REPASO DE CONOCIMIENTOS PREVIOS ESTRUCTURA, ORGANIZACIÓN Y...

REPASO DE CONOCIMIENTOS PREVIOS

ESTRUCTURA, ORGANIZACIÓN Y FUNCIÓN DEL MATERIAL HEREDITARIO

LA QUÍMICA DEL GEN – Tema 0-1

EXPRESIÓN GÉNICA: FLUJO DE INFORMACIÓN GENÉTICA – Tema 0-2

EXPRESIÓN GÉNICA: TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN – Tema 0-3

ORGANIZACIÓN DEL MATERIAL HEREDITARIO EN EUCARIOTAS Tema 0-4

REPLICACIÓN Tema 0-5

TEMA 0-1

LA QUÍMICA DEL GEN

El ADN como sustancia genética.Estructura de los ácidos nucleicos.Propiedades físico-químicas.Propiedades espectroscópicas y térmicas.

Genética – 1er Curso

Facultad de Medicina

Hershey y Chase

Griffiths, Avery, McCarty y MacLeod

El ADN como sustancia genética

Apartados

1944

1952

Dos cepas de Streptococcus pneumoniae (patógena y no patógena)• patógena, tiene una cápsula que causa la muerte del ratón• ADN de células patógenas codifican información para transformar células no patógenas

El ADN podía transformar una cepa de bacteria en otra

Griffiths, Avery, McCarty y MacLeodEl ADN como sustancia genética

ADN, no proteína, es el agente infeccioso


Bacteriófagos son un tipo de virus que infectan bacterias• se unen a la superficie de la bacteria e inyectan su ADN a las células• bioquímicamente, es fácil separar el fago de la bacteria

Hershey y Chase

Claves para el experimento:• azufre es exclusivo de proteínas

(sólo en cisteína/metionina)• fósforo es exclusivo de ADN


Hershey y ChaseADN, no proteína, es el agente infeccioso

Inicialmente:• crecer dos lotes de fagos• marcar el ADN con 32P• marcar la proteína con 35S

Seguidamente:• infectar un cultivo de bacterias con los lotes radiactivos de fagos y determinar si las bacterias se han marcado con 32P ó 35S

Conclusión:• sólo la radiactividad de 32P entróa la bacteria. Por tanto, el ADN fue el material transmisor


Objetivos

Hershey y Chase

Griffiths, Avery, McCarty y MacLeodEl ADN podía transformar una cepa de bacteria en otra.

Trabajaron con dos cepas de Streptococcus pneumoniae (patógena y no patógena). La patógena tiene una cápsula que causa la muerte de ratones infectados. Vieron que el ADN de células patógenas codifica información para transformar células no patógenas.

ADN, no proteína, es el agente infeccioso.

Los bacteriófagos son un tipo de virus que infectan bacterias. Se unen a la superficie de la bacteria e inyectan su ADN a las células. Bioquímicamente es fácil separar el fago de la bacteria.En sus experimentos utilizaron los isótopos radiactivos 32P ó 35S que marcan ADN y proteínas, respectivamente.

1944

1952

Bases Secuencia ADN/ARN

Uniones fosfodiéster

Nucleótidos

Nucleósidos Doble hélice del ADN

Estructura de los ácidos nucleicos

Apartados

Hélices A, B y Z

Estructura secundaria del ARN

Clases


Clases

• ADN un tipo, un propósito

• ARN 3 tipos, 3 propósitos

- ARN ribosomal base de la estructura y función de los ribosomas

- ARN mensajero lleva el mensaje

- ARN transferente lleva los aminoácidos


Basesunidad monomérica

• ácidos nucleicos almacenan información

• compuestos de• una base (la parte de información)• un armazón para sostener la base• un conector (para unirlo todo)

base

esqueletoconector

BasesEstructura de los ácidos nucleicos

• Hay cuatro bases en el ADN. • adenina (A) • timina (T) • guanina (G) • citosina (C)

