INFORME BIOLOGÍA EXPERIMENTAL 1
Jose Luis Rodrigo Loyola Llori
INTRODUCCIÓN
La micropropagación o cultivo de tejidos vegetales involucra el cultivo aséptico de
células, tejidos, órganos y sus componentes bajo determinadas condiciones físicas y
químicas in vitro. La planta se corta en pequeños trozos llamados “explantes” y cada uno
puede desarrollarse en una planta completa. La micropropagación es un área innovadora
y es aplicada en la agricultura y biotecnología vegetal. Esta técnica es efectiva debido al
carácter totipotente de las plantas; cada célula vegetal contiene información genética y la
maquinaria celular necesaria para generar un organismo completo.
Dos conceptos, plasticidad y totipotencia, son los procesos más importantes para
comprender la regeneración y el cultivo de células vegetales. Las plantas, debido a su
larga vida y naturaleza sésil, han desarrollado una gran capacidad para sobrellevar las
condiciones extremas. La mayoría de los procesos como el crecimiento y desarrollo de la
planta, se han adaptado a las condiciones del ambiente. Cuando las células y tejidos
vegetales son cultivados in vitro, la mayoría muestran un alto grado de plasticidad, el cual
permite el desarrollo de un órgano o tejido a partir de cualquier otro. De esta forma, una
planta completa puede ser regenerada. Este mantenimiento del potencial genético es
llamado totipotencia.
El medio empleado en el cultivo de tejidos vegetales es un suplemento artificial de
nutrientes orgánicos e inorgánicos. La composición apropiada del medio determina el
crecimiento y desarrollo del cultivo. El medio utilizado para el cultivo in vitro incluye tres
componentes básicos.
1) Elementos esenciales (iones) suplementados como una mezcla compleja de sales.
2) Suplementos orgánicos que como vitaminas y aminoácidos.
3) Una fuente de carbono que generalmente es sucrosa.
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Cuando se realiza el cultivo en un medio apropiado que contiene auxina y citoquinina, los
explantes dan origen a una masa de células, en división y crecimiento, desorganizada
llamada callo. El cultivo de callos se inicia de una parte pequeña de un órgano o
segmento de tejido en un medio sólido utilizado como soporte para el crecimiento.
Durante la formación del callo, ocurre un alto grado de dediferenciación tanto en la
morfología como en el metabolismo. Una de las mayores consecuencias de esta
dediferenciación es que la mayoría de los cultivos vegetales pierden la capacidad para
realizar fotosíntesis.
Aunque los principios de la micropropagación son básicamente invariables en
todos los laboratorios de cultivo de tejidos vegetales, su aplicación puede presentar
variaciones en magnitud y complejidad, que dependerá de los objetivos planteados por
cada laboratorio.
En el presente informe se resumen algunos procesos realizados en mi experiencia
en el área de Cultivos vegetales del Instituto de Biotecnología – IBT así como los
utilizados en otros laboratorios cuya línea de investigación es similar.
ORGANIZACIÓN DE UN LABORATORIO
1. Preparación de medios.
En esta área se preparan los medios de cultivo y también se almacenan los
materiales de vidrio y de plástico, y los reactivos químicos. Este ambiente cuenta con
mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colocar las balanzas, el
medidor de pH, y otros elementos; también incluye vitrinas, estanterías y espacio para
equipos de refrigeración.
Aquí también se encuentra una zona de lavado, el cual cuenta con un lavadero
grande con agua fría. Se cuenta con una fuente de agua de alta pureza y agua destilada
que son compradas a un proveedor. En esta área también se realiza la limpieza de los
frascos y medios contaminados, desechándolos en una bolsa próxima al lavadero la cual,
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una vez llena, es colocada en un tacho más grande ubicado en el ambiente de
esterilización.
2. Esterilización.
Los medios de cultivo son autoclavados en frascos de vidrio que son cerrados con
tapas de plástico o papel aluminio. Sin embargo, las soluciones que contienen
componentes termolábiles deben ser filtradas. Los medios de cultivo son autoclavados a
15 psi y 121°C. Para volúmenes pequeños de líquidos (100 ml o menos), el tiempo de
autoclavado es de 15-20 min, pero para grandes cantidades (2-4 litros), se requiere 30-40
min. Generalmente se preparan volúmenes grandes de medio (10-15 litros). La presión
no debe exceder 20 psi, ya que altas presiones podrían descomponer los carbohidratos y
otras componentes termolábiles del medio. El tiempo es un factor importante para
asegurar la esterilización del medio.
El autoclavado puede causar los siguientes cambios en el medio:
Disminución del pH del medio entre 0.3-0.5 unidades.
Las altas temperaturas pueden caramelizar azúcares, que pueden tener un efecto
tóxico.
Las sustancias volátiles pueden ser destruidas por el uso de la autoclave.
Largos periodos de autoclavado pueden precipitas las sales y depolimerizar el
agar.
La temperatura y tiempo correctos son pre-requisitos para una apropiada
preparación y estabilidad del medio.
3. Siembra.
En esta área se realiza el trabajo de escisión, inoculación y transferencia de los
explantes a los medios de cultivo. Debido a que este trabajo debe realizarse bajo lo más
altos niveles de limpieza ambiental, se utiliza una cámara de flujo laminar para dicho
propósito. Las cámara de flujo laminar deben ubicarse lejos de las puertas y con un
mínimo de corrientes de aire, para prolongar la vida útil de éstas.
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En este ambiente también se realiza el sellado de los medios de cultivo
esterilizados, los cuales son almacenados en vitrinas por una semana. Luego de una
semana pueden utilizarse, siempre y cuando no presenten algún tipo de contaminación.
