RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS

VIABLES

1. INTRODUCCIÓN:

La mayoría de los alimentos industrializados (excepto, por ejemplo, los

productos fermentados) deben ser considerados como inadecuados

para el consumo cuando contienen un gran número de microorganismo

aun cuando las características del mismo no hayan sido alteradas

Recuentos altos indican que: Las materias primas contaminadas,

tratamientos sanitarios no satisfactorios. En productos perecederos

pueden indicar también condiciones inadecuadas de

tiempo/temperatura.

La presencia de un número elevado de bacterias aerobias Mesófilos que

crecen bien a temperatura corporal o próximo a ella, pueden haberse

desarrollado microorganismos patógenos de origen humano o animal.

Algunas cepas bacterianas no consideradas como agentes de

enfermedades transmitidas por alimento pueden causar enfermedad a

un elevado número de células viables en los alimentos. Todas las

bacterias patógenas presentes en los alimentos son mesófilas y en

algunos casos contribuyen con su presencia a los recuentos en placas.

Cuando el alimento contiene 106 microorganismos por gramo sus

características organolépticas se ven alteradas, algunos ya son

inaceptables con 107 bacterias por gramo. En productos fermentados

(queso, embutidos, etc.) alcanzan niveles de 109/gramo, en contraste los

no fermentados ya tendrían una alteración muy avanzada. Las bacterias

mesófilas (las que crecen en placa de agar a 30-37°C) se consideran

como organismos indicadores aunque representan una medida mucho

menos precisa y fiable del peligro de intoxicación alimentaria que otros

indicadores. Los recuentos elevados de bacterias mesófilas en

productos crudos o no tratados, a menudo están constituidos por la

microflora normal o quizás indican una alteración insipiente del alimento

y no un peligro potencial para la salud del consumidor.

Es preciso advertir que el recuento de la flora aerobia mesófila tiene un

valor limitado en algunos casos:

En determinados tipos de alimentos (embutidos fermentados, col

ácida, queso y otros derivados lácteos) es natural y deseable una

gran multiplicación bacteriana, con una fermentación o

maduración paralela del alimento. En estos productos, un

recuento elevado carece prácticamente de significado, ya que los

microorganismos impropios no pueden diferenciarse

generalmente de la microflora propia o normal.

En los alimentos tratados por el calor, la población de

microorganismos viables suele ser muy baja, aunque un examen

microscópico de estos productos puede a veces poner de

manifiesto la presencia de microorganismos muertos, cuyo

número indica que la materia prima estaba muy contaminada.

Del mismo modo, en los alimentos deshidratados y en los

congelados, siempre se obtienen recuentos de bacterias viables

más bajos. Así, un recuento en placa puede no reflejar la calidad

bacteriológica de la materia prima antes de los procesos o

tratamientos correspondientes, y por ello, es necesario llevar a

cabo un examen microscópico directo para comprobar si,

efectivamente, en un principio existían o no abundantes

gérmenes.

Los recuentos de bacterias mesófilas son de escaso valor a la

hora de predecir la vida útil de un alimento conservado en

refrigeración, ya que muchos microorganismos mesófilos no

crecen a temperaturas por debajo de los 5ºC. Para esta finalidad

es preferible el recuento de bacterias viables psicrotróficas con

temperaturas de incubación entre 0 y 5 ºC durante 10 días.

El recuento en placa es el método más utilizado para la determinación

del número de células viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.)

en un alimento. Los recuentos totales deben hacerse en función de uno

de los siguientes factores:

Método de muestreo utilizado.

Distribución de los microorganismos en la muestra.

Naturaleza de la microflora del alimento.

Naturaleza del alimento.

Antecedentes del alimento.

Adecuación nutricional del medio de cultivo.

Temperatura y medio de incubación.

pH, aw, potencial de oxidación reducción del medio.

Tipo de diluyente utilizado.

Número relativo de microorganismos en la muestra.

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de

colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una

cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones

ambientales determinadas.

Estos recuentos no pueden considerarse como recuentos totales ya que

solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de

crecer en las condiciones establecidas.

Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la

temperatura, la atmósfera, la composición del medio y el tiempo de

incubación.

En función de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos:

Los que crecen bien a 7º C o por debajo de esta temperatura

cuya temperatura: psicrótofos.

Los que crecen entre 20 – 30º C, con una temperatura óptima de

crecimiento está entre 30 – 40º C: mesófilos.

Los que crecen por encima de los 45º C: termófilos

Recuento de aerobios mesófilos:

En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras

capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En

este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de

microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las

condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia

prima. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura

la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un

recuento elevado no significa presencia de flora patógena.

