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Estratégias de Optimziación

Adriana Freire Machado MScEspecialista de AplicaçãoEppendorf do Brasil

Realplex

Adriana Freire Machado

Eppendorf do Brasil

Optimización de la Reacción

• Preparo da reacción (pipetas calibradas)

• Cualidad del template (molde)

• Diseño de los primers (dimers)

• Condiciones de termociclagem

• Característica del equipo

• Concentración de los reactivos (MgCl2)

• Tamaño del amplicon

Diseño de primers

• Es la etapa mas importante para establecer una nueva reacción de PCR

• Un buen diseño no es garantía, pero esto aumenta la posibilidad de suceso e de esa forma, ahorra:

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Diseño de primers

• Busque la secuencia de interese http://www.ncbi.nlm.nih.gov

• Tamaño:18 a 30 bases

• Cuantidad GC: 30 a 80%(ideal 40 a 60%)

• Temp. de melting: 60ºC (dos pasos)

• ∆Tm primer forward y reverse primer ≤ 4 °C

• Evitar nt idênticos, especialmente de 3 o mas Gs o Cs en el final 3´

• Tamaño del fragmento: 80 a 150 pb

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Diseño de primers

• Evitar estructuras secundarias

• Evitar dímeros de primers

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Diseño de primers

• Verificar se los primers son únicos y específicos

BLAST

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast

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Diseño de primers

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Diseño de primers

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Diseño de sonda

• Busque una región rica en GC

• Tm sonda 10ºC > Tm primers

• Tm 70ºC la sonda se hibrida inmediatamente antes de la mayor eficiencia de la polimerasa

• GC: 20-80%

• Verificar especificidad

• Nunca puede haber G en el extremo 5’ (quenchernatural)


Diseño de sondas

• Cheque estructura secundaria

• Cheque se existe complementariedad entre primers y

sonda

• A sonda debe estar próxima al primer

• Testar [ ]s: 250 nM, 200 nM,150 nM ,100 nM e 50 nM

• < Ct >Sensibilidad



Otimización de Reacción: desenho de primer y sonda

Pasos de otimización de primer y sonda

Whitehead Institute for Biomedical ResearchCopyright (c) 1996,1997,1998 Whitehead Institutefor Biomedical Research. All rights reserved

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

Verificar la presencia de estructuras secundarias

MFOLD (http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi)

Fragmentos de PCR pequeños=80 a 150pb


Optimización de Reacción: diseño de primer y sonda


Otimización de Reacción: diseño de primer y sonda


Optimización de Reacción: diseño de primer y sonda

Realización de matriz de primers

• Una matriz de primer, que combina las concentraciones comunes del

primer forward y reverse, debe ser hecha

• Para garantir resultados confiables, cada punto debe ser hecho en

triplicata

• Concentraciones típicas de primers: 50 - 900 nM


Optimización de Reacción: concentración de los primers

Realización de matriz de primers

Forward / Reverse

50 nM

100 nM

300 nM

600 nM

900 nM

50 nM

50 / 50

100 / 50

300 / 50

600 / 50

900 / 50

100 nM

50 / 100

100 / 100

300 / 100

600 / 100

900 / 100

300 nM

50 / 300

100 / 300

300 / 300

600 / 300

900 / 300

600 nM

50 / 600

100 / 600

300 / 600

600 / 600

900 / 600

900 nM

50 / 900

100 / 900

300 / 900

600 / 900

900 / 900


Primer Matriz(Optimización)

Cycle

403938373635343332313029282726252423222120191817161514131211109876543210

Flu

ore

sce

nce

(n

orm

)

2100

2000

1900

1800

1700

1600

1500

1400

1300

1200

1100

1000

900

800

700

600

500

400

300

200

100

0

-100

Temperature [°C]

949290888684828078767472706866646260

- dI / d

T (

%)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

-10

mean Ct Primer Combination22.03 600/300

22.08 900/300

22.13 900/90022.14 300/900

22.2 900/60022.27 600/600

22.29 300/300

22.33 600/10022.34 300/600

22.38 900/100

22.42 600/90022.54 300/100

22.83 100/900

23.1 100/30023.16 100/600

23.33 100/100

23.38 900/5023.48 600/50

23.81 300/5024.33 50/300

24.59 100/50

24.8 50/600

24.83 50/10024.84 50/900

25.93 50/50

Analise el valor del Ct

Dímero de primer

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Eppendorf do Brasil

Realplex


Eppendorf do Brasil

Optimización de la Reación: Diseño delprimer

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Eppendorf do Brasil

Optimización de Reación: “annealing” de los primers

Realplex


Eppendorf do Brasil

Función gradiente

Realplex


Eppendorf do Brasil

Función gradiente


Optimización con el Gradiente de temp. en real-time PCR

Multiplex de reaciones de qPCR

• ¿Qué es una reacción multiplex?

