INFORME BIOLOGÍA EXPERIMENTAL 1

Jose Luis Rodrigo Loyola Llori

INTRODUCCIÓN

La micropropagación o cultivo de tejidos vegetales involucra el cultivo aséptico de

células, tejidos, órganos y sus componentes bajo determinadas condiciones físicas y

químicas in vitro. La planta se corta en pequeños trozos llamados “explantes” y cada uno

puede desarrollarse en una planta completa. La micropropagación es un área innovadora

y es aplicada en la agricultura y biotecnología vegetal. Esta técnica es efectiva debido al

carácter totipotente de las plantas; cada célula vegetal contiene información genética y la

maquinaria celular necesaria para generar un organismo completo.

Dos conceptos, plasticidad y totipotencia, son los procesos más importantes para

comprender la regeneración y el cultivo de células vegetales. Las plantas, debido a su

larga vida y naturaleza sésil, han desarrollado una gran capacidad para sobrellevar las

condiciones extremas. La mayoría de los procesos como el crecimiento y desarrollo de la

planta, se han adaptado a las condiciones del ambiente. Cuando las células y tejidos

vegetales son cultivados in vitro, la mayoría muestran un alto grado de plasticidad, el cual

permite el desarrollo de un órgano o tejido a partir de cualquier otro. De esta forma, una

planta completa puede ser regenerada. Este mantenimiento del potencial genético es

llamado totipotencia.

El medio empleado en el cultivo de tejidos vegetales es un suplemento artificial de

nutrientes orgánicos e inorgánicos. La composición apropiada del medio determina el

crecimiento y desarrollo del cultivo. El medio utilizado para el cultivo in vitro incluye tres

componentes básicos.

1) Elementos esenciales (iones) suplementados como una mezcla compleja de sales.

2) Suplementos orgánicos que como vitaminas y aminoácidos.

3) Una fuente de carbono que generalmente es sucrosa.

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Cuando se realiza el cultivo en un medio apropiado que contiene auxina y citoquinina, los

explantes dan origen a una masa de células, en división y crecimiento, desorganizada

llamada callo. El cultivo de callos se inicia de una parte pequeña de un órgano o

segmento de tejido en un medio sólido utilizado como soporte para el crecimiento.

Durante la formación del callo, ocurre un alto grado de dediferenciación tanto en la

morfología como en el metabolismo. Una de las mayores consecuencias de esta

dediferenciación es que la mayoría de los cultivos vegetales pierden la capacidad para

realizar fotosíntesis.

Aunque los principios de la micropropagación son básicamente invariables en

todos los laboratorios de cultivo de tejidos vegetales, su aplicación puede presentar

variaciones en magnitud y complejidad, que dependerá de los objetivos planteados por

cada laboratorio.

En el presente informe se resumen algunos procesos realizados en mi experiencia

en el área de Cultivos vegetales del Instituto de Biotecnología – IBT así como los

utilizados en otros laboratorios cuya línea de investigación es similar.

ORGANIZACIÓN DE UN LABORATORIO

1. Preparación de medios.

En esta área se preparan los medios de cultivo y también se almacenan los

materiales de vidrio y de plástico, y los reactivos químicos. Este ambiente cuenta con

mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colocar las balanzas, el

medidor de pH, y otros elementos; también incluye vitrinas, estanterías y espacio para

equipos de refrigeración.

Aquí también se encuentra una zona de lavado, el cual cuenta con un lavadero

grande con agua fría. Se cuenta con una fuente de agua de alta pureza y agua destilada

que son compradas a un proveedor. En esta área también se realiza la limpieza de los

frascos y medios contaminados, desechándolos en una bolsa próxima al lavadero la cual,

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una vez llena, es colocada en un tacho más grande ubicado en el ambiente de

esterilización.

2. Esterilización.

Los medios de cultivo son autoclavados en frascos de vidrio que son cerrados con

tapas de plástico o papel aluminio. Sin embargo, las soluciones que contienen

componentes termolábiles deben ser filtradas. Los medios de cultivo son autoclavados a

15 psi y 121°C. Para volúmenes pequeños de líquidos (100 ml o menos), el tiempo de

autoclavado es de 15-20 min, pero para grandes cantidades (2-4 litros), se requiere 30-40

min. Generalmente se preparan volúmenes grandes de medio (10-15 litros). La presión

no debe exceder 20 psi, ya que altas presiones podrían descomponer los carbohidratos y

otras componentes termolábiles del medio. El tiempo es un factor importante para

asegurar la esterilización del medio.

El autoclavado puede causar los siguientes cambios en el medio:

Disminución del pH del medio entre 0.3-0.5 unidades.

Las altas temperaturas pueden caramelizar azúcares, que pueden tener un efecto

tóxico.

Las sustancias volátiles pueden ser destruidas por el uso de la autoclave.

Largos periodos de autoclavado pueden precipitas las sales y depolimerizar el

agar.

La temperatura y tiempo correctos son pre-requisitos para una apropiada

preparación y estabilidad del medio.

3. Siembra.

En esta área se realiza el trabajo de escisión, inoculación y transferencia de los

explantes a los medios de cultivo. Debido a que este trabajo debe realizarse bajo lo más

altos niveles de limpieza ambiental, se utiliza una cámara de flujo laminar para dicho

propósito. Las cámara de flujo laminar deben ubicarse lejos de las puertas y con un

mínimo de corrientes de aire, para prolongar la vida útil de éstas.