4. Incubación.
Los cultivos son incubados en un cuarto apropiado o en cámara de crecimiento;
éstas pueden ser más eficientes en el control ambiental, pero son más costosas. Esta
área proporciona un buen control de la temperatura (20-28 °C), iluminación (variable,
según las necesidades) y de humedad relativa (70%-80%).
En este cuarto de incubación hay estanterías metálicas para colocar los cultivos.
Además existe una pequeña zona destinada para los cultivos en agitación y en
biorreactor. La regulación de la temperatura se logra gracias a aparatos de aire
acondicionado. Es necesario tomar las precauciones para evitar calentamiento excesivo.
5. Invernadero.
Las plantas regeneradas en el área de incubación son acondicionadas o
aclimatadas y luego trasplantadas en macetas, bandejas o camas apropiadas. Después
del trasplante, las plantas necesitan un acondicionamiento gradual a las condiciones de
campo, lo cual se logra utilizando cámara húmedas de plástico (túneles).
6. Oficina.
En esta área se ubican el mobiliario de oficina como escritorios, archivos y
almacenamiento de datos, los libros de referencia y de control del laboratorio, los
catálogos y otros documentos. Aquí también se encuentra el equipo de computación.
Diversos autores señalan distinto modo de organización de un laboratorio de
cultivos vegetales que dependerá de las necesidades y fines del propio laboratorio. Así,
se incluyen áreas de observación y examen, en la que se encuentran los microscopios
para realizar observaciones periódicas de los cultivos. También se puede incluir un área
de cuarentena, la cual es un almacén para la recepción de las muestras o plantas
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destinadas a la limpieza clonal. Otros autores señalan la fusión de algunas áreas; el
lavado y la esterilización podrían estar en un área común.
METODOLOGÍA
Aquí se describen algunas metodologías que considero como nuevas para mi aprendizaje
y que son determinantes para el buen crecimiento y desarrollo de la planta, con respecto
a la desinfección y esterilización.
1. Limpieza de semillas.
Este procedimiento será determinante en la contaminación del medio de cultivo y
el fracaso en el desarrollo y crecimiento de la planta. Los autores señalan que la solución
de cloro debe ser al 7%, la cual sirve para desinfectar la superficie de las semillas. Esto se
lleva a cabo en un placa Petri, la cual es sometida a movimientos circulares durante 10-15
minutos para que el tratamiento sea eficaz.
2. Limpieza de frascos.
Los frascos son lavados con detergente y luego enjuagados con agua, este
procedimiento se realiza luego de desechar material contaminado, previamente
autoclavado, contenido en los frascos. Para verter los medios de cultivo en los frascos,
éstos son previamente enjuagados con agua de caño, sumergidos en una solución de
lejía (1:6) para desinfectarlos y luego son enjuagados dos veces con agua destilada y
escurridos.
3. Preparación de medios.
Los medios de cultivo son muy variables y existen diversas formulaciones, las
cuales aportan carbono, nutrimentos minerales, vitaminas, agente gelificante, sustancias
reguladoras del crecimiento y otros compuestos.
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Entre las fuentes de carbono, la sacarosa es el azúcar más utilizado, y puede ser
reemplazada por glucosa o fructosa (son más costosos). Los nutrimentos minerales
comprenden los macro y micronutrientes que son esenciales para el crecimiento de
plantas enteras. El nitrógeno se suministra en forma de nitrato y amonio; otras fuentes de
nitrógeno incluyen glutamina, urea y caseína hidrolizada. Los medios de cultivo contienen
fósforo, calcio, magnesio y azufre. La adición de hierro con un agente quelante, lo hace
disponible en un amplio rango de pH.
En los medios semisólidos se agrega agar como agente gelificante. Se debe tener
en cuenta la pureza del agar, ya que es frecuente la presencia de impurezas de
naturaleza variada como se observó en una de las marcas empleadas para la preparación
de los medios. Las marcas utilizadas y las concentraciones del agar utilizado pueden
alterar las respuestas in vitro de los cultivos. Es así, que se incrementó la concentración
de agar en dos oportunidades debido al cambio de marca, esto se debió principalmente al
menor poder gelificante.
El carbón activado es incorporado al medio de cultivo, principalmente por absorber
metabolitos tóxicos. Este componente se utilizó para la preparación de medios de
orquídeas.
4. Siembra de explantes.
Este proceso se lleva a cabo en una cámara de flujo laminar, y es necesario
adoptar algunas precauciones durante su realización. Antes de comenzar con la actividad,
se debe desinfectar la mesa y las paredes de la cámara con etanol. Los recipientes que
contienen los medios de cultivo y todo lo demás deben ser desinfectados de la misma
forma. Es necesario que las manos y los antebrazos del cultivador sean desinfectados
con etanol; además, el uso de máscaras reduce la contaminación, así como el empleo de
gorros.
Los instrumentos metálicos como pinzas y bisturí se deben flamear con etanol. El
material utilizado como soporte para las disecciones (platos metálicos) es esterilizado en
autoclave. Las operaciones de transferencia y disección se deben realizar lo más cerca
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posible del mechero y se debe evitar la exposición prolongada de los explantes o de los
medios de cultivo en recipientes abiertos.
BIBLIOGRAFÍA
Roca, W.M., Mroginski, L.A. 1991. Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y
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Sharma, H.P., Dogra, J.V.V., Misra, A.N. 2012. Plant tissue culture: Totipotency to
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Goldman, C.A. 1990. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Eleventh
Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). 195
pp.
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