NN

N NH

H

NH2

H

NN

N NH

H

O

NH2

H

N

N

O

H

H3C

H

O

H

N

N

NH2

H

H

H

OG

A

C

T

purina pirimidina

1

23

4

56

9

78

1

23

4

56

9

78

5

61

2

34

5

61

2

34


• hay cuatro bases en el ADN. Timina es reemplazada por Uracilo (U) en el ARN• adenina (A) • timina (T) • uracilo (U)• guanina (G) • citosina (C)

NN

N NH

H

NH2

H

NN

N NH

H

O

NH2

H

N

N

O

H

H

H

O

H

N

N

NH2

H

H

H

OG

A

C

U

purina pirimidina

1

23

4

56

9

78

1

23

4

56

9

78

5

61

2

34

5

61

2

34


• hay cuatro bases en el ADN• todas tienen hidrógenos aceptores y dadores

NN

N NH

H

NH2

H

NN

N NH

H

O

NH2

H

N

N

O

H

H3C

H

O

H

N

N

NH2

H

H

H

OG

A

C

T1

23

4

56

9

78

1

23

4

56

9

78

5

61

2

34

5

61

2

34


• hay cuatro bases • todas tienen hidrógenos aceptores y dadores• pares de base AT tienen dos puentes de hidrógeno, pares de base GC tienen tres puentes de hidrógeno

NN

N NH

H

NH2

H

NN

N NH

H

O

NH2

H

N

N

O

H

H3C

H

O

H

N

N

NH2

H

H

H

OG

A

C

T1

23

4

56

9

78

1

23

4

56

9

78

5

61

2

34

5

61

2

34


• El armazón es ribosa, un azúcar pentosa (cinco carbonos)• ribosa es el azúcar armazón del ARN

H H

OH OH

OH

H

HOCH2

H

O

1’

2’3’

4’

5’


• El armazón es ribosa, un azúcar pentosa (cinco carbonos) • 2’-desoxirribosa es el azúcar armazón del ADN

H H

OH H

OH

H

HOCH2

H

O

1’

2’3’

4’

5’


• la base se conecta a la posición 1’ (liberando agua)• un conector de fosfato se añade a la posición 5’

H H

OH H

OH

H

HOCH2

H

O

1’

2’3’

4’

5’base

PO4


• La base se conecta a la posición 1’ (liberando agua) • un conector de fosfato se añade a la posición 5’• la estructura puede extenderse conectando el fosfato al 3’ de otro azúcar

H H

OH H

OH

H

HOCH2

H

O

1’

2’3’

4’

5’base

PO4


• un nucleósido es la combinación química de base y azúcar

H H

OH H

OH

H

HOCH2

H

O

1’

2’3’

4’

5’base

PO4

nucleósido

Nucleósidos


• un nucleótido es la combinación química de base, azúcar y fosfato

H H

OH H

OH

H

HOCH2

H

O

1’

2’3’

4’

5’base

PO4

nucleótido

Nucleótidos


• Cada fosfato se une a la posición 5’de un azúcar y a la 3’ del siguiente: enlace fosfodiester

• el ADN es un polímero altamente cargado, con una carga negativa en cada fosfato

Uniones fosfodiester

Uniones fosfodiester y estructura covalente de una cadena de ADN

Unión fosfodiéster3’-5’ {


• la secuencia corresponde con la secuencia de bases A,C,G,T/U de la cadena

• dirección 5’ 3’

• cadenas antiparalelas

Secuencia ADN/ARN


Secuencia ADN/ARN

Doble hélice del ADNEstructura de los ácidos nucleicos

• doble hélice• enrollamiento a derechas• esqueleto, azúcar + fosfato hacia fuera• bases en el interior; unidas por puentes

de hidrógeno• complementariedad de cadenas:

A = TG ≡ C


Surcoprincipal

Doble hélice del ADN

Surcomenor



En este gráfico se observa ADN ad-sorbido en una superficie alta-mente cargada. Se aprecia claramente el surco principal. Una medida sobre el plano indica alrededor de 3.4 nm, de modo que el ADN se encuentra en la forma B.