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En este ambiente también se realiza el sellado de los medios de cultivo

esterilizados, los cuales son almacenados en vitrinas por una semana. Luego de una

semana pueden utilizarse, siempre y cuando no presenten algún tipo de contaminación.

4. Incubación.

Los cultivos son incubados en un cuarto apropiado o en cámara de crecimiento;

éstas pueden ser más eficientes en el control ambiental, pero son más costosas. Esta

área proporciona un buen control de la temperatura (20-28 °C), iluminación (variable,

según las necesidades) y de humedad relativa (70%-80%).

En este cuarto de incubación hay estanterías metálicas para colocar los cultivos.

Además existe una pequeña zona destinada para los cultivos en agitación y en

biorreactor. La regulación de la temperatura se logra gracias a aparatos de aire

acondicionado. Es necesario tomar las precauciones para evitar calentamiento excesivo.

5. Invernadero.

Las plantas regeneradas en el área de incubación son acondicionadas o

aclimatadas y luego trasplantadas en macetas, bandejas o camas apropiadas. Después

del trasplante, las plantas necesitan un acondicionamiento gradual a las condiciones de

campo, lo cual se logra utilizando cámara húmedas de plástico (túneles).

6. Oficina.

En esta área se ubican el mobiliario de oficina como escritorios, archivos y

almacenamiento de datos, los libros de referencia y de control del laboratorio, los

catálogos y otros documentos. Aquí también se encuentra el equipo de computación.

Diversos autores señalan distinto modo de organización de un laboratorio de

cultivos vegetales que dependerá de las necesidades y fines del propio laboratorio. Así,

se incluyen áreas de observación y examen, en la que se encuentran los microscopios

para realizar observaciones periódicas de los cultivos. También se puede incluir un área

de cuarentena, la cual es un almacén para la recepción de las muestras o plantas

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destinadas a la limpieza clonal. Otros autores señalan la fusión de algunas áreas; el

lavado y la esterilización podrían estar en un área común.

METODOLOGÍA

Aquí se describen algunas metodologías que considero como nuevas para mi aprendizaje

y que son determinantes para el buen crecimiento y desarrollo de la planta, con respecto

a la desinfección y esterilización.

1. Limpieza de semillas.

Este procedimiento será determinante en la contaminación del medio de cultivo y

el fracaso en el desarrollo y crecimiento de la planta. Los autores señalan que la solución

de cloro debe ser al 7%, la cual sirve para desinfectar la superficie de las semillas. Esto se

lleva a cabo en un placa Petri, la cual es sometida a movimientos circulares durante 10-15

minutos para que el tratamiento sea eficaz.

2. Limpieza de frascos.

Los frascos son lavados con detergente y luego enjuagados con agua, este

procedimiento se realiza luego de desechar material contaminado, previamente

autoclavado, contenido en los frascos. Para verter los medios de cultivo en los frascos,

éstos son previamente enjuagados con agua de caño, sumergidos en una solución de

lejía (1:6) para desinfectarlos y luego son enjuagados dos veces con agua destilada y

escurridos.

3. Preparación de medios.

Los medios de cultivo son muy variables y existen diversas formulaciones, las

cuales aportan carbono, nutrimentos minerales, vitaminas, agente gelificante, sustancias

reguladoras del crecimiento y otros compuestos.

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Entre las fuentes de carbono, la sacarosa es el azúcar más utilizado, y puede ser

reemplazada por glucosa o fructosa (son más costosos). Los nutrimentos minerales

comprenden los macro y micronutrientes que son esenciales para el crecimiento de

plantas enteras. El nitrógeno se suministra en forma de nitrato y amonio; otras fuentes de

nitrógeno incluyen glutamina, urea y caseína hidrolizada. Los medios de cultivo contienen

fósforo, calcio, magnesio y azufre. La adición de hierro con un agente quelante, lo hace

disponible en un amplio rango de pH.

En los medios semisólidos se agrega agar como agente gelificante. Se debe tener

en cuenta la pureza del agar, ya que es frecuente la presencia de impurezas de

naturaleza variada como se observó en una de las marcas empleadas para la preparación

de los medios. Las marcas utilizadas y las concentraciones del agar utilizado pueden

alterar las respuestas in vitro de los cultivos. Es así, que se incrementó la concentración

de agar en dos oportunidades debido al cambio de marca, esto se debió principalmente al

menor poder gelificante.

El carbón activado es incorporado al medio de cultivo, principalmente por absorber

metabolitos tóxicos. Este componente se utilizó para la preparación de medios de

orquídeas.

4. Siembra de explantes.

Este proceso se lleva a cabo en una cámara de flujo laminar, y es necesario

adoptar algunas precauciones durante su realización. Antes de comenzar con la actividad,

se debe desinfectar la mesa y las paredes de la cámara con etanol. Los recipientes que

contienen los medios de cultivo y todo lo demás deben ser desinfectados de la misma

forma. Es necesario que las manos y los antebrazos del cultivador sean desinfectados

con etanol; además, el uso de máscaras reduce la contaminación, así como el empleo de

gorros.

Los instrumentos metálicos como pinzas y bisturí se deben flamear con etanol. El

material utilizado como soporte para las disecciones (platos metálicos) es esterilizado en

autoclave. Las operaciones de transferencia y disección se deben realizar lo más cerca

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posible del mechero y se debe evitar la exposición prolongada de los explantes o de los

medios de cultivo en recipientes abiertos.

BIBLIOGRAFÍA

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