2. OBJETIVOS:

Determinar el número de Microorganismos aerobios mesófilos

viables por el método de recuento convencional en placa según la

ICMSF, presentes en una muestra de refresco.

3. METODOLOGÍA:

3.1. Método 1: Recuento Estándar en Placa, Recuento en Placa

por Siembra en todo el Medio o Recuento en Placa de

Microorganismos Aerobios.

Hartman y Huntsberger, 1961; Angelotti, 1964.

3.1.1. Materiales y Aparatos:

Agua peptonada para disolución (Straka y Stokes, 1957):

Disolver 1 g de peptona en 1 litro de agua destilada y

ajustar a pH 7, distribuir en frascos de diluciones o en

tubos de volúmenes predeterminados, autoclavar (121

°C durante 15 min.).

Placas Petri de vidrio (100 x 15).

Pipetas bacteriológicas de 1, 5 y 10 ml.

Estufa.

Estufa de incubación.

Contador de colonias (modelo Quebec de campo oscuro

o equivalente).

Agar para recuento en placa

Formula:

Triptona 5 g

Glucosa 1 g

Extracto de levadura 2,5 g

Agar 15 g

Añadir los ingredientes en 1 litro de agua destilada,

calentar en ebullición agitando hasta obtener la completa

dilución, dejar enfriar a 45-60 °C, autoclavar a 121 °C

por 15 min. Este medio existe en el mercado en forma

deshidratada, reconstituido en la forma indicada en el

envase.

3.1.2. Técnica:

Preparar la muestra del alimento por los métodos de

dilución, agua peptonada.

Aproximadamente se añadirá en un matraz de 500 ml

225 ml de agua peptonada estéril, posteriormente

aforar con 25 ml de la muestra, homogenizar.

Pipetear por duplicado, en placas Petri, alícuotas de 1

ml de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3; lo que supone la

siembra por placa de 10-1 a 10-3 g de alimento.

Fundir el agar para el recuento, templar el medio a 44-

46 °C y controlar cuidadosamente su temperatura para

que al mezclarlo con la dilución del alimento no sean

inactivados lo gérmenes. Verter a las palcas Petri.

Acto seguido, mezclar el inoculo con el medio fundido,

inclinando y girando las placas.

Una vez solidificado el agar, invertir las placas e

incubarlas a 29-31 °C durante 48 horas.

Calcular el recuento estándar en placa o el recuento

estándar en placa estimado.

3.2. Método 2: Recuento en Placa de Siembra por Extensión en

Superficie.

Reed y Reed, 1948; J.J.R. Campbell y Konowalchuk, 1948; Gaud

y col., 1963; D.S. Clark Clark, 1967.

3.2.1. Materiales y Aparatos:

Agua peptonada para dilución.

Agar para recuento en placa.

Placas Petri de vidrio (100 x 15).

Pipetas bacteriológicas de 1, 5 y 10 ml.

Asas de Digralsky.

Estufa.

Estufa de incubación.

Contador de colonias (modelo Quebec de campo

oscuro o equivalente).

3.2.2. Técnica:

Fundir el Agar para Recuento en Placa (45-60°C), y

añadir a cada placa Petri 15 ml del medio (2 placas

por dilución).

Preparación de la muestra y diluciones (se usarán

diluciones más altas si se sospecha que la muestra

está muy contaminada).

Tomar dos alícuotas de 0.1 ml de cada dilución y

depositarla en la superficie del medio contenido en

dos placas Petri.

Extender las alícuotas con ayuda del asa de

Drigalsky

Incubar las placas Petri invertidas durante 3 días a

29-31°C.

Realizar el conteo de colonias escogiendo dos

placas, correspondientes a una dilución.

Proceder a calcular el recuento estándar en placa.

4. CÁLCULOS:

4.1. Cálculo del Recuento Estándar en Placa:

Si las placas escogidas de cierta dilución tienen 30 y 300

colonias.

Se cuentan todas las colonias de cada placa.

Se halla la media aritmética de los dos valores y

multiplicarla por el factor de dilución (inversa de la

dilución).

Dar el valor obtenido como el recuento estándar en

placa.

Si una de las placas de la dilución escogida presenta algo

menos de 30 colonias o algo más de 300.

Contar todas las colonias y proceder como en el caso

anterior.

Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan

entre 30 y 300 colonias.

Deben hallarse el recuento en placa de todas las

colonias de cada dilución.

El resultado será la media de los dos valores, a no

ser que uno de ellos sea superior al doble del otro.