Características• puentes de hidrógeno para emparejar bases• apilamiento de los anillos aromáticos de la

bases confieren estabilidad• los fosfatos en la cara externa están

asequibles para interaccionar con cationes• surco principal y surco menor• el grupo 2’-OH del azúcar en el ARN hace

que la doble cadena de ARN se una menosfuertemente

Atributos funcionales• los puentes de hidrógeno de las hebras hacen

más fácil el desenrollarse (separarse)• las bases aun permanece accesibles (leíbles)

desde el borde• Hay suficiente flexibilidad en en el armazón y

las bases para formar una doble hélice


Hélices A, B y Z

Comparación del ADN A, B y Z

• A: a derechas, corta y ancha, 2.3 A, 11 pb por vuelta

• B: a derechas, más larga, más fina, 3.32 A, 10 pb por vuelta

• Z: a izquierdas, la más larga, la más fina, 3.8 A, 12 pb por vuelta

• H: triple hélice, estructura muy poco usual


Hélices A, B y Z


Hélices A y B



Diferencias entre ADN y ARN

• El ARN adopta conformaciones globulares en las que se forman regiones locales en hélice mediante puentes de hidrógeno intramoleculares y apilamiento de bases dentro de la única cadena de ácido nucleico• Estas regiones se forman por complementariedad de una parte de la cadena con otra.• De ahí, la gran variedad de funciones del ARN en la célula

ADN ARN• ácido desoxirribonucleico • ácido ribonucleico• no hidroxilo en 2’ del azúcar • hidroxilo en 2’ del azúcar• A, C, G, T • A, C, G, U• timina lleva un grupo metil (CH3) • uracilo tiene un átomo de hidrógenoen la posición 5 en la posición 5• doble cadena • cadena simple o doble cadena



Bases

SecuenciaADN/ARN

Unionesfosfodiester

Nucleótidos

Nucleósidos

Doble hélicedel ADN

Estructura de los ácidos nucleicos (I)ADN: 4 bases, 2 purinas -adenina (A) y guanina (G)- y 2 pirimidinas -citosina (C) y timina (T)-. ARN: la timina se sustituye por el uracilo (U).

Base + azúcar. ADN: desoxirribosa desoxirribonucleósidos.ARN: ribosa ribonucleósidos

Base + azúcar + fosfato. NTPs & dNTPs: monómeros ARN & ADN

En polímeros de ác. nucleicos, los azúcares están unidos mediante un fosfato entre la posición 5’ de uno y la 3’ del siguiente, formando una unión fosfodiester 3’,5’. Los ácidos nucleicos consisten en un esqueleto direccional azúcar-fosfato con una base unida en 1’ de cada azúcar. La unidad de repetición es un nucleótido. Los ác. nucleicos son polímeros altamente cargados con una carga negativa en cada fosfato.

La secuencia de ác. nucleios es la secuencia de bases A, C, G, T/U en la cadena de ADN o ARN. La secuencia se escribe convencionalmente desde el 5’ libre al 3’ libre final de la molécula (5’-ATAGTC-3’ (ADN) o 5’-AUAGUC-3’ (ARN).

El ADN se presenta fundamentalmente como doble hélice. Dos cadenas separadas y antiparalelas de ADN se enrollan una alrededor de la otra en una hélice a derechas con el esqueleto azúcar-fosfato hacia fuera y las bases, unidas por puentes de hidrógeno y apiladas una sobre otra, en el interior. “A=T”, “G≡C”. Las dos cadenas son complementarias; una especifica la secuencia de la otra.

Objetivos

HélicesA, B y Z

Estructurasecundariadel ARN

Estructura de los ácidos nucleicos (y II)

La hélice de ADN “estándar” (Watson-Crick) se conoce como la forma B, y es la estructura predominante in vivo. Existen otras formas de hélice a derechas, como la forma A, adoptada por secuencias de ARN in vivo; y formas a izquierdas, denominadas hélice Z, que sólo se forma en secuencias de bases especificas alternantes y no es importante in vivo.

La mayoría de moléculas de ARN son de simple cadena. Pueden plegarse en una conformación compleja, involucrando regiones locales de emparejamiento de bases intramoleculares y otras interacciones de puentes de hidrógeno. Esta complejidad se refleja en la variedad de funciones del ARN en la célula.

Objetivos

Propiedades físico-químicas de losácidos nucleicos

Estabilidad

Viscosidad

Apartados

Propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos

Estabilidad

• especificidad puentes de H

• estabilidad interacciones hidrofó-bicas y dipolo-dipolo entre las bases apiladas

ViscosidadPropiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos

El ADN celular es largo y fino

• 2 nm de diámetro

• longitud de μm, mm, cm (cromosomas eucarióticos)

• si el diámetro fuera el de un “spaghetti” el cromosoma de E. coli (4.6 millones de pb) mediría un km de largo

• es rígido, como un “spaghetti” poco cocido

• Las soluciones de ADN son altamente viscosas

• Las moléculas largas de ADN pueden romperse fácilmente: mecánicamente o por sonicación

Propiedades físico-químicas de losácidos nucleicos

Aunque podría parecer obvio que la doble cadena del ADN y la estructura del ARN se estabiliza por puentes de hidrógeno, no es así. Las uniones de hidrógeno determinan la especificidad del emparejamiento de bases, pero la estabilidad es el resultado de interacciones hidrofóbicas y dipolo-dipolo entre los pares de bases.

Estabilidad

Objetivos

Viscosidad El ADN es muy largo y fino, y las soluciones de ADN son muy viscosas. Moléculas largas de ADN en solución pueden romperse mecánicamente. Este proceso puede utilizarse para obtener ADN de una longitud media específica.

Propiedades espectroscópicas y térmicas de losácidos nucleicos

Absorción UV

Cuantificación

Pureza del ADN

Apartados

Desnaturalización térmica

Renaturalización

Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos

Absorción UV

• Las bases aromáticas de los ác. nucleicos absorben luz UV a λmax de 260 nm; las proteínas absorben a 280 nm

• El esqueleto azúcar-fosfato no contribuye apreciablemente

• Esta propiedad se utiliza para la detección, cuantificacióny cálculo de la pureza del ADN


Cuantificación

• 1 mg/ml: ADN de doble cadena tiene A260 = 20; ARN y ADN de cadena simple tienen A260 ≅ 25

• Estos últimos valores son aproximados porque:

- son la suma de las absorbancias de las diferentes bases (purinas tienen mayor coeficiente de extinción que las pirimidinas)

- el coeficiente de extinción depende del ambiente que rodea a las bases de manera que:A260 nucleótidos aislados > A260 ADN cadena simple o ARN > A260 ADN doble cadena

- dependen del número de regiones de doble cadena (estructura secundaria)


Pureza del ADN


Renaturalización

• La renaturalización tiene lugar enfriando la solución de ADN

• Enfriamiento rápido sólo permite la formación de regiones locales de doble cadena formadas por la unión de regiones cortas complementarias

• Enfriamiento lento permite la complementariedad completa de las cadenas de ADN, ya que da tiempo a que cada cadena encuentre a la otra

• La renaturalización de regiones complementarias entre cadenas de ácidos nucleicos diferentes se llama hibridación


Renaturalización

Propiedades espectroscópicas y térmicas de losácidos nucleicos

Absorción UV

Cuantificación

Pureza delADN

Las bases aromáticas de los ác. nucleicos absorben luz a λmax de 260 nm

Absorbancia a 260 nm se utiliza para determinar la concentración de los ác. Nucleicos. 1 mg/ml y 1 cm de paso de luz: ADN de doble cadena tiene A260 = 20; ARN y ADN de cadena simple tienen A260 ≅ 25. Estos últimos valores dependen de la composición de bases y de la estructura secundaria

La relación A260/A280 de una muestra de ADN de doble cadena puede usarse para calcular su pureza. ADN puro 1.8. Valores mayores de 1.8 sugieren contaminación de ARN, y menores, contaminación de proteínas

Objetivos

Desnaturalizacióntérmica

El aumento de temperatura conlleva la desnaturalización del ADN y ARN. El ARN se desnaturaliza gradualmente, mientras que el ADN de doble cadena se “funde” cooperativamente para dar cadenas simples a una temperatura determinada, Tm, la cual estáen función del contenido G+C.

Renaturalización El ADN renaturaliza por enfriamiento, pero sólo se formarácompletamente la doble cadena nativa si se enfría lentamente para permitir la unión de las cadenas complementarias

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