• Una reacción de PCR en que dos o mas blancos

son ampliados en el mismo tubo

-2 targets: duplex

-3 targets : triplex

-4 targets : quadriplex

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Multiplex de reações de qPCR

• Ventajas

– resolución de problemas cuando el template es limitado

– economía de tempo

– economía de reactivos

– pode proveer una mayor correlación estatística

• Desventajas

– en general requiere mucho mas tempo para diseño de primers,

optimización y establecimiento de reacción qPCR multiplex

– la economía de dinero pode no ser tan efectiva por la necesidad

de mas optimización

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• Todos los primers y sondas deben ser compatibles con el tamaño, temp. de melting y cuantidad GC

• Todos los primers y sondas no deben tener estructuras complementares

• Todos los primers y sondas deben ser usados en la menor concentración posible para minimizar la formación de productos inespecíficos

• Cada reacción debe ser separadamente optimizada como un singleplex

• Curvas estándar deben ser corridas en singleplex y

multiplex

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Fast PCR em tempo real

• Reações padrão: de 90 a 120 minutos

Importância de uma reação “fast”:

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Mais amostras processadas

Mais pessoas usam o

equipamento


• Ensaios com menos de 40 min fast qPCR

• Fast q PCR otimizado

• Com um sistema bem otimizado, equipamento e reagentes corretos possível reações “very fast” de

até 25 min

Redução do volume de reação

• Se bem otimizada, a reação pode ter seu volume reduzido para alcançar mais rapidamente a

temperatura de reação apropriada

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• Alvo de amplificação=~100pb

• A extensão pode ser reduzida

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real-time PCR efficiency and amplification performance

PCR inhibitors:Hemoglobin, Urea, Heparin

Organic or phenolic compounds

Glycogen, Fats, Ca2+

Tissue matrix effectsLaboratory items, powder, etc.

RNA / DNA

degradation

PCR reaction

components

DNA

concentration

tissue

degradation

PCR enhancers:DMSO, Glycerol, BSA

Formamide, PEG, TMANO, TMAC etc.

Special commercial enhancers:Gene 32 protein, Perfect-Match, Taq-

Extender, AccuPrime, E. Coli ss DNA binding

unspecific

PCR productsDNA dyes

lab management

hardware:PCR platform & cups

cycle conditions

Cuantificación y análisis de la muestra –

Biofotómetro plus- a partir de 0,7ul de muestra

Cálculo Automático después de la medición (ej. dsDNA):

Diluciónde la

muestra

Conc. De la muestra

Razón de pureza

Todos los resultados de laslongitudes de onda importantesque indican calidad de la muestra

Tipo de muestra

Sin computadoraSin diluir la muestra

32

Photometría consejos & trucos

• A260 > 0.1: menores valores flotarán fuertemente y

llevan a altos errores de medida

• A260/280 > 1.8: valores abajo indican contaminación por proteína o fenol

• A260/230 > 1.8: valores abajo indican carbohidratos, peptídio, fenol o componentes aromáticoscontaminantes

• A340 ~0,0 =fuera indica presencia de material particulado

33

Photometria consejos & trucos

• pH 7 - 8.5: Comportamiento da absorción de AN depende de

pH & fuerza iónica. En bajo contenido de sal el pH debe ser 7-8.5 (TRIS). La agua lleva a resultados falsos

• Blank: use lo mismo buffer para blank & muestras para

medidas precisas

• Clear sample: burbujas de aire o partículas interfieren

fuertemente en la medida

3403.08.2010

Rafal GrzeskowiakEppendorf AG

Photometría consejos & trucos

• Mezcle: Diferencias en la concentración llevan a medidas

inestables y falsas!

Frecuentemente sub-estimado!

30 sec in separate tube

MixMate: 2D Mix control







RNA / DNA

degradation

PCR reaction

components

DNA

concentration

tissue

degradation





unspecific


lab management


cycle conditions


Principio del equipo

Fuente de luz de ExcitaciónLED

Laser

Lâmpada de Tungstênio

Filter

DetectorCCD

Fotodiiodo

Fotomultiplicador

TermocicladorPeltier

Air

Módulo Óptico

Realplex

Mastercycler ep realplex

Cual es la fuente de excitación del Mastercycler ep

realplex?

El Mastercycler ep realplex usa una matriz de 96 LEDs

longitud onda de excitación de 470 nm.

Real time PCR-fuente de excitación

Leds (Light-Emitting

Diiodes)

lámpara LASER

Media de vida 40.000 horas 2.000 a

3.000 horas

5.000 a 50.000

horas

Necesidad de enfriamiento

no sí si

“efecto borda” no sí no

Pierda de 0,0007% de intensidadDespués 50 corridas por semana cada

reacción con multiplex de 4 alvos durante 50 semanas

Pierda de 5% de intensidad después 7200 anos


Función gradiente

RealplexAdriana Freire Machado

Mastercycler ep realplex - Performance

• Fast real-time PCR: Velocidad y Precisión

SR

Y T

aqM

an A

ssa

y

Runtime: 72 min Runtime: 42 min 02 sec

Runtime: 35 min 37 sec Runtime: 23 min 34 sec

Standard ABI like 2-step profile realplex standard 2-step profile

realplex very fast 2-step profilerealplex fast 2-step profile

St.dev.: 0.05 St.dev.: 0.07

St.dev.: 0.08St.dev.: 0.09

Realplex

Mastercycler ep realplex - Desempeño

• Sensibilidad: Detección de Molécula Simple

SRY TaqMan Assay, 1 copy human gDNA

Ø Ct: 37.03

Características Realplex

• Excitación por 96 LEDs

• Tecnología gradiente

• Abierto para consumíbles y reactivos

• Bloque rápido: plata 6°C/s calentamiento y 4,5°C/s enfriamiento. No necesita de reactivos o placas “fast”. El bloque que es rápido. Reacciones en 30min.

• Uso como uno termociclador convencional

• Garantía de 2 años y accesoria científica








RNA / DNA

degradation

PCR reaction

components

DNA

concentration

tissue

degradation





unspecific


lab management


cycle conditions

Real-time PCR Tube Strips y Twin.tec real-time PCR


Twin.tec real-time PCR plate


Aumento del señal: 10x mas fuerte

Sellador térmico y film adhesivo

Heat Sealer ®

• Selado térmico y hermético de placas

• Protección ideal para la PCR contra la

evaporación, evita la contaminación cruzada

Film adhesivo Mastercycler real-time PCR ®

• está destinado a sellar placas de PCR y

tempo real tanto por fricción como por la presión ejercida por la tapa calentada

del termociclador


Precisión en pipeteo


Efectos del pipeteo manual

Manual Reação Setup - Comparación

Cyc le

302826242220181614121086420

Flu

ore

scen

ce (

norm

)

2700

2600

2500

2400

2300

2200

2100

2000

1900

1800

1700

1600

1500

1400

1300

1200

1100

1000

900

800

700

600

500

400

300

200

100

0

-100

Cycle

32313029282726252423222120191817161514131211109876543210

Flu

ore

sce

nce (

norm

)

2800

2600

2400

2200

2000

1800

1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

Cy c le

3 53 43 3323 13 0292 82 72 62 5242 32 22 12 0191 81 7161 51 41 31 2111 09876543210

Flu

ore

sce

nce

(n

orm

)

2 20 0

2 10 0

2 00 0

1 90 0

1 80 0

1 70 0

1 60 0

1 50 0

1 40 0

1 30 0

1 20 0

1 10 0

1 00 0

9 00

8 00

7 00

6 00

5 00

4 00

3 00

2 00

1 00

0

-10 0

-20 0

• mismo ensayo, tres individuos diferentes, mismas pipetas y

reactivos.



Solución: epT.I.P.S. LoRetention

Efecto Perla!

Líquido residual cuando pipeteadas

soluciones con detergentes:

Razonable pérdida de muestra con puntas comunes

Máxima recuperación de muestras con epT.I.P.S. LoRetention

2

1

1 2

Solución-Pipeta electrónica

Solución: Preparo de la reacción

Alta sensibilidad:

Reaciones con 10 µl y 5 µl

Alta precisión y reproducibilidad:

+

Grand ahorro de reactivos sien perder calidad



Preparo Manual vs. epMotion

epMotion 5070

Técnico treinado

Mayor reprodutibilidad y precisión

SD 0.1 Ct

SD 0.4 Ct

Lambda DNA & SYBR Green (10µl total vol.)

Redución del volumen


epMotion - Economía de reactivo de qPCR

Custo médio de ensaios de qPCR

www.save-reagents.com

Reduciendo el volumen de qPCR de 25 µl para 5 µl en 100 reacciones/dia economiza ~ € 24.000 por ano (TaqMan)

Contato Eppendorf


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Tel.:11-3095.9344

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Referências

BLAST•http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiPrimer 3•http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi

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