En ese caso se dará como recuento estándar en

placa el valor más bajo.

Si ninguna placa tiene entre 30 y 300 colonias, el valor se

da como recuento estándar en placa estimado.

Si todas las placas presentan más de 300 colonias.

Dividir las dos placas correspondientes a la dilución

más elevada, en secciones radiales (2, 6, 8).

Contar todas las colonias que se hallan en una o

más secciones.

Multiplicar el total de colonias obtenidas en cada

caso por el factor adecuado (según el número de

secciones).

Hallar la media del valor estimado por las dos placas

y multiplicar por el factor de dilución

correspondiente.

Dar el valor obtenido como el recuento estándar en

placa estimado.

4.2. Cálculo del Recuento Estándar en Placa Estimado:

Si todas las placas presentan más de 300 colonias.

Dividir las dos placas correspondientes a la dilución

más elevada, en secciones radiales (2, 6, 8).

Contar todas las colonias que se hallan en una o

más secciones.

Multiplicar el total de colonias obtenidas en cada

caso por el factor adecuado (según el número de

secciones).

Hallar la media del valor estimado por las dos placas

y multiplicar por el factor de dilución correspondiente

Dar el valor obtenido como el recuento estándar en

placa estimado.

Si en las placas inoculadas con la dilución menos

concentrada se encuentran más de 200 colonias en una

sección correspondiente a la octava parte de la placa

Multiplicar 1, 600 por el factor de dilución

Expresar el recuento estándar en placa estimado

como superior (<) al valor obtenido.

Aconsejable es señalar entre paréntesis la dilución usada.

Cuando no se encuentra colonias en placas de la dilución

más concentrada

Expresar el recuento estándar en placa estimado

como inferior a (>) 1 multiplicado por el factor de

la dilución más concentrado.

4.3. Cálculo y presentación de los resultados:

Se deben utilizar únicamente 2 cifras significativas.

Correspondiente al primer y segundo dígito

(empezando por la izquierda).

Los restantes se reemplazan por ceros.

Si el tercer dígito (empezando por la izquierda) es 5

o superior, se aumenta en una unidad al segundo

dígito

4.4. Presencia de Colonias de Crecimiento Difusivo en Superficie

Si este crecimiento no supera la mitad de la placa.

Contar las colonias fuera de esta zona.

Corregir la cifra obtenida teniendo en cuenta el área que no

se a podido contar.

Siempre que la zona ocupada por este tipo de colonias

ocupe más de un cuarto de la placa.

Hay que registrar su presencia.

4.5. Presentación e Interpretación de los Resultados:

Los resultados deben darse en como:

Recuento estándar en placa o recuento estándar en placa

estimado por gramo o por mililitro de alimento, según

corresponda.

Para decidir si una partida de alimentos se acepta o se

rechaza, debe tenerse en consideración únicamente:

El recuento estándar en placa y nunca el recuento

estándar en placa estimado

4.6. Diferencias Respecto al Recuento en Placa de la FDA, 2001:

El intervalo adecuado, según la FDA, para el recuento en

placa es de 25 a 250.

Usan la siguiente fórmula para sus cálculos.

Casos:

Placas Normales (25-250):

Seleccione placa(s) libre de esparcimiento. Cuente

todas las unidades formadoras de colonia (UFC).

Placas con más de 250 colonias:

Cuando la cantidad de UFC por placa excede a 250,

para todas las diluciones, registre los recuentos

como demasiado numeroso para el conteo.

Placas con menos de 25 colonias:

Registrar el conteo como menos de 25 × 1/d cuando

«d» es el factor de dilución para la dilución de la que

se obtuvieron los primeros recuentos.

Placas sin UFC:

Cuando las placas de todas las diluciones no tienen

colonias, reportar el APC como menos de 1 vez la

correspondiente dilución más baja utilizada.

Todas las placas con crecimiento difusivo

(esparcimientos) y/o accidentes de laboratorio.

Reportar respectivamente como:

Propagación (SPR).

Accidente de Laboratorio (AL).

Cálculo y Registro de los Recuentos:

Redondear subiendo el segundo dígito hasta el

siguiente número más alto cuando el tercer dígito

sea 6, 7, 8, 9.

Usar ceros para cada dígito sucesivo hacia la

derecha del segundo dígito.

Redondee hacia abajo cuando el tercer dígito sea 1,

2, 3, ó 4.

Cuando el tercer dígito sea 5, redondee hacia arriba

cuando el segundo dígito sea impar y redondee

hacia abajo si fuera par.