Columnas

Se construyen con tubo de acero inoxidable, niquel o vidrio.

Los diámetros interiores van de 1,6 a 9 mm.

La longitud suele ser inferior a los 3 m.

Se rellenan de un material adsorbente adecuado a las sustancias

que se quiere separar.

Columnas cromatográficas empacadas

Se construyen con sílice fundida.

Los diámetros interiores suelen ser de 200-250

mm.

La longitud suele ser superior a los 20 m.

Hay dos tipos:

Empacadas con partículas sólidas ocupando el total del

diámetro de la columna (micro-empacadas)

Tubulares abiertas, con trayectoria para el flujo abierta y sin

restricción por el centro de la columna

Columnas cromatográficas capilares

Ejemplos de fases estacionarias en

cromatografía de gases

Separaciones por punto de ebullición de compuestos

en un intervalo amplio de masas moleculares:

Escualano

Polidimetilsiloxano

Para hidrocarburos insaturados y otros compuestos

polidifenildimetilsiloxano

policarboranometilcianoetilsilicón

Para compuestos nitrogenados

poliamida

policianoetilmetilsilicon

Para alcoholes, ésteres, cetonas y acetatos

polietilenglicol

pentaeritritol tetracianoetilado

• Las columnas cromatográficas se enrollan, se sujetan en unsoporte y se introducen en el interior de un horno

• El horno debe poderse calentar y enfriar rápidamente

• La temperatura se debe poder programar para poder trabajar enrégimen de gradiente

• Muchas aplicaciones y métodos cromatográficos requierencomenzar a temperaturas por debajo de la ambiental

HORNO

Detector de Ionización a la Llama (FID)

Consiste de una llama dehidrógeno-aire y una placacolectora. El efluente de lacolumna pasa a través de la llama,que ioniza las moléculasorgánicas.

Los iones se recogen en unelectrodo de polarizaciónnegativa y producen una señaleléctrica.

El FID es extremadamentesensible y es el detector másampliamente utilizado, sudesventaja es que destruye lamuestra.

Detector de Espectrometríade Masas, MSD

*El espectrómetro de masasusa la relación masa-carga(m/z) de moléculas ionizadas.

*Es una técnica muy poderosaque permite cuantificar,identificar y da informaciónacerca de la estructura decompuestos desconocidos.

*La operación general del espectrómetro de masas es:

a) crea iones en fase gaseosa

b) separa los iones en base a su relación (m/z).

c) mide la cantidad de iones de cada relación (m/z).

Detector-analizador de masas

Una vez ionizadas las moléculas, estas pasan al analizador de iones el

cual los transporta hacia el detector: Existen diferentes tipos de

analizadores los que son utilizados de acuerdo a las necesidades.

Dentro de los analizadores podemos citar, la trampa de iones, el

sector magnético, el tiempo de vuelo, el cuadrupolo, etc.

El cuadrupolo consiste de cuatro cilindros metálicos paralelos, endonde dos de ellos tienen un potencial (U + Vcos(wt)) y los otros dos–(U + Vcos(wt)), lo que le da un rango de frecuencia, los iones concierta relación (m/z), pasan a través del cuadrupolo, los que no soneliminados. En este sistema se necesita un alto vacío, para eltransporte de los iones a través del analizador (10-9 torr).

La cromatografía es un método, usado

primariamente para la separación de los

componentes de una muestra, en la cual los

componentes se distribuyen en dos fases.

El HPLC (High Performance Liquid

Chromatography) o CLAR (Cromatografía

Líquida de Alta Resolución) es el método más

moderno para realización de cromatografías.

Si es un gas: Modalidad cromatográfica gaseosa.

Si es un líquido: Cromatografía líquida.

•Cromatografía en capa delgada

•Cromatografía líquida en columna abierta

•HPLC

Diferencias. Fase Móvil

Sistema HPLC

HPLC SolventReservoirs

RheodyneInjector

HPLCColumn

9010 SolventDelivery System

9050 VariableUV/Vis Detector

9060 Polychrom(Diode Array) Detector Computer

Workstation

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CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (PARTES DE UN HPLC)

Desgasificador

de disolventes

Abastecimiento

de disolvente

Filtro

Bomba de alta presión

Válvula de seguridad y purga

Columna analítica

Espacio térmico

Lectura

Amplificador

Recoleccióno descarga

Descarga

Gases disueltos

Jeringa o válvula para la muestra

Introducción de la muestraPreco-

lumna

Medidorde presión

%A %B %C Flow Rate Pressure{H2O} {MeOH} (mL/min) (atmos.)

Varian 9010 Solvent Delivery System

throughpulse

dampener

Rheodyne

Injector

Co

lum

n

Ternary Pumpfrom solvent

reservoirto

detector

through pump

to column

to injector

Varian 9060Polychrom Detector

UV Spectrum

ChromatogramReset

Ready

UV Spectrum{shows full UV abs.}

Chromatogram{shows peaks, Rt}

AB

S.

Time

AB

S.

Wavelength

UVmaxUVmax

Rt Rt

HPLC Chromatograms

Rt = 3.0 min.faster movingless retained

Rt = 5.2 min.slower movingmore retained

0 1 2 3 4 5 6 7

Time (minutes)

Ab

sorb

ance

Approximationof peak area by

triangulation

Area =base x height

2

base

height

Peak A Peak B

Chromatography Stationary Phases

relatively polar surface

O O O

| | |

OSiOSiOSiOH

| | |

O O O

| | |

OSiOSiOSiOH

| | |

O O O

bulk (SiO2)x surface

relatively nonpolar surface

Silica Gel

O O O

| | |

OSiOSiOSiOR

| | |

O O O

| | |

OSiOSiOSiOR

| | |

O O O

bulk (SiO2)x surface

Derivatized Silica Gel

Where R = C18H37

hydrocarbon chain (octadecylsilyl deriv.

silica or “C18”)

“normal phase” “reversed phase”

Hay dos tipos de fases estacionarias:

Fase Normal: el componente principal de la fase estacionaria esmuy polar(ej. silice) y la fase móvil es poco o medianamentepolar. Bajo estas condiciones los compuestos poco polareseluyen primero

Fase Reversa: La fase estacionaria es poco polar, normalmente silica tratada (siloxano) con R de C8H17 (C-8 o n-octil) a C18H37 carbonos(C-18 o n-octildecil). La fase móvil es polar y en estas condiciones los compuestos menos polares son mas retenidos, eluyendo primero los más polares junto con la fase móvil

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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA vs CROMATOGRAFIA DE GASES

Son al día de hoy dos poderosísimas herramientas de análisis

Ambas admiten acoplamiento con otras técnicas de detección

(hibridación de técnicas, por ejemplo con espectrometría de

masas o plasmas..etc)

La cromatografía de gases, requiere muestras gaseosas o

fácilmente volatilizables.

El resto de muestras que no poseen esas características pueden

ser analizadas por HPLC.

Ambas técnicas por su versatilidad, y por las diversas posibilidades

que ofrece la selección de la columna cromatográfica, permiten

abordar análisis de multicomponentes en muestras de diversa

procedencia, con elevada precisión y sensibilidad (dependiendo del

detector).

EJEMPLO CG

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AgradecimientoS

Senescyt (ecuador) a través del proyecto prometeo

Universidad técnica de machala: institución de